（动物学专业论文）蚓激酶提取工艺以及酶学性质研究.pdf

s p e c i a l t y ：z o o l o g y c o l l e g e ：c o ll e g eo fl i f es c i e n c e s u p e r v is o r ：p r o f e s s o rm ag u a n g z h i x uj i e s u b m i t t e dd a t e ：m a y2 6 ，2 0 1 0 i i i i iiiil l l l ll ii i iulliii y 17 6 8 015 o f 1 ) 蚓激酶的提取工艺的优化 以赤子爱胜蚓( e i s e n i af a e t i d a ) 为原料，采用组织破碎、离心、超滤、二次 硫酸铵盐析、s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤、d e a l 3 c e l l u c o s e 5 2 离子交换层析的提纯 步骤，分离得到蚓激酶( e f e ) 。酶活力检测采用纤维蛋白平板法，实验过程中对 酶提取条件进行优化，选取0 1m o l lp h 7 8 的磷酸缓冲溶液作为提取缓冲液，在 盐析过程中分别选取3 5 一7 0 n h 4 s 0 4 分部沉淀。提取纯化的蚓激酶( e f e ) 经过 d e a e 离子交换层析，比酶活达4 2 0 0 0u m g ，纯化倍数达到5 3 8 倍，酶活力回 收率为3 7 。经过s d s p a g e 凝胶电泳，其相对分子量约为2 6k d ，含有2 个 亚基，每个亚基的相对分子量约为1 4k d ；获得二聚体，得到较高纯度的蚓激酶。 2 ) 提取工艺的成本核算 本实验提取纯化的蚓激酶过程中能耗、成本支出、蚓激酶收益进行成本核 算，以1 5 0 0 0 u m g 规格蚓激酶市场价6 0 0 0 元蚝，2 0 0 0 0 u m g 规格蚓激酶市 场价1 2 0 0 0 元k g 为标准，1 0 0k g 鲜蚯蚓可生产规格为1 5 0 0 0 u m g 的蚓激酶4 2 k 或者规格为2 0 0 0 0 u m g 的蚓激酶2 4 6 k g ，经过成本计算得到毛利润分别为 1 9 9 6 2 7 元和2 4 2 8 2 7 元。 3 ) 以提取的蚓激酶为研究对象，对蚓激酶( e f e ) 的酶学性质和酶的稳定性进 行了研究。来源于赤子爱胜蚓( e i s e n i a f a e t i d a ) 的蚓激酶最适温度为4 5 ，最适 摘要 l - _ - - - - _ _ l l _ _ - _ _ l i _ _ _ - - _ _ i _ _ _ i _ _ _ _ _ _ i - - _ _ 一 p h 为7 0 ；在3 7 5 5 。c ，该酶有较好的热稳定性，但是温度高于6 0 c 时，酶活迅 速降低；在p h7 0 9 0 范围内，酶活相对稳定，说明该酶有一定的耐碱性；金属 离子h 9 2 + 对酶活有强烈的抑制作用；而m 9 2 + 对酶有明显的激活作用； c a 2 + 和 k + 对酶活的影响不明显算。 关键词：蚓激酶工艺提取酶学性质成本核算 i i s t u d yt h eo p t i m i z a t i o np r o c e s so fi t sp u r i f i c a t i o na n dt h ec a l c u l a t i o no ft h ec o s t t h e f o l l o w i n gm e t h o d sw e r ea p p l i e di no r d e r ：u l t r a f i l t r a t i o n , a m m o n i 啪s u l f a t e ，t h e m o l e c u l a rs i e v ea n di o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a f t e ra c q u i r i n gar e l a t i v e l yh i g h p u r i t yo fl u m b r o k i n a s e ，t h i st h e s i sp r e l i m i n a r ys t u d i e dt h ep r o p e r t i e so ft h i se n z y m t h em a i nr e s u l t sa r ei l l sf o l l o w s ： 1 ) t h eo p t i m i z a t i o no ft h ee x t r a c t i o np r o c e s sf o rl u m b r o k i n a s e u s i n ge a r t h w o r m ( e i s e n i af a e t i d a ) a sr a wm a t e r i a l s ，a p p l y i n gt h em e t h o d so f t i s s u e f r a g m e n t a t i o n , c e n t r i f u g a t i o n , u l t r a f i l t r a t i o n , s e c o n d a r ya m m o n i u ms u l f a t e ， s e p h a d e xg 一2 5g e lf i k r a t i o n , d e a e c e u u c o s e 5 2b yi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i no r d e r ，w eo b t a i n e dt h el u m b r o k i n a s e a c t i v i t yw a sd e t e c t e db yf i b r i np l a t em e t h o d ， a i m i n ga to p t i m i z i n gt h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so nt h ee n z y m e ，w es e l e c t e d0 1m o l l p h 7 8p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o na st h ee x t r a c t i o nb u f f e r , i nt h es a l t i l l gp r o c e s sw e c h o s e3 5 - 7 0 n h 4 s 0 4p o i n t sd e p a r t m e n to fp r e c i p i t a t i o n a f t e rb e i n gt r e a t e d w i t hd e a ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , s p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yo fe f ew a su pt o 4 2 0 0 0u m g ，p u r i f i c a t i o nf a c t o rr e a c h e d5 3 8 - f o l d ，t h ee n z y m e a c t i v i t yr e c o v e r yw a s 3 7 t h es d s - p a g eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a ti t sm o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t 2 6k d ，c o n t a i mt w os u b u n i t s ，t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fe a c hs u b u n i tw a sa b o u t 14k d ；t h ed i m e rh a sa r e l a t i v e l yh i g hp u r i t yl u m b r o k i n a s e i i i a b s t r a c t 2 ) a c c o u n t a t i o nf o rt h ec o s to fe x t r a c t i o n i nt h i ss t u d y , t h ee n e r g yc o n s u m p t i o na n dc o s tw e r ea c c o u n t e di nt h ep r o c e s so f e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f h m b r o k i n a s e s e t t i n gt h es t a n d a r do f6 ，0 0 0y u a np e rk g f o rt h e15 0 0 0 u r n gs p e c i f i c a t i o n sl u m b r o k i n a s e a n d12 0 0 0y u a np e rk gf o rt h e 2 0 0 0 0 u m gs p e c i f i c a t i o n sh m b r o k i n a s ei nt h em a r k e t 10 0k go ff r e s he a r t h w o r m c a np r o d u c e s p e c i f i c a t i o n s 15 0 0 0 u m go fl u m b r o k i n a s e4 2 k go r s p e c i f i c a t i o n s 2 0 0 0 0 u m go fl u m b r o k i n a s e2 4 6 埏，t h eg r o s sp r o f i ta f t e rc o s t sw e r e19 ，9 6 2 7y u a n a n d2 4 ，2 8 2 7y u a n 3 ) u s i n gt h ee x t r a c t e dl u m b r o k i n a s ea st h er e s e a r c ho b j e c t ，t h ee n z y m a t i c p r o p e r t i e so ft h el u m b r o k i n a s ew e r es t u d i e d t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h ee f e w h i c he x t r a c t e df r o me a r t h w o r mw a s4 5 ，t h eo p t i m u mp hi s7 o ；a t3 7 - 5 5 ， t h ee n z y m eh a dg o o dt h e r m a ls t a b i l i t y , b u tw h e nt h et e m p e r a t u r er e a c h e d h i g h e r t h a n6 0 ，t h ea c t i v i t yd e c r e a s e dr a p i d l y ；i nt h ep h7 0 - 9 0r a n g e ，t h ea c t i v i t yi s r e l a t i v e l ys t a b l e ，i n d i c a t i n gac e r t a i ne n z y m ea l k a l i n e ；m e t a li o n sh 9 2 + s t r o n g l y i n h i b i t e dt h ee n z y m ea c t i v i t y ；a n dm g “c o u l da c t i v a t et h ee n z y m e ；c a + a n dc h a d n os i g n i f i c a n te f f e c to nt h ei t sa c t i v i t y k e yw o r d s ：l u m b r o k i n a s ee x t r a c t i o np r o c e s sc h a r a c t e r i z a t i o n c o s t i n g i v 目录 目录 1 1 ：! ：； 和纤溶酶特性4 的降解作用及对纤溶酶原作用的研究4 4 用专一性研究5 抑制作用的研究7 9 9 1 7 蚓激酶的应用研究1 2 1 7 1 蚓激酶的抗凝和溶纤功能1 2 1 7 2 毒性实验13 1 7 3 蚓激酶临床应用研究1 4 本论文的研究意义及内容1 5 第二章蚓激酶提取工艺研究。1 6 2 1 实验材料1 6 2 1 1 实验材料1 6 2 1 2 主要试剂16 2 1 3 主要仪器1 6 2 2 方法17 2 2 1 蛋白标准曲线制作与蛋白含量测定1 7 2 2 2 蚓激酶酶活力的检测方法1 7 2 2 3 蚓激酶粗酶液的制备18 2 2 4 超滤18 2 2 5 硫酸铵分级沉淀1 8 2 2 6 s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤18 2 2 7d e a e c e l l u c o s e 5 2 离子交换层析1 9 2 2 8 层析柱的装柱和再生1 9 2 2 94 - 2 0 s d s p a g e 梯度电泳l9 2 3 结果与讨论一2 0 v 目录 2 3 1 匀浆缓冲液的选择与用量的确定2 0 2 3 2b r a d f o r d 法测定蛋白含量的标准曲线2 l 2 3 3 纤维蛋白平板法测定酶活力标准曲线2 2 2 3 4 超滤前后酶液成分含量的变化2 3 2 3 5 硫酸铵分级沉淀工艺条件的确定2 4 2 3 6 s e p h a d e x 2 5 凝胶过滤2 6 2 3 7d e a e c e l l u c o s e 5 2 离子交换层析2 7 2 3 84 2 0 s d s p a g e 梯度电泳2 8 2 4 本章小结3 0 2 4 1 分离纯化总流程3 0 2 4 2 纯化结果31 第三章蚓激酶酶学性质的研究3 4 3 1 实验材料一3 4 3 1 1 实验材料3 4 3 1 2 实验试剂3 4 3 1 3 主要仪器3 4 3 2 方法3 4 3 2 1 酶活测定方法3 4 3 2 2 蚓激酶最适反应温度及热稳定性的测定3 5 3 2 3 金属离子对酶活的影响3 5 3 2 4 最适p h 测定3 5 3 3 结果与讨论3 6 3 3 1 蚓激酶最适反应温度及热稳定性3 6 3 3 2 金属离子对酶活的影响3 8 3 3 3 最适p h 值3 8 3 4 本章小节4 0 第四章蚓激酶提取工艺的成本核算4 1 4 1 产品成本概述4 l 4 1 1 产品成本分类4 1 4 1 2 成本计算方法4 2 4 1 3 成本核算意义4 3 4 2 本实验成本数据来源4 3 4 3 蚓激酶市场价格4 6 4 4 本实验生产得到的蚓激酶收益4 6 v i 目录 4 5 成本的收支结算4 7 4 6 本章小节。4 7 结论与展望4 8 结论4 8 展望4 9 参考文献5 0 致谢5 5 攻读硕士学位期间科研情况5 6 v n 蚯蚓在中医上又称地龙，我国传统的中医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、 定惊、利尿、降压等功效。蚯蚓体内的蛋白质含量非常丰富，且具有人体所需的 1 0 种氨基酸，其含量和营养价值都很高，甚至超过大豆蛋白。而且其体内的不 饱和脂肪酸含量高，尤其是亚油酸，其具有抗癌、降血压，防止动脉硬化的作用。 此外维生素和微量元素含量也很丰富，蚯蚓的药用价值已成为人们研究蚯蚓的热 点( 徐凤彩，2 0 0 1 ) 。 目前研究的最多的是蚯蚓体内的酶，包括其中的血纤蛋白溶酶( 也叫纤溶 酶) 、胶原蛋白酶等，还有蚯蚓超氧化物歧化酶、蚯蚓过氧化氢酶，蚯蚓金属硫 蛋白酶等。 1 9 8 2 年m i h a r a 自l u m b r w u sr u b e h u s 中提取出一组具有纤溶活性的纤溶 酶，命名为蚓激酶( 1 u m b r m o n a s e ) ( m m a r a h ，1 9 8 2 ) 。由于蚓激酶具有治疗心 脑血管疾病的性质，而使其成为研究的热点( 杨嘉树等，1 9 9 8 ；吴蓉1 9 9 8 ；钟 良玮，2 0 0 1 ；徐炜虹，1 9 9 6 ) 。蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间 接溶解纤维蛋白的双重作用。在临床上，该酶可口服后经肠胃进入血液，同时可 降低血液粘滞度、改善微循环。对缺血性心脑血管病、陈旧性血栓病、高血压、 动脉硬化、心肌梗塞等具有较好治疗作用，尤其对因脑血管病导致的肢体瘫痪及 语言障碍的恢复效果显著( 王志峰，2 0 0 7 ) 。其特点是稳定性好、纤溶活性强、 药理作用广泛、口服有效、副作用小，许多国内外科研人员都在致力于这类新的 溶栓酶类新药开发( j e o noh ，1 9 9 5 ；m i h a r a h ，1 9 8 9 ；s u m ih ，1 9 9 3 ) 。此后， 人们从不同的蚯蚓品种中获得该酶，且对其研究也同益深入。 华南师范大学硕士学位论文 1 2 蚓激酶的理化特性 根据国内外研究报道，一般认为蚓激酶是一组分子量为2 0 4 0 k d 、p 1 3 5 、具 有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶( n a k a j i m a n ，2 0 0 2 ；w a n gc ，2 0 0 4 ) ，属胰 蛋白酶，类似于人血纤维蛋白溶酶。蚓激酶具有以下特性：1 ) 能水解蛋白质底 物如酪蛋白、碱性氨基酸的酯如苯甲酞l 一精氨酸乙酯( b a e e ) ，以及酰胺。2 ) 具有强烈的溶解血纤蛋白的作用。3 ) 具有很好的热稳定性：多种蚓激酶提取物 6 0 加热3 0 m i n 后，酶活性没有明显降低，6 0 以上，酶活性开始下降，8 5 加 热3 0 r a i n 酶活性完全丧失。4 ) 酸稳定性：多数纯化的蚓激酶在p h 3 1 l 间酶活性 没有明显变化，p h 低于3 或高于1 1 时，酶活性明显下降，最佳纤溶反应的p h 值范围较宽，多数在7 1 0 之间。 由于蚯蚓种类的不同、纯化技术的各异，所获得的蚓激酶也有一些相异的特 性：现纯化的蚓激酶多为寡聚酶，而( y a n gjs ，1 9 9 7 ) 等纯化到的具有激酶活 性的二聚酶，由大小两个亚基组成，亚基的单一酶活性均小于二聚酶；国内有 数篇文章报道( 张伟，1 9 9 7 ) 纯化的蚓激酶为糖蛋白，含糖量在3 1 5 之间，三 氟甲烷磺酸去糖处理可使酶活性丧失，但n a k a j i m a 等报道其所纯化的六种纤溶 酶均为非含糖的蛋白质( n a k a j i m an ，1 9 9 9 ) ；不同组分的蚓激酶对不同种类的 丝氨酸蛋白酶抑制剂的敏感性存在明显的差异，一种抑制剂可抑制某一组分的蛋 白酶，但对另一组分的蛋白酶可能无抑制作用，甚至有激活作用。 目前，世界上己提取的蚓激酶蛋白已有几十种，研究人员对其中的一些所分 离到的酶蛋白进行了氨基酸组成分析，以及氨基酸序列测序( 杨嘉树等，1 9 9 8 ； y a n gjs ，1 9 9 7 ；熊义等，1 9 9 7 ；n a k a j i m an ，1 9 9 3 ) 。发现这些蚓激酶具有相 似的氨基酸组成，其中甘氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸含量较高， 谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸及异亮氨酸在某些单体中含量也较高，但赖氨酸的含量 均较低，这点同人纤溶酶的氨基酸组成有明显的差异。 另外，对蚯蚓的蚓激酶基因序列以及氨基酸序列和人的血纤蛋白溶酶进行同 源性比较，发现它们相互之间的同源性存在很大的差异。但大多数单体间都具有 较保守的序列，甚至还发现有两对单体的n 端序列完全一致。同源分析发现这 些单体同胰蛋酶、糜蛋白酶、因子、血浆酶、弹性蛋白酶等具有较高的同源性， 并含有凝血酶和纤溶酶某些共同的保守序列。如n a k a j i m a 分析蚓激酶与胰蛋白 2 重叠肤段和共 及糜蛋白酶具 多个酶活性中 类似于纤溶酶 酶原激活物的 因对纤维蛋白 ( f n ) 具有相当的亲和性而部分富集于血栓周围，纤溶酶原激活剂( p a ) 能将p g 激 活为纤溶酶( p m ) ，具有丝氨酸蛋白酶活性的p m 则能降解构成血栓骨架的f n 从 而起到溶栓作用( 应蓓文，1 9 9 9 ) 。 纤溶蛋白 ( 血栓的形成) 图1 - 1 蚓激酶溶栓机理 f i g1 1 m e c h a n i s mo fl u m b r o k i n a s et h r o m b o l y t i c 华南师范大学硕十学位论文 1 3 1 蚓激酶的激酶和纤溶酶特性 蚓激酶的激酶和纤溶酶作用可同时出现，也可单独存在。m i l i a r a 等纯化的三 组六种蚓激酶，纤维蛋白平板法检测仅具有纤溶酶活性( m i h a r ah ，1 9 8 3 ) 。而 y a n g 等分离的蚓激酶双体酶在s d s 刺激下主要表现为激酶活性，更多的实验室 获得的蚓激酶均是具有激酶和纤溶酶双重特性的单体酶，不仅具有激活纤溶酶原 类的尿激酶活性，更具有直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性。因此，这些蚓激酶不 仅能溶解血栓，而且还具有抗凝作用，不仅能溶解含纤维蛋白原的纤维蛋白板， 而且也能水解含精氨酶脂键的人工合成底物，如t a m e ( 对甲苯磺酸精氨酸甲酯) 和b a e e 等，在体外还能直接溶解天然动物血凝块，以人工合成底物t a m e 和 b a e e 来精确描述蚓激酶的酶学行为时，发现从赤子爱胜蚓中分离出来的一种具 有纤溶酶原激活剂活性的组分e p a 既能降解b a e e 也能降解a t e e ，只是在活 性上略有差，j i j ( y a n gjs ，1 9 9 7 ) 。 1 3 2 对纤维蛋白原的降解作用及对纤溶酶原作用的研究 n a k a j i m a 等应用s d s p a g e 电泳研究了蚓激酶f i 1 组分对牛纤维蛋白原的 降解作用，当f 1 i i 1 与纤维蛋白原孵育后，a a ，8 1 3 首先被切割，随后丫链也被 降解，同人纤溶酶相比，蚓激酶对纤维蛋白原降解速度快，降解片段分子量小、 这可能是蚓激酶体外溶解血块的速度快于其它纤溶酶的原因之一( n a k a j i m a n ， 1 9 9 3 ) 。y a n g 等应用s d s p a g e 电泳及氨基酸测序技术研究了蚓激酶对纤溶酶原 的降解，发现蚓激酶可在五个位点切割纤溶酶原。其中a r 9 5 5 7 1 1 e 5 5 8 是切割纤 溶酶的位点。 总之，对蚯蚓纤溶酶的研究，大多数还是停留于对其酶学性质的研究，而 对其应用相对显得比较薄弱( y a n gjs ，1 9 9 7 ) 。 1 4 酶学性质 蚓激酶的酶学性质比较复杂，它不仅具有激活纤溶酶原的类尿激酶活性，更 具有直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性，不仅能溶解血栓，而且还具有抗凝作用， 不仅能溶解含纤维蛋白原的纤维蛋白板，而且也能水解含精氨酶酯键的人工合成 4 的同一位置( 杨嘉树，1 9 9 8 b ) 。1 9 9 3 年m i h a r a 所在实验室对其分离到六种蚓 激酶成分的底物特异性进行分析，发现此六种蚓激酶成分对不同的产色底物具有 不同的降解蛋白的活性( n a k a j i m an ，1 9 9 3 ) ( 表1 1 ) 。 华南师范大学硕十学位论文 表1 1 酶的底物特异性 t a b l el - 1s u b s t r a t es p e c i f i c i t yo f e n z y m e 由表1 1 可以看出，f 1 1 1 2 和f 1 可与多数底物作用并有相似的底物反 应谱，f i 2 和f i 1 的底物特异性类似，并对h d 1 i e p r o a r g p n a ( 2 8 u m g ) 具有最大酶活；f l i 和f i 0 分别对m e o s u c - a l a - p r o - v a l p n a ( 0 3 u m g ) 和 h d v a l - l e u - a r g - p n a ( 0 4 u m g ) 有活性。 在底物特异性上，既有象胰蛋白酶的一面，也有象胰凝乳蛋白酶的一面，即既 能切割碱性氨基酸，又能切割蔬水性氨基酸。n a k a j i m a 等纯化的六种纤溶酶在 纤维蛋白平板上均具有纤溶酶活性，但对合成底物的作用具有明显的差异、如 f i i i 2 组分对h d p h e - p i p - a r g p n a 是专一的。而f i - l 组分对$ 2 2 8 8 是专一的， 说明这些纤溶酶具有相异的纤维蛋白切割位点( n a k a j i m an ，1 9 9 3 ) 。另外w o o 等 人也从粉正蚓中纯化出一种可为p o l y - l l y s i n e 激活的蛋白酶( p l a p ) ，这种酶只 能降解p h e 或t y r 等形成的肽键，而对a r g 和l y s 形成的肽键则不能降解( w o ok m ，1 9 9 4 ) 。 6 第章绪论 1 4 2 对不同抑制剂抑制作用的研究 蚓激酶对各种不同的酶类抑制剂表现为不同程度的抑制。m i h a r a h 发现 l b t ( 和j 马豆胰蛋白酶抑n n ) 和e d t a 可1 0 0 抑制酶的活性，t l c k 烈对甲苯 磺酰赖氨酰氯甲基酮) 、苯甲脒( b e n z a m i d i n e ) 、d f p ( - - 异丙基氟磷酸酯) 对其 的抑制程度分别为5 8 3 、4 0 4 、1 1 4 ( m i h a r a h ，1 9 9 2 ) 。1 9 9 3 年m i h a r a h 所在实验室检测了不同抑制剂对其提取的蚓激酶的抑制作用，结果发现e d t a ( 1 m m o l l ) 对酶无抑制作用，而其它抑制剂对酶的作用也与上述结果不同( 表1 2 ) ( n a k a j i m an ，1 9 9 3 ) 。 华南师范大学硕十学位论文 表1 2 不同抑制剂对酶的抑制效应 t a b l e1 - 2d i f f e r e n ti n h i b i t o r ye f f e c t so fi n h i b i t o r so ne n z y m e 残留活性( ) 抑制剂浓度 f 2 i i i 2 f i i i 1f i if i 2f i 1 f i - 0 n o n e 1 0 0 1 0 01 0 01 0 01 0 0 1 0 0 二异丙基氟 0 1 0 10 10 11 0 磷酸酯( d f p ) m m o l m l 大豆胰蛋白o 0 0 1 m g m l 0 51 4 1 74 0 酶抑制剂 ( s b t i ) a p r o t i n i n ( 抑0 0 0 1m g m l0 70 32 58 4 肽酶) 2 氨基乙酸 o 19 09 0 9 09 0 ( 一2 a c a ) n 一对甲苯磺 酰苯丙氨酰 氯甲基酮 ( t p c k ) n 对甲苯 磺酰赖氨酰 氯甲基酮 ( t l c k ) 弹性蛋白酶 抑制剂 ( e l a s t a t i n a l ) e d t a 1m m o i p i ， 1 o 1 0 4 04 0 8 58 5 9 09 0 m m o l m l 0 1 1 0 01 0 01 0 09 59 0 9 0 m m o l m l 0 1 8 5 m m o l m l o 0 1 m g m l 9 9 lm m o l m l 1 0 0 7 58 01 0 0 1 0 08 0 9 49 28 41 0 0 7 0 1 0 0 1 0 0 1 0 01 0 01 0 0 8 第章绪论 由表1 2 可知，二异丙基氟磷酸酯对所有酶成分均可完全抑制，f i i i 2 、f i i i 1 和f i i 在很大程度上被大豆胰蛋白酶抑制剂抑制，氨基乙酸、n 对甲苯磺酰苯 丙氨酰氯甲基酮、n 对甲苯磺酰赖氨酰氯甲基酮和e d t a 并不影响酶的活性。 对抑制剂的研究不仅有助于阐明蚓激酶的性质而且为纯化酶蛋白提供了新的方 法( 杨嘉树等，1 9 9 8 ) 。 1 5 酶的构象 2 0 0 2 年t a n g 等利用x 射线衍射对y a n g 于1 9 9 7 年分离的蚓激酶的大亚基作 了酶的立体结构分析( t a n gy ，2 0 0 2 ) 。结果表明，大亚基的晶体结构属于菱形 空间结构p 2 ( 1 ) 2 ( 1 ) 2 ( 1 ) ，单晶结构参数为a = 4 0 6 ，b = 1 2 7 5 ，c = 1 2 9 2a ，每 个不对称格含有3 个分子。用m i r 法( 2 5a ) 观测到整个多肽以类糜蛋白丝氨酸 蛋白酶的方式折叠，有弹性蛋白酶必需的s l 特异性决定基团，其s l 特异性口 袋西侧的1 3 链被v a l 2 1 7 之后插入的四个残基明显延长，这样不但为底物远处的 p r o 提供更多的氢键结合位点，而且造成s 1 口袋向南延伸。s 2 亚活性位点被体 积较大的t y r 9 9 部分遮盖。根据结构决定抑制剂类型的模式，大亚基s l 特异性 口袋会优先容纳具有弹性蛋白酶特异性的小疏水p l 残基，在与底物结合力增加 或s l 口袋发生诱导性契合的条件下，也可以容纳长的或大的p 1 残基。蚓激酶 的大亚基因此而具有广泛的底物特异性，包括纤维蛋白和纤溶酶原。s 2 亚活性 位点_ 上_ t y r 9 9 的出现说明其倾向于与p 2 o l y 的结合，对t y r 9 9 的诱导性契合其 也可以容纳较大的p 2 残基( w a n gf ，2 0 0 3 ) 。 1 6 蚓激酶分离纯化 自从8 0 年代日本宫崎医科大学m i h a r ah 教授等从蚯蚓蛋白粗提物中分离到具 有纤溶酶活性的蚓激酶以来，随后国内外多个实验室也开展了蚓激酶的提取、纯 化研究，分离纯化技术日趋成熟其通常是通过制备蚯蚓匀浆、盐析、凝胶层析、 离子交换层析及h p l c 等一系列的步骤进行分离纯化。通过分离纯化一般可以得 到具有较高纯度的单个或多个组分的蚓激酶。 9 华南师范大学硕+ 学位论文 如迟玉杰等用硫酸按分步盐析，透析脱盐及d e a e 纤维素、s e p h a d e x a 2 5 和 s e p h a d e x g 5 0 三种柱层析方法从蚯蚓组织提取液中分离纯化一种单一组分的纤 溶酶f 迟玉杰，1 9 9 9 ) 。近年来层析技术在蚓激酶分离中得到广泛应用，表现出较 大的优越性，如操作简单，分离时间短，获得的活性组分多等，己成为纯化蚓激 酶最为理想的方法之一。用国产对氨基苯讽乙基交联琼脂代替进口s e p h a r o s e 4 b ， 利用亲和柱色谱分离可以得到纯度较高的蚓激酶( 姜东胜，1 9 9 6 ) 。林少琴等用牛 血纤溶酶原s e p a r o s e 4 b 作为亲和层析剂来分离纯化蚓激酶也得到了良好的效 果，且大大的简化了分离纯化的过程( 林少琴，2 0 0 0 ) 。 日本m i h a r a 于19 8 3 年首次报道了从蚯蚓( l u m b r i c u sr u b e l l u s ) 中提取出一 组具有纤溶活性的蚓激酶( m i h a r ah ，1 9 8 3 ) ，1 9 9 1 年m i h a r a 等再次报道其从 l u m b r i c u sr u b e l l u s 中提取出一组具有强纤溶活性的蚓激酶成分，分子量为 2 0 3 0 k d ，p i 值为3 4 ，此酶具有热稳定性和在广泛的p h 范围内保持活性，其 对提取的蚓激酶纯化后获得生化性质不同的3 个片段，此3 个片段可进步分 离，f i 可分离为f i 0 ，f i 1 和f i 2 ，片段i i 不能再分离，片段i 可分离为 f h i 1 和f 1 i i 2 。根据其对底物的特异性不同，其认为片段i 为类糜蛋白酶类， 片段为类胰蛋白酶类，片段i i 不属上述两种酶也非弹性蛋白酶。经纤溶活性分 析，他认为具有纤溶活性的酶主要来自蚓体的前部( m i h a r ah ，1 9 9 1 ) 。1 9 9 3 年 m i h a r a 所在的实验室对其分离到的六种三r u b e l l u s 中的蚓激酶成分进行理化性 质鉴定，对经过凝胶过滤层析提纯后的酶蛋白进行s d s p a g e 电泳，测定六种 酶分子的分子量分别为2 9 6 6 2 k d 、2 9 6 6 7k d 、2 4 6 6 4k d 、2 4 2 2 0k d 、2 4 1 9 6k d 和2 3 0 1 3k d 。各个酶分子对应的p i 值分别为3 4 0 ，3 6 0 ，4 2 0 ，4 0 0 ，4 3 0 和4 8 5 。各个酶是一条单一的多肽链，全部酶蛋白都不含有糖成分，在p h1 1 1 和 最高不超过6 0 的条件下稳定。对其底物特异性及酶活抑制的研究表明，此类 酶为类碱性胰蛋白丝氨酸蛋白酶，其n 端序列与类胰蛋白酶有局部相似性，从 氨基酸测序、氨基酸组成分析和免疫原性分析结果来看，此六种酶是来自至少4 个基因的同工酶( n a k a j i m an ，1 9 9 3 ) 。 我国学者路英华等1 9 8 6 年自锯齿远蚓( a m y n t h a sd a n c a t a l a ) 等多种蚯蚓中 提取到不同蚯蚓的蚓激酶成分，经酶活性比较，认为自各种不同蚯蚓中提取的酶 的纤溶活性存在差异，个体大、内脏发达的锯齿远蚓及环毛蚓纤溶活性强于个体 l o 到一组含有糖脂蛋白的纤溶活性成分，并命名为g 一9 0 。此混合物包含二种有纤溶 活性和抗凝活性的丝氨酸蛋白酶( pi 和pi i ) 并测得其酶活与剂量存在一定依赖 关系( n r z e n j a kt m ，1 9 9 8 ) 。 目前，世界上已提取的蚓激酶蛋白多种( 见表1 3 ) ，由于采用的分离手段各不 相同，并且只有少数报告对所分离到的酶蛋白进行基因或蛋白水平上部分或全部 测序，所以难以对已分离到的蚓激酶成分进行分类。葛涛等在国际基因库共检索 至1 3 0 余条蚓激酶，通过对已在g e n b a n k 上发表的蚯蚓的蚓激酶基因序列以及蛋 白序列进行同源性比较，发现它们相互之间的同源性存在很大的差异，估计造成 这种差异的原因可能为：( 1 ) 蚓激酶很可能是蚯蚓体内的消化酶类，土壤中的 养料的种类和成分非常复杂，所以需要蚯蚓有多个基因所编码的不同的酶类进 行消化，获得养料；( 2 ) 根据进化论的理论，蚓激酶的成分可能会随环境的改 变而发生变化，从而衍生出来现在种类繁多的蚓激酶( 葛涛，2 0 0 3 ) 。 华南师范大学硕十学位论文 表1 3已分离的蚓激酶简表 t a b l e1 - 3 h a v eb e e ns e p a r a t e dl u m b r o k i n a s e 路英华等锯齿远蚓 2 等多种蚯 蚓 吴骋等京条纹爱 2 胜蚓 周元聪等赤子爱胜 7 蚓 徐建民等 饶育雄等 同上 参环毛蚓 2 2 - - 2 3 3 5 有有 5 0 8 4 0 - 4 1 2 8 6 0 3 7 4 2 3 0 2 5 3 0 有有 92 7 粗制 口 i ：1 1 ：i 有有 有有 杨嘉树等l u b r i c u s l4 5 有 有 一 r u b b l l u s 赵晓瑜等 91 6 - 3 3 有 m i h a r a 等l u b r i c u s 6 2 3 , - 一3 0 3 4 有有 6 0 r u b b l l u s 4 8 r y u 等l u b r i c u s 6 一 有有 3 7 r u b b l l u s h r z e n j a k e i s e n i a2 一一 有 一 等 f o e t i d e 8 9 l l 8 - ，表示没有报道 1 7 蚓激酶的应用研究 1 7 1 蚓激酶的抗凝和溶纤功能 目前已有很多研究证明蚓激酶在体外具有较强的纤溶活性，从而使其可能成 1 2 第章绍论 为一种很有应用前景的溶栓制剂，研究者因此对其体内的活性进行了检测。1 9 9 2 年，m i h a r ah 给志愿病人口服提纯的蚓激酶成分，随后每同抽血进行体内多项 指标的检测，发现( 1 ) 纤维蛋白降解产物在口服药物后1 2 天开始升高，保持到1 7 天活性消失；( 2 ) 组织纤溶酶原激活竟0 j ( t z p a ) 的含量和纤溶活性在给药期间一直增 高，提示蚓激酶不但能在体内具有直接纤溶酶活性而且可以通过激活t z p a 发挥 纤溶活性( m i h a r ah ，1 9 9 2 ) 。另外，在纤溶过程中伴有纤维蛋白原的降低及血纤 维蛋白降解产物( f d p ) 的增加，纤维蛋白原的减少可阻止血栓继续形成，而f d p 本身就具有抗凝作用。因此，抗凝作用是纤溶作用的一个重要伴随现象。动物实 验发现，蚓激酶静脉或口服给药，凝血时f b j ( t t ) 、凝血酶原时间( p t ) 及部分凝血 酶激活时间( k p t t ) 均延长，纠正实验提示有i i 、因子的降低，提示蚓激酶也 有降解凝血因子的作用。此后的多项研究结果均显示蚓激酶具有显著的抗血小板 的凝集效应和明显的抗栓及增强纤溶的作用( z h a n gzx ，1 9 9 2 ) 。 1 7 2 毒性实验 在研究者对蚓激酶体内的活性进行检测的同时，也检测其在体内是否具有毒 性。1 9 9 9 年贺石林以健康小鼠为模型，一次性向腹腔内注入蚓激酶提取物，注 入后4