（分析化学专业论文）可抛弃型葡萄糖生物传感器的研究.pdf

搿抛弃型蓣萄耱生物黄感器静硗究攮要 可抛弃型葡萄糖生物传感器的研究 摘要 糖尿瘸是世界性的多发病和常见瘸，它严重地威胁着人类的健康，是仅次子心血 管病和癌症的世界第三大危险疾病。目前我国的糖尿病人数已经接近5 0 0 0 万，如何 控制和治疗糖尿病是项十分重要的任务。葡萄糖是人体中最基本的化学物质之一， 当人体内胰岛素出现相对或绝对不足时，人就会换上糖尿病，其主要特征就是高血糖 及糖尿。缀此，在糖尿病的预防及治疗孛，盘糖定期检测与监测是必不可少的手段。 此外，大量药品、食品、饮料、饲料以及我们生活的自然环境中也广泛存在着葡萄糖。 可见，葡萄糖的分析检测意义重大。本论文将纳米金颗粒引入酶传感器制备过程中， 结合自组装及溶胶一凝胶法，主要做了下面三个部分的工作。 第一、首先采用电沉积法制各了金纳米修饰氧化钢锡( a u n p s i t o ) 电极，结合自 组装法将葡萄糖氧化酶( g o d ) 修饰于a u n p s i t o 电极表面，制各了g o d c y s a u n p s i t o 酶电极。系统地研究了电镀圈数、p h 及扫速对酶电极性能的影响，优化了电极的制 备条件，获得了g o d 的直接电化学，实现了对葡萄糖的响应，并考察了电极稳定性。 酶电极电子转移速率常数为3 7 0s ，对葡萄糖的响应为0 0 4m m 4 8m m ，米氏常 数为1 2 。0 7m m ，在4 放罴3 0 天盾对葡萄糖的响应仍保持原来的8 5 。 第二、用溶胶一凝胶法制备g o d - c y s s g a u n p s i t o 酶电极，实现了g o d 与 a u n p s i t o 电极的直接电予转移。同时对电极的电化学性能进行了探讨，并测定了样 品中葡萄糖的浓度，电极电子转移速率常数为3 7 9s ，线性响应为o 0 5r a m - 4 0m m ， 米氏常数为1 3 7 9r n m ，在4 放置3 0 天后对葡萄糖的响应只降低了8 。 第三、在用自组装法及溶胶一凝胶法制备g o d 酶电极的基础上，采用溶胶一凝胶法 制备了g 0 一般卜c y s s g a u n p s i t o 双酶电极。溶胶一凝胶法易予控制双酶含量之比及 总含量，便于优化电极性能。制备的双酶电极性能大大提高，对葡萄糖的线性响应为 0 + 0 2m m - 3 2m m ，在4 口c 放置3 0 天后对葡萄糖的响应只降低了1 0 。g o d 酶生物传 感器灵敏度较低，而双酶生物传感器灵敏度要高、线性范围要宽、重现性要好、并且 具有高度的选择性。 i t o 具有良好的导电性能，较低的价格，以镀金i t o 电极作为基底修饰葡萄糖氧 霹挞弃型甍麓糖生浆簧感器魏研究 攒要 化酶，方法简便，可以大批量生产，为制作可抛弃型传感器提供了便利。本论文使用 i t o 作为电极基底，钊备了三种类型的可抛弃型葡萄糖生物传感器。 关键词：葡萄糖氧化酶，辣根过氧化酶，生物传感器，金纳米，i t o 作者：王建文 指导老师：狄俊伟 s t u d y0 1d i s p o s a b l eg l u c o s e ( ) x 掇a s eb i e n z y m eb i o s e n s o r s a b s t r a c t s t u d yo nd i s p o s a b l eg l u c o s e ， b i o s e n s o r s a b s t r a c t d i a b e t e sm e l l i t u si sac o m m o na n df r e q u e n t l y o c c u r r i n gd i s e a s e ，w h i c hs e r i o u s l y m e n a c e st h eh e a l t h yo ft h eh u m a nb e i n g s p r e s e n t l y , t h e r ea r ea b o u tf i 衄m i l l i o nd i a b e t i c p e o p l ei no u rc o u n t r y t h e r e f o r e ，t h ed i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fd i a b e t e sm e l l i t u si sa l l i m p o r t a n tt a s k 。g l u c o s ei so n eo f t h em o s te s s e n t i a lc h e m i c a ls u b s t a n c e si nh u m a nb o d y w h e nat o t a lo fp a r t i a ll a c ko fi n s u l i nh a p p e n s ，o n ew i l ls u f f e rf r o md i a b e t e sm e l l i t u s ， c h a r a c t e r i s t i co fh i 曲g l u c o s ec o n t e n ti nb l o o da n du r i n e 。s o ，f o rt h ed i a b e t i cp r e v e n t m e n t a n dt r e a t m e n t ，t h ei n s p e c ta n dm o n i t o ro fb l o o ds u g a rt i m e l yi sa l la b s o l u t e l yn e c e s s a r i l y w a y b e s i d e s ，g l u c o s ea l s oe x i s t se x t e n s i v e l yi nm e d i c a m e n t ，f o o d s ，b e v e r a g e ，f e e d sa n d e v e nt h ee n v i r o n m e tw el i v e s t h e r e f o r e ，g l u c o s ea n a l y s i sa n dd e t e c t i o nh a sg r e a t s i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r , t h en a n o p a r t i c l e sw e r eu s e di nt h ef a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r s 。 c o m b i n i n g s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) a n ds o l g e l t e c h n o l o g y , t h i st h e s i s c o n c e r n st h r e er e s e a r c hs e c t i o n s ： f i r s t ，t h eg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) w e r ee l e c t r o d e p o s i t e do nt h ei n d i u mt i no x i d e o t o ) e l e c t r o d es u r f a c e ，a n dt h e nt h eg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w a si m m o b i l i z e do nt h e a u n p s i t oe l e c t r o d et of a b r i c a t et h eg o d c y s a u n p s i t oe l e c t r o d e 张ep r e p a r t i o n c o n d i t i o n so ft h ee n z y m ee l e c t r o d ew e r eo p t i m i z e d 弧ei m m o b i l i z e dg o de x h i b i t e d d i r e c te l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rt o w a r dt h eg l u c o s e 。t h eh e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e r r a t ec o n s t a n t ( k s ) w a se v a l u a t e dt ob e3 7s 1 。t 氛ec a l i b r a t i o nr a n g eo fg l u c o s ec o n t e n tw a s f r o mo 0 4m mt o4 8m m t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t i e nc o n s t a n t ( k m 聊) v a l u eo f g o d i m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ew a sf o u n dt ob e1 2 。0 7m m 。t h ee l e c t r o d em a i n t a i n e d 8 5 o f i t so r i g i n a lc u r r e n tr e s p o n s ea f t e r3 0d a y s s e c o n d ，s o l g e lm e t h o dw a sa p p l i e df o rf a b r i c a t i o no fg o d c y s - s g a u n p s i 约 e l e c t r o d e t h ed i r c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e ng o da n da u n p s i t oe l e c t r o d es u r f a c ew a s i i i s t u d yo nd i s p o s a b l eg l u c o s e o x i d a s eb i e n z y m eb i o s e n s o r s a b s t r e e t r e a l i z e d t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h ee l e c t r o d ew e r es t u d i e da n di tw a su s e dt o d 曲：髓t h eg l u c o s ec o n t e n t r a t i o n 。髓ekw a se v a l u a t e dt ob e3 7s - 1a n dt h ec a l i b r a t i o nr a n g e o fg l u c o s ec o n t e n tw a sf r o m0 0 4m mt o4 8m m 1 1 1 ek m 印pv a l u eo fg o di m m o b i l i z e d o nt h ee l e c t r o d es u r f a c ew a sf o u n dt ob e1 2 。0 7m m 。t h ec u r r e n tr e s p o n s eo n l yr e d u c e d8 o fi t so r i g i n a lc u r r e n ta f t e r3 0d a y s t h i r d ，o nt h eb a s i so fs a m sa n ds o l g e lm e t h o d sf o rf a b r i c a t i o no fg o db i o s e n s o r s ， t h eg o d h r p - c y s s g a u n p s i t ob i e n z y m ee l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e d 、撕t l is o l g e l m e t h o d 。t h es o l g e lm e t h o di se a s yt oc o n t r o lt h ec o n t e n to ft h et w oe n z y m e s ，t h u s o p t i m i z et h ep r e p a r t i o nc o n d i t i o n s t h ee l e c t r o e a t a l y t i a la b i l i t yw a se n h a n c e dl a r g e l ya n d t h et h ec a l i b r a t i o nr a n g eo fg l u c o s ec o n t e n tw a sf r o mo 0 2m mt o3 2m m 曩c u r r e n t r e s p o n s eo n l yr e d u c e d10 o fi t so r i g i n a lc u r r e n tr e s p o n s ea f t e r3 0d a y s t h eb i e z y m e e l e c t r o d es h o w sh i g hs e n s i t i v i t y ，e x c e l l e n tr e p r o d u c i b i l i 够a n dh i g hs e l e c t i v i 够。 d u et oi t sg o o dc o n d u c t i v ep r o p e r t i e sa n dl o wc o s t ，a u n p sm o d i f i e di t oe l e c t r o d ei s ag o o ds u b s t r a t et oi m m o b i l i z eg o de n z y m e i ti se z s ya n dt h eb i o s e n s o r sc a nb e m a n u f a c t u r e di nl a r g e t h r e ek i n d so fd i s p o s a b l eb i o s e n s o r sw e r ef a b r i c a t e du s i n gi t o e l e c t r o d ea st h es u b s t r a t e k e yw o r d s ：g l u c o s eo x i d a s e ，h o r s e r a d i s ho x i d a s e ，b i o s e n s o r s ，g o l dn a n o p a r t i c l e ， i n d i u m - t i no x i d ee l e c t r o d e i v w r i t t e nb yj i a n w e nw a n g s u p e r v i s e db yj u n w e d i 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果拳除文中已经注明引爝的内容外，本论文+ 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：期：塑醒l 兰! i o 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件帮电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：至建整嚣 导师签名： 期：一塞盟塞! 簦一! ，秽 霹挞宾型楚蔫糖生物蕊感器豹研究第一章翦言 第一章前言 生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，也是电化学分析和生物技术研 究最为活跃的领域之一疆1 。生物传感器是指用固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、 激素等) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织等) 作为感元件的传感器。与传统的各种 物理传感器和化学传感器的最大区别在于生物传感器的感受器中含有生命物质，以生 物活性单元作为敏感基元，通过备种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间的 反应，然后将反应程度用离散或连续的数字电信号表达出来，得瞵被分析物的信息瞄。 生物传感器具有灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、价格低廉、稳定性好、 畿在复杂的体系中进行快速在线连续监测等特点，笺广泛应用予基础研究、生物、临 床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军攀、过程控制与检测、环境监控与保 护等领域“。根据生物活性物质的类别，生物传感器可以分为酶传感器、免疫传感器、 d n a 传感器、组织传感器和微生物传感器等。酶生物传感器是由一个固定化的生物敏 感膜和与之密切结合的换能系统缀成，它把圈化酶和电化学传感器结合在一起，因而 具有独特的优点：( 1 ) 它既毒不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度； ( 2 ) 由于酶的专属反应性，使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。 因此，酶电极在生物传感器领域中占有非常重要的地位。 葡萄糖是人体中最基本的化学构成物质之一，它是为机体提供能量的主要来源。 进入循环系统与血液结合的葡萄糖称为血糖，蛊糖水平变化常可反映糖在体内代谢的 状况，溯定血糖含量可判断糖代谢是否正常。冒篱，测试血液葡莓糖浓度的方法主要 有3 种：显色法、酶电极法和荧光方法。三种方法备有优点，其中酶电极法由于速度快， 检测方法简单，成本较低而芷被越来越多地使用。目前绝大多数葡萄糖传感器均采用 在电极表面修饰葡萄糖氧化酶的方法来制备，以期获得高灵敏度和高选择性的电极响 应，基于电化学的原理测定电极上葡萄糖氧化所产生的微电流丽测得葡萄糖的浓度。 葡萄糖传感器在生物和医学上有极其重要的应用价值，不仅能用予医学上的疾瘸检 测，而且能用于化工、食品工业的检测之中，用途广泛，是世界上重点开发的产品之 在酶生物传感器的研究应用中，基于葡萄糖氧化酶的生物传感器占到了8 0 以 上。并且在葡萄糖浓度测定方法中，葡萄糖氧化酶( g o d ) 生物传感器以其准确、快速 可抛弃型葡萄糖生物传感器的研究 第一章前言 和低成本的优点而成为当前世界上葡萄糖传感器研究的焦点。 1 1 葡萄糖生物传感器 1 1 1 基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器 制备电化学生物传感器的主要方法是使用生物成分作为换能器的酶电极。有少量 报道是利用葡萄糖脱氢酶制备葡萄糖传感器口3 。一般来讲葡萄糖生物传感器都是以葡 萄糖氧化酶( g o d ) 作为生物识别成分。 葡萄糖氧化酶1 9 2 8 年由m u l l e r 等发现，此后n e k a m a t s u 、k o n e l i a 、y o s n o 等先后 对其作了大量的研究并投入生产h 一】。葡萄糖氧化酶对b - d 一葡萄糖具有高度专一的催 化氧化作用。其主要的两种来源为黑曲霉菌和灰绿霉菌。葡萄糖氧化酶分子量为15 0 至1 8 0k d a 的二聚体。葡萄糖氧化酶在临床检测及食品工业中有广泛的用途，主要 有四个方面：一是去葡萄糖，二是脱氧，三是杀菌，四是检测葡萄糖的含量。 自1 9 6 7 年u p d i c k 和h i c k s 【6 】首次研制出以铂( p t ) 电极为基体的葡萄糖氧化酶电 极，用于定量检测血清中葡萄糖含量以来，酶生物传感器由于酶可以重复使用、试样 用量少以及制备步骤简单等特点受到越来越多的关注。n 8 0 年代，”生物传感器“这 一概念便已在国际上得到公认。在生物传感器发展的早期阶段，以酶为催化剂制成的 电极主要用于临床葡萄糖的分析。随着生物传感器的发展，测定各种生物样品的生物 传感器纷纷涌现。目前，由于材料科学，生命科学，电子技术，生物技术等众多学科 参与研究开发，使生物传感器成为现代分析化学中最有生命力的一个分支。 酶电极是一种把酶膜固定在电化学传感器表面构成的最普通的酶基电化学生物 传感器。它把固定化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：1 它既 有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；2 由于酶的专属反应性， 使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定【_ 7 1 。酶选择性的催化生化反应， 生成或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的浓度可以通 过电位或电流模式进行测定。故酶生物传感器分为电位型和电流型两类传感器【8 】。 电位型传感器是指酶电极与参比电极间输出的电位信号，它与被测物质之间服从 能斯特关系。而电流型传感器是以酶促反应所引起的物质量的变化转变成电流信号输 出，输出电流直接与底物浓度有关【9 】。电流型传感器与电位型传感器相比具有更简单、 直观的效果，且灵敏度也高，是生物传感器领域中研究最多的一种类型。基于所涉及 的- 电化学( 电荷传递) 机理，电流式葡萄糖传感器通常分为三代。 2 撼赛型蘩鹫耱生物转感瓣弱瑗究第一章魏言 1 1 2 电流式葡萄糖传感器的发展历程 一、第一代葡萄糖氧化酶生物传感器 第一代葡萄糖氧化酶生物传感器是以氧为中继体的电催化。 酶层：g o d o x 葡萄糖峰g o d , 。d 葡萄糖酸 ( 1 1 ) g o d r c d 十0 2 一g o d o x + h 2 0 2( 1 - 2 ) 电极：h 2 0 2 一0 2 + 2 h + + 2 e ( 1 3 ) 通过氧来传递电子，在这种情况下过氧化氢浓度的增加或氧浓度的降低都与葡萄 糖浓度成正比，嚣此可通过检测酶催化反应产物h 2 0 2 1 0 - 1 9 1 浓度的变化或氧 2 0 。2 1 1 消 耗量来测定底物浓度。在普通的工作电极上，对h 2 0 2 的测定需要在较高的正电位下进 行，+ o 。6 v ( v s 。a g a g c l ) 。这通常会使多巴胺、尿酸及其它电活性物质产生于扰。上 世纪8 0 年代很多种不同的方法致力予减少这种干扰。其中一种方法是使用高聚物、多 层膜、混合膜等来隰碍电活性物质所带来的干扰 2 2 - 2 8 1 。这些表面膜能降低电极对活性 物质的响应，可以保护电极表面，提高酶电极稳定性。当把g o d 固定在修饰有电聚 合膜如亚苯基二胺、多酚、聚吡咯等的表面时，这些膜对提高电极的选择性尤为有效 2 2 2 4 , 2 s j 。虽然限制了电极的稳定性，但电聚合过程能很有效地在电极表面形成一层覆 盖物，这对提高选择性很有效。使用包含有不同性能的单模的复含膜具有更好的效果。 如文献鼬1 曾报道，交替性地修饰n a f i o n 及醋酸纤维素膜能消除维生素c 及尿酸的干扰。 提高选择性的另外一种途径是通过调整电催化h 2 0 2 的工作电位至( - 0 2 0 v ，v s a g a g c l ) 间，这样能有效地排除氧化性物质的干扰。基于金属铁氰化物的传感器可 有效地降低h 2 0 2 催化的过高电位【3 0 。3 5 】。亚铁氰化亚铁( p b ) 修饰电极具有较好及稳 定的电催化性能而受到了广泛的关注。k a r y a k i n 曾计算了p b 膜对h 2 0 2 电催纯常数为 3 1 0 3m 1 s 以【3 2 】。p b 高的催化活性也使其对于h 2 0 2 的检测具有较高的灵敏度。为了进 一步提高选择性及稳定性，文献瑟4 】将g o d 及p b 共沉积于碳纤维电极表蔼，制备了一 种葡萄糖纳米传感器。类似地，金属化的碳电极如r h ，c ，r u c 用于葡萄糖传感器可将 对掩0 2 的催纯电位降至0 v 左右，这个电位可使大多数的于扰消除。 虽然采用不同方法可提高选择性，但该酶生物传感器依然存在如下缺点：( a ) 溶 解氧的交化可能影喃电极响应的波动；( b ) 盘于氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时， 响应电流明显下降，从而影响检出限；( c ) 生物传感器的响应性能受溶液中p h 值及 温度影响很大。 二、第二代葡萄糖氧化酶生物传感器 可抛弃型葡萄糖生物传感器的研究第一章前言 酶电极的性能是有酶的催化活性，酶活性中心和导电基质之间电子交换速率决定 的。g o d 含有一个核黄素( f l a v i n ) 辅基，其与酶牢固地结合在一起。根据核黄素辅 基的状态，g o d 相应有氧化、还原两种状态。电流式g o d 酶电极最主要的问题是寻 找一种能够将酶重新氧化，从而避免氧依赖性的方法，这一问题很困难，因为核黄素 辅基深埋在蛋白质内部，不容易达到，因而传统的金属电极实用性较差。在第二代 葡萄糖生物传感器中，作为电子受体的氧被人工媒介体( m ) 如二茂铁及其衍生物等 所取代，这些电子媒介体能够从酶的氧化还原中心迅速传送电子到工作电极的表面并 往复传递电子加强了酶与电极间的直接电子传输。下为媒介体型葡萄糖传感器的反应 流程示意图。 ) ( ! 蒌銎! ( 图1 媒介体葡萄糖传感器工作原理。 酶层：g o d o x + 葡萄糖一g o d d + 葡萄糖酸 ( 1 - 4 ) 修饰层：g o d r c d + m 。x g o d o x + m r 酣( 1 5 ) 电极：m 陀d m o x + r l e ( 1 6 ) 选择这样的媒体体有很多要求。首先，最基本的是媒介体要具有迅速的异相( 电 极反应) 动力学和迅速的均相( 酶反应) 动力学，而且媒介体要对氧稳定，无毒性， 具有一适宜的氧化还原电势。如媒介体为二茂铁时，其氧化可以在很低的电位下( 通 常+ 0 1 5 至+ o 。2 5 v ) 发生，而不一定需要催化的或贵金属电极。在如此低的电位下， 其他可氧化化合物的干扰是很小的。由于氧与产生信号的过程无关，传感器的信号不 依赖于氧的浓度。以二茂铁及其衍生物为媒介体的葡萄糖传感器是一个非常成功的办 法【3 6 , 3 7 】。其它一些常见的媒介体还有铁氰酸盐，锇及其化合物，醌类，有机染料，四 硫富瓦烯等汹蛳1 。 4 _ _ h ；：=。 哪 x 一 浩 一=：一i=僻 咖 一一一一 渤 硼 一一 棚 e 一 e 哺 = = m d =：=嘈 幽 一一一 噱骺0 一一 c 一 u n j g 诣 !|=：g u 一= = 一一 b 掰抛弃型莓蔼糖生物传感爨豹硒究第一章前言 p j ，： i i j 制韪蟹 嫡啊瞄爪i 喀碡 图2 二茂铁媒介体葡萄糖传感器工作原理。 第二代酶生物传感器增加了化学修饰层，扩大基体电极可测化学物质范围，并且 检测灵敏度得到了很大的提高 4 1 - 4 3 】。基体电极经过修饰后，可以看成是一个改进了 的信号转换器。媒介体的加入能促进电子的传递，降低工作电位 4 4 1 ，然而同时也使电 极的选择性变差】。 三、第三代酶生物传感器 第三代酶生物传感器是酶与电极之间电子交换不经过动态媒介参加，而直接进行 酶与电极之间的电子传递，它可以大大简化生物传感器的步骤。 酶层：g o d o x 十葡萄糖一g o d 糟d + 葡萄糖酸 ( 1 7 ) 电极g o d r e d g o d o x + n e ( 量一8 ) 蛋白质电化学表明，电子交换速率依赖于蛋白质的性质、电极材料和电极电解 质界面的状态【4 6 】。只有一些分子量相对低的毫予载体和蛋皇质，可以在金属酶电极上 观测到电子的直接传递【4 7 1 。高分子量酶的活性中心深埋于多肽内部，因而很难发生直 接电子传递湖。鬓前关于g o d 的直接电子传递已有报道1 4 9 - 5 9 3 。酶直接电化学已成 为生物电化学研究的最重要领域之一。酶作为一类典型的生物大分子和特殊催化剂， 在生命过程中扮演着极其重要的焦色。在理论上，酶与电极之闻直接电子传递过程更 接近生物氧化还原系统的原始模型，为揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础：从 应用方面谣言，酶直接电化学的实现可用于发展人工心脏用的生物燃料电池。因此， 第三代酶生物传感器的研究具有重要意义。 1 2 纳米技术在蔫萄糖生物传感器中的癜用 葡萄糖氧化酶易溶于水且性质不稳定，为防止其从电极上脱落流失影响传感器的 灵敏度、稳定性、使用寿命等性熊，赦自1 9 6 2 年首列葡萄糖氧化酶生物传感器诞生 以来，人们一直在寻找良好的固定生物活性物质的材料。 5 戆弃型甍麓糖生物抟感器的研究第一章前言 纳米是指粒径在1 - 10 0r i m 的颗粒。这一尺寸大小的材料处在原子、分子为代表 的微观世界和宏观物质世界交界豹过渡区域，因此，纳米材料产生了常规颗粒所不具 有的新效应：表面效应、体积效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应。并由此产生 懑许多特殊性质：奇异力学、毫学、磁学、热学、光学和仡学活性等渤3 。 纳米粒子具有比表面积大、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强、表面活 性高等特殊性质使其在传感器组装中具有重要的应用价值。首先，纳米颗粒增强酶在 载体表面上的固定作用；其次是定向作用，分子在定向之后，其功能会有所改善；第 三，由于金、铂纳米颗粒具有良好的导电性和宏观隧道效应，可以作为固定化酶之闻、 固定化酶与电极之间有效的电子媒介体，从而使得酶的氧化还原中心与电极间电子转 移成为可能。纳米颗粒的使用可大幅度地提赢固定化酶的催化活性，增加电极的电流 响应灵敏度，改进生物传感器的抗干扰性能，提高信嗓比秘h 餐。目前为止在葡萄糖传 感器应用中研究较多的属碳纳米管及以金纳米为首的金属纳米。 1 2 1 碳纳米管在葡萄糖传感器申的应用 作为一种新型电极材料，纳米碳管改性电极要比传统电极具有更好的导电性能和 纯学稳定性。s o f i r o p o u l o u 等嘲利用在p t 上生长的纳米碳管阵列固定葡萄糖氧化酶，制 作了检测葡萄糖浓度的生物传感器。r e n 课题组泓1 报道了定向纳米碳管电极葡萄糖传 感器。t a n g 嘲将m p t 努t 米修饰的c 陋吸附g o d 酶分子制备了葡萄糖生物传感器。l i u 渊 通过层层最组装的方式将g o d 酶分子固定在c n t 修饰的玻碳电极上，将所制备的酶电极 潮于流动注射，检测葡萄糖可在- 1 0 0i v 下进行。 沁嫩g 的研究小组嘲通过层层盘组 装的方式将多壁碳纳米管幂i g o d 共同修饰于石墨电极上，发现当修饰6 层时，酶电极的 性能最好。 董绍俊等畸盯通过吸附作用将g o d 固定在聚二甲基二烯丙基氯化铵( p d d a ) 多壁碳 纳米管的修饰电极上，实现了g o d 的直接电化学。露时他们还采用了包埋法，周壳聚糖 将碳纳米管及g o d 共同包埋与g c 电极上，也获得- r g o d 的直接电化学阳耵。z h a o 口们也做了 类似工作，首先将p d d a 修饰于鑫轻电极表面，然后将c n t 修饰于p d d a 层，最后层层组装 g o d 酶分子，制作的酶电极保持了较好的催化活性和较高的稳定性，并能有效去除尿 酸及多巴胺的干扰。蔡陈心涨3 等将g o d 固定在碳纳米管修饰的玻碳电极表面，制成了 g o d - c n t g c 电极，并获得y g o d 的直接电子转移。 1 2 2 金属纳米在萄萄糖传感器中的应用 l i m 等人将纳米p t 和葡萄糖氧化酶一起电沉积到经n a f i o n 溶解的多壁纳米 6 霹抛弃型葡饕糖生貔抟感器熬臻究第一章懿言 碳管膜表面，制备的传感器对葡萄糖响应迅速、灵敏口射。唐芳琼等将超细a g 颗粒作 为圊酶基质应用于葡萄耱生物传感器的割备，以改善酶电极电流响应性能h 瓤。丽将纳 米c u 代替纳米a g 作为固酶基质，发现纳米c u 也可大幅度提高酶的催化活性口 。 1 9 9 2 年矗。l 。c r u m b l i s s 渊将粒径戈5 0n m 纳米a 毽溶胶与g o d 电沉积在铂丝电极 上制成了葡萄糖氧化酶生物传感器。两周后g o d 保持了8 0 的生物活性，7 周后g o d 的活性基本保持在7 0 不变。s 。y a b u k i 渊用纳米如胶吸附g o d 修饰玻碳电极得到了 葡萄糖氧化酶电极。j w a n g 等口7 1 把溶胶一凝胶技术用于纳米a u 固载g o d 制备的葡萄 糖氧化酶毫极也表现出较好的稳定性葶鑫对葡萄糖较宽的响应范围。b h a r a t h i 等人以 n 一 3 一( 三甲氧基硅基) 丙基 乙二氨为合成纳米a u 的稳定剂，合成的纳米a u 与葡 萄糖氧化酶混合蜃，用电化学沉积方法将其沉积到导电玻璃电极表面，铡备葡萄糖生 物传感器，其有效使用寿命达4 个月之久嘲。 在国内，江龙的小组早在8 0 年代中期就开始将纳米粒子引入葡萄糖氧化酶生物 传感器的研究工作啪) 。他们将1 0 - 3 0n m 的纳米金用于葡萄糖氧化酶电极的制备。实 验发现，纳米金的加入使酶的活性增强，而且用i 0n m 纳米金吸附酶制成的酶电极的 灵敏度大大高于3 0n m 纳米金制成的酶电极渤1 。这可能归因于：( 1 ) 量子尺寸效应， 小尺寸的粒子有较强的吸电子能力，从而有利予纳米粒子在电极与酶的活性中心迅速 传递电子；( 2 ) 表面效应，超细颗粒粒径小，比表面积大，可以增加g o d 的吸附量。 欧雪梅等哺及c h e n 等阻幻研究了不同直径纳米金颗粒对g o d 活性的影响，结果表明金 属颗粒越细，活性越大。由于金的氧化还原电位是+ 1 6 8 v ，具有极强的夺电子能力， 而g o d 中的f a d 的氧化还原电位只有十o 6 0 v ，因此金纳米颗粒已不是一种惰性的粒子， 丽是参与了g o d 本身的催化反应的活性粒子。唐芳琼等合成了亲水纳米袁硅、憎水纳 米a u 、憎水纳米s i o ：等纳米颗粒，单独或复合使用于葡萄糖传感器的制备中，利用 聚乙烯醇缩丁醛为膜材料，将葡萄糖氧化酶与纳米颗粒共同物理吸附于p t 电极表面， 制备了一系列纳米颗粒增强的葡萄糖生物传感器，并对其作用机理作了详细阐明阴朝。 主。2 3 其它纳米材料在葡萄糖传感器孛妁应用 人们还尝试将其它纳米材料运用于葡萄糖氧化酶电化学生物传感器的研究。如， 用电子媒余体蹭和g o d 共沉积于纳米碳纤维中制成的纳米级葡萄糖氧化酶电极在很 低的电位一0 i v ( v s a g a g c l ) 电催化还原酶反应产物h ：0 。，并且还具有高选择性、 寿命长、重现性好等特点劁。多空纳米t i o ：因其良好的生物相容性、较高的催化效 率和较大的比表面积成为有前途的固酶材料。s c o s n i e r 用多空纳米t i o ：制成的电 7 可抛弃型葡萄糖生物传感器的研究 第一章前言 流式葡萄糖氧化酶生物传感器在电位- 0 1 5 v ( v s s c e ) 测定葡萄糖，其最大灵敏度和 检测限分别为3 3 3m a m c m - 2 、1 5 州。国内，李清文也做了这方面的研究工作， 其葡萄糖氧化酶生物传感器在工作电位0 7 v ( v s s c e ) 可以快速测定葡萄糖，表现 出良好的稳定性和线性。l i m 等船劬将p d 纳米、g o d 及c n t 共沉积于玻碳电极表面制备 了葡萄糖生物传感器，对葡萄糖的检测限为0 1 5m m 。 1 3 双酶生物传感器 作为生物传感器的重要组成部分，双酶生物传感器一直是当前研究的热点。双酶 生物传感器以酶作为感元件，它将两种酶同时修饰固定在一个电极上，让两种酶都参 与发应，它比单酶生物传感器灵敏度要高、线性范围要宽、重现性要好、并且具有高 度的选择性，因此一直受到广泛的关注+ 。愈宝明f 9 0 】用交联法将赖氨酸脱羧酶与碳酸 酰酶共同固定于c 0 2 电极透气膜上，制成了l 赖氨酸双酶电极，并测定了食品中赖 氨酸的含量，与自动分析仪所得结果一致。最近，李华清等【9 l j 以聚已二醇二缩水甘油 醚为交联剂将辣根过氧化物酶与谷氨酸固定在电极表面，制备了双酶生物传感器，对 谷氨酸的检测具有很好的线性。 双酶传感器中，研究比较多的基于g o d 的双酶生物传感器。张日等m 】将葡萄糖 淀粉酶及葡萄糖氧化酶共同组装成测定淀粉的双酶传感器。周惠【9 3 】用戊二醛为交联剂 将这两种酶固定在铂电极上制成了测定麦芽糖的双酶传感器，此电极可连续测定5 0 0 次以上，冰箱放置两个月后响应电流并不下降。金利通【9 4 】将葡萄糖氧化酶和过氧化物 酶固定在玻碳电极上，制成双酶生物传感器，用于人体血清中葡萄糖的测定，一些常 见干扰物质对测定无干扰，该传感器具有选择性好和重现性好、响应时间短等优点。 在基于g o d 的双酶生物传感器测定葡萄糖的研究中，大多是h r p g o d 双酶型 生物传感器。其原理是： g o d g l u c o s e + 0 2 h r p h 2 0 2 g l u c o n o l a c t o n e + h 2 0 2 ( 1 9 ) h 2 0 ( 1 1 0 ) 葡萄糖从溶液中扩散到电极表面，与薄膜中固定化的葡萄糖氧化酶及溶液中的溶解 氧发生反应，所生成的过氧化氢继续在电极表面扩散，与固定在溶胶凝胶膜里的h r p 发生反应，产生电流信号。张占恩等【9 5 1 p a n ，n 一二甲基苯胺作聚合单体，用电化学聚 合方法在玻碳电极上同时固定辣根过氧化物酶和葡萄搪氧化酶制备了双酶生物传感 8 霹抛弃型蘩鹫糖生物转感器鳇磅究 第一章熬言 器，该传感器在- 0 0 5 v 电位下对葡萄糖有响应，因此可排除常见物质的干扰。李春香 渊提出了种基于电聚合硫堇作为电子传递媒介体的h r p - g o d 双酶型葡萄糖传感器， 该法采用碳糊包埋h r p 牙i 硫堇，通过原位电聚合形成聚硫堇修饰的碳糊电极，以壳聚 糖膜修饰该电极表面，焉戊= 醛交联豳定g o d 镱i 褥，该传感器具有良好的选择性及稳 定性，经个月的连续使用后，仍能保持其初始活性的8 0 。同样，王雅琴阳7 3 将介体 对甲酰苯基二茂铁与h r p 共价结合，然后单体啦咯一起电聚合到铂电极上，再通过戊 二醛将葡萄糖氧化酶交联固定在电极上，制成共价修饰的h r p g o d 介体酶传感器，底 物测试范围0 - 4 0m i ，电极稳定性增强。t i a n 醐首先制备了翼船修饰石墨电极，再用溶 胶法将媒介体f c a 修饰于电极表面，最后将g o d 酶及聚合基p p y 电聚合于电极上，此电 极在一周内活性保持9 2 。l o m i l l o 等汹3 用二茂铁及秘b 作为酶介体，将h r p 和g o d 共同电 聚合于铂金片微电极上，制成了检测葡萄糖的生物传感器，其原理见图3 。 图3 媒介体型双酶生物传感器的工作原理。 i a c k e y 等瑟嘲采用恒电彼电沉积的方法将h r p 和g o d 酶同时固定在用聚乙烯兹烯 聚合物修饰的印刷碳电极上，并发现当两种酶的摩尔浓度l ：1 时，电极的性能最好。 为了获得较好的电极性能，a n z a i 骆8 珏研究了h r p 及g o d 酶的先嚣修镣顺序及酶层对电 极的性能的影响，发现当先修饰h r p 后修饰g o d 作为外层时电极性能较好，他用伴刀 蔑球蛋自透过配位、络合力交替地固定两释酶，两静酶都保持了较好的催他活性，当 酶层增加时，电极性能也增加。 d e t v a u x 等n 。2 3 采用共价键和的方式将h r p 及g o d 同时修饰于纳米金管电极上制各 了测定葡萄糖的双酶生物传感器，工作电位降至一0 2 v 。f e r n a n d o n 叫首先将金电极浸 泡在二硫代羧酸醮及二甲基亚砜溶液中2 0 分钟进行用蘸活化，然后将醮化焉的电极 与h r p 酶按触1 5 小时，最后用戊二醛将g o d 交联到h r p 修饰的金电极上制备h r p - g o d 双酶传感器。c o r v i s 等n 0 4 3 通过物理吸附的方式将h r p 及g o d 酶共同固定在修饰有裂 褶菌疏水蛋白的玻碳电极表面，提供了一种制备双酶传感器的简便方法。l e i 1 0 5 l 首先 9 舻妒 矽 融 鳓 如 p p 袋 r h h廷 峨 ，印 参 ：塞 x x a g g s， 参 螂 一 c u 畦 磐 咖 霹抛弃型甍萄耱生辏媸感器的辨究第一章裁言 将壳聚糖修饰子玻碳电极表面，褥皇组装一层金纳米，然后将电极浸入h r p 酶溶液 中8 小时自组装酶分子，制各的测定双氧冰的单酶电极，其又将g o d 酶溶液涂于 h r p 酶电极上制备饿了测定葡萄糖的双酶传感器。 张雯艳等n 嘲采用溶胶一凝胶法将含有葡萄糖氧化酶的聚吡咯薄膜修饰到含有h r p 酶和媒介体的碳陶瓷毫极表面，发展了一种新型双酶安培检测葡萄糖传感器，对葡萄 糖检测的线性范圈为8 。0 1 0 啃- 1 。3 1 。g u 垂r e n t e n 嘲用溶胶凝胶将h r p 和g o d 及石 墨粉同时固定在玻碳电极上，制作了不含媒介体的双酶生物传感器。 1 4 可抛弃型生物传感器 近凡十年来，葡萄糖传感器的研究取褥了令人瞩是的成果。但多数研究以国体碳 电极和贵金属电极为基础电极，制作工艺只适合专业实验室，难于得到实际的推广应 用。新型的应用g o d 的葡萄糖传感器不断向多功能化、高灵敏度化和微型化方面发展。 普通酶电极的性能和寿命受反复使用过程中固定化酶的渗漏及酶活性