三氯蔗糖成品的检测方法.docx

XXXXX检验方法三氯蔗糖版本号/修订次：A/00第 13 页 共13 页生效日期:2013年09月01日物料名称三氯蔗糖测试项目色泽、组织状态、气味、含量、比旋光、水分、灼烧残渣、水解物、相关物、甲醇、砷、重金属、鉴别、PH、颗粒度、堆积密度、三苯氧磷、细菌总数、霉菌酵母菌、铅、溶液的颜色和澄清度、口感1 色泽、组织状态1.1仪器洁净的白搪瓷托盘1.2试剂无1.3实验步骤 取20g样品置于清洁、干燥的白瓷盘中，在相同的自然或照明光线下，观察其色泽和组织状态。1.4注意事项确保使用的取样签、取样袋干净无污染，取完样后立即扎紧袋口。2 气味2.1仪器 留样瓶2.2试剂 无2.3实验步骤 三氯蔗糖倒入留样瓶中，在塑料留样瓶中嗅其味。2.4注意事项 确保使用的取样签、取样袋干净无污染，留样瓶无污染。3 含量3.1 仪器和设备 高效液相色谱仪（配备示差折光检测器）、电子天平3.2试剂 色谱纯乙腈、三氯蔗糖标准品。3.3实验步骤参考色谱条件 a) 色谱柱：SUPELCOSILTMLC-18 4.6*250 5m。或其他等效色谱柱。 b) 流动相：将150mL 乙腈与850mL 水混合均匀后，用0.45m 滤膜过滤，超声脱气后备用。 c) 柱温：30。 d) 流动相流速：1.0 mL/min。 e) 进样量：60 L。 f) 三氯蔗糖保留时间：9min 左右，为确保获得所需的保留时间，必要时可以调整流动相的比例。注：系统适用性为重复注入标准溶液两次，所得响应面积的RSD不大于2.0。 分析步骤 标准溶液的制备：称取0.1500g 三氯蔗糖标准品（精确至0.0001g），溶于预先准确称取的49.0000g纯水中，所得溶液用0.45m 滤膜过滤，滤液备用。试样液的制备：称取约0.1500试样（精确至0.0001g），溶于预先准确称取的49.0000g纯水中，所得溶液用0.45m 滤膜过滤，滤液备用。测定 在3.3 参考色谱条件下，分别对标准溶液和试样液进行测定，进样量为60 L，重复进样一次，计算出其主峰面积平均值。计算结果X1=AU*MS*P/（AS*MU）*100式中：X1试样中三氯蔗糖的含量，%；AU试样液色谱主峰面积的平均值；MS称取三氯蔗糖标准品质量，g；P三氯蔗糖标准品的含量，%；AS标准溶液色谱主峰面积的平均值；MU称取的试样质量，g；实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。3.4注意事项 a)系统适应性为重复注入标准溶液两次，所得响应面积的RSD不大于2.0。 b)进样时不得有气泡，并且进样速度保持匀稳推进。4 比旋光4.1仪器旋光仪、容量瓶、电子天平4.2试剂纯水4.3实验步骤精确称取1g（精确至0.0001g）待测样品，用纯水溶解，定容至50ml同时做空白。先将装有空白液的试管放入样品室，将测量示数清零。然后将待测样品注入试管，同方向放入样品室，测量其旋光度。计算公式：【】=50*/(2*m)+0.1*(T-20)其中：所测得旋光度；m样品质量T测定条件下的温度两次平行测定结果不超过0.5%，取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。4.4注意事项a) 使用前调试仪器先要开电源开关，预热约30分钟；b) 样品的测试温度要控制在室温200.5；c) 从溶解样品到测试的整个过程时间要短，防止样品因温度和容积变化带来测试偏差；d) 测试过程中试液不能滴漏到仪器上，测量时旋光管中的气泡要赶到球中。5 水分5.1仪器水分测定仪、注射器、天平5.2试剂无水甲醇、卡尔费休试剂、纯水5.3实验步骤在卡尔费休滴定池内先注入约20ml左右的无水甲醇，用卡尔费休试剂滴定至终点，然后用10l进样针抽取10l纯水样，注入滴定池，再用卡尔费休试剂滴定，记下读数V1,紧接着称取1g左右三氯蔗糖试样，精准至0.0001g，记下读数m,注入滴定池，用卡尔费休试剂再次滴定，记下读数V2，最后按下式计算：W=(V2/V1*m*100)*100%其中： V1滴定纯水时消耗的卡尔费休试剂的体积，mlV2滴定试样时消耗的卡尔费休试剂的体积，mlm试样的质量，gw一水精制的水分取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。两次平行测定结果之差值不大于0.03%。5.4注意事项a)确保所使用的试剂在有效期内；b)称量、计算必须准确无误。6 灼烧残渣6.1仪器电子天平、马弗炉、干燥器6.2试剂试剂硫酸6.3实验步骤精确称取1.0000g样品于恒重的坩埚中，放电炉上烧至无烟，冷却10分钟后加1ml硫酸，继续烧至无烟放置于800的马弗炉中，3小时后取出置于电炉上稍冷却数秒钟，再置于干燥器中冷却至室温称量。计算公式：w=m1-m2m*100%其中：m1为坩埚+试样灼烧前的质量，g；m2为坩埚+试样灼烧后的质量，g；m为样品质量，g。6.4注意事项a) 称样量必须精准；b) 加硫酸时一定要等冷却10分钟后才加，以防坩埚爆裂；c) 确保使用的坩埚是恒重的，并且一定要放在干燥器中冷却。7 PH7.1仪器酸度计、温度计7.2试剂pH=4.00，6.86, 9.18的缓冲溶液7.3实验步骤样品制备：准确称取10g（精准至0.0002g）的样品于100ml小烧杯中，加90ml的纯水溶解。开机预热30min，测量前用PH=4.00，6.86，9.18的缓冲溶液进行仪器校准，再用卷纸擦拭干，将电极插入样品，按读数键，当出现根号后，记下读数。7.4注意事项a) 测量前一定要开机预热，并进行3点校正；b) 使用完电极要放在饱和氯化钾溶液中。8 相关物8.1仪器 薄层层析板：涂有0.2mm 厚度的C18 烷基修饰的硅胶或其他等效物质。8.2试剂 三氯蔗糖标准品：质量分数98.0%、乙腈、硫酸、无水甲醇、氯化钠溶液：50g/L。8.3实验步骤 展开剂的制备：氯化钠溶液乙腈=7030（体积比） 显色剂的制备：配制15%硫酸的甲醇溶液（体积分数）。 标准溶液的制备：称取0.5g 三氯蔗糖标准品（精确至0.001g），溶解于5.0mL 甲醇中，此为溶液C。吸取0.5mL的溶液C，用无水甲醇定容至100mL，此为溶液D。 试样液的制备：称取1.0g 试样（精确至0.001g），溶解于10.0mL 甲醇中。 取溶液C、溶液D 和试样液各5L，点于薄层层析板底部，将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，待展开的溶剂前沿移至15cm 时后取出薄层层析板，放置，待展开剂挥发干净后用显色剂喷雾，然后于1252烘箱中加热10min。试样液主色斑的Rf值应与溶液C 主色斑的Rf值相同，且试样液中其他色斑的呈色应不深于溶液D 主色斑的呈色。Rf 值试样展开后斑点到原点的距离与溶剂前沿到原点的距离的比值。8.4注意事项a)所有试剂都在有效期内；b)手拿薄层层析板时，不要碰到涂有0.2mm 厚度的C18 烷基修饰的硅胶的一面；c)在点板时，戴上口罩，防止薄层层析板被污染；d)展开缸内一定要干净无污染；e)原点不要浸在展开剂里9 水解物9.1仪器和设备薄层层析板：涂有0.25mm 厚度的Merk 硅胶60 或其他等效物质。9.2试剂对氨基苯甲醚、邻苯二甲酸、甲醇、甘露糖醇、果糖。9.3实验步骤 显色剂的制备：将1.23g对氨基苯甲醚（有毒害性）和1.66 g 邻苯二甲酸溶于100 mL 甲醇中。将溶液存放在暗处并冷藏，如果溶液退色则已失效。 标准溶液A的制备：称取10g 甘露糖醇（精确至0.001g），用水溶解后，移入100mL 容量瓶中，用水定容至刻度。 标准溶液B的制备：分别称取10g 甘露糖醇（精确至0.001g）和0.04g 果糖（精确至0.0001g），移入100mL 容量瓶中，用水定容至刻度。试样液的制备：称取2.5g 试样（精确至0.001g），用5mL 甲醇溶解后，转移至10mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。取标准溶液A、标准溶液B 和试样液各5L，分别在同一块薄层层析板的不同位置进行点样，将每份溶液分5 次(每次1L) 点于板上，每次点样之间要待样点干燥后再继续点，3 份样点的面积要基本相同，点样完毕后用显色剂喷雾后于1002烘箱中加热15min，加热后立即在阴暗背下观察层析板，试样液的色斑呈色不应深于标准溶液B 的色斑呈色。9.4注意事项a) 如果标准溶液A 的点样点变黑，说明层析板加热时间过长，需重新制备；b) 对氨基苯甲醚是有毒物质，操作时注意不要和皮肤接触；10 甲醇10.1 仪器和设备 气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器。10.2 试剂 甲醇标准品（色谱纯）、色谱纯正丙醇、色谱纯吡啶。10.3实验步骤参考色谱条件 a) 色谱柱：2.1m4mm（内径）玻璃柱，内填充0.2mm0.15mm 聚苯乙烯型色谱固定相；或其他等效色谱柱。 b) 载气：氮气或氦气。 c) 柱温：150。 d) 进样口温度：200。 e) 检测器温度：250。 f) 流速：20mL/min。 g) 进样量：0.2L。注：系统适用性为重复注入标准溶液两次，所得响应面积的相对误差小于2.0。实验步骤 内标溶液的制备：准确吸取1.0mL正丙醇，置于100mL 容量瓶中，用吡啶定容至刻度，摇匀。移取5mL 该溶液，置于500mL容量瓶中，用吡啶定容至刻度，摇匀。标准溶液的制备：准确吸取2.0mL甲醇，置于100mL容量瓶中，用内标溶液定容至刻度，摇匀。移取1.0mL该溶液，置于100mL容量瓶中，用内标溶液定容至刻度，摇匀。试样液的制备：称取约2g试样（精确至0.001g），用内标溶液溶解，移入10mL容量瓶中，用内标溶液定容至刻度，摇匀。在10.3参考色谱条件下，分别对标准溶液和试样液进行测定，进样量为0.2L，重复进样一次，计算出每次进样甲醇峰面积与内标物峰面积的比值。结果公式： x=RU*0.00158RS*MU*100%式中： X试样中甲醇的含量，%； RU两次进样试样液中甲醇与内标物(正丙醇)峰面积之比的平均值；0.00158标准溶液中甲醇的浓度甲醇的密度试样液的体积（210-40.7910） RS两次进样标准溶液中甲醇与内标物(正丙醇)峰面积之比的平均值； MU称取的试样质量，单位为克（g）。实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。10.4注意事项a) 样品一定要称得精准；b) 所使用的烧杯、进样瓶、注射器等一定要干净无污染。11 重金属11.1仪器 50mL纳氏比色管11.2试剂硝酸、硫酸、6mol/L盐酸、1mol/L盐酸、6mol/L氨水、1mol/L氨水、PH3.5的乙酸盐缓冲液、酚酞指示液、饱和硫化氢水、铅标准溶液、1%硝酸11.3实验步骤试剂配制：6mol/L盐酸：量取50mL盐酸，用水稀释至100mL。1mol/L盐酸：量取8.3mL盐酸，用水稀释至100mL。PH3.5的乙酸盐缓冲液：称取25.0g乙酸铵溶于25mL水中，加入45mL6mol/L盐酸，用稀盐酸或稀氨水调节PH值至3.5，用水稀释至100mL。酚酞指示液：1%乙醇溶液。饱和硫化氢水：将硫化氢气体通入不含二氧化碳的水中，至饱和为止（此溶液临用前制备）。铅标准溶液：称取0.1598g高纯硝酸铅，溶于10mL1% 硝酸中，中定量移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。此溶液1mL相当于1.0mg铅。临用前用水稀释至100倍，使成1.0mL相当于10ug铅（可以外购之）。1%硝酸：取1mL硝酸加水稀释至100mL。试样处理：称取试样5.0g置于坩埚中，加入适量硫酸浸润试样，小火碳化后，加2mL硝酸和5滴硫酸，小心加热，直到白色烟雾挥尽，移入高温中，于550灰化完全，冷却后取出，加2mL 6mol/L盐酸浸润残渣，于水浴上慢慢蒸发至干。用1滴浓盐酸浸润残渣，并加10mL水，于水浴上再次加热2min ，将溶液移入50mL容量瓶中，如有必要须过滤，用少量水洗涤坩埚和滤器，洗涤液一并移入容量瓶中，混匀，每10mL该溶液相当于1.0g试样。在试样灰化同时，另取一坩埚，按上述方法座试剂空白实验。A管：吸取含铅量相当于指定种金属限量的铅标准溶液（不低于10ug铅）于50mL纳氏比色管中（如试样经处理，须同时吸取与试样液等量的试剂空白液），加水至25mL，混匀，加1滴酚酞指示液，用6mol/L稀盐酸或1mol/L稀氨水调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。B管：取一支与A管所配套的纳氏比色管，加入10mL-20mL（或适量）试样液，加水至25mL，混匀，加1滴1% 酚酞指示液，用6mol/L稀盐酸或1mol/L稀氨水调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。C管：取一支与A、B所配套的纳氏比色管，加入与B管等量的相同试样液，再加入与A管等量的铅标准溶液，加水至25mL，混匀，加1滴1% 酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水（6mol/L或1mol/L）调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。向各管中加入10mL新鲜备制的硫化氢饱和液，并加水至50mL刻度，混匀，于暗处放置5min后，在白色背景下观察，B管的色度不得深于A管的色度，C管的色度应与A管的色度相当或深于A管的色度。11.4注意事项：a) 所有试剂都在有效期内；b) 所用玻璃仪器都要用10%-20%的硝酸浸泡24h以上，用自来水反复冲洗，最后用纯水冲洗；c) 实验中运用的强腐蚀实际时，注意安全，做好防护工作。12 砷12.1仪器 测砷装置12.2试剂 5%溴化汞乙醇溶液、溴化汞试纸、硝酸、1+1硫酸、1mol/L硫酸、盐酸、20%氢氧化钠溶液、氧化镁、15%硝酸镁、15%碘化钾、40%氯化亚锡、无砷金属锌、酚酞指示液、10%乙酸铅、脱脂棉12.3实验步骤试剂配制：溴化汞试纸：将剪成直径2cm的圆形滤纸片，在5%溴化汞乙醇溶液中浸泡1h以上，保存于冰箱中，临用前取出置暗处阴干备用。乙酸铅棉花：将脱脂棉浸于10%乙酸铅溶液中，2h后取出晾干。40%氯化亚锡溶液：称取20g氯化亚锡，溶于50mL盐酸。1+1硫酸：将1体积浓硫酸慢慢加入1体积水中，冷却后使用。1mol/L硫酸：量取28mL浓硫酸，慢慢加入水中，用水稀释至500mL。酚酞指示液：1%乙醇溶液。砷标准溶液：称取0.1320g于硫酸干燥器中干燥至恒重的三氧化二砷，溶于5mL20%氢氧化钠溶液中，溶解后，加入25mL1mol/L硫酸，移入1000mL容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度。此溶液1.00mL相当于0.100g砷。临用前取1.0mL，加1.0mL1mol/L硫酸与100mL容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度，此溶液1.0mL相当于1.0ug砷（可以外购之）。试样的处理：取5.0g试样于瓷坩埚中，加10mL15%硝酸镁溶液，加入1g氧化镁溶液，混匀，浸泡4h，于低温或水浴上蒸干，用小火加热至炭化完全，将坩埚移至高温炉中，在550以下灼烧至灰化完全，冷却后取出，加适量水湿润灰分，加入酚酞溶液数滴，再缓缓加入盐酸（1+1）溶液至酚酞红色褪去，然后将溶液移入50mL容量瓶中（必要时过滤），用少量水洗涤坩埚3次，洗涤并容量瓶中，加水至刻度，混匀。每10mL试样液相当于1.0g试样。取相同量的氧化镁、硝酸镁、按上述方法做空白试验。 吸取一定量的试样液和砷的限量标准液（含砷1.0ug或2.0ug），分别置于锥形瓶中，加5mL盐酸（试样液中如含硫酸或盐酸，则要减去试样液中所含酸的毫升数），加水至30mL，再加5mL15%碘化钾溶液，5滴40%氯化亚锡溶液，混匀，室温放置10min。向上述锥形瓶中，各加入3g无砷金属锌，并立即塞上预先装有乙酸铅棉花及溴化汞试纸的测砷装置，于25放置1h ,取出砷斑进行比较，试样的砷斑不得深于砷的限量标准的砷斑。12.4注意事项： a) 所有试剂都在有效期内；b) 所用玻璃仪器都要用10%-20%的硝酸浸泡24h以上，用自来水反复冲洗，最后用纯水冲洗；c) 实验中运用的强腐蚀实际时，注意安全，做好防护工作。13 颗粒度13.1仪器振筛仪、电子天平13.2试剂无13.3实验步骤称取10.0g样品，根据样品的规格选择相应目数的筛网，将样品倒置筛网上，盖好盖子。放置振筛仪上，并设置振筛时间为5分钟。振完后，根据样品规格分别称量筛网上、筛网下样品的质量m。计算公式：m/10 *100%13.4注意事项根据样品规格要求，筛网上、筛网下样品质量不能弄混淆。14 堆积密度14.1仪器10ml容量瓶、电子天平14.2试剂无14.3实验步骤将10ml容量瓶放置天平上，清零，然后将样品放置称量纸上倒入容量瓶中，力度均匀地摇晃40-50下，直至样品到容量瓶刻度线。放置天平称量，记下读数m。计算公式：m/1014.4注意事项一定要力度均匀慢慢地摇晃。15 鉴别在检测三氯蔗糖含量试验中，试样液在液相色谱图中的主峰保留时间应与标准溶液中三氯蔗糖的保留时间相同。16 三苯氧磷16.1 仪器和设备 高效液相色谱仪（配备紫外检测器）、天平16.2试剂 色谱纯乙腈、三苯氧磷标准品。16.3实验步骤参考色谱条件 a) 色谱柱：C18 反相色谱柱，8mm10cm，粒度5m。 b) 流动相：将670mL 乙腈与330mL 水混合均匀后，用0.45m 滤膜过滤，超声脱气后备用。 c) 柱温：室温。 d) 流动相流速: 1.5 mL/min。e) 进样量：25L。 f) 三苯氧磷保留时间：6min 左右，为确保获得所需的保留时间，必要时可以调整流动相的比例。 标准溶液的制备：精确称取0.1000g 三苯氧磷准品（精确至0.0001g），用流动性定溶到10mL的容量瓶中，再从中移取1.0mL溶液用流动相定溶到100mL容量瓶，再把该溶液稀释100倍，所得溶液用0.45m 滤膜过滤，滤液备用。试样液的制备：称取约0.1000试样（精确至0.0001g），记录下样品的重量。用流动性定容到10mL的容量瓶中，所得溶液用0.45m 滤膜过滤，滤液备用。在17.3 参考色谱条件下，分别对标准溶液和试样液进行测定，进样量为25 L，重复进样一次，计算出其主峰面积平均值计算公式：x=At*10000AS*Wt式中：X三苯氧磷的含量； At三苯氧磷的峰面积； AS样品的峰面积； Wt样品的称样量；mg。16.4注意事项 a)系统适应性为重复注入标准溶液两次，所得相应面积的相对误差不大于2.0%； b)进样时不得有气泡，并且进样速度保持匀稳推进。17 细菌总数17.1仪器培养箱、电子天平、放大镜、无菌均质杯、无菌平皿、无菌吸管（无菌移液枪）17.2试剂磷酸盐缓冲液、营养琼脂17.3实验步骤17.3.1样品稀释与培养称取10g样品置盛有90ml磷酸盐缓冲液的无菌均质杯中，制成1：10的样品匀液。吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，做平行样。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15ml-20ml冷却至46的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48小时1小时。17.3.2菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。a) 选取菌落数在30300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板计录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。b) 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。c) 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。17.3.3菌落计数的计算方法平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(ml)样品中菌落总数结果。17.4注意事项若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。18 霉菌酵母菌18.1仪器培养箱、电子天平、放大镜、无菌均质杯、无菌平皿、无菌吸管（无菌移液枪）18.2试剂孟加拉红培养基18.3实验步骤18.3.1样品稀释与培养称取10g样品置盛有90ml蒸馏水的无菌均质杯中，制成1:10的样品匀液。吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，做平行样。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15ml-20ml冷却至46的孟加拉红培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，281培养5d，观察并记录。18.3.2菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌数。以菌落形成单位（CFU）表示。选取菌落数在