（预防兽医学专业论文）兔乳腺上皮细胞凋亡的研究.pdf

中文摘要 用5 6 只成年日本大耳白母兔进行乳腺上皮细胞凋亡观察试验，来探讨哺乳动物在泌乳期前 后乳腺上皮细胞凋亡数量及泌乳量变化的规律。母兔试验前和期间自由采食和饮水。泌乳前后 乳腺上皮细胞凋亡数量检测的采样时间分别为未妊娠、分娩后第2 d ，8 d ，1 6 d ，2 4 d ，3 2 d ，3 9 d ，4 6 d 共8 个时间点进行采样。在前6 个时间点各屠宰5 只母兔，在后2 个时间点各屠宰3 只母兔， 每只母兔取乳腺组织迅速分别放入平皿置4 冰箱中保存和放入中性福尔马林固定液中保存； 测量泌乳量的采样时间分别为分娩后第2 d ，8 d ，1 6 d ，2 4 d 共四个时间点进行采样，每个时间点测 量2 0 窝仔兔吃奶前和吃奶后的体重。 本试验采用苏木素伊红染色法、免疫组织化学s p 染色法、流式细胞仪分析法检测母兔泌 乳前后乳腺上皮细胞凋亡数量：采用仔兔吃奶前后窝体重变化差值测量泌乳量。试验数据均用 s a s 软件统计分析。结果如下：( 1 ) 苏木苏一伊红染色，细胞核呈蓝色，胞浆呈粉红色。未妊娠 期乳腺腺泡小，腺泡腔内无分泌物，腺上皮为单层立方上皮，凋亡细胞核浓缩，呈圆形或新月 形，数量多，与分娩后各期凋亡细胞数量差异极显著( p o 0 5 ) ，与分娩后其他各期凋亡细胞数 量差异极显著( p o 0 5 ) ；分娩后3 9 天， 凋亡细胞数量逐渐增多，变化显著( p 0 叭) ；( 2 ) 免疫组化染色，正常细胞核被染成蓝色，凋 亡细胞质被染成棕褐色。未妊娠母兔与泌乳后各期乳腺组织细胞凋亡数量差异极显著( p o 0 5 ) ，与分娩后其他各期差异极 显著( p o 0 5 ) ；( 3 ) 流式细胞仪分析法检 测，未妊娠期母兔乳腺上皮细胞凋亡比率大，泌乳旺期乳腺细胞凋亡比率小。未妊娠期与分娩 后各时期凋亡百分率差异极显著( p o 0 5 ) ；分娩后3 2 天与分娩后4 6 天和未妊娠期差异极显著( p o 0 5 ) ，到分娩后 1 6 天达到高峰，与其他三期泌乳量差异极显著( p o 0 1 ) ，分娩后2 4 天泌乳量下降，变化显著 ( p o 0 5 ) 。( 5 ) 母兔泌乳量与乳腺上皮细胞凋亡数量呈负强相关。 以上结果表明：( 1 ) 未妊娠兔乳腺细胞凋亡数量大，在泌乳初期及泌乳后期也较显著，在 泌乳旺期细胞凋亡不显著。( 2 ) 泌乳量在分娩后第1 6 天达到峰值，且与细胞凋亡呈负强相关。 在实际的临床实践中，哺乳动物产奶量与乳腺上皮细胞凋亡数量之间这种负相关关系，为 探索通过抑制细胞凋亡途径提高泌乳量及临床防治乳腺疾病提供了科学的理论依据。 关键词：兔，乳腺上皮细胞，细胞凋亡，免疫组化，流式细胞仪 黑龙江省教育厅资助项目( 项目编号：2 0 0 0 9 0 ) a b s t r a c t i no r d e rt od i s c u s st 1 1 em 锄m a lsa p o p t o s i sq u a n t i t yo f g a l a c t o p h o r ee p j t h e l i u m 柚dt h em j i ky i e l d c h a n g e b e f o r ea n da 雠rt h e 】a c 雠i o np e o d ，w eu s e d5 6j a p a n e s ea d u l tl o n g - e a r e dw h i t em o t h e r r a b b i t st oc a h yt h r o u g hao b s e r v ee x p e n m e n to fg a l a c t o p h o r ee p i t h e l i u ma p o p t o s i s b e f o r ea f l di nt 1 1 e p e r i o do fe x p e r i m e n t ，l h ea n j m a lw a sf e do rd n m kf r e e l 弘t h e8s a mp l l n gt i m ew h j c ht om e a s u r et h e a p o p t o s i s 帅o u n tg a l a c t o p h o r ee p i t h e l i u mb e f o r ea n d 掮e rt h el a c t a t i o np e o di sn o tp r o g n a l l c ya i 】d t h e2 d ，8 d ，1 6 d ，2 4 d ，3 2 d ，3 9 d ，4 6 da r e rd e l i v e r yr e i p e c t i v l yf o r e6t i m eo r d e r se a c hs l a u g h t e r5m o t h e r r a b b i t s ，a ta r e r2t i m eo r d e re a c hs l a u 曲t e r3 m o t h e rr a b b i t s ，t h em a m m a r yg l a n d so 培a n i 动t i o nq u i c k l y w e r et a k e nt ok e e pi nt h en x e d1 i q u di nt h en e u 仃a lf o n n a l i ni n4 r e 衔g e r a t o r sj n t ot h ep l a t e r e s p e c t i v e l y ；t h et i m eo fm e 删 n gt h eq u a n t i t yw a sd i v i d e d i n t ot h e2d a y ，8 da y ，1 6d a y 2 4d a y a 丘e rd e l i v e r * e a c ht i m eo r d e r st om e a s u r et h ew e i g h to f 2 0n e s tb a b yr a b b i tb e f o r ea i l da n e rs u c “i n g t h ee x p e r i m e n tu s eh e m a t o n y ma n de o s i ns t a i nm e t h o di m m u n i t yh i s t o c h e m i s t r ym e t h o d s pt 0 o b s e r v ea l lt h ea p o p t o s i sq u a n t 时b e f o r ea n da n e rf 抽a l er a b b j t sl a c t a t i o np e o d ；e m p l o y i n gh o w d y w e i 曲tv a r i a t i o nb e f o r ea 1 1 da f 【e r b a b yr a b b i ts u c k h n gt om e a s u r et h em i l ky i e l da l lt t l ee x p e m e n t d a t ai s 锄a l y z e db ys a ss o 帅a r et h er e s u l ta sf o l l o w i n g ：( 1 ) h es t a i n ，n o m a lc e l l 叫c l e u ss h o w s b l u e c ”o p l a s ms h o w sp i n k n o n _ p r e g a tg a l a c t o p h o r ca c i n u si ss m a l l t h e r ei sn os e c r e t i o ni na c i n u s c a v e “a n d u l a re p i t h e l i u mi s s j n g l e l a y e rc u b i c a le p i t l l e l i u m ，a p o p t o s i sc e l lc o r ec o n d e n s e ，s h o w i n g m u n da n dn e wm o o ns h 印e t h en u m b e ro f 印o p t o s i si sl a 唱e t h ec e l l 印o p t o s i sn u m b e rj so b v i o u si n t h ed i 廊r e n tp e o da r e rd e l j v e r y ( p o 0 1 ) ，t 、v od a y sa r e rd e l i v c r yg a l a c t o p h o r ea n i m u sb e c o m e sb i g g e r e p i t h e l i u mc e l ls h o wp i 】i l c h e o n ，n o 兀t t a lc e l ln u c l e u sp r e s e n t se l l i p s ea c i n u sc o n eb e c o m eb i g g e rs o m e o f t h e mj s 如1 lo fs e n i o t y 印o p t o s i sc e 】ln u m b e rd e c r e a s et h ee l i m i n a t i o na su n n o t i c e a b i ec o m p 撕n g t ot h ec e i l 印o p t o s i sn 哪b e r4 6d sa 髓rd e l i v e r y ( p o 0 5 ) h o w e v e ld i t n l c t i o ni sr a 廿1 e rr e t r i e v a b l ea t t h eo t h e rp e o d 确e rl a c 协i o n ( p o 0 5 ) 3 9 d sa 舭rd e l i v e m c e l lt h e a p o p t o s i sq u a n t i t yg r a d u a l l yi nc r e a s e ，o b v i o u sc h a n g e ( p 00 1 ) ，( 2 ) i m m u n i l yh i s t o c h e m i s n y s t a i n ，s h o w i n gt h en o n n a ic e l ln u c l e u si sd y e db l u e ，t h e 印o p t o s i sc e l lq u a l i t yi sd y e dp a l mn eb m w n t h ea p o p t o s i sq u a l l t i yo ft h em a m m a r yh i s t o c ”ei sv e r yd j 仟e r e n ti nn o tg e s 协t i o nm o t h e rr a b b i ta n d f h er a b b j tw h j c hj sj ne a c hp e 打o do f 】a c t a t j 伽( p 0 0 5 ) ，c o m p a r et oo t h e rp e r i o d a r e rc h d b e “n gt h e r ei sc o n s p i c u o u sd i 艉r e n c e ( p 0o ti sn o tc o n s p i c u o u sd j 髓r e n c ei nt h e1 6 d s a n dt h e2 4 d sa n e rc h i l d b e a r i n g ( 3 ) f 1 0 wc ”o m e t r ya n a l y s i sm e t h o de x a i t l i n e s t h ea p o p t o s j sr a t i oo f m a m m a r ye p i t h e l i u mi nn o tg e s t a t i o np e r i o dm o t h e rr a b b ti sb i 岛a n di ti ss m a l li np r o s p e r o u sp e r i o do f l a c t a t i o nt h en o n n a io fn op m g l l a j l c e ya 1 1 dd e l i v e r ye x p r e s sac o n s p i c u o u sd i 行色r e n c ei na p o p t o s i s p e r c e n t a g er a i e ( p 0 0 5 ) i t i sc o n s p i c u o u sd i 疏r e n c ei nt h e n o tg e s t a t i o na n dt h e3 2d s ，t h e4 6 d sa n e r c h i l d b e a r i n g ( 4 ) t h em i l kq u a l i t yo f t h ef e m a l er a b b i tf m m t h e2d st o8d sa r e rc h i l d b e a n n gi n c r e a s e d g r a d u a l ly ，b u tc h a n g e i sn o tv e r yd i 腩r e n t ( p o0 5 ) ，t h e1 6 d sa 讹rc h i l d b e a r i n gi ia n a i n e dh 曲 p e a kc o m p a r e dw i t h o t h e rt i 玳ep e r i o d s ，t h ed i 雎r e n c eo fm j l kq u a l i t yi sc o n s p i c u o u s ( p o 0 1 ) ；t h e m ky i e l dd e s c e n d si nt h e2 4d sa n e rc h i l d b e a r i n g ，c h a n g ei sc o n s p i c u o u s ( p 0 0 5 ) ，t h em i l kq u a l i t yo f m o t h e rr a b b j ta n dt h ea p o p t o s i sq u a n t i t yo f m a m m a r ye p i t h e l i u mt a k en e g a t i v ec o r r e l a t i o n t h ea b o v er e s u l te x p r e s s e s ：( 1 ) t l l e m 锄m a r ye p i m e l i u m 印o p t o s i so fm o t h e rr a b b i t ，e v e r y p e r i o db e f o r ea i l d 撕e rl a c t a t i o na l w a y sc h a l l g er e g u l a r l yt h e 印o p t o s i sq u a l l t 时o fc e l li nt h e p r o s p e r o u sp e r i o do f1 a c t a t i o ni sa l m o s tf o rt h ez e r o ( 2 ) t h em i l ky i e l dw i t ht 1 1 ed i f r e r e n tp e r i o do f 1 a c t a t i o na l s op r c s e n tt h er e g u l a t i o nv a r i e t y 1 nt h ea c t u a lc l i n i c a lf u l n l l m e n t ，t h i sk i n do fr e l a t i o ni nt h em i i ky i e l do fm a m m a la n dt h e a p o p t o s i sq u a n t i t yo fm a m m a r ye p i t h e i i u m ，c a nh e l pu st of o u n da f le f r e c t i v em e t h o dt or a i s et h em i i k y i e l d ，m e a n w h i l ep m v i d ea ni m p o 煳tt h e o r yb a s i sf o rm e d i c i n er e s e a r c hd e v e l o p m e n tt op r e v e n ta 1 1 d c u r em a m m a r yg l a i l d sd i s e a s eo c c u r r e n c e k c y w o r d s ： r a b b i t ，m 锄m a r ye p i m e 】j u m ，a p 叩t o s i s ，i m m u n i t yh i s t o c h e m i s 臼mf l o wc ”o m e t r y t h ep r o j e c ta n d 疗n a n c j a i l yi nh e i l o n 西i a n ge d u c a i lo 塌c e ( s e r i a ln u m b e r ：2 0 0 0 9 0 ) l i i 独创性声明 y8 8 2 8 9 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：董心丹 时间：锄年月矿目 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：首。j ，乎 时间： 洲年么月廿日 新硌细从 时间：7 一i 年b t 厂日 时阃：寸一口0年玛| 厂日 黑龙江八一农垦人学硕上学他论殳前言 - 一一 日吣昂 1 9 6 6 年s a 蛐d e r 首次提出程序化细胞死亡( p r o g r a 册e dc e l ld e a t h ，p c d ) 的概念，井指出 p c d 是细胞生理性死亡。是生物进化过程中在自然选择压力下形成的有利于牛物体牛存的机制。 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) i _ j 细胞的生长、分化一样，属十虽摹本的细胞学事件或过程。自1 9 7 2 年k e h 等通过光镜和电镜观察提出凋亡概念用以描述这种形态学上有别于细胞坏死的细胞死亡过 程，细胞凋亡不引起炎症反应”。，从此开始了有关凋亡的研究。引入这一概念以来，其重要的生 理意义及检测技术探究就从来没有停止过。2 0 0 2 年有关程序性细胞死亡中基冈调控研究获诺贝 尔奖，使得a d o 口t o s i s 作为一种程序性细胞，e 亡( p r o g r 硼m e dc e lld e au 】，p c d ) 形式成为各个生 物学各领域研究的热点之。细胞捅亡是动物生命过程中不可缺少的组成部分，正常的生命体一 方面通过细胞分裂来产生新的细胞，一方面又通过程序性细胞死l 来清除“无用”的细胞，当这种 程序发生紊乱时，就会发生相关的疾病。其中坏死是一种主动的可控的科序性细胞夕e 亡”1 ，自噬细 胞死亡( a u t o p h a g i cp c d ) 也为另一种p c d 存在形式“。，a p u p 抽s j s 是生理意义较大的一种p c d 形 式。本研究主要探讨在生理情况下，成年口木大耳白兔乳腺组织细胞的凋亡隋况。 细胞凋亡与生长发育主要表现在：( 1 ) 组织器官形成所必须，如应用c a s p a s e 抑制剂抑制细胞 死亡，则阻碍指或趾的形成；( 2 ) 消除不! 珏要的器官结构；( 3 ) 控制细胞数量。如脊椎动物神经元 和少突胶质细胞有一3 卜经凋亡消除，使其数最与神经支配的靶绌胞和鞘形成的轴突相一致；( 4 ) 产生投有细胞器官的分化细胞。如某些上皮细胞、晶状体上皮细胞和哺乳动物的红细胞在分化过 程中丧失核及细胞器，其中分化的晶状体细胞和红细胞能继续存活和代谢，而分化的角质细胞捌 亡形成皮肤表层的鳞状上皮层。 细胞捌亡与免疫研究表明细胞凋亡是t 、b 淋巴绌胞分化发育的需要。对t 细胞而言，如果 r c r 基因发生等位无意义突变便不能产生正确的t c r 分子，此时细胞便走向凋亡；如果产生了正 确的t c r 分子，还必颁经过进一步的严格的选择机制，使可能导致自身免疫性疾病的细胞凋亡，此 即为胸腺的阴性选择作用或称负选择作削。b 淋巴细胞的发育过程与此相似，发生错误重组的或 能产生与自身抗原起让 别反应的b 淋u 细胞都要发生凋亡而被清除“1 。 研究证实，细胞凋亡减少和细胞存活增加引起的有关疾病有癌症、自身免疫病、某些病毒病 ( 如痘病毒、疱疹病毒) 、结肠息肉等”；细胞凋亡增加引起的有关疾病，如a t i ) s 、神经退行性疾 病”1 ( 阿尔茨海默痫、帕金森病、舞蹈病等) 、血细胞疾病( 再生障碍- 眭贫血、骨髓增生异常综合 症) 、心肌梗死、骨组织疾病等。同时研究表明细胞凋亡与肿瘤和器官移植密切相关。肿瘤的发 生并不是因为细胞生长过快而是因为细胞死亡太慢，使细胞凋亡受阻，造成不平衡的结果“一。 奶制品现在已成为人们生活所必需的营养品，奶牛、奶l 羊等哺乳动物泌乳期奶产量的高低、 乳腺癌及乳房炎的防治一直是养殖户关心的问韪，本研究利用日本大耳白兔为实验研究模型，来 探讨哺乳动物在泌乳前后各个时期乳腺上皮细胞凋亡的情况，咀期待能找山提高泌乳产量的有效 方法和防止或减少乳腺疾病发生的自效的药物开发提供理论依据。 方法和防止或减少乳腺疾病发牛的有效的药物开发提供理论依据。 黑龙江八一农垦火学硕士学位论文 第一章文献综述 1 3 细胞凋亡的生物学特征 1 3 1 形态学变化 形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞 也并非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质 密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素c 到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎， d n a 降解成为约1 8 0 b p 一2 0 0 b p 片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞 膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起 周围的炎症反应凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 1 3 2 生物化学变化 1 3 2 1d n a 的片段化 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的d n a 降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常 特异并有规律，所产生的不同长度的d n a 片段约为1 8 0 一2 0 0 b p 的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白 寡聚体的长度，提示染色体d n a 恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡 聚核小体片段，实验证明，这种d n a 的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核 小体连接部位切断染色体d n a ，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状l a d d e r 图 谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。 13 2 2 大分子合成 细胞凋亡的生化改变不仅仅是d n a 的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表 达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如我们实验室发现的t f a r 一1 9 就是在细胞凋亡时高表 达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入r n a 合成抑制剂或蛋白质合成 抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。 1 4c a s p a s e 凋亡基因 1 4 1c a s p a s e 分类和结构 目前认为细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性细胞死 亡过程。对线虫的研究表明c e d 3 基因的激活为线虫细胞凋亡所必需，其后在人类发现的与c e d 基因高度同源的c a s p a s e 家族，在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路 的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。人类c a s p a s e 家族成员至少有1 1 种，包括c a s p a s e l 1 0 、 1 3 ，而c a s p a s e 一1 l 、1 2 有种族特异性，仅存在于鼠中。最近在鼠中又发现了c a s p a s e 一1 4 。根据其 蛋白酶序列相似性可分为3 个亚族：c a s p a s e 一1 亚族，包括c a s p a s e l 、4 、5 、1 3 ；c a s p a s e2 3 的调节。cn l l a 初始被被认为是c a s p a s e l 的特异抑制剂，后认为对不同的c a s p a s e 有不同的作 用。c r m a 是c a s p a s e 一1 、一4 、一6 、8 的强效的抑制剂，而对c e d 一3 、c a s p a s e 一2 、一3 、7 、一l o 的抑制作用较弱”5 ”1 。 b c 卜2 家族成员在程序性细胞死亡中起关键作用，其基因家族产物包括抗凋亡和促进凋亡两 类蛋白质。在j u r k a t 细胞系中，b c 卜2 能抑制过度表达c a s p a s e 一3 、一7 所诱导的凋亡，提示b c 卜2 可能对下游c a s p a s e 有抑制作用，参与对c a s p a s e 活性的调节”“。此外b c 卜2 和b c l x l 能抑制 细胞色素c 从线粒体向胞浆流动，抑制其对凋亡的诱发作用。但b c 卜2 家族某些成员能被 c a s p a s e 一3 所剪切，产生具有促凋亡作用的片段，导致多种细胞凋亡。 杆状病毒的p 3 5 基因产物能抑制c a s p a s e 一1 、一2 、一3 、4 的活性，其克分子数与c a s p a s e 相等时对c a s p a s e 抑制作用最强。c a s p a s e 在p 3 5 的d q m d i g 位点对其切割后，被切割后的p 3 5 能与c a s p a s e 形成p 3 5 2 c a s p a s e 复合物，抑制c a s p a s e 后续分子的激活”。 对i a p 家族( i n h i b i t o ro fa p o p t o s i sf a m i l yo fp r o t e i n s ，i a p s ) 抑制凋亡的研究表明， i a p s 主要通过直接抑制c a s p a s e 活性，某些i a p s 还可将c a s p a s e 从胞内清除或与c a s p a s e 的底 物结合，阻断其介导的蛋白酶级联反应。如x i a p 能通过b i r 结构域( b a c u l o v i r u si a pr e p e a t s ) 抑制c a s p a s e 一3 、一7 、一9 的活性，而对c a s p a s e 一8 的活性无影响”。 在特异性抑制c a s p a s e 活性的多肽抑制剂中，多数抑制剂均无单一性。z - v a d f h ( ( b e n z y l o x y c a r b o n y v a 卜a 1 a a s p ( o m e ) f l u o r o m e t h y lk e t o n e ) 是一最早应用于抗c d 9 5 抗体 诱导的小鼠肝损伤模型的三肽化合物，是c a s p a s e 的可逆性抑制物，对多种刺激诱导的凋亡有 抑制作用”。z v a d f h i l ( 能抑制c a s p a s e 一2 、3 、一6 、一7 的活化和c a s p a s e 一8 诱导的凋亡。随着 研究的深入，也发现了一些单一c a s p a s e 多肽抑制剂，如a c w a d c h 0 仅抑制c a s p a s e 一1 和 a c d m q d c h o 仅抑制c a s p a s e 一3 等”“。 总之，c a s p a s e 在介导细胞凋亡中起重要的作用。尽管在不同细胞或同一细胞受不同刺激诱 发凋亡过程中激活的c a s p a s e s 不尽相同，但普遍认为c a s p a s e 一3 ( c p p 3 2 ，a p o p a i n ) 是细胞凋亡蛋 白酶级联反应的必经之路。人类c a s p a s e 一3 与c e d 一3 的同源性高达3 5 ，提示c a s p a s e 一3 是线虫 c e d 一3 在哺乳动物中真正对应者，有人称之为“死亡蛋白酶”。c a s p a s e 一3 介导的凋亡在人体多种 细胞中普遍存在。多种刺激因素启动的信号激活c a s p a s e3 ，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋 白质降解失活。可以说c a s p a s e 3 是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶”。 1 5b c l 一2 族凋亡基因 b c 卜2 基因是细胞凋亡研究中最受重视的基因之一，其表达的蛋白质b c l 一2 蛋白最初发现于 b 一淋巴细胞瘤白血病2 ( bc e l l1 ) r 【i i p h o m a l e u k e m i a2 ，b c l 一2 ) 而得名，与线虫c e d 一9 基因表达的c e d 一9 分子在结构上有同源性。b c l2 基因家族包含抑制和促进细胞凋亡两类功能相 反的基因，在细胞凋亡中发挥重要的调节作用。抑制细胞凋亡的基因包括：b c 卜2 、b c 卜x l 、b c 卜w 、 b f l l 、b r a g 一1 、m c 卜1 和a1 等。促进细胞凋亡的基因有b a x 、b a k 、b o k 、b c 卜x s 、b a d 、b i k 、 b i d 、b l k 和h r k 等。b c l2 家族中抑制与促进细胞凋亡的两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋 亡信号刺激时是否发生凋亡。这种比例的变化部分是由特定的蛋白间竞争性的二聚化作用决定 的。在细胞凋亡的调肖过程中，b c 卜2 家族成员通过互相的纯或杂二聚化作用形成动态平衡。目 6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一苹文献综述 前尚不能肯定二聚化是凋亡的调节形式，但也不能排除一部分二聚体参与形成更高形式的多蛋 白复合物影响凋亡的调节。 b c l 2 的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上， 并通过阻止线粒体细胞色素c 的释放而发挥抗凋亡作用。此外，b c 卜2 具有保护细胞的功能， b c l 2 的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽( g s h ) 的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而 降低了c a s p a s e 的活性。b a x 是b c l 2 家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞 液迁移到线粒体和核膜。有人研究发现，细胞毒性药物诱发凋亡时，核膜b a x 水平的上升与l a m i n 及p a r p 两种核蛋白的降解呈正相关。用b a x 寡核苷酸处理的细胞，只能特异地阻断l a l i l i n 的降 解，对p a r p 的降解不起作用。这种效应的调控机制目前仍然不清楚。 1 6p 5 3 族凋亡基因 p 5 3 是典型的肿瘤抑制基因，分野生型与突变型两种，野生型p 5 3 诱导细胞凋亡，突变型d 5 3 抑制细胞凋亡。野生型基因产物主要存在于细胞核内，积累时可促进细胞凋亡，当其缺乏时会引 起肿瘤细胞的无限繁殖。野生型p 5 3 诱导细胞凋亡的机制是使d n a 受损的细胞停滞于g 1 期。野 生型p 5 3 可促进c d k i n t e r a c t i n gp r o t e i nl ( c i p l ) 基因编码的2 1 k d 蛋白表达，从而抑制 细胞周期蛋白依赖性激酶2 ( c d k 2 ) 的表达，导致细胞不能进入d n a 合成期，停滞于g 1 期，利用 细胞自身修复机制修复受损伤的d n a ，若d n a 受损细胞不能有效修复，则细胞凋亡。另外，d 5 3 能特异性地抑制b c 卜2 的表达，但能促进b “的表达。目前已发现p 5 3 家族的成员有：p 5 3 、 p 6 3 ( p 5 1 ) 、p 7 3 。p 5 3 基因的突变与肿瘤发生密切相关，在人类全部肿瘤疾病中，发生p 5 3 突变 的约为6 0 ，突变型的p 5 3 基因干扰和灭活野生型p 5 3 的功能，使损伤的d n a 未经修复即进入子 代细胞，这种损伤的积累使细胞生长信号紊乱，导致细胞转化和过度增生，逐步形成肿瘤。 1 7n f kb 凋亡因子 n f - kb 是一种调节基因转录的核因子，调控着许多生物活性介质如细胞因子、趋化因子、 黏附分子等基因的转录与表达。n f _ xb 的活化会抑制凋亡的进行。n f _ xb 作为一种抗凋亡物质 早已得到证实，在用f a s l 诱导巨噬细胞凋亡的过程中n f - kb 可降低细胞凋亡的发生率，用n 卜 xb 抑制剂处理后巨噬细胞凋亡的发生率大大增加”“。最近研究表明，n f _ xb 的活化能阻止处于 c a s p a s e s 级联反应顶端的c a s p a s e 一8 的活化，从而抑制凋亡。n f - kb 能抑制t n f 诱导的细胞凋 亡，它的靶基因是t n f r 结合因子1 ( t r a f l ) 、t n f r 结合因子2 ( t r a f 2 ) 、抑制凋亡蛋白( i a p ) 。 1 8c m y c 基因 c m y c 也是一种原癌基因，它对细胞有两种主要的作用：一是参与细胞的转化增生，二是促 进或诱导细胞捌亡的发生。目前已发现c m y c 能诱导成纤维细胞、杂交瘤t 细胞、白血病细胞等 发生凋亡，这种致凋亡作用可被b c l 一2 或p 5 3 的表达抑制，但在某些情况卜如与致癌基因同时存 7 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述 在时则可协同c m y c 导致肿瘤的发生”。总之c m y c 与细胞的生长、分化、增殖和肿瘤的发生有 关，但在不同的细胞及机体环境中表现不同的功能。因而，如果病毒编码的产物能影响b c l 一2 或p 5 3 的表达即可能影响c m y c 的表达。 1 9 死亡受体信号转导诱导凋亡 可引起细胞凋亡的死亡信号转导途径主要是f a s l f a s 途径和t n f ，r n f r 途径。现己发现许 多致病性病毒的某些基因及其表达产物能通过直接调控f a s l 胆a s 、t n f ，r n f r 信号转导途径来执 行细胞凋亡，逃避免疫监视作用。例如人的免疫缺陷病毒( h i v ) 感染的c d 4 + 淋巴细胞【3 5 | 、流感 病毒感染的上皮细胞、乙型肝炎病毒感染的肝细胞等都使其表面的f a s 蛋白的表达明显增强【”】。 1 9 1f a s l f a s 途径 当f a s 和f a s l 结合后f a s 发生多聚化，f a s 受体胞浆中的死亡区域( d d ) 与胞浆中的f a s 相关 死亡区域( f a d d ) c 端的d d 结合。f a d dn 端的死亡效应区( d e d ) 与c a s p a s e - 8 结合，从而激活 效应c a s p a s e s ，引起凋亡。除了f a d d 外，与f a s l f a s 途径相关的其他胞浆蛋白还有r e c e p t o r i n t e r a c t i o np r o t e i n ( i u p ) 、f a s 相关磷酸酶l ( f a p 1 ，抑制f a s 介导的凋亡) 、f l i c e 抑制蛋白( f l i p ， 抑制凋亡) 。许多种病毒都通过上调f a s l 、f a s 来促进细胞凋亡，如人获得性免疫缺陷病毒( h i v - 1 ) 的1 a t 蛋白就是f a s l 的激动剂。c h i o u 和c i n a t l 等3 9 】发现h c m v 感染可促进视网膜上皮细 胞表达f a s l ，促进视网膜上皮细胞凋亡，而用f a s 的中和抗体处理细胞，可以减少凋亡的发生， 用c a s d a s e 罐的抑制剂也能减少凋亡的发生。 1 9 2t n f t n f r 途径 t n f ，f r 途径与f a s f a s l 相似，其中的重要分子是t n f r 相关死亡区域( n 认d d ) ，它不 但介导t n f r 1 的凋亡信号转导，还介导t n f r 诱导转录因子n f kb 、a p a f 介导的c a s p a s e s 活化。利用t n f ，r n f r 途径诱导细胞凋亡的病毒很多。最近的研究表明，鸡n d v 可通过肿瘤坏 死因子有关的配体来诱导细胞凋亡。m r c 5 纤维母细胞感染了巨细胞病毒( c m v ) a d l 6 0 毒株厉， 对t n f a 诱导的凋亡作用更加敏感了1 4 。研究表明巨细胞病毒诱导凋亡可能是由多种原因引起 的。d 5 3 作为一种重要的调节凋亡的冈子，在其中也可能起到重要的作用，可能与t n f 途径相 配合。w a l l g 等1 4 1 悃含有c m vi e l 基因和】e 2 基因的质粒转染内皮细胞，发现细胞内的p 5 3 的含 量明显增加，细胞凋亡率也大大、j 二升。 11o 影响细胞凋亡的基因调控 目前普遍认为细胞凋亡是一种受遗传基因调控的单个细胞的自杀过程，它是维持机体平衡 的重要机制之一。控制细胞凋亡的基因一般分为生存基因与死亡基因两人类，这两类基因在细 胞凋亡的调节过程中起重要的作用。已知与细胞凋亡相关的基因一般仅在凋亡发生时才表达。 8 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述 即这些基因的表达是诱导性的。这些基因所编码的蛋白质在止常细胞中也呈非组成性的表达。 已证实与细胞凋亡相关的基因包括：p - 8 、r p 2 、p d 1 、n u r 7 7 、i c e 、c ，m y c 、b c l 2 、b c i x 、b “、 t g f b 、c e d - 3 、e g l - 1 、a p t 一3 、印t - 4 、印t - 5 、c e s 一2 、n u c 一1 、g z m b 、c f o s 、p 5 3 等。也有人将这些 基因分为两种，即凋亡相关基因和凋亡相关原癌基因。近年来的研究证实，与细胞的增殖和癌 变有关的原癌基因及抗癌基因，多数参与细胞凋亡的调控。当原癌基因发生突变，导致调控细 胞凋亡的信号下调，就引起突变细胞异常存活，并使这些细胞获得选择生存的优势从而异常增 殖。己知的原癌基因c m y c 、p 5 3 、b c 】一2 、r a s 、c - f o s 等均在凋亡的过程中起重要作用。而目前在 肿瘤治疗研究中，许多成功的抗肿瘤治疗方案都是依据诱导肿瘤细胞凋亡而实现抗肿瘤效果的。 如转染野生型的抗癌基因p 5 3 可引起人的大肠癌细胞出现凋亡，并导致肿瘤消退。应用低剂量 的电离辐射和化学抗癌药物可诱导肿瘤细胞的p 5 3 基因的表达，引发肿瘤细胞的凋亡。 1 1 1 乳腺细胞的形态学检测 1 1 1 1 乳腺细胞的形态学特征 生理条件_ 卜，许多退化过程都与凋亡有关，包括断奶后泌乳乳房恢复至静息状态，卵泡闭 锁，毛发生长中期毛囊的退化，胸腺中自身反应性t 细胞的清除，淋巴结生发中心b 细胞的选 择，衰老、突变细胞的清除，哺乳类胚胎发育中趾间蹼的去除等。 乳腺( m m a r yg l d ) 是哺乳幼畜十分重要的皮肤腺，基本结构特征与动物年龄、性周期 有很大关系。乳腺是复管泡状腺，被结缔组织分隔为许多小叶，小叶间的结缔组织称为乳腺间质 组织。乳腺的实质是分泌部和各级导管，妊娠后期和授乳期的乳腺有泌乳功能，称为泌乳期乳腺。 性成熟前及两个泌乳期之间去分泌功能的乳腺，称为静j p 期乳腺。 乳腺组织分为分泌部和导管部：分泌部由泡状和管状的腺泡组成。腺泡的数量、大小和上 皮形态随分泌周期而变化，在静止期，腺泡数量少，腺泡上皮为单层立方上皮。在妊娠期，由于 受孕酮的刺激腺泡数量增多，腺泡变大，腺上皮为单层立方或柱状上皮。妊娠后期，腺上皮具有 分泌活动，胞质内聚集大量的脂滴和蛋白质颗粒，细胞呈高柱状或锥形，顶端突入腺泡腔内，核 呈球形，多位与细胞基部。此时腺泡腔窄小。泌乳期腺泡的结构与妊娠后期基本相同。乳腺为顶 浆分泌腺，随着乳腺细胞将分泌物排出，细胞变成低立方形或扁平状，腺泡腔变大，并充满分泌 物。在腺上皮细胞与基膜之间有梭形的肌上皮细胞，收缩时，可促使乳腺分泌物的排出。在同一 时期内，同一个腺小叶中的各个腺泡的分泌活动并不完全一致，分别处于不同的分泌阶段。因此 可看到腺泡细胞形状也不尽相同，有的最高柱状，胞质内含有分泌颗粒，而另一些则呈立方或扁 平形，腺泡中充满乳汁。 导管部为输送乳汁的管道，包括小叶内导管、小叶间导管、输乳管、乳池、和乳头管。小 叶内导管一端与腺泡相连，管壁上皮为单层立方上皮，也有肌上皮细胞。另一