（分析化学专业论文）金属元素与细胞膜键合特性研究镧与细胞膜的研究.pdf

中国科学技术大学研究生院( 台肥) 颁士学位论文 致谢 本论文的选题和具体的硷文工作都是在黄碧霞副教授的精心指导下完成 的，我的论文中的每一个字都倾注了她的心血和汗水。 黄老师对待工作极其认真、一丝不苟的精神给我留下了深刻的印象；从她 那里我不仅得到了有关实验论文的具体指导，同时也得到了一个科学工作者和 教育工作者良好素质的榜样。黄老师的治学严谨，认真求实的敬业精神，深深 地感染着我，使我受益非浅。她不仅指导我的科研工作，而且在生活中给予我 慈母般的关怀。对此我表示衷心的感谢我从内心深处由衷地感谢她在三年的时 间里给予我的无私帮助和热情指导。 非常感谢苏庆德老师和宛寿康老师在学习和工作上给予我亲切的关怀和热 情的帮助，在此一并深表谢意。 感谢本实验室的谢晓梅、徐洛、周波勇等同学对我实验工作的大力支持 和帮助。 最后还要向孙玉刚博士、胡耀武博士、杨跃涛博士、詹金华博士、聂磊同 学、张雄同学、张宏伟同学、陈俊同学、和所有帮助过我的人表示诚挚的谢意。 谨以此文献给养育我的父母和所有关心我的人 2 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 颁士学位论文 摘要 t 怖土元素l a 是生物体的非必需金属元素。非必需金属元素进入细胞后，其 作用的靶部位常常是细胞膜，因此研究非必需金属元对生物体的影响时，应首 先研究这些元素与细胞膜的作用。近年来，稀土元素作为肥料在我国农业生产 领域广泛应用。尽管尚未证明稀土元素是否为植物的必需营养元素，但许多研 究表明，稀土元素对植物的生理功能有积极的影响。探讨稀土在植物体内的作 用机制对农业上更加科学合理的利用稀土具有特别重要的意义，而且对生态环 境保护也具有重大意义。 酋名丁本文探讨了在化学实验室的条件下研究金属元素在细胞膜上结合形 态的方法，包括：i ) 细胞中富含细胞膜组分样品的提取。2 ) 富含细胞膜组分 样品的分级分离( 包括h p l c 分离法与凝胶排阻分离法) 。3 ) 样品分离级分的 消化与检测。 进而利用我们所建立的这种方法 发现：稀士元素l a 结合到细胞膜上 量比膜蛋白的分子量大。 探讨了稀土l a 在细胞膜上的键合特性。 且与一非膜蛋白组分键合，该组分的分子 既然l a 键合到细胞膜上，其必然会影响膜的结构和功能。细胞膜的三大功 能之足控制细胞内外物质的交流。为此，本文还观察了l a 对大豆幼苗根c a 、 k 等元素代谢的影响，并讨论了其影响机制。 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 a b s t r a c t r e c e n t l y , r a r e e a r t he l e m e n t s ( r e e s ) h a v eb e e n w i d e l yu s e di n a g r i c u l t u r eo f o u rc o u n t r ya n dh a v er e c e i v e dm u c ha t t e n t i o n ，r a r ee a r t h e l e m e n t sh a v eb e e nk n o w nt oi n f l u e n c es o m ep h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s i n p l a n t s ，a l t h o u g h i ti sn o ta f f i r m e dt h a t t h e y a r ee s s e n t i a lo r n o n e s s e n t i a lm i n e r a l s i no r d e rt oe l u c i d a t et h e i rb i o l o g i c a lf u n c t i o n s a n d t o x i c i t y ，i ti sn e c e s s a r yt om a k e t h er e s e a r c ho ft h ed i s t r i b u t i o na n d t h es p e c i a t i o no fr a r ee a r t he l e m e n t si np l a n tc e l l s i nt h i s p a p e r , t h e d i s t r i b u t i o na n dt h e s p e c i a t i o n o ft h er a r ee a r t he l e m e n t sa n dt h e i r e f f e c t so nt h em e t a b o l i s mo fm i n e r a le l e m e n t si nt h er o o t so f s o y b e a n s e e d l i n gw e r ei n v e s t i g a t e d f i r s to fa l l ，i no r d e rt oe l u c i d a t et h es p e c i a t i o no ft h er e e si nc e l l p l a s m am e m b r a n e ，i nt h i sp a p e r , w ee s t a b l i s ham e t h o dw h i c hi sa d a p t f o rt h es p e c i a t i o no fr e e si np l a n tc e l lm e m b r a n ee a s i l ya n dq u i c k l y i n c l u d e ：1 ) e x t r a c tt h ee n r i c h e dp l a s m am e m b r a n es p e c i m e n 2 ) t h e m e t h o d so fs e p a r a t i o no fe n r i c h e dm e m b r a n es p e c i m e n ( i n c u d eh p l c a n dg e l s e c ) 3 ) e l e m e n t sd e t e r m i n a t i o na f t e rs e p a r a t i o no fe n r i c h e d m e m b r a n e s p e c i m e n 6 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 a l s ow eh a v ei n i t i a l l ye l u c i d a t e dt h es p e c i a t i o no fl ai np l a n tc e i l p l a s m am e m b r a n ew i t ht h i s m e t h o da n di n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a m a s ss p e c t r o s c o p y ( i c p m s ) l ah a se n t e r e dc e l l p l a s m am e m b r a n e ， a n d t h e yb e h a v ea san o n m e m b r a n ep r o t e i nf o r m t h i sf o r mm o l a c u l a r w e i g h tw a s h e a v i e rt h a nm e m b r a n ep r o t e i n a tt h es a m et i m et h e m e t h o do f i n g e s t i o no fs p e c i m e n sw a si n v e s t i g a t e di nd e t a i l a s l o n ga sl a i sb i n d i n gt ot h ec e l lm e m b r a n e ，i ts h o u l da f f e c tt h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fc e l lp l a s m am e m b r a n e i nc a s eo f c a l c i u m ，w e h a v ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fl ao ni ta n do t h e rf u n c t i o no f i n f a c t s 7 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕e 学位论文 第一部分文献综述 第一章稀土元素形态分析研究进展与现状 形态分析( s p e c i a t i o na n a l y s i s ) 是近年来国际上兴起的分析化学研究热点之 一，它是利用生物大分子的分离及检测手段和元素检测手段相结合的方法来研 究元素的化学形态。由于元素进入生物体系之后，可以与蛋白、酶、膜等结 合；进入环境体系的元素还可以和大分子有机物等结合；因此在生态环境和生 物化学领域研究元素的形态分析，将有助于阐明元素的环境生物化学行为、生 物可给性、生态和生理毒性效应。不难推测，这些研究可使环境科学和生物科 学某些交叉领域实现根本的突破。如s h a n gx i a o q u m l ，c h e nb i n 等首次提出的 生物可给性的慨念就是在深入研究了土壤中硫的形态及其与生物可给性的关系 的基础上提出的口1 。 近年来元素的化学形态分析研究取得了很大的进展，尤其是在细胞分布的 基础上研究其化学形态，还能为深入地为阐明元素的生物效应提供更加充分的 理论依据。 第一节稀土在细胞中的分布及结合形态研究 目前，研究元素在细胞中的形态和分布所用的方法一般都是物理的研究手 段如e x a f s 、原子力扫描遂道显微技术、电镜观察、x 射线能谱和x 射线微 区分析等方法【6 。9 】，以获取植物体内稀土元素周围存在的原子、价态、键长等信 息，以求探讨出稀土元素在植物体内真正存在状态。其中使用最为普遍的手段 是原子力扫描遂道显微技术和电镜观察，因为所有这些物理的分析方法一般都 是利用稀土离子具有在中性至碱性条件下生成沉淀、易为电子显微镜观察，达 到明确表示其细胞定位。所以在这方面我们见到的电子显微镜观察的报导最多。 但是在生物体内元素的生物活性成分通常是与生物大分子相( 如蛋白质、脂类、 多糖以及核酸等) 结合的形态，这些结合形态对稀土元素来说在中性至碱性条 件下就不一定能生成沉淀，从而难于为电镜等物理方法所检测到。因为稀土金 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 属离- - y ：$ n 生物大分字的结合一般都是形成了四级结构的空间配位关系1 ，所以 一旦结合上去，其它任何酸碱等小分子就难以再结合上去，一方面由于生物大 分子四级结构所造成的空间位阻效应，另一方面也由于稀土元素金属离子的与 生物大分子基团( 如羟基、羧基等) 的特定配位关系 15 1 所限定。 综上所述，用物理手段的研究，并不能全面反应生物体系的真实情况，要 深入全面地理解稀土元素的生物效应，还必须研究其化学形态，尤其是弄清稀 土是否与细胞膜结合。然而，传统的制备质膜的方法。不仅需要很多试剂。更 重要的是必须要有专门的超速离心机。 在细胞、亚细胞及分子水平上研究稀土元素在植物体内存在状态对研究稀 土的生物效应具有重要意义。稀土离子具有在中性至碱性条件下生成沉淀、易 为电子显微镜观察等特性，可用于植物的电镜研究，以明确表示细胞外空隙和 细胞透性标志的定位。q i a nj i a n g 等用电子显微镜发现，稀土元素l a 不能透过 质膜而沉积在细胞壁，沉积在外皮层细胞和邻近的薄壁细胞质膜的外表面上忡】， l a ”大部分分布于内纤维素膜( 松树) ，根的内表层阻止l a 进入中柱，凯氏带的 存在使l a “不能透过。从而解释了根部通过质外运输的稀土元素不能进入内皮 层，也就不能从木质部运输到地上部分而存在于质外体中的发现。当供给根系 o 0 0 1 m m o l 的l a c i ，5 小时后，用x 射线能谱分析检测了细胞壁、质膜和细胞器， 结果均未检测出有l a 的存在，供应0 1 m m o l 的l a c l ，2 0 小时后，则发现在根 分生细胞壁外侧之间有l a 的沉积 1 7 - 1 9 l 。 1 9 7 4 年n a g a h a s h i 等报道f 2 0 1 以在含l a 3 + 的溶液( p h 57 ) 中培育4 天的玉米幼 苗之初生根为材料，用电镜技术研究觊氏带对溶质从玉米根的皮层向中柱菲原 质体移动的屏障作用。仅在表皮、皮层、内皮层到凯氏带的细胞壁和细胞腰外 面发现有l a 的沉积。显示稀土元素l a 未能进入植物细胞内。钟淑琳等m 】 艮道 了白天然茶园从未喷施过稀土的新鲜茶叶中，分离出一种稀土一脂多糖，脂多 糖是主要由类脂和多糖结合在一起的大分子化合物，在植物体内，是构成植物 细胞壁的重要成份，表明稀土主要积累在细胞壁内。 吴兆明等m 1 研究了黄瓜根系对稀土的吸收和根系伤流的影响，发现随稀土 ( l a ，c e ) 处理时间的增长，伤流量均有增加的趋势：当稀土处理时间较短时，难 9 中国科学技术大学研究生院( 台肥) 硕士学位论文 以从伤流液中检出稀土，随着培养时间的延长，黄瓜根系中富集了较多的稀土， 伤流液中稀土含量也随之增加，但浓度仍很低( n m 1 ) ，反映了黄瓜植物对稀土 的运输很慢。认为与h a n z e l y 等【2 1 1 所观察的实验事实一致，即元素l a 沉积在细 胞壁内，以及在外皮层细胞和邻近的薄壁细胞质膜的外表面，不能通过质膜， 并推断稀土在黄瓜植物体内可能主要以细胞间的方式运输。常江吲研究了l a 对 水稻、小麦组织细胞透性的影响，得出l a 在低浓度下( o 5 m m o l l ) 则相反，高浓度l a 可从细胞中 大量地移了钙，这也许是膜透性增大的原因，因为c a 对质膜起着稳定性作用。 杨频等”3 1 认为：由于l 矿离子半径与c a 2 + 相近，l 矿可能结合在细胞膜上通常被 c a ”所占的位置上，并把c a 2 + 取代出来；由于l a 竞争性地结合质膜上钙结合位 点，从而改变了膜的钙结合位点的构型，或改变了膜内带电粒子的分布，或影 响到膜质完整性所需要物质的合成，从而改变了膜的性质的结构，导致膜透性 的增加，甚至细胞膜的破坏。邢金明等1 2 1 i 的研究表明：l a “或c e 4 + 的延缓叶片 衰老作用和c a 2 + 类似，认为可能是由于它们与膜相结合，而阻止了磷脂降解有 关。用光镜和电镜对比观察l a 、c e 以及c a 对马铃薯苗株超微结构( 细胞壁和 膜系统) 影响的研究表明口4 1 ：l a 或c e 可延缓缺c a 症状的发生，认为l a 或c e 在维持膜的完整性和细胞壁结构的整体上，和在一定时间内有代替钙的作用，c e 似乎稍优于l a 。 尽管大多数的报导都认为稀土分布在细胞膜之外，主要存在于细胞壁内， 不能进入细胞内，但也有稀土进入细胞的报道。胡海勤等【2 5 1 分别在百忙之中清 水和在5 0 m g l l a ”溶液中培养两周后，认为金鱼藻叶细胞叶绿体电镜切片照片 显示：与正常相比，5 0 m g l l a 3 + 金鱼藻叶细胞叶绿体片层结构已明显松散、破 坏，叶绿体膜皱折，内容物外渗，叶绿体濒于解体。这表明，高l a 3 + 对金鱼藻 叶绿体的破坏作用是造成金鱼藻失绿枯死的主要原因，其损伤机制可能有二种， 可能是l a 3 进入细胞直接与叶绿体蛋白结合或取代m 9 2 + 而改变叶绿体结构 1 2 6 , 2 7 ，也可能是l a ”直接与质膜a t p 酶形成配合物 2 8 1 使膜的透性增大甚至破裂， 从而造成细胞内容物流失 2 7 , 2 9 1 。 李齐【3 1 1 以不同浓度的c e 【n 0 ，) ，处理i 一9 0 杨根，再经快速冷冻干燥、塑料真 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 空渗透及怨包埋用透射电镜，分散型x 射线微分析对c e “离子在茎尖分生组 织和叶的不同组织中的细胞、细胞质、细胞核及叶绿体等亚细胞微区分布和含 量进行了测定，表明不但进入植物细胞而且在细胞核内有明显的富集。对于这 种方法所得到的稀土进入细胞的结论，从其方法的本身上来说可能也是不尽完 善的，因为这种用稀土溶液直处理生物样品而导致稀土进入细胞，到底是稀土 以正常的代谢途径通过细胞膜而进入细胞的，还是由于高的渗透压破坏了细胞 膜结构而进入细胞的，这一点还有待于进一步探讨，而不能非常肯定地说稀土 就进入了细胞。 综上所述，植物的细胞是由细胞壁、质膜和细胞内容物所组成的，前人的 研究已清楚表明稀土未能进入细胞内而沉积于细胞膜外，尤其是沉积细胞壁上。 然后种种迹象又表明稀土又的确影响细胞内的某些代谓f 活动。细胞膜是细胞进 行各种生命活动的重要结构基础，它和细胞骨架行成动态的空间结构。遗传物 质d n a 、r n a 等以及各种酶、各种活性因子和各种底物就是在这特定的空间 结构里进行各种生命活动。质膜上存在着大量的质子泵、离子通道、载体、蛋 白激酶、激素受体和其它一些受体等，因为这些蛋白质与植物物质运输、信息 传递存在蓿密切相关。这就意味着可能有少量的稀土与某些膜成分结合，改变 了膜的结构和功能所致。因此本论文的题目就定为稀土l a 在细胞膜上的结合形 态研究。 为了阐明稀土l a 与细胞膜的结合形态研究，还必须要研究细胞膜成分的提 取、分离及元素的检测方法等，下面就这三个方面分别进行综述。 中国科学技术大学研究生院( 台肥) 硕士学位论文 第二节提取分离技术在形态分析中的应用 一、离心分离的手段在分离细胞器与生物大分子方面的应用 先用各种方法将细胞破碎，如低渗、超声粉碎、强制过滤、匀浆或研磨。 这些方法都可以使细胞的许多膜结构( 如质膜、内质网膜、高尔基体膜等) 破 坏成片段，这些膜片段立即再封闭成小的封闭泡。使用这些方法，结合差速离 心即利用不同的离心速度所产生的离心力将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分 离开。将差速离心与密度梯度离心的手段相结合起来便可以达到相当精确的分 离 3 2 - 3 4 】。 二、细胞组分的选择性抽提 除了用物理的方法结和离心技术分离细胞组分以外，还可以用化学抽提法 选择性地抽提细胞的某些成分，然后抽提的成分和存留的成分可以分别用于分 析研究。 l 、抽提的基本原则 抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分提取分离的过程。 因此，首先要进行的是，样品的选取和前处理，样品的选取的基本原则是，有 效成分的含量多，稳定性好，来源丰富，保持新鲜：提取工艺简单；有综合利 用价值。一般室内栽培或野外采集的样品用水洗净后，保存在一4 3 0 冰箱中 保存备用；种子一般须泡涨或粉碎后才可使用。如材料中含油脂多，还要进行 脱脂处理9 ”。经过处理和破碎的原材料的有效成分，可以用缓冲溶液、稀酸、 有机溶剂( 如乙醇或丙醇等) 提取。有时换可以用蒸馏水提取【3 6 。一般理想的 提取应具备以下条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小，对杂质不溶解或溶 解度小；来源广泛，价格低廉，操作安全【3 7 1 。总的来说，提取的过程包括以下 过程：( 1 ) 破碎生物组织，用适当的缓冲液将生物分子提取出来；( 2 ) 用离心法或 其它方法将亚细胞颗粒及细胞碎片同溶液分开；( 3 ) 用盐析法或有机溶剂法使各 种方式生物分子分开 3 8 , 3 9 。 生物大分子的种类很多，性质差异很大，又处于不同的体系中，因此，不 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 可能有一个固定的程序适合于各种类型大分子的提取分离，但有一些共性的问 题对我们分离提取任何生物分子都是应当注意的，即：( 1 ) 选择一种最好的含有 目的分子的材料；( 2 ) 分离步骤要尽可能地少，因提取的每一步都不可避免地有 一部分损失；( 3 ) 尽可能地避免其变性，这就要求提取分离的过程不仅要快，而 且保持较低的温度( 4 。c ) 进行【4 。 2 、提取液成份的选择及需注意的外部环境 在提取、纯化生物分子时，其效果常受到本身存在的水解酶的影响，从而 导致实验失败，所以要选择性地加入适当的抑制剂。溶剂的极性和离子强度” 也常常影响提取分离的效果，有些生物分子的在极性大、离子强度高的溶液中 稳定；有些在极性大、离子强度高的溶液中稳定。例如，提取刀豆球蛋白a 时 常，用0 1 5 m o l l 甚至更高浓度的n 。c 1 溶液都可从刀豆粉中溶液出来，稳定存 在。而提取脾磷酸二脂酶时，则要用o 2 m o l l 的蔗糖溶液，才能达到目的。 除以上这两点外，还有须考虑的条件如：空气氧化作用、金属离子的变性作 用、溶液的p h 值影响、环境温度的影响和提取液和提取物比例的影响等。 第三节膜蛋白的分离与提取技术 1 、质膜的结构与性能【4 3 1 质膜( p l a s m am e m b r a i l e ) 又称细胞膜( c e l lm e m b r a n e ) ，是指围绕在细胞最外层， 由脂类和蛋白质组成的薄膜。质膜不仅使细胞具有一个相对稳定的内环境，同 时在细胞与环境进行物质、能量的交换及信息的传递过程中也起着决定性的作 用。真核细胞内部存在由膜构成的各种细胞器。细胞内的膜系统与细胞质膜系 统统称为生物膜( b i o m e m b r 觚e ) ，它们具有共同的结构特征【4 4 1 。即：( 1 ) 具有极性 头部和非极性尾部的脂分子在水相中具有自发行成封闭膜系统的性质，以疏水 尾部相对，极性头部朝向水相的脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分。( 2 ) 蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双分子层中或结合在其表面，蛋白类型、蛋 白部分的不对称性及其与质分子的协同作用赋予了生物膜具有各自的特性和功 能。( 3 ) 生物膜可以看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液。 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 2 、质膜的成分及含量 4 ( 1 ) 膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。磷脂构成膜脂的基本成分，约 占膜脂的5 0 以上；糖脂普遍存在于所有细胞的质膜上，其含量占膜脂总量的 5 以下；胆固醇的含量般不超过膜脂的1 3 ，它主要在调节膜的流动性、增 加膜的稳定睦以及降低水溶通透性方面起重要作用。 ( 2 ) 膜蛋白的种类繁多，其含量一般占膜的4 0 一6 0 之间。根据膜蛋白分离的难 易及其与脂分子的结合方式膜蛋白可以分为两大基本类型：外在膜蛋f ；兰1 ( e x t r i n s i c m e m b r a n ep r 。t e i n s ) 或称夕卜周膜蛋l 刍( p e d p h e r a lm e m b r a n ep r o t e i n s ) 和内在膜蛋白 ( i n t r i n s i cm e m b r a r t ep r o t e i n s ) 或称整合膜蛋白( i n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s ) 。外在膜 蛋白一般靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质或脂分子结合，因此只要 改变溶液的离子强度或提高温度就可从膜上分离下来，通常膜的结构并不破坏。 内在膜蛋白结合紧密，只能用去垢齐e ( d e t e r g e n t ) 等特殊试剂才可从膜上分离下 来。 3 、提取膜蛋白的常用去垢剂 去垢剂是一端亲水端疏水的两性小分子，是分离和研究膜蛋白的常用试 剂。去垢剂可分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂二类。常用的离子型去垢荆， 如十二烷基磺酸钠( s d s ) ，其分子式见图5 3 所示，它不仅可以使细胞膜破坏， 还可与膜蛋自的疏水部分结合使其分离；出于s d s 对蛋白质的作用较为剧烈， 引起蛋白质的变性，因此在纯化有生物活性膜蛋白时，常采用非离子型去垢剂。 常用的非离子型去垢剂如t r i t o nx 1 0 0 ，其分子式见图5 3 所示，非离子型去垢 剂也可使细胞膜崩解，但它们对蛋白质的作用比较温和，它不仅可以用与膜蛋 白的分离与纯化，也可用于除去细胞的膜系统，以便对细胞骨架蛋白和其它蛋 白进行研究。 图1 1 是一些常用的离子型去垢剂和非离子型去垢剂的分子结构”“。 中国科学技术大学研究生院( 台肥) 硕士学位论文 c h ， i 。 h 3 c 一( c 坞) o c h 2 一对+ _ o 。 c h d o d e c y l d i m e t h y l a n 血eo x i d e ( d d a oa m m o n y xc o ) 十二烷基甲胺氧化物 q 乌 h 3 c 一( c h o - v1 c h 3 b r c h 3 d o d e c y k r l m e t h y l a r r a n o n i u mb r o m i d e ( d t a b 、 溴化十二烷基三甲胺 c h ，c h ， h 3 c 一c 坞聿一 一。一( c h 2 _ c 马一o x h c h 3c h 3 p o l y o x y e t h y l e n ep - t - o c t y lp h e n o l ( t r i t o nxs e r i e s ) 曲酮系列 护咖脚h 2 0 h ，9 n 州c h 3 9 一d s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) 十二烷基磺酸钠 图i - 1 用以溶解和纯化膜蛋白的一某些去污剂的结构 f i g 1 - ls t r u c t u r e so f s o m ed e t e r g e n t su s e dt os o l u b i l i z ep u r i f ym e m b r a n e p r o t e i n 1 5 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 颁士学位论文 第四节蛋白分离技术的运用 一般常用的蛋白分离方法较多，如：h p l c 法、电泳分离法】、凝胶排 阻色谱法i 、离子交换色谱法( 5 ”等但比较适合我们研究目的的方法是h p l c 和 凝胶排阻色谱法。h p l c 分离法的分离特点是：实验操作比较简单快捷，涉及 试剂较少，引入污染少，对试剂和样品的要求都不是很高，但实验费用较贵， 一次处理的样品少。凝胶排阻色谱法的的特点是；分离操作条件简单易行，涉 及试剂少，引入污染少，对试剂和样品的要求低，实验费用较低，仪器设备易 于实验室自行安装设制，一次性处理样品量大。电泳分离法的特点是：实验操 作要求比较繁琐，涉及试剂较多，较易引入污染，对试剂和样品的要求都很高， 实验费用较贵，一次处理的样品少，一般不太适于形态分析。离子交换色谱分 离法的特点是：实验操作比较简单，涉及试剂较少，较易引入其它离子，对试 剂和样品的要求不高，实验费用较低，一次处理的样品较多，一般不太适于形 态分析 综上所述，再结合本研究课题自身特点要求：实验操作尽可能简单快速， 涉及试剂尽可能地少，减少污染。因此，比较适合我们研究目的的方法是h p l c 和凝胶排阻色谱法。 最为重要的一点就是，排阻h p l c 和凝胶排阻色谱法是按照物质的分子量 大小进行分离的，在分离的同时还可以用分子量的大小进行分离组分的表征。 考虑到在进行淋洗条件实验时，若条件选择不当，可能会造成分离柱的堵塞。 如果初步的条件实验在h p l c 上分离，一旦h p l c 分离柱发生堵塞，则会造成 较大的经济损失。而凝胶色谱法由于以上所述的特点，就特别适合于有机大分 子的初步条件实验。因此，本文进行条件实验阶段采用凝胶排阻色谱法；而一 旦条件成熟，在正式分离实验中则采用h p l c 分离。 6 中国科学技术大学研究生院( 合肥) 硕士学位论文 第五节稀土元素检测技术 在自然界稀土元素总是共生的。对稀土的测定有稀土总量的测定和单一稀 土含量的测定。稀土元素总量的测定是根据各稀土元素在化学性质上的相似性， 采用重量法、容量法和吸光度法。其中重量法和容量法一般用于稀土含量较高 的样品，例如稀土矿物原料和稀土产品；而吸光光度法则常用于稀土含量较低 的生物样品和材料。单一稀土测定与稀土总量测定相比较为困难；按不同试样 大致可分为三类：( 1 ) 纯稀土试剂中某个痕量稀土杂质的检测。( 2 ) 混合稀土 中个别稀土的检测。( 3 ) 非稀土试样中低含量单一稀土的测定，例如土壤、生 物、环境样品等。为了检测单一稀土，不仅需要利用它们的化学性质，还需要 充分利用各稀土元素由于电子层或核结构的微小差异表现在光谱学、质谱学或 核反应性质上的差别才能实现。对本文的研究而言，需要的是检出限更低，干 扰尽可能小的分析方法，因此，最适用的手段乃是i c p m s 和i c p a e s 。 1 i c p - a e s 稀土元素由于其外层电子结构相似导致的物理化学性质相似性，给大多数 稀土元素的化学分析造成了很大的困难。光谱分析可不受这一限制，能够较简 单地对单个稀土元素进行定性和定量分析。与一般元素相比，稀土元素的光谱 性质有如下特点：( 1 ) 具有十分复杂的光谱，它们的谱线繁多，除镥有4 5 5 条 谱线外，其他稀土元素的谱线多在千条以上，因此谱线和背景的干扰很严重。 为了克服这一影响，可采用大色散率的光栅光谱仪。一般的中型光谱仪只能用 于个别稀土元素的测定。( 2 ) 稀土元素较易激发电离，它们的电离电位( 一次 电离) 约为5 - 6 e v ，属于易电离元素。常可用它们的离子线作为分析线。在一 定条件下，谱线的发射强度与光源中稀土原子蒸气浓度或试样中元素含量成正 比，由此建立了光谱定量分析的基本关系。电感耦合等离子体( i c p ) 作为新型 激发光源的应用是八十年代发射光谱的一个重要成就。i c p a e s 已成为稀土分 量测定的主要分析方法f 6 4 1 和原子发射光谱发展的主流【6 5 】，应用涉及冶金、材料、 生物及环境分析等领域。它具有检出限低、准确度好、干扰小和线性范围宽等 优点。在植物样品分析上已被用于粮食 6 6 4 5 8 】、大豆6 ”、茶叶 7 0 , 7 1 、中药i 7 2 1 及其他 植物 7 3 , 7 4 的稀土元素各分量的同时测定。 中国科学技术大学研究生院( 台肥) 硕士学位论文 植物，3 , 7 4 1 的稀土元素各分量的同时测定。 2 1 c p m s 八十年代兴起的电感耦合等离子体( i c p ) 为离子源的等离子体质谱( i c p m s ) ，具有极低的检出限、很强的专属性、可以同时测定多种元素及同位素。 特别是对于一般分析技术难于测定的稀土元素，i c p m s 更成为多元素超灵敏痕 量分析的有效方法【5 1 1 。p h a m 等 5 2 , 5 3 1 用i c p m s 测定了稻米等植物中的稀土元素 含量。a l v a r a d o 等【5 4 1 分析了青草中c e 、s m 、e a 、t b 、t m 的含量。我国学者近 年来也开展了这方面的工作，对茶叶 5 5 , 5 6 等植物的稀土元素进行了检测，并利 用i c p m s 对国际小麦粉中1 5 种稀土元素进行定值研究 5 7 1 。有学者比较了i c p - m s 和i c p a e s 的检出限( 表1 - 1 ) ，从表1 1 可看出，i c p m s 的检出限明显优 于i c p a e s ，在进行微量和超微量稀土元素分析时通常是首选方法。为了保证 i c p m s 良好的检出限和精密度，在测定样品中稀土时，需控制盐分 ( 第一卷) ，败涂地高教出 版社1 9 8 9 ：1 2 3 w a t t sc a n dm a r km a r s he ，w h a tg o e si na n dh o w , j c e l ls c i e n c e 19 9 2 ， 1 0 3 ：1 a r i e lgl p h i l i ps j o h nr m a n dj o n a t h a na n g c e l ls t r u c t u r ea n d f u n c t i o n ，s a u n d e r s c o l l e g ep u b l i s h i n g ，1 9 9 1 ：2 1 1 f u n a h a s h im a n a l b i o c h e m 1 9 8 2 ，1 2 6 ：4 1 4 c h e n gj i e k e i n o r g c h i ma c t a ，1 9 8 4 ，9 4 ：2 4 9 2 5 8 l is h ，l is q ，z h a n gy j 砌a n t a ，1 9 9 2 ，3 9 ( 8 ) ：9 8 7 - 9 9 1 何久康，李北罡分析化学，1 9 8 8 ，1 6 ，( 8 ) ：7 1 9 - 7 2 2 赵泓，成荣明理化检验，1 9 9 0 ，2 4 ( 4 ) ：2 0 5 张华山，黎心懿化学试剂，1 9 8 9 ，1 1 ( 6 ) ：3 2 7 3 3 2 ，3 2 3 d u r r a n ts f t r a n a l c h e m 19 9 2 ，1l ：6 8 p h a m t 。，h u y n hm ，e ta i j r a d i o a n a l 。n u c l c h e m ，1 9 9 7 ，2 1 7 ( 1 ) ：9 5 9 9 s c h o l z eh ，h o f f m a n ne ，e ta 1 f r e s e n i u s j a n a l c h e m ，1 9 9 6 ，3 5 5 ( 7 8 ) ： 8 9 2 - 8 9 4 a l v a r a d oj s n e a lt j ，e ta 1 a n a l c h i m a c t a ，1 9 9 6 ，3 2 2 ( 1 2 ) ：1 1 2 0 张国文，张涵光谱学与光谱分析，i 9 9 7 ，1 7 ：( 1 ) 7 4 7 8 刘明，刘虎生光谱学与光谱分析，1 9 9 8 ，1 8 ( 5 ) ：5 8 3 5 8 6 刘国生，王耐芬，等，环境化学，1 9 9 7 ，1 6 ( 2 ) ：9 8 1 0 2 丰田稔，野尺明义，金子敏男二 ，世e ，1 9 8 7 ，( 7 ) ：4 8 6 l o