（果树学专业论文）草莓叶片不定芽发生及抗生素对其影响的研究.pdf

摘要 本研究以四川主栽草莓品种丰香和章姬的无菌试管苗为材料，在前 期工作的基础上，分别设置了四种植物生长调节剂组合对其进行不定芽诱导研究 同时探讨了暗培养、硝酸银对章姬草莓叶片不定芽再生的影响，并在获得丰 香和章姬叶片最高不定芽诱导率的培养基上进行了抗生素影响试验，其试 验结果如下： 1 在分别设置的四个处理中，通过比较不定芽再生率及不定芽的质量，获得了 丰香和章姬不定芽再生的最佳生长调节剂的组合和最高再生率分别 是： 丰香：m s + t d z 2 0n a g l “+ i b a 0 6 m g l ，不定芽再生率8 8 9 6 。 章姬：m s + t d z2 0m g l 。+ i b a 0 8 m g l - 1 ，不定芽再生率2 1 6 7 。 2 暗培养使章姬草莓叶片愈伤组织增多，但转入光下后极易褐化。暗培养 时间越长，褐化越严重。同时，暗培养后章姬叶片不定芽再生被明显的 抑制，而且随暗培养时间加长，其抑制作用越显著。 3 在培养基中添 j 1 2 5 1 0 0m g l 的a g n 0 3 后，章姬叶片的不定芽发生提 前7 1 2 d ，而且再生频率和再生芽数也不同程度的提高。同时，随着a 斟0 3 浓度的增大，其促进效应更明显。在添加1 0 0m g l 1 的a g n 0 3 的培养基中， 章姬叶片的不定芽再生率显著提高，达7 0 ，且不定芽发生质量较好。 但进一步提高a g n 0 3 浓度，章姬叶片不定芽发生受抑制。 4 抑菌性抗生素头孢霉素( c c f o t a x i m e ，c e f ) 、氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) 、 青霉素g 钠盐( p e n i c i l l i ng ，p e ng ) 和羧苄青霉素( c a r b e n i c i l l i n ，c r b ) 的 加入使草莓叶片不定芽发生时间推迟1 0 1 5 d 。p e ng 对草莓愈伤组织的发生 无影响或影响最小。c e f a m p 和c r b 对草莓愈伤组织的发生都有很强的抑制 作用，且随其浓度的增大，抑制作用增强。在相同浓度下，c e f 对草莓不定 芽的发生影响较小，c r b 对草莓不定芽再生的影响最大。c r b 、a m p 和p e ng 在2 5m g l 。1 时就显著或极显著地抑制草莓叶片不定芽的再生，而c e f 在5 0 或 1 5 0m g l _ l 时才分别显著地抑制章姬和丰香草莓叶片不定芽的再生。 5 丰香和章姬草莓叶片对硫酸卡那霉素( k a n a m y c i ns u l f a t e ，k m ) 和 新霉素( n e o m y c i n ，n c o ) 都敏感。k m 和n e o 在低浓度( 5m g l 。1 ) 时就极 显著抑制丰香和章姬愈伤组织的发生和完全抑制不定芽的再生。k m 在1 0n a g - l - 1 g l n e o 在1 5m g l 。1 时完全抑制丰香愈伤组织的发生，k m 在1 5 m g l “和n e o 在3 0m g - l 1 时完全抑制章姬愈伤组织的发生。观察发现， k m 浓度为5m g l 1 时就使丰香的一部分叶片发生黄化，随浓度的升高， 毒害作用加强，到浓度3 0m g l d 时，叶片全部白化，3 周内全部死亡。而n e o 在3 0n a g l - 1 时虽然丰香和章姬叶片没有愈伤组织和不定芽发生，但 叶片仍能保持绿色。 关键词：草莓( f r a g a r i a a n a n a s s a d u c h ) ：叶片培养；不定芽再生；抗生素 s t u d y o ns h o o t r e g e n e r a t i o nf r o ml e a v e so fs t r a w b e r r y a n de f f e c t so fa n t i b i o t i c so ni t w a n g m e i ( c o l l e g eo f f o r e s t r y a n d h o r t i c u l t u r e ，s i c h u a n a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ，y a a n ， s i c h u a n ，c h i n a ，6 2 5 0 1 4 ) a b s t r a c t s t e r i l i z e ds e e d l i n g so fs t r a w b e r r yc u l t i v a r t o y o n a k a a n d z o j i i ns i c h u a nw e r e u s e da sm a t e r i a l s o nt h eb a s i so fp r e v i o u sw o r k ，a d v e n t i t i o u sb u d si n d u c t i o nw i t h4 k i n d so fc o m b i n a t i o n so fp g r ( p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r s ) a n de f f e c t so fd a r k c u l t i v a t i o n ，c o n c e n t r a t i o no fa g n 0 3o na d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o no fl e a v e sf r o m z o j i w e r es t u d i e d t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tk i n d so fa n t i b i o t i c sw e r es t u d i a do nt h e r e s p e c t i v em e d i u mw i t ht h eh i g h e s tr a t eo fs h o o tr e g e n e r a t i o n t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： f i r s t ，b yc o m p a r i n gt h er a t e so fa d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o na n dt h e i rq u a l i t y i nf o u rt r e a t m e n t s ，i tc a m et ot h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n ：m sm e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t l l2 0n a g l - 1t d za n d0 6m g l 一1i b aw a sm o s te f f e c t i v ef o r t o y o n o k a 、i t l lt h e r e g e n e r a t i o nr a t eo f8 8 9 6 ，w h i l et h eb e s tc o m b i n a t i o no fp g rf o r z o j i w a s2 0 m g l t d z a n d 0 8 m g l i b a w i t h 2 1 6 7 r e g e n e r a t i o nr a t eo f a d v e n t i t i o u sb u d s s e c o n d ，d a r k - c u l t i v a t i o nc o u l di m p r o v ec a l l u si n d u c t i o no f z o j i ，b u tt h ec a l l u s g o tb r o w ne a s i l ya f t e rb e i n ge x p o s e dt ol i g h t t h el o n g e rt h ed a r kp e r i o dv c a s ，t h e m o r gs e r i o u s l yt h ec a l l u sg o tb r o w n i nc o m p a r i s o nw i t hd a r k - f r e e ，t h eb u d r e g e n e r a t i o no f z o j i w a si n h i b i t e do b v i o u s l yb yd a r k c u l t i v a t i o na n dg o tm o r ea n d m o r es i g n i f i c a n tw i t ht h ed a r k c u l t i v a t i o np r o l o n g i n g t h i r d ，f o rz o j i ，t h ea d d i t i o no fa g n v a r i e df r o m2 5m g l t o1 0 0m g l 1t o t h em e d i u mc o u l db r i n gf o r w a r dt h ed a t eo fs h o o t s a p p e a r a n c ef r o m7t o1 2d a y s w h a t sm o r e ，t h er a t ea n dt h en u m b e ro fa d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o np e rl e a fw e r e i m p r o v e da n dt h e e f f e c tw a sm o r eo b v i o u sw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fa g n 0 3 i n c r e a s i n g ，t h er a t eo fs h o o tr e g e n e r a t i o nc o u l dr e a c h7 0 w i t hb e t t e rs h o o tq u a l i t y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fa g n 0 3w a si m p r o v e dt o1 0 0m g l i ft h ec o n c e n t r a t i o n o fa g n 0 3w a sa b o v e1 0 0m g l ，t h ee m e r g e n c eo fa d v e n t i t i o u sb u dw o u l db e i n h i b i t e d f o u r t h t h es h o o t s a p p e a r a n c ew a sd e l a y e df r o m1 0t o1 5d a y sw i 廿lt h ea d d i t i o n o fc e f , a m p ，p e nga n dc r b p e ngh a dn oe f f e c to rs l i g h te f f e c to nc a l l u si n d u c t i o n ， w h i l ec e f , a m pa n dc r bi n h i b i t e dc a l l u si n d u c t i o ns i g n i f i c a n t l ya n di t si n h i b i t i o n i m p r o v e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g c e fh a dt h el e a s ti n h i b i t i o na n dc r bh a d t h em o s to nt h ea d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o nw i t ht h es a n l ea n t i b i o t i c sc o n c e n t r a t i o n 矿h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s 敏2 5m g l 1 ，a m p ，c r ba n dp e ngh a di n h i b i t e dt h er a t e o fa d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o n s i g n i f i c a n t l yo rv e r ys i g n i f i c a n t l y , w h i l ec e f i n h i b i t e ds h o o tr e g e n e r a t i o no fl e a v e sf r o m s t r a w b e r r y t o y o n o k a o r z o j i s i g n i f i c a n t l ya t5 0m g l a n d15 0m g - l 1r e s p e c t i v e l y f j f i h t o y o n o k a a n d z o j i w e r es e n s i t i v et ok m a n dn e o b o t hk ma n dn e o i n h i b i t e dc a l l u si n d u c t i o nv e r ys i g n i f i c a n t l ya n dc o m p l e t e l yi n h i b i t e da d v e n t i t i o u s b u d sr e g e n e r a t i o na tl o wc o n c e n t r a t i o n ( 5m g l “) t h ec a l l u si n d u c t i o no f t o y o n o k a w a sc o m p l e t e l yi n h i b i t e dw h e nk mw a sa t1 0m g l - 1o rn e ow a sa t1 5m g - l 一a n d t h es a r f l eh a p p e n e dt o z o j i w h e nk mw a sa t1 5m g l o rn e ow a sa t3 0m g l i t w a sd i s c o v e r e dt h a tk mc a u s e ds o m el e a v e so f t o y o n o k a t ot u r ny e l l o ww h e ni t s c o n c e n t r a t i o nw a sa t5m g l a n dt h et o x i c i t ye n h a n c e d 诚也i t sc o n c e n t r a t i o n i n c r e a s i n g k mm a d e t o y o n o k a l e a v e sa l lw h i t ea n dd i ew i t h i nt h r e ew e e k sa t3 0 m g l h o w e v e r , w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fn e ow a si m p r o v e dt o 3 0m g l 一1t h e l e a v e so f t o y o n o k a a n d z o j i k e p tg r e e na l t h o u g ht h ef r e q u e n c yo fc a l l u si n d u c t i o n a n da d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t i o nw e r ez e r o k e y w o r d s ：s t r a w b e r r y ( f r a g a r i a a n a n a s s a d u c h ) ：l e a v e s c u l t u r e ；a d v e n t i t i o u s b u d sr e g e n e r a t i o n ；a n t i b i o t i c s 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 王界每 加f 年月。 7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解i tj i i 农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：王养每 导师签名澎艨 “西年f 月o ) 7 日 ( 啦严年卉日 i 刖青 草莓( f a g a r i aa n a n a s s ad u c h ) 属于蔷薇科( r o s a c e a e ) 草莓属( f a g a r i a ) 多年生草本植物，园艺学分类属浆果类，在世界浆果生产中的总产量和总面积仅 次于葡萄，居世界第二位。草莓具有较高的营养价值和经济价值，因其成熟浆果 鲜红艳丽，柔软多汁，香味浓郁，酸甜可口，营养丰富，深受国内外消费者的欢 迎。草莓已成为我国各地发展农村经济、促进农民增收的重要经济作物【1 l 。近年 来，我国的草莓育种和生产等方面得到了迅速的发展，系列新品种不断推出，栽 培面积也迅速扩大。但由于病毒病、真菌病和细菌病的严重危害，草莓的产量和 品质受到了极大的影响。生产上急需品质好、产量高和抗性强的优良新品种。由 于草莓的高杂和性和多倍性给常规育种带来了周期长、工作量大和效率低等问 题，使得草莓育种改良工作进展缓慢。随着农业生物技术的发展，利用植物基因 工程技术可以不受上述因素的限制，极大地推动了草莓育种工作的进程。自2 0 世 纪8 0 年代末以来，各国学者对草莓转基因研究的离体再生体系的研究取得了一定 的进展，一些草莓获得了高效再生体系，促进了草莓遗传转化的研究，为用生物 技术的手段改良革莓品种奠定了一定的基础刚o l 。 2 文献综述 2 。1 草莓叶片培养主要研究进展 从8 0 年代开始，国外的些实验室开始了草莓的基因转化研究。自1 9 9 0 年以 来，国内外已陆续有了一些文献报道，草莓成为继核桃、苹果之后第三个获得转 基因植株的果树。目前应用于草莓上的基因导入法主要是农杆菌介导的叶盘法 1 1 1 , 1 2 l 。利用该法时，由于共培养中农杆菌的侵染和抗生素的作用等因素的影响会 导致转化外植体和非转化外植体的再生率有不同程度的降低，即植物基因转化率 较低。因此，以叶盘法获得转基因草莓新品种的前提条件就是要建立一个高频、 稳定的再生受体系统。n e h r a ( 1 9 8 9 ) 等建立了由草莓叶盘直接再生不定芽的技 术，每一个叶盘平均可产生1 3 个不定芽，r e d c o a t 再生频率达9 4 。此后，许多 学者对叶片再生体系做了研究，1 s e a 1 4 1 、张志宏1 1 5 , 1 6 1 、于冬梅【1 7 1 、w a w r z y n c z a k 1 乳、 邓掣19 1 、p a s s e y 2 0 1 、魏源文【2 ”、张利义【2 2 1 、陈琴芳吲和吴雪梅冽等相继以多种 草莓的叶片为材料成功诱导出了不定芽，获得了m 1 4 、弗吉尼亚、丰香 和r 全明星等品种的高频再生受体系统。宋国庆口5 1 、张红梅口6 1 、孙崇波1 ”1 、闰 华晓【2 8 】、蔡宝宏口9 】和胡繁荣口川等也成功获得了草莓叶片再生植株，但再生频率不 高。目前，关于草莓叶片再生体系的研究很多，涉及品种也不少，但真正能建立 起商频再生体系的品种很少，许多学者对影响草莓再生率的因素进行了研究。研 究发现影响草莓叶片不定芽诱导的因素主要有基因型、外植体生理状态、基本培 养基、植物生长调节剂和培养条件等。 2 1 1 基因型 许多学者就基因型对草莓离体叶片不定芽诱导再生频率的影响作了一定的 研究，并认为草莓的基因型对叶盘不定芽诱导再生频率起着决定性的作用。 n e h r a 【l3 】等以r e d c o a t 、v e e s t a r 等品种为试材，比较了它们之间的不定芽再 生率，发现r e d c o a t 的再生率可达9 4 ，其它的均低于5 0 。邓馨等以长 虹、明磊和m 1 4 等五个品种为试材比较了它们的再生力，结果发现m 1 4 的再生率明显高于其他四个品种，以哈尼的再生率最低。张利义等口2 1 的实验 表明在相同条件下，全明星和弗吉尼亚的再生率分别可达8 6 6 和8 2 2 ， 而丰香的仅为1 5 6 。因此他们认为外植体本身的基因型是影响再生的内因。 闰华晓2 8 1 等在相同条件下比较丰香、鬼怒甘、北斗和弗吉尼亚四个 品种的出芽率，结果发现其出芽率分别为5 、8 、4 0 和6 0 ，分化率在品种 间差异显著。因此普遍认为基因型对草莓叶片的再生能力起决定性的作用。然而 被人们营遍认为再生力很弱的丰香，在胡繁荣t 3 0 l 的试验中不定芽再生率可达 5 2 8 ，张红梅【2 6 】和蔡宝宏 2 9 1 的实验中分别可达5 3 _ 3 和5 3 ，张志宏【1 6 以t d z 代替b a 后将丰香不定芽再生率提高到6 4 ，魏源文【4 1 1 和陈琴芳【矧的实验中 丰香的再生率分别达到8 8 和8 3 2 ，而吴雪梅 2 4 1 通过调节生长调节荆的种 类、浓度及配比，经1 4 d 暗培养处理后，丰香的再生率达到了9 0 1 。由此可 见，基因型对叶片再生力虽有一定的影响，但并非起决定性的作用，只要找到了 合适的培养基、合适的生长调节剂组合以及合适的培养条件等，就可刺激叶片的 不定芽高效再生。 2 1 2 外植体生理状态 于冬梅 1 7 】实验得出，叶龄在1 4 3 0 d 的叶片再生不定芽的频率高，以2 1 2 8 d 的叶龄最佳，再生率高达9 0 3 6 ，叶龄在3 0 d 以上，叶盘不定芽再生率普遍下降。 孙崇波【2 7 1 实验得出，3 0 d 以内苗龄的叶片再生频率和数量差异不显著，再生频率 都较高，在4 5 以上。叶龄越大再生频率越低，叶龄越小再生能力越强。陈琴芳 】的试验也认为，3 0 d 以内苗龄的叶片再生频率都较高，而以1 0 c l 左右叶龄再生能 力最强。牛建新【3 1 1 和郭素枝【3 2 1 等研究表明，试管苗完全展开的叶切片效果最差， 而越嫩的叶切片产生不定芽的诱导率越高。 同一叶片不同部位的不定芽再生能力也不同，p a s s e y 2 0 1 、w a w r z y n e z a k j s j 和胡繁荣等【3 0 】研究认为叶片不同部位再生能力差异较大：托叶 叶柄 带叶脉叶 片 不带叶脉叶片。 2 1 3 基本培养基 应用于草莓叶片再生的基本培养基较多，有m s 、m s + b 5 ( m s 培养基中无机 盐成分附 j i i b 5 培养基中有机成分) 、改良m s 、l s 、g 、m t 等。n e h r a ”1 和邓馨【1 9 】 等以m s + b 5 为基本培养基建立了r e d c o a t 和m 1 4 的高频再生体系。许多 已建立高频再生体系的草莓品种都n m s 为基本培养基。张志宏1 1 5 , t 6 1 、于冬梅”7 1 、 魏源文【甜1 、陈琴芳口引、吴雪梅1 2 4 1 和张利义【2 2 1 等均以m s 为基本培养基，建立了 弗吉尼亚、m 1 4 、丰香和全明星的不定芽高频再生体系。 2 1 4 植物生长调节剂 对于叶片再生而言，一旦外植体确定，影响其再生的关键因素即为激素。在 有关文献报道中，绝大多数都有植物生长调节剂方面的研究，不同品神对植物生 长调节剂种类及浓度要求不同。于冬梅【1 7 】实验中，m 1 4 叶盘在6 - b a 和i a a 的 组合下，随着6 - b a i a a 浓度之比增大( 2 2 5 1 7 5 ，2 5 1 2 0 和3 o 1 5 m g l 1 m g l 1 ) ， 叶盘再生芽频率也增加( 5 4 ，5 5 ，6 7 5 0 和7 0 9 7 ) ，但尚未达到8 0 。以2 ，4 一d 代替i a a ，其浓度组合中6 - b a 3 0m g l ，2 ，4 一d o 2m g - l 。对m 1 4 叶盘 再生芽的诱导效果最好，不定芽诱导率达9 4 “。 与大多数植物一样，草莓叶片对不同生长素类物质的反应也不同。在草莓叶 片诱导不定芽的实验中绝大多数都以i a a 作为生长素。宋国庆1 2 5 1 和牛建新3 1 1 等证 实，叶盘诱导不定芽再生过程中应用i a a l i ：i b a 效果好。吴雪梅【2 4 1 的试验则认为， i a a 的效果不及i b a 和n a a 。轲善强【3 3 i 的试验结果表明，n a a 的效果较i a a 为佳， 但只有n a a 和6 一b a 的适当浓度组合才能使草莓叶片诱导不定芽。 草莓离体叶片的不定芽诱导中常用的细胞分裂素是6 一b a 和t d z ，还有z t 和 k t 。而t d z ( 噻重氮苯基脲) 自8 0 年代以来，被广泛应用于植物组织培养，作为 种活性较b a i 高的多的细胞分裂素在草莓离体叶片诱导上已经开始得到广泛的 应用。张志宏l l6 】以t d z 代替6 一b a ，使m 1 4 的叶盘再生率高达1 0 0 ，而在获 得丰香高频再生体系的试验中，都是使用的t o z t 2 1 , 2 3 2 , q ，张利义【2 2 1 在获得全 明星和弗吉尼亚的高频再生体系中细胞分裂素也是使用的t d z 。然而于冬 梅f 17 j 等指出，在组织培养中应用低浓度的t d z 的确可促进细胞分裂分化，还可以 缩短不定芽再生的时间：但同时会导致不定芽密集丛生、不易分离、芽成苗困难， 而且玻璃化现象严重。与6 - b a 交替使用，可在一定程度上弥补不足。 2 ，1 5 附加物 目前研究的最多的附加物是a g n 0 3 。a g n 0 3 作为乙烯的抑制剂，对玉米、番 茄、烟草及芸苔属蔬菜有促进组织或器官再生植株的作用1 3 4 , 3 5 。 宋国庆【2 5 】首次将a g n 0 3 应用于草莓离体叶片不定芽诱导中，发现| a g n 0 3 也有 促进草莓叶片不定芽再生的作用，但在不同阶段所起的作用不同：在叶盘愈伤组 织诱导起施用，能促进不定芽的直接再生；在愈伤组织诱导后旌用，能显著地提 高不定芽的再生率。陈琴芳j 实验表明，当a g n o 浓度为8m g l 。时，丰香和 章姬的再生率分别提高1 1 2 和1 5 7 - 个百分点，且外植体无褐化现象。但是张 利义【2 2 】和闫华晓【2 8 1 实捌a g n 0 3 x 寸弗吉尼亚的再生有明显的抑制作用。 陈喜文等【3 6 】研究表明，a g n 0 3 ：对乙烯的积累起一定的抑制作用，特别是降低 中后期( 芽分化期) 培养容器中乙烯的浓度，降低了乙烯对芽发生的抑制，从而 促进不定芽发生。张鹏【3 7 1 等研究认为，a g + 作为一种乙烯活性抑制剂，并非抑制 乙烯的合成，而是由于a r 的存在使乙烯不能干扰多胺的合成，而多胺的合成有 利于体细胞胚和芽的发生。钟名其等【3 础在桑幼叶培养过程中也发现a g n 0 3 处理乙 烯产量明显比对照区增加，也说明a 一对桑叶片不定芽分化的促送作用，并不是 因为抑制了乙烯的合成与释放。 水解酪蛋白( c h ) 作为一种有机氮物质，被认为对外植体的生长及分化有 一定的促进作用，在组培试验中广泛应用。l i u 3 9 ；芷试验中将水解酪蛋白( c h ) 的量增加到6 0 0m g l 1 ，促进了全明星草莓叶片的不定芽爵生。而在诱导v i l a n o v a 草莓的叶片分化时，c h 的加入降低了其不定芽的再生率，且以c h 和t d z 配合使用还降低了愈伤组织的发生率 4 0 】。 4 2 1 ，6 培养条件 2 1 6 1 预培养和暗培养 不同的培养条件对叶片外植体不定芽的分化也有影响。s o r v a r i | 4 i 】以两个草莓 品种的叶片在g 培养基上进行预培养，然后再置于分化培养基上培养后发现，将 h i k u 和j o n s o k 先在g + 6 一b a 0 ，5m g l + g a 3 0 2m g l 。培养基上顸培养4 周 后，再用分化培养基诱导，不定芽的再生频率大幅度提高。但仅嚣于未添加任何 植物生长调节剂的g 培养基上预培养，其再生频率未发生改变。 暗培养在许多植物( 如梨，苹果) 的离体叶片培养中都可以促进不定芽的高 效再生。这一点在许多草莓的离体叶片不定芽诱导试验中也得到了证实。i s a c i l 4 1 将材料接种后，先暗培养2 周，再进行光培养，有利于a i k o 、d a n a 、g o r e l l a 和p m m i a l 四个草莓品种愈伤组织的形成。与此相似，牛建新【3 0 矛1 b a r c e l o l 4 2 1 分别将材料先暗培养1 周或2 周，再进行光培养，有利新明星和c a n d l e r 叶 片的不定芽发生。对此结果，牛建新【4 1 】推测可能是由于生长素i a a 在光下易分解， 而先暗培养减少了分解，提高了i a a 的浓度，从而有利于不定芽的分化。但张志 宏1 6 l 的研究表明，弗吉尼亚草莓叶片接种后先进行两周暗培养未能提高叶 片的不定芽再生频率。于冬梅【1 7 1 对5 个草莓品种进行的比较试验还发现，对于不 同的基因型暗培养的作用效果也有所差异。张利义【2 2 】试验表明，在前期暗培养7 t o d 后转入光下培养可减轻或避免褐化，完全暗培养则再生率大大降低，且分化 出的苗十分细弱。在自然光照下不仅再生苗好，而且没有玻璃化苗。 2 1 6 2 放置方式 外植体与培养基的接触方式对叶片不定芽再生也有影响，且以叶盘背面向下 与培养基接触有利于不定芽的发生。n e h r a 1 1 1 3 1 、于冬梅1 7 1 和宋国庆【2 5 1 的试验均 证实了这一点。一般认为，造成这种差异的原因是叶背面气孔较多、组织疏松和 角质层发达，有利于营养的吸收。王文和等【4 3 】对草莓叶片愈伤组织形成及再生芽 分化的组织学研究表明，叶片以维管束周围的薄壁细胞及叶肉表皮或下表皮细胞 再生不定芽为主，从形态解剖结构上为这一解释提供了一定的支持依据。李英慧 4 4 1 的试验采用了叶盘正面向下置于培养基上的放置方式也取得了良好效果。张志 宏1 1 5 - 1 6 1 和闰华晓【2 8 】的试验中，外植体与培养基接触方式( 叶片正面与培养基接 触或背面与培养基接触) 对草莓叶片不定芽再生率也没有显著影响。 2 2 抗生素在植物组织培养及遗传转化中的应用 2 2 1 抗生素在植物组织培养中的抑菌应用 在植物组织培养过程中，试管苗常常会受到各种真菌或细菌的污染，因而常 常在培养基中添加不同的抗生素来抑毒4 污染。方志明【4 5 i 和马春红脚1 等在马铃薯脱 毒试管苗染菌的培养基中加入羧苄青霉素( c a r b e n i e i l l i n ，c r b ) 后明显抑制了细菌 繁殖，极大地改善了试管苗生长情况。黄惜等m 证明青霉素( p e n i c i l l i n ，p e n ) 对香蕉组培苗的某种细菌具有较强杀伤作用，且对香蕉苗没有明显副作用。王亦 菲【4 8 】等的实验表明，2 0 0m g l 1 的青霉素g 钾盐( p e n i c i l l i ngk a l i u m ) 对彩色海芋 组培中的内生菌抑制的效果最为明显，且不影响组培苗的正常生长。唐智明等 4 9 1 试验表明，在制食用菌母种中加入链霉素( s t r e p t o m y c i n ，s t r e p ) 既达到抑菌的 目的又不影响菌丝生长。黄小荣【5 0 】等实验证明p e n i c i l l i n f l b 较好抑制香水自掌组培 苗中的细菌。陈大成等【5 1 】对沙田柚外植体分化及生长的影响实验表明，c r b 及头 孢霉索( c e f o t a x i m e ，c e f ) 浓度为3 0 0 4 0 0m g - l 1 时挪菌效果较好，对外植体的 生长和分化影响亦较小。 2 2 2 抗生素在遗传转化中的作用 2 2 2 1 在遗传转化中作为抑菌剂使用 植物基因工程是将目的基因导入植物，按预定方向改变植物的基因型、改良 植物性状，获得稳定遗传的新品种和新种质的技术，已发明了多种向植物中转基 因的方法。对双子叶植物而言，常采用的转化方法是农杆菌介导的遗传转化。农 杆菌易过度生长，造成污染。当植物材料受农杆菌浸染后，需用抗生素如青霉素 和头孢霉素类抗生素及时有效地杀死和抑制细菌，以防细菌严重为害植物组织的 生长和分化。其中杀菌和抑菌效果最好的是c e f 、c r b ，c e f 是农杆菌介导的转化 中广泛使用的杀菌剂，对大多数菌株的杀菌效果好【”1 。唐东芹5 3 】等选择c e f 作为 百合抑菌性抗生素进行敏感性实验，结果c e 饼不抑制植物细胞正常生长，能使 外植体形成愈伤组织或分化出不定芽，其选择压在2 5 0m g - l 。1 时即可达到较好抑 菌效果。其实验还证明可用同样选择压的c r b 代替c e f 使用。张松和达克东等1 5 4 l 筛选出羧吩青霉素( t i m e n f i n ) 做韭菜组培中农杆菌的抑制剂。张智俊【5 5 1 等用2 0 0 4 0 0m g l 。浓度范围内的氨苄青霉素( a m p i c i l l i ns o d i u m ，a m p ) 很好地抑制农杆 菌过渡生长造成的污染，且对甜瓜植株再生的影响较小。 6 2 2 2 2 遗传转化中作选择性抗生素 自从1 9 7 8 年m a n o n 等人【5 6 】应用农杆菌t i 质粒为载体第一次成功地将外源基 因转入烟草后，植物基因工程载体在植物遗传转化操作中的应用取得了很大发 展。人们利用t i 质粒这一植物基因工程的载体，可以将外源基因导入到植物的细 胞中，并使其得到表达，以达到改造植物并创造新的植物类型的目的。为了确定 外源基因是否已导入植物细胞，必须对假定的转化体进行筛选和鉴定5 7 1 。为了把 转化体筛选出来，一般在转化质粒中构建一个以上的选择标记基因f 5 叭。在植物基 因工程和遗传转化中经常使用抗生素抗性基因作为选择标记。常用的选择标记基 因有新霉素磷酸转移酶( n p t i i ) 基因，氯霉紊乙酰转移酶( c a t ) 基因和潮霉素 磷酸转移酶( h p t ) 基因等【5 ”。其中来自大肠杆菌的氨基糖苷3 磷酸转移酶 ( n p t i i ) 是最常见的一种【6 2 】。n p t i i 作为抗性标记基因，一般与目的基因连锁在 一起，可赋予转基因植物对氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素( k a n a m y c i n ，k m ) 、 新霉素( n e o m y c i n ，n e o ) 和0 4 1 8 ( 庆大霉素的衍生物g e n e t i c i n ) 等产生抗性， 抑制n n 等与植物细胞叶绿体和线粒体核糖体结合，保证叶绿体和线粒体蛋白质 的正常合成和幼苗的正常绿色，而非转基因植物由于缺乏n p t i i ，能够引起诸如 烟草、棉花、油菜等多种植物绿色器官黄化 6 3 , 6 4 。因而可利用抗生素来筛选转化 细胞( 植株) 与非转化细胞( 植株) 。 目前，植物基因工程中最常用的选择抗生素是k m 。许多双子叶植物的转化 细胞，如烟草、番茄、马铃薯等，还有一些单子叶植物的转化细胞都用k m 来筛 选1 6 5 1 。目前已在多种材料上试验得出适合的浓度。黄萍【删试验得出，在猕猴桃遗 传转化中，使用k m 作为选择剂，其用量应在2 0 5 0m g l 。胡桂兵【67 】等的试验 结果表明，台湾青枣愈伤组织对k m 敏感，一定浓度的k m 能有效地抑制胚性愈伤 组织的生长，转化处理的愈伤组织可采用培养基中附加2 5 7 5m g l - 1 的k m 来筛 选转化细胞，在芽或苗期用7 5m g - l d 作为选择压力比较合适。张智俊等【5 5 】试验表 明：k m 对甜瓜愈伤组织、不定芽分化及生根均有明显的抑制作用，7 5m g - l 。的 k m 可作为今后甜瓜遗传转化筛选转化体和非转化体的临界浓度。杨广东【6 引等试 验表明，在农杆菌介导的基因转化中对大白菜转化苗筛选的k m 浓度在1 0m g l 。 左右是最适用的。罗素兰等 6 0 l 的试验表明，在番茄组培的不同阶段，不同外植体 对k m 的反应存在较大的差异。以下胚轴出愈对k i n 反应最敏感，子叶出愈和生根 阶段对其反应迟钝。因此建议在番茄遗传转化中，k m 对子叶出愈和生根阶段的 7 筛选质量浓度为1 0 0m g ，l 一，对下胚轴出愈用5 0n a g l ，对芽分化及其生长用7 0 m g l 。申琳【6 l 】等试验表明，叶盘法转化番茄子叶时k m 以5 0m g l 。1 为宣。唐东 芹1 5 3 】等通过试验确定了东方百合不同外植体适宜的抗生素筛选浓度：k m 筛选浓 度为鳞片7 5m g l - 1 ，小鳞片叶为1 2 0m g l ，小叶柄为7 5m g l 一，小叶片为5 0 m g - l 一。杨惠杰等吲对水稻的试验表明，5 0m g l 1 的i 洫可作为检测是否导入了抗 k m 基因的选择剂量。王丹等1 6 8 1 的试验表明k i n 浓度以1 5 2 5m g l 1 作为马铃薯叶 圆片转化时的选择压更合适。赵姝华等 6 9 】试验表明，k m 对玉米种子的筛选浓度 应定在6 0 0 1 1 0 0m g l 。1 范围内。对水稻种子的筛选浓度定在6 0 1 0 0m g l 。范围 内比较适合，应因品种不同，选取适当筛选浓度。而杜天奎【7 0 】等的实验表明：分 子育种过程中采用k m 作选择抗生素不太理想，未经转化的春小麦对k m 不敏感。 2 2 3 抗生素对组培材料生长分化等的影响 k m 、c e f 等对组培材料的生长和分化等具抑制作用，少数抗生素女f l a m p 对组 培材料的生长发育等具促进作用。 陈大成等【5 1 对沙田柚子叶、上胚轴、下胚轴的分化及新梢生长的影响试验结 果表明：培养基中k m 浓度超过5 0n a g l 。1 时，不利于产生愈伤组织，也不利于上 下胚轴形成不定芽，k m 浓度大于7 5m g l 1 ，明显抑制愈伤组织的分化和新梢的 生长。张松和达克东等 s 4 1 试验表明k m 浓度对植株再生有很强的抑制作用，在k m 为2 0n a g l - 1 时就完全抑制愈伤组织和不定芽的发生，t i m e n t i n 对愈伤组织和芽的 分化影响不大。杨广东等【6 2 】试验表明：g p 。1 1 种子在含有2 0 0m g l 。k m 的m s 培养 基上发芽生长时，幼苗子叶完全黄化，侧根数为0 ，随k m 浓度的升高，芽、主根 和侧根生长均受到一定程度的抑制，但发芽率和发芽势不受影响。张松和温孚江 等【5 2 l 试验表明，k m 严重抑制根和芽的形态发生，c e 髓烈抑制再分化，并有推迟 芽和根形态发生的作用。c r b 对根和芽的分化无明显的抑制作用，而a m p 对根和 芽的分化有显著的促进作用，当a m p 为1 0 0 0m g l - 1 时，芽分化频率达9 6 6 7 。c r b 和a m p 也有缩短再分化进程的作用。唐巍等 7 1 1 试验得出，5 0 0m g l 。1 c r b 和2 m g l 一6 b am g l 1 i b a 的组合导致转基因火炬松愈伤组织的生长提高5 4 2 ，分化 提高4 5 7 。5 0 0m g t l - 1c l a f o r a n 和2m g l 1 6 一b a 0 5m g l 。i b a 的组合导致转基因愈 伤组织的生长提高4 0 8 ，分化提高3 8 7 。而高浓度的植物激素和抗生素降低了 转基因愈伤组织的生长和分化。许明辉等58 】利用不同浓度的抗生素g 4 1 8 胁迫条