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甲状腺结合前清蛋白与小分子结合的分子对接 及动力学研究 摘要 甲状腺结合前清蛋白( t t r ) 为血浆运输蛋白的一种，主要运输甲状腺 素和维生素a 结合蛋白。甲状腺素及其同系物可以在t t r 中心空腔内结 合。在一些非自然条件下，t t r 能够形成淀粉化纤维，淀粉化纤维造成 新陈代新紊乱，最终导致组织淀粉化类疾病。已有实验表明一系列小分子 能够和t t r 四聚体有效结合。这个结合增强了t t r 四聚体的稳定性，而 阻止了其分解，在体外有效地阻止了淀粉化物的形成。本文采用分子对接 与分子动力学模拟来研究抑制剂分子与t t r 的结合模式，并通过 m m p b s a 和m m g b s a 的方法计算体系的结合自由能，对于寻找高活性 的抑制剂有重要的意义。主要工作如下： 1 、本文采用动力学模拟研究了f l u f e n 锄i ca c i d ( f l u ) a n dn p h e n y l p h e n o x a z i n e ( b p d ) 与t t r 的结合模式。对t t r 与f l u 、b p d 复合物的晶 体结构进行动力学模拟。t t r 与f l u ，b p d 的动力学模拟结果解释了负 性结合和独立结合的机理。f l u 在第一个结合位点结合后，引起第二个 结合位点的扩张导致f l u 分子在第二个结合位点结合能力的削弱。但是 b p d 在第一个结合位点结合后，第二个结合位点变化不明显，b p d 分子 可以在第二个结合位点紧密结合。 2 、采用m m p b s a 方法计算了t t r 与f l u ，b p d 的结合自由能。 北京化t 人学顸。l ：学位论文 其计算结果能较好的与实验值匹配，从能量的角度解释了f l u 和b p d 与 t t r 结合的不同结合模式。采用m m g b s a 方法得到了对t t r 与配体结 合自由能较大的贡献的残基，为设计高活性的小分子抑制剂提供了能量方 面信息。 3 、利用d o c k 程序对t t r 与几个系列抑制剂分子进行对接，预测 t t r 与不同抑制剂结合的复合物结构。将对接所得到的t t r 与抑制剂的 复合结构进行m d 模拟。同样利用m m p b s a 和m m g b s a 的方法计算 抑制剂分子与t t r 的结合自由能。结果说明抑制剂与t t r 结合采取多种 结合模式，并且能够有效地抑制t t r 四聚体的分解，这与实验结果相一 致。 关键词：甲状腺结合前清蛋白，分子动力学模拟，分子对接，抑制剂， 结合自由能 北京化工人学硕一l ：学位论文 m ds i m u l a t i o na n dd o c n go ni n h i b i t o r s b l n d i n gw i t ht t r a b s t r a c t t r a n s t h y r e t i n ( t t r ) i sa ni m p o r t a n tt r a n s p o r t e ro ft h y r o x i n eb o t h i n p l a s ma n dc e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) t h y r o x i n ea n di t sa n a l o g u e sc o u l db i n d w i t ht t ra tt w oe q u i v a l e n tb i n d i n gs i t e sl o c a t e di nt h ec e n t r a lb i n d i n g c h a n n e l t t rc o u l dd i s s o c i a t ei n t om o n o m e r sa n dt h e nm i s f o l dp a r t l y d i s r u p t e di n t e n n e d i a t e sf 0 1 l o w e db ya m y l o i d o s e s i ti sa ne f f e c t i v et h e r 印e u t i c s t i a t e g yt od e s i g nas e r i e so f1 i g a n d sb i n d i n gw i t ht t rt op i e v e n ti tf 而m d i s a s s e m b l i n g i nt h i s p a p e r ， d o c ka n dm o l e c u l a rd y n 锄i c s( m d ) s i 咖1 a t i o n sa r ep e r f o m e dt os t u d yo ni n h i b i t o r sb i n d i n gt ot t r t h i sr e s e a r c h g i v ef a r r e a c h i n g i n f o 加1 a t i o n sf o rd i f r e r e n ti n h i b i t o r s b i n d i n g w i t h t r a n s t h y r e t i n t h em a i nw o r k i nt h i ss t u d yi sa sf o l l o w s ： 1 、m ds i m u l a t i o n sa r ep e r f o m e dt os t u d yt h ed i 毹r e n c e so f b i n d i n g c h a n n e ls h a p e so ft t rw i t ht w oh n d so fi n h i b i t o r s ，n u f e n a m i ca c i d ( f l u ) a n dn p h e n y lp h e n o x a z i n e ( b p d ) ap o s s i b l eb i n d i n gm e c h a n i s ma c c o u n t i n g f o rn ca n di ci sp r o p o s e d ：内rn co ff l u ，t h ee x p a n d i n go ft h es e c o n d l l l 北京化工人学硕士学位论文 b i n d i n gs i t ew e a k e nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt t ra n df l u ，f o ri co fb p d ，t h e s 锄es i z eo fs e c o n db i n d i n gs i t ea sw t - t t rh a ss i m i l a rb i n d i n g a m n i t yw i t h b p dl i k et h ef i r s to n e 2 、i nt h i sp a p e r ，c o l l e c t i n gt h es a m p l eo fm d s i m u l a t i o n sa n dc a l c u l c a t e t h e6 e eb i n d i n ge n e r g yb ym m p b s aa n dm n i g b s am e t h o d st oi n s p e c tt h e b i n d i n gm o d eo ft r a n s t h y r e t i nw i t hi n h i b i t o r s f r o mt h er e l a t i o n so ff 琵e b i n d i n ge n e r g y ，i tc a ng i v er e a s o n a b l ee x p l a n a t i o nw h yf l ua d o p t sn e g a t i v e c o o p e r a t i v i t ya n db p da d o p t si n d 印e n d e n tc o o p e r a t i v i t y t h i sr e s e a r c hg i v e 胁r e a c h i n gi n f i o 啪a t i o n sf o rt h e 能ee n e r g yo ft h ed i f f e r e n ti n h i b i t o r sb i n d i n g w i t ht r a n s t h y r e t i n 3 、t h eb i n d i n gm o d e so fi n h i b i t o r sw i t ht t rw e r es t u d i e du s i n gd o c k i n g a i l dm o l e c u l a rd y l l 锄i cs i m u l a t i o n s t h eb i n d i n gf 琵e e n e 曙i e s w e r ea l s o c a l c u l a t e du s i n gm m p b s aa n dm m g b s a m e t h o d s t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h ei n h i b i t o r sa r ei n m u l t i p l eb i n d i n gm o d e sa n dc o u l de f f e c t i v e l yp r e v e n t t t rf 两md i s s o c i a t i o n ，w h i c ha r ec o n s i s t e n tw i t he x p e r i m e n t a ld a t a k e yw o r d s ：t r a n s t h y r e t i n ，m o l e c u l a rd y n a m i c s ，d o c hi n h i b i t o r ，舶e b i n d i n ge n e r g y i v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名： 至蔓 日期：型乡：! 毋：! 兰 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上一年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 圣j 圣夔 日期：翌篁：! ：! 兰作者签名：垒堡垒日期：翌兰：! ：! 兰 导师签名： 圣盥 日期：箩o 占， 北京化t 大学硕- 上学位论文 第一章绪论 1 1 计算机辅助药物分子设计的发展及意义 据国际上统计，研制成功一种新药，平均需要花费1 0 1 2 年的时间，耗资2 0 3 5 亿美元，并且其费用正以每年2 0 的速度增进。造成这种状况的一个重要原因就是缺 乏深入的理论指导。 药物设计是随着药物化学学科的诞生相应出现的。早在2 0 世纪2 0 年代以前，一 些研究人员就开始进行天然有效成分的结构改造。直到1 9 3 2 年，欧兰梅耶发表了将 有机化学的电子等排原理和坏状态结构等价概念应用于药物设计，首次出现具有理论 性的药物分子结构的修饰工作。随后，药物作用的受体理论，生化机制，药物在体内 转运等药物设计的理论不断出现。 药物设计研究是化学、物理学、生物学、计算机科学和信息科学相互交叉和渗透 的新兴科学前沿，与基因组和蛋白质组学、生物信息学、结构生物学和计算生物学等 学科密切相关，不仅是一个迅速发展的基础研究领域，也是一个应用前景突出的高技 术领域，这一领域的发展，可能带来生命科学和药物研究的革命性变化，并导致数字 化生物学的新体系。 计算机辅助药物设计( c o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i 印，c a d d ) 以计算机为工具，充 分利用已有的有关药物及其生物大分子靶标的知识，通过理论模拟、计算和预测，来 指导和辅助新型药物分子的设计和发现。目前，发达国家有一批著名科学家领导的研 究组从事这方面研究，许多制药公司也纷纷投资建立运用计算机进行理论研究以带动 新药的开发研究，并且已有一些获得成功的药物发表，如最近上市的新药碳酸醉酶抑 制剂，g l a ) ( o w e l l c o m e 公司的5 h t 受体激动剂等。随着蛋白质结构测定技术及计算 机科学的发展，计算机辅助药物设计也进入了一个崭新的时代，出现了基于生物大分 子靶标三维结构知识的合理药物设计( s t m c t u r eb a s e dd m gd e s i 印) 。国外各大制药公 司竞相投资于计算机辅助药物设计，不但开发出了潜在的产品，也大大促进了计算机 辅助药物设计方法和软件的丌发。基于蛋白质三维结构的合理药物设计与组合化学以 及高通量筛选结合引起了医药工业新的革命。 计算机辅助药物设计的出发点是基于对药物和受体间相互作用的理解和研究。计 算机辅助药物设计主要有以下三种方法： ( 1 ) 基于受体的药物设计( r e c e p t o r - b a s e dd m gd e s i 印) 基于受体的药物设计又称为基于( 受体生物大分子) 结构的药物设计 ( s t n l c t u r e _ b a s e dd r u gd e s i 印) ，主要根据受体的三维结构设计能与之匹配的配体，包 括基团生长法( b u i l d i n g ) 、模板连接法( 1 i 她) 以及分子对接法( d o c k i n g ) 。当靶 北京化工大学硕上学位论文 标受体生物大分子的三维( 3 d ) 结构已经用x 射线衍射、三维核磁共振等实验方法 测定，就可以根据生物大分子的结构设计新的药物分子。首先从与生物活性有关的受 体上的靶点入手，阐明靶点的功能、三维结构、内源性配体和天然底物的化学结构特 征，以计算机辅助展示这些物质的结合位点，然后用各种方法寻找和设计合理的药物 分子以发现选择性作用于靶点的又具有药理活性的先导化合物；或根据靶点的三维结 构直接设计活性配体，这种基于结构和基于机理的药物设计又称为合理药物设计。但 知道受体的三维结构并不意味着就知道配体与之作用的结合位点。确定结合位点的方 法，是基于受体蛋白与小分子配体的互补结合，包括几何互补和能量互补如疏水相互 作用、离子键、氢键、电荷转移等相互作用。 ( 2 ) 基于配体的药物设计( “g a n d b a s e dd m gd e s i 髀) 这一类设计方法主要是针对未知受体结构的药物分子，主要包括定量构效关系方 法和药效团模型方法。定量构效关系【2 】( o s a r ) 方法是将化合物的结构信息、理化 参数与生物活性进行分析计算，建立合理的数字模型，研究结构和活性之间的量变规 律，为药物设计、先导化合物结构改造提供理论依据。经过不断的发展和完善，定量 构效关系方法已经成为计算机辅助药物设计应用最为广泛的方法之一【3 】。 在受体三维结构未知的情况下，可采用基于配体的药物设计法，主要包括 3 d o s a r 方法，建立药效团模型的方法以及在此基础上的三维结构搜寻方法。 3 d q s a r 方法将药物的理化参数与药效拟合出定量关系，再以此关系设计新的化合 物。药效基团模型方法是对一系列活性化合物作3 d q s a r 分析研究，并结合构象分 析，总结出一些对活性至关重要的原子和基团以及空间构效关系，反推出与之结合的 受体的立体形状、结构和性质，推测得到靶点物质信息，即得到虚拟受体模型，来设 计新的配体分子。基于药效基团模型的三维结构搜寻的方法是以药效基团模型为搜寻 标准( 即提问结构) ，来搜寻小分子三维结构数据库得到新配体分子。利用计算机对 化合物数据库进行“筛选”，可以大大减少工作量与成本，加速新药发展的步伐。 ( 3 ) 基于机理的药物设计( m e c h a n i s m - b a s e dd 1 1 j gd e s i 印) 这种方法在基于结构的药物设计基础上，进一步考虑了药物和受体的动态结合过 程，药物对受体构象的调节以及药物在体内的传输、分布和代谢【4 1 。随着新世纪生命 科学、计算机科学的发展，这种考虑药物作用的不同机理和全部过程的药物设计方法， 将会更加完善，在新药的发展中发挥更大的作用。 当然上面介绍的这些方法之问也并不是完全独立的。对于某个体系，常常会采用 多种药物设计的方法来进行先导化合物的设计。比如知道了蛋白质和药物分子相互结 合的复合物结构时，可以从蛋白质结构出发用基于分子对接的数据库搜索方法来进行 先导化合物的寻找；从复合物的相互作用信息，也可以得到药效团模型，然后从药效 团模型出发进行药物设计，同时，也可以从蛋白质结构出发，用片段生长的方法进行 全新药物分子的设计；此外，先导化合物得到以后，也可以采用计算组合化学的方法 2 北京化j 大学硕士学位论文 并结合定量构效关系来进行先导化合物的优化。 1 2 计算机辅助药物设计中的理论方法的应用 计算机辅助药物分子设计都是基于各种分子模拟技术及各种数理统计方法，其中 包括分子力学、量子力学方法、蒙特卡罗及分子动力学方法、数值和非数值优化技术 等【5 6 j 。这些方法各有特点及局限性，需要取长补短，有时需要结合使用。要提高药物 设计的准确度及命中率涉及很多方面的问题，如蛋自在溶液中的结构( 自由能、溶剂 化能、构象的多重性、动力学性质等) 、抑制剂在溶液中的构象( 自由能、溶剂化能、 浓度效应、构象的多重性、动力学性质及穿透性) 以及蛋白与抑制性的相互作用( 结 合自由能、溶剂化能、结合模式、诱导匹配、极化及电荷转移以及复合物的结构) 等。 量子力学把相互作用的体系作为一个复合大分子来描述这种相互作用的结果。这 种方法不用参数，较严格，可得到一些额外的电子的状态信息。但受机时与体系大小 的限制，目前该方法对大分子体系的模拟还不现实。本论文的研究工作主要涉及的是 分子动力学和分子对接方法，以及结合自由能计算。 1 2 1 分子动力学方法的应用 分子动力学方法是进行生物大分子模拟的重要工具。它把相互作用的两个体系作 为一个复合体系，模拟体系之间的非成键相互作用、体系内部的各个构型变化，以及 这种相互作用随温度变化的不同。分子动力学可以模拟相当大的体系如蛋白质与核 酸，蛋白质与蛋白质，受体与抑制剂之间的相互作用，同时亦可将溶剂加进来一起模 拟，以便考虑溶剂效应对这种分予问相互作用的影响 j 。 分子动力学可以为计算机辅助药物设计提供许多帮助，如依赖x r a v 衍射数据和核 磁共振( n m r ) 数据的结构优化，对生物大分子的动力学变化研究，模拟新的同类化 合物的能量最低的结构和其动力学轨迹。另外，运用图形与分子模拟交互，可以在计 算机屏幕上以图形的形式表示出分子动力学的轨迹数据，观察，比较和分析分子的各 种构象的三维立体结构，用以推测和评价药物与生物大分子相互作用的分子构象。 蛋白质所具有的功能在很大程度上取决于其空l 日j 结构，因此对蛋白质空问结构的 研究在蛋白质工程中有着极其重要的意义。早在1 9 5 9 年c b a n f i n s e n 在进化的分子 基础一书中写道“蛋白质化学家很自然地想到理解细胞行为最可能的方式在于研究 蛋白质分子的结构与功能的关系”。生物体内大部分的生理活动都是通过蛋白质来实 现的。所有的生物大分子在溶液中都是动态的，具有结构柔性。而且在表现其生物功 能的时候都会发生构象变化，小到局部的残基侧链的位置变化，大到整个功能域的运 动。 北京化工人学硕十学位论文 分子动力学方法可以跨过较大的能垒，在温度t 时，每一个自由度可跨越足。丁的 能垒，因此可以通过升温来搜索更大的构象空f b j 。高温下整体能量和势能波动较大， 意味着较大的构象变化，当总能量中出现最小点后，系统将在常温( 3 0 0 k ) 下平衡，这 样便可以获得低能量构象。分子动力学与简单的能量优化相比，能更有效地表现生物 大分子的动念行为。 分子动力学的主要优点是可以利用有限的实验数据构造分子的结构模型并研究 它的能量与结构的动态变化，这些数据对于药物设计是很有意义的，而这些数据对于 用试验方法来确定结构是远远不够的。因此任何关注生物大分子结构模拟，结构预测 与药物设计者，都应了解这方面的发展。 分子动力学方法的发展和应用是和分子动力学本身力场、算法的发展以及计算机 的发展和应用分不开的。在计算机技术飞速发展的今天，分子动力学在生物大分子动 态模拟中的应用越来越广，研究的体系越来越大，在模拟时考虑水溶液环境、膜环境 等更接近生物体系的真实环境。超级计算机已经并将继续在计算生物学领域得到广泛 应用。许多适合生物大分子计算的分子动力学程序的发展( 如a m b 一8 1 、c h a m m 0 1 、 g r o m a c s 1 和g r o m o s 【1 2 1 3 】等) 已趋于成熟。 1 2 2 分子对接方法的应用 分子对接的最初思想起源于1 0 0 年前f i s h e re 的“锁一钥匙模型”。然而，配体与 受体的结合过程是一个复杂的过程，涉及到配体和受体的去溶剂化、配体和受体( 主 要是活性部位处的残基) 的构象变化以及与受体之间的相互作用。 所谓分子对接就是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的 过程。分子对接在药物设计中具有十分重要的意义。在药物分子产生药效反应的过程 中，药物分子与靶酶相互结合，首先就需要两个分子充分接近，采取合适的取向，使 两者在必要的部位相互作用契合，发生相互作用，继而通过适当的构象调整，得到一 个稳定的复合物构象。通过分子对接确定复合物中两个分子正确的相对位置和取向， 研究两个分子的构象特别是底物构象在形成复合物过程中的变化，是确定药物作用机 制、设计新药的基础。 人类基因组计划的目的之一在于阐明人的约1 0 万种蛋白质的结构、功能、相互 作用以及各种人类疾病之问的关系，寻求各种治疗和预防方法，包括药物治疗。基于 生物大分子结构的药物设计是生物信息学中极为重要的研究领域。为了抑制某些酶或 蛋白质的活性，在已知其三级结构的基础上，可以利用分子对接算法，在计算机上设 计抑制剂分子，作为候选药物【1 4 l 5 1 。 分子对接模拟分子体系的非键相互作用，主要考虑范德华力及静电相互作用，而 各分子内部的几何结构不能变化。如分子体系不太大时可在计算机屏幕上显示体系结 4 北京化t 大学硕士学位论文 构及能量的变化。通过研究小分子配体与受体大分子的相互作用，分子对接能够预测 其结合模式和亲和力而实现基于结构的药物设计。根据配体与受体作用的“锁钥原理” ，分子对接可以有效地确定与靶受体活性部位空问和电性特征互补匹配的小分子化合 物。 目前，分子对接已广泛应用于基于结构的药物设计中数据库搜寻及虚拟组合库的 设计和筛选研究中。此外，分子对接方法为探讨相关蛋白分子问作用提供了一种有效 的研究手段。 当受体三维结构已知时，可以根据形状互补、性质互补的原则将配体放置在活性 部位，使之形成有利于相互作用的配体受体复合物，即所谓的对接。随着x 射线衍 射以及核磁共振等技术的发展，越来越多的生物大分子的三维结构被测定出来，或者 以同源蛋白建模方法获得，以及商用小分子数据库的不断更新，基于受体三维结构的 药物设计方法分子对接在药物设计中取得了巨大的成功，已经成为基于结构药物设计 中最为重要的方法。 分子设计在药物设计中有着重要的地位，其应用范围也很广泛。分子对接计算可 以直接揭示药物分子和靶点之间的相互作用；也可以为构效关系和药效团模型研究提 供最为合理的活性构象；基于分子对接的虚拟筛选可以用于先导化合物的发现。近年 来，基于分子对接方法的虚拟筛选方法在药物设计中取得了巨大的成功，例如胸苷酸 合成酶( t h y m i d y l a t es y n t h a s e ) 抑制剂【】、二氢还原酶( d h f r ) 抑制剂【1 7 】、表皮生 长因子受体和抑制剂问相互作用模式的研究等等。 1 2 3 自由能计算的应用 在药物设计工作中，受体和配体之间结合自由能( f r e eb i n d i n ge n e r g y ) 的预 测是基于结构的讨算机辅助药物分子设计的核心问题之一。自由能计算在生物分子模 拟中有着重要的应用。准确地预测自由能能更好地理解生物的功能，有助于合理的药物 设计，同时也是计算化学的热点和难点之一【i 引。 分子对接的目的是如何找到配体分子和受体分子的最佳结合位置，因此分子对接 会面对两个重要的问题：如何找到最佳的结合位罱以及如何评价对接分子之间的结合 强度。当然，不仅仅是分子对接方法，其他基于结构的药物设计方法，比如从头设计 等，最终往往都面临一个同样的问题，就是配体分子和受体分子之间相互作用的评价。 许多药物和其他生物分子的活性都是通过与受体大分子之间的相互作用表现出来的， 所以受体和配体之间结合自由能的预测是基于结构的计算机辅助药物分子设计的核 心问题之一。精确的自由能预测方法能够大大提高药物设计的效率。在过去的2 0 年 中，随着受体一配体相互作用的理论研究以及计算机辅助药物分子设计方法的快速发 展，自由能预测方法的研究受到了越来越多的关注。 5 北京化丁大学硕上学位论文 在药物设计中，研究者希望能对受体和药物分子之间的结合能力进行快速而精确 的评价。在目前粗筛方法同臻完善的情况下，以自由能为代表的精确评价方法显得日 益重要起来。 1 3 研究甲状腺结合前清蛋白淀粉抑制剂的意义 甲状腺结合前清蛋白( t r 锄s t h v r e t i n ) 是血浆运输蛋白的一种，主要由肝脏合成。 运输甲状腺素和维生素a 结合蛋白【1 9 】。 在生理环境( p h = 7 2 ) 环境下，t t r 是一种稳定的蛋白质。在一些非自然条件下， 1 t r 分解为单体，导致淀粉变性病【2 0 】。1 v r r 能发生病变淀粉化在组织器官中产生纤 维物而导致家族淀粉化神经系统疾病( f a m i l i a la m y l o i dp o l y l l e u r o p a t h y ，f a p 【2 l 】) 和家 族淀粉心脏肌病( f 锄i l i a la m ”o i dc a r d i o m y o p a t h y ，f a c ) 以及老年系统淀粉化疾病 ( s e n i l es y s t e m i ca m y l o i d s i s ，s s a ) 【2 2 1 。 对t t r 的纤维化过程。人们达到一定共识，认为是t t r 经过了误折叠重组为纤 维，在折叠前有一个过程就是四聚体的分解。已有实验表明一系列小分子能够和t t r 四聚体有效结合。这种结合增强了t t r 四聚体的稳定性，而阻止了其分解，在体外 有效地阻止了淀粉化物的形成【2 3 1 。 从原子层次一卜，采用基于分子动力学模拟的结合自由能的计算方法。用m m p b s a 的方法研究不同配体与1 v r r 的结合自由能，结合模式与结合能力。提出小分子配体 与t t r 的最佳结合模式及规律。并将结合分子对接方法和自由能计算方法，研究设 计新的抑制剂分子，为基于t t r 及其他淀粉化类前体蛋白结构的药物分子设计提供 新的思路。 1 4 论文的主要研究内容 本论文以1 v r r 结合抑制剂为研究对象，用分子动力学和分子对接方法对1 v r r 与 抑制剂的结合模式进行了研究。论文共分为七章： 第1 章绪论，介绍了计算机辅助药物分子设计的研究背景，包括计算机辅助药 物设计的理论、方法和意义，以及t t r 的研究意义； 第2 章理论计算与方法，具体介绍了本论文所涉及的分子动力学、分子对接方 法以及蛋白配体结合自由能计算的原理和主要步骤； 第3 章t t r 及其抑制剂的研究进展，综述了t t r 的结构和中心空腔研究进展， 以及t t r 淀粉抑制剂的研究进展； 第4 章t t r 与f l u 、b p d 的分子动力学模拟，对t t r 与f l u 、b p d 结合复合 物的晶体结构采用分子动力学方法对复合物进行模拟，t t r 与f l u 、b p d 复合物的 6 北京化工人学硕上学位论文 结构稳定性以及结合模式研究： 第5 章t t r 与f l u 、b p d 结合自由能的计算，采用m m p b s a 、m m g b s a 方 法计算1 v r r 与f l u 、b p d 的结合自由能，并采用g b 方法进行能量分解，研究对结 合自由能贡献较大的残基。 第6 章t t r 与其他几个系列抑制剂分子对接、分子动力学研究，归纳了四个系 列，总共9 8 个小分子，分别与t t r 进行分子对接，分析其结合模式，最佳构型。并 对对接结果进行分子动力学模拟，研究其体系的稳定性，运用p b s a 的方法计算t t r 与小分子的结合自由能。 7 北京化工人学硕一 ：学位论文 第二章计算模拟的理论与方法 在本论文的研究工作中，主要采用了三种理论计算方法，即分子动力学模拟方法 和分子对接方法，结合自由能计算。本章内容将阐述分子动力学方法的基本原理、分 子力场、主要算法和分子对接方法的基本原理、优化搜索算法、经验结合自由能函数 等内容。 2 1 分子动力学模拟方法 分子动力学是在原子水平上求解多自由度体系相互作用问题的重要的计算机模 拟方法。通过求解体系所有原子的运动方程，可以模拟与原子运动路径相关的基本过 程。由于计算机技术与计算化学的进步，目前分子动力学模拟已经应用在许多研究领 域上，如酶反应机制的研究、蛋白质折叠问题、蛋白质结构预测、蛋白质一配体结合 自由能计算、合理药物设计、p k a 计算、基于x r a y 及n m r 实验的生物分子结构修正 等。 2 2 1 分子动力学的基本原理 分子动力学( m o l e c u l a rd ) ，1 1 a m i c s ，简称m d ) 的基本思想是：将系统中每个原子 都视为遵守第二定律的经典粒子，通过求解数值的积分运动方程式，来解析许多原子 的运动轨迹，这些轨迹表明了系统内所有原子的位置、速度以及体系能量随时间发生 变化的情况。对于含有n 个原子的体系，每个原子的运动规律都符合牛顿运动方程( 牛 顿第二定律) ： 黜) 叫艇却，学= 竹掣 ( 2 - 1 ) 其中，f ( f ) 是原子f 在f 时刻时所受的力，聊，是原子i 的质量，口) 是原子f 在f 时刻时的加速度，t ( f ) 是原子f 在f 时刻时的位移矢量。原子所受的力可由分子 力学势能函数v 的负梯度求得： 邪卜掣 ( 2 - 2 ) 在直角坐标系中，z 和可用它的三个分量来表示。以石方向为例，将f 时刻原 子i 在工方向的坐标进行t a y l o r 展开，得到以下两个方程( 一个向前、一个向后) ： o + f ) = ( f ) + v ( f ) f + q o ) f 2 2 + 岛o ) f 2 6 + ( 2 - 3 ) 9 北京化t 大学硕：i ：学位论文 毛( f 一f ) = 玉o ) 一v o ) f + q o ) f 2 2 一勿o ) f 2 6 + ( 2 - 4 ) 这里( f ) ，v ( f ) ，q ( f ) 和岛( f ) 分别是f 时刻原子i 在x 方向上的位置、速度、加 速度和石对f 的三阶导数。 将式( 2 3 ) 和( 2 4 ) 分别相加与相减后可得到： 玉o + f ) = 2 薯o ) 一五( f 一f ) + q ( f ) f 2 ( 2 5 ) k ( f ) = 【五o + f ) 一誓o 一f ) 】2 f( 2 6 ) 在f 及f 一f 时刻第f 个原子的位置是知道的，加速度可以从势能函数的负梯度求 出 q ：鼻觋：一盟掣( 2 7 ) u 巧 所以以后任何时刻原子的位置、速度和加速度都可迭代求解。这就是计算牛顿运 动方程的v e 订e t 方法。( 2 5 ) 式称为v e r l e t 方程。对高阶项的不同处理方式就涉及到后面 要提到的算法问题。 我们可以概括一下分子动力学的基本流程： 1 给出体系所有粒子的初始坐标乏( f ) 和速度t ( f ) 。这里t ( f ) 通常都是按照体系的初始 温度根据波尔兹曼分布赋值。 2 采用特定的力场参数和能量评价函数，从；( f ) 得到体系的势函数，由此计算每个粒 子所受到的力，( f ) 。通常这一步的计算占据整个计算步骤的9 0 的时间。 3 运用牛顿运动方程，由毒( f ) ，t ( f ) 积分计算乏( h f ) ，乏( f + f ) 。这罩涉及数值积 分计算方法问题，选择合适的数值积分计算方法是动力学计算方法效率的决定因素。 4 用乏( f + f ) ，t ( f + f ) 作为输入，计算再下一步的乏( f ) 和矗( ，) 。不断重复步骤( 2 ) 一 ( 4 ) 。 2 2 2 分子力场 m d 模拟方法将分子体系看作是质点在势能面中的运动，由于每个分子体系的势 能面是高度复杂的，难以精确描述。为了实用往往选用某些与原子坐标相关的函数对 势能面进行拟合，得到势能面的近似解析表示。这种势能面的表示方法称为力场，而 这组与坐标相关的函数称为势函数。 分子力场是根据经典的物理模型如谐振子模型等，结合一些光谱实验数据，发展 的一种适合计算蛋白质构象参数的势能函数形式。在m d 模拟中，系统中的分子都处 于力场中。力场由两个部分组成：描述势能及分子间力的势函数，以及势函数中所采 1 0 北京化工大学硕十学位论文 用的参数。势函数和参数结合起来才能描述力场，对于相同的势函数，可以采用不同 的参数，但是这些参数必须成套使用，因为在整个力场中各个参数都不是孤立的。 分子力场是一种对分子内相互作用的半经验近似描述，通过对实验结果和严格的 理论化学计算结果的拟合得到一套力场参数和能量函数，而合格的力场必须是在平衡 预测精度和计算效率的前提下比较好地预测分子的物理化学性质。可以通过x 一射线、 n m r 、光谱以及中子散射等一系列实验结果和力场预测的物理化学性质比较来检测力 场的精度。力场的势能函数( ，) 通常包含以下几项： k ( ，) = l ( ，吃，) = 点6 0 。捌+ e 。一6 。删 = 寺k ( 6 6 0 ) 2 + 去k ( p 一岛) 2 + 寺t ( 孝一彘) 2 b o n d s 厶 口n g k s 二 t o r s i o n sl + 如( 1 + c 伽( ，l 一万) ) + 啬一】 ( 2 8 ) d i h e d r e l s p n i r s l i n iu1i j 其中最。捌是共价键能，e 。神。倒是非共价键能，成键部分包括：键伸缩能， 键弯曲能，二面角扭曲能，非键部分包括上式中的后两项，也就是是范德华作 用能j 邑k ( 通常采用l e n n a r d j o n e s ( 6 12 ) 指数形式表示) 和静电作用能尾曲4 d s 尬巧c ( 通常用c o u l o m b 静电作用项表示) ，有时把生物体系中重要的氢键相互作用能勘。d 在非键能量项中明确表达。非键作用势函数形式对力场的精度影响非常大，由于动力 学模拟时非键相互作用在每一时间步长内都要进行全体系积分计算量非常大，实际应 用中采用截取( c u t o f d 的做法，即只对截取距离范围内进行积分，范围之外的影响忽略 不计。 m d 模拟中常见的力场有：a m b e r 、c h a r m m 、d i s c o v e r 、e c e p p 、g r o m o s 等。这些力场的基本形式是相似的，只是在能量函数各项的参数选取上有些差别。这 些力场在研究分子随时问变化过程，优化构象以及自由能微扰计算方面等都有许多应 用。本论文中m d 模拟采用了a m b e r 力场。下面具体介绍这种力场。 a m b e r 力场是k 0 1 1 m a n 科研组丌发的力场，可能是目前应用最为广泛的力场之 一。最初的a m b e r 力场参数化需要的数据全部由实验获得( w e i n e r1 9 8 4 ，w e i n e r 1 9 8 6 ) 。最初的a m b e r 力场仅仅为蛋自质和核酸体系提供了相应的原子类型和力场 参数。比如，1 9 9 0 年，h o m a n 等对a m b e r 力场进行了扩展，发展了适用于多糖模 拟的力场参数( h o m 柚1 9 9 0 ) 。k 0 1 l m a n 的课题组也对a m b e r 力场进行了几次修正 和扩展( c o m e l l l 9 9 5 ，w a n g2 0 0 0 ) ，加入了一些适用于有机小分子的原子类型和参数 【2 4 1 。因此，扩展的a m b e r 力场不仅仅适用于蛋白质和核酸体系，还可以用于一些高 分子和小分子体系的计算。但总的来讲，a m b e r 力场对有机小分子的支持还很不完 备，目前其应用范围还基本局限于大分子体系。此外，由于a m b e r 力场中的势函数 北京化t 大学硕上学位论文 形式比较简单，其扩展性可能会受到一定的约束。a m b e r 力场已经用于各种分子模 拟软件包中，包括i n s i 曲ti i 、c 嘶u s 2 、s y b y l 以及m o e 等。 应用此力场通常可得到合理的气态分子几何结构、构型能、振动频率与溶剂化自 由能。a m b e r 力场的参数全来自计算结果与实验值的对比，此力场的标准形式为： u = k ：( 6 一) 2 + ( 秒一岛) 2 + 去 1 + c o s ( 刀矽一九) 】 十小c 知焉+ c 孚一争， 陆9 ， 其中，6 、臼与矽为键长、键角与二面角；第四项为范德华作用项，第五项为静电 作用项，第六项为氢键的作用项。 2 2 3 主要算法 ( 1 ) 周期性边界条件( p e r i o d i cb o u n d a f vc o n d i t i o n s ) 要缩小一个特定系统的边界影响，经典的方法是为系统加上周期性边界条件。将 系统中的原子放入一个盒子里，盒子周围都是与自身相同的复制体，这样对整个系统 来说就没有边界了【2 5 】。 ( 2 ) s h a k e 算法 为了保证体系结构在m d 模拟过程中的合理性，我们通常为键长加上约束，最常 用的方法是s h a k e 算法。s h a k e 算法通过一组无约束的坐标转化为一组约束距离 的新坐标。s h a k e 需要一个容忍度t o l ( t 0 1 e r a i l c e ) ，直到所有约束满足t o l 。 ( 3 ) 溶剂模型 水分子通常有以下几种溶剂模型：t i p 3 p ( j o r g e n s e ne ta 11 9 8 3 ) 、s p c ( b e r e n d s e n e ta l1 9 8 1 ) 、s p c e ( b e r e n d s e ne ta 1 1 9 8 7 ) 、t i p 4 p ( j o 唱e n s e ne ta 1 1 9 8 4 ) 、s t 2 等模型 【2 6 】 o 八彩 场 国移 s p c t 垆4 p s p c ，eb f 图2 1 水溶剂模型 f i g u r e2 - lw a t e rs o l v e l l tm o d e l s 1 2 北京化工大学硕士学位论文 2 2 分子对接方法 分子对接是指两个或多个分子通过几何匹配和能量匹配相互识别的过程。在药物 设计中有十分重要的意义。药物分子在产生药效的过程中，需要与靶酶相互结合，这 就要求两个分子要充分接近并采取合适的取向以使二者在必要的部位相互契合，发生 相互作用，继而通过适当的构象调整，得到一个稳定的复合物构象。通过分子对接确 定复合物中两个分子正确的相对位置和取向，研究两个分子的构象特别是底物构象在 形成复合物过程的变化是确定药物作用机制，设计新药的基础。 2 2 1 分子对接的原理 配体与受体能否结合，以及配体与受体的结合强度则取决于结合过程的自由能变 化： 瓯。咖= 一尺丁1 i l k ( 2 一l o ) 其中k j 是药物对受体的结合常数。而结合自由能又可以表示为： g b i n d i n g = hb t n d l n g t s b 喇i n g q 一、1 、) 大部分的分子对接法忽略了全部的熵效应，而在焓效应中也只考虑配体与受体的 相互作用能。配体与受体的相互作用包括静电作用( e k 胁招廊) 、范德华作用( ) 和氢键相互作用( 点0 勘。) ，即： e 嘛e 。嘶m = e 巾彤+ e 踟c l 。c n t i c + e h 一d q l 砼 根据所采用的力场的差异，上式中的氢键作用可以显式地表达；也可以通过调整 相应原子的范德华半径来处理，或者将其包含在静电作用能中。 2 2 2 分子对接方法 分子对接方法根据不同的简化程度大致可以分为三类：刚性对接、半柔性对接以 及柔性对接。表2 1 列出了有代表性的分子对接方法。 1 、刚体对接 指在对接过程中，研究体系的构象不发生变化。适合考察比较大的体系，如蛋白 质和蛋白质问以及蛋白质和核酸之问的对接。其中比较有代表性的方法是j i a n g 等发 展的软对接( s o nd o c k