（外科学专业论文）血管内皮生长因子基因多态性与肺癌发病风险的相关性研究.pdf

1 目录 舢舢册f f i | j 舢 y 18 0 0 012 中文摘要 l 英文摘要4 研究论文血管内皮生长因子基因多态性与肺癌发病风险的相关性 研究 前言 8 刖舌j 萏 材料和方法8 结果 1 4 附图 1 6 附表 1 7 讨论2 2 结论2 6 参考文献2 6 综述血管内皮生长因子及其单核苷酸基因多态性与恶性肿瘤的相 关性研究进展3 2 致谢5 1 个人简历5 2 中文摘要 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌发病风 险的相关性研究 摘要 目的：肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大 的恶性肿瘤。肺癌己成为全球恶性肿瘤死因的首位。大量研究明确提出： 吸烟、职业暴露、环境污染等被认为是肺癌的危险因素。尽管绝大多数肺 癌的发生与这些因素相关，但是仅有1 5 的吸烟者最终发生肺癌，有不足 1 0 的肺癌患者则从不吸烟。近来，随着分子生物学研究水平的不断进展， 肺癌遗传易感性的影响逐渐被重视。 血管增生是肿瘤的发生和发展的重要一步，可以有效促进肿瘤的生 长、侵袭和转移。血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ， v e g f ) 是已知作用最强的促血管生成因子之一，近来报道提示：在一些 肿瘤性疾病如：乳腺癌，胃癌、肺癌、前列腺癌和食管癌等可以检测到患 者血、尿或肿瘤组织内v e g f 表达量增加。v e g f 基因具有高度多态性， 目前至少发现y3 0 个单核苷酸多态性( s n p ) 位点。本研究旨在探讨v e g f 基因启动子区2 5 7 8 c a 和+ 4 0 5 g c 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ，s n p ) 与中国北方汉族人群肺癌( 1 u n gc a n c e r ) 发病风险 的关系。 方法：采用基于医院的病例对照研究方法，采集1 7 2 例肺癌患者( 其 中鳞状细胞癌6 2 侈1 j 、腺癌4 1 例、腺棘细胞癌1 7 例、小细胞肺癌2 6 例、其他 病理类型包括大细胞癌、印戒细胞癌、透明细胞癌、肉瘤样癌、细支气管 肺泡癌等2 6 例) 和1 8 4 例健康对照个体的静脉抗凝血5 m l ，同时记录其病史 和个人相关资料。采用蛋白酶k 消化饱和氯化钠盐析法于外周血采集一周 内提取其白细胞d n a ，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性 ( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， p c r r f l p ) 分析方法和引物介导的限制性聚合酶链反应 ( p r i m e r - i n t r o d u c e dr e s t r i c t i o na n a l y s i sp c r ，p i r a p c r ) 方法检测 v e g f 2 5 7 8 c a 和+ 4 0 5 g cs n p s 的基因型频率分布。 数据统计分析采用s p s s 11 5 版软件包( s p s sc o m p a n y ，c h i c a g o ， 中文摘要 i l l i n o i s ，u s a ) 进行分析，p o 0 5 ) 。肺癌患者组v e g f 2 5 7 8 c a s n pc 和a 等位基因频率分别为7 0 9 、2 9 1 ；健康对照组中等位基因频率分 别为7 8 5 、2 1 5 ：肺癌组中a 等位基因频率明显高于对照组，两组比 较有统计学意义( ) c 2 - 5 0 6 4 ，p = 0 0 2 0 ) 。三种基因型( c c 、c a 、a a ) 分布频率：健康对照组分别为6 0 9 、3 5 3 、3 8 ；肺癌组的基因型频 率分别为4 9 4 、4 3 o 、7 6 。由于a 俊基因型频率较低，遂将c a 与 a a 基因型合并。合并后肺癌患者组的c c 、c a + a 基因型频率分别为 4 9 4 、5 0 6 ；健康对照组基因型频率分别为6 0 9 、3 9 1 。两组间基 因型分布有统计学意义( z = 4 2 6 5 ，p = 0 0 3 3 ) 。与c c 基因型相比，携带 a 等位基因( c a 寸a ) 的基因型可显著增加肺癌的发病风险。经性别、 年龄和吸烟情况校正后o r = 2 0 1 9 ，9 5 c i = 1 2 9 0 3 1 5 8 。根据个体吸烟状 况进行分层分析发现，与c c 基因型相比，携带a 等位基因( c a + a ) 的基因型可显著增加吸烟人群的发病风险。经性别和年龄校正后的 o r - - 2 0 4 3 ，9 5 c i = 1 0 9 0 3 8 2 7 。根据肺癌病理类型进行分层分析发现， 与c c 基因型相比，携带a 等位基因的基因型( c a + a a ) 明显增加肺 鳞状细胞癌发病风险，经性别、年龄和吸烟状况校正后的o r 值是2 0 7 3 ； 9 5 c i 是1 0 2 5 4 1 9 1 。3 健康对照组中的v e g f + 4 0 5 g c 多态性位点的 基因型分布均符合h a r d y w e i n b e r g 平衡( p o 0 5 ) 。v e g f + 4 0 5g c 基因 型和等位基因频率分布在肺癌组与健康对照组之间均无统计学意义 中文摘要 ( p o 0 5 ) 。根据个体吸烟状况分层分析发现，与g g 基因型相比，携带 c 等位基因的基因型( g c + c c ) ，可增加吸烟个体肺癌的发病风险，经 性别和年龄校正后的o r = 2 4 0 2 ，9 5 c i = 1 17 7 4 9 0 4 。根据肺癌病理类型 进行分层分析发现，与g g 基因型相比，携带c 等位基因的基因型 ( g c + c c ) ，明显增加肺鳞状细胞癌发病风险，经性别、年龄和吸烟状 况校正后的o r 值是2 2 1 0 ；9 5 c i 是1 0 8 1 4 5 1 7 。4 应用2 l d 软件对 v e g f 2 5 7 8c a 与v e g f + 4 0 5 ( 3 c 多态性位点进行联合分析显示，两多 态性位点间不存在连锁不平衡( d = o 2 7 1 4 9 ) 。 结论：1 吸烟可以明显增加肺癌的发病风险。2v e g f 2 5 7 8 c a 单核 苷酸多态性与肺癌发病风险相关，与c c 基因型相比，携带a 等位基因 的基因型( c a + a a ) 可显著增加肺癌的发病风险。根据个体吸烟状况分 层分析发现，其主要与吸烟个体肺癌的发病风险相关，与c c 基因型相 比，携带a 等位基因的基因型( c a + a a ) ，明显增加吸烟个体肺癌的发 病风险。根据病理类型进行分层分析发现，携带a 等位基因的基因型 ( c a + a a ) ，增加肺鳞状细胞癌发病风险。3v e g f + 4 0 5 g c 单核苷酸多 态性与吸烟个体肺癌的发病风险相关，携带c 等位基因的基因型 ( g c + c c ) ，可增加吸烟个体肺癌的发病风险。根据病理类型分成分析 发现，携带c 等位基因的基因型( g c + c c ) ，增加肺鳞状细胞癌发病风 险。 关键词：血管内皮生长因子；肺癌；多态性；单核苷酸；易感性；发 病风险 英文摘要 _ _ 一 s t u d yo f t h ea s s o c i a t i o no f v e g f g e n e t i cp o l y m o r p h i s m s w i t h t h er i s ko fp r i m a r yl u n gc a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e ：l u n gc a n c e r , t h em o s tc o m m o nm a l i g n a n t t u m o rt h r e a t e n st h e h e a l t ha n dl i f eo fh u m a nb e i n g sw i t hi t si n c i d e n c ea n dm o r t a l i t ya r ei n c r e a s i n g r a p i d l y l u n gc a n c e ri st h ef i r s tk i l l e ro f c a n c e r - r e l a t e dd e a t h sb o t hi nm e na n d w o m e ni nt h ew o r l d p r e v i o u ss t u d i e sh a v ed e m o n s t r a t e d t h a tc i g a r e t t e s m o k i n g ，v a r i o u so c c u p a t i o n a le x p o s u r e sa n dc a r c i n o g e n si nh e a v i l yp o l l u t e d a i ra r et h er i s kf a c t o r st ol u n gc a n c e r a l t h o u g hi ti sw e l lr e c o g n i z e dt h a tm o s t o fl u n gc a n c e rc a s e sa r ea t t r i b u t a b l et ot h e s ef a c t o r s ，o n l y15 o f a l ls m o k e r s d e v e l o pl u n gc a n c e ra n dl e s st h a n1o o f a l ld i a g n o s e dl u n gc a n c e ra r ea m o n g n o n - s m o k e r s r e c e n t l y , a l o n gw i t ht h ed e v e l o p m e n t o ft h em o l e c u l a rb i o l o g y ， t h ee f f e c to fh e r e d i t a r ys u s c e p t i b i l i t yh a sb e e nf o c u s e d o nt h er e s e a r c ho fl u n g c a n c l ；i a n g i o g e n e s i si s a ni m p o r t a n ts t e pi nt h ed e v e l o p m e n to ft u m o ra n di s n e c e s s a r yf o rp r i m a r yt u m o rg r o w t h ，i n v a s i v e n e s s ，a n dm e t a s t a s i s v a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( v e g f ) i so n eo ft h ep o w e r f u lf a c t o r st of a c i l i t a t e a n g i o g e n e s i sa sw ek n o ws of a r c u r r e n t l y ，s t u d i e ss h o w t h a ts o m et u m o r s m a yi n d u c eah i g h e rs e r u m a l ，u r i n a r yo ri n t r a t u m o r a l v e g fl e v e l ，f o ri n s t a n c e ， b r e a s tc a n c e r ，g a s t r i cc a n c e r ，l u n gc a n c e r ，p r o s t a t i cc a r c i n o m a ，a n de s o p h a g e a l c a r c i n o m a v e g fg e n eh a sh i g hi n c i d e n c eo fp o l y m o r p h i s m a tl e a s t 3 0 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p ) h a v eb e e ni d e n t i f i e d i nt h ev e g f g e n e t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt w o s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( 一2 5 7 8 c aa n d + 4 0 5 g c ) i nt h ep r o m o t e r r e g i o no f v e g f g e n ea n dt h es u s c e p t i b i l i t i yo fl u n g c a n c e ri nn o r t hc h i n a m e t h o d s ：t h i sh o s p i t a l b a s e dc a s e c o n t r o ls t u d yc o m p r i s e d17 2p a t i e n t s w i t hl u n gc a n c e r ( 6 2s q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s ，4 1a d e n o c a r c i n o m a s ，17 a d e n o s q u a m o u sc a r c i n o m a ，2 6 s m a l lc e l ll u n gc a r c i n o m a s ，a n d2 6o t h e r p a t h o l o g i c a lt y p e si n c l u d i n gl a r g e c e l lc a r c i n o m a ，c l e a r - c e l lc a r c i n o m a ， _ _ - - _ - - _ 一 4 英文摘要 s i g n e t r i n g e e l l c a r c i n o m a ，c a r c i n o m as a r c o m a t o d e s ，b r o n c h i o l o a l v e o l a r c a r c i n o m a ，a n ds oo ni n c l u d e d ) a n d18 4f r e q u e n c y m a t c h e dh e a l t h yc o n t r o l s w i t hn oe v i d e n c eo fd i s e a s e f i v em i l l i l i t e ro fv e n o u sb l o o df r o me a c hs u b j e c t w a sd r a w ni nv a c u t a i n e rt u b e sc o n t a i n i n ge d t aa n ds t o r e da t4 ，m e a n w h i l e t h em e d i c a lh i s t o r ya n dp e r s o n a ld a t ao fe a c hs u b j e c tw a so b t a i n e d t h e g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e d w i t h i no n ew e e ka f t e rb l e e d i n gb yu s i n g p r o t e i n a s ekd i g e s t i o nf o l l o w e db yas a l t i n go u tp r o c e d u r e g e n o t y p e so f t h e v e g f 一2 57 8 c aa n d + 4 0 5 g cs n p sw e r ea n a l y z e db yp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( p c r - r f l p ) m e t h o da n d p r i m e r - i n t r o d u c e dr e s t r i c t i o na n a l y s i sp c r ( p i r a p c r ) s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n gs p s s11 5s o f t w a r ep a c k a g e a p r o b a b i l i t yl e v e lo f5 ( p 0 0 5 ) i nl u n gc a n c e rp a t i e n t s ，f r e q u e n c yo f t h eca n da a l l e l ew e r e7 0 9 a n d2 9 1 r e s p e c t i v e l y ；i nh e a l t h yc o n t r o l s ，t h ef r e q u e n c i e s w e r e7 8 5 a n d21 5 r e s p e c t i v e l y t h ef r e q u e n c yo ft h eaa l l e l ei nl u n g 5 英文摘要 c a n c e rp a t i e n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nh e a l t h yc o n t r o l s ( = 5 0 6 4 ，pv a l u e = 0 0 2 0 ) t h ef r e q u e n c i e so ft h r e eg e n o t y p e s ( c c ，c aa n d a ) i nh e a l t h yc o n t r o l sw e r e6 0 9 ，3 5 3 a n d3 8 r e s p e c t i v e l y ，a n d4 9 4 ， 4 3 o a n d7 6 r e s p e c t i v e l yi nl u n gc a n c e rp a t i e n t s ( b e c a u s eo ft h el o w f r e q u e n c yo fn 入g e n o t y p e ，t h ec aa n d kg e n o t y p ew e r ec o m b i n e d ) 。t h e f r e q u e n c i e so ft h et w og e n o t y p e s ( c ca n dc | 特吣i np a t i e n t sa n dh e a l t h y c o n t r o l sw e r e4 9 4 ，5 0 6 a n d6 0 9 ，3 9 1 ， r e s p e c t i v e l y t h e r ew a s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei n g e n o t y p e d i s t r i b u t i o n so ft h ev e g f 一2 5 7 8 c a p o l y m o r p h i s mb e t w e e nt h et w og r o u p s 簖= 4 2 6 5 ，pv a l u e = 0 0 3 3 ) c o m p a r e d w i t hi n d i v i d u a l sw i t ht h ec cg e n o t y p e 。i n d i v i d u a l sw i t ht h ec | 时入 g e n o t y p eh a ds i g n i f i c a n t l yh i g h e rr i s kt od e v e l o pl u n gc a n c e r ( a g e ，g e n d e ra n d s m o k i n gs t a t u sa d j u s t e do r = 2 0 19 ，9 5 c i = 1 2 9 0 - 3 15 8 w h e ns t r a t i f i e db y s m o k i n gs t a t u s ，c o m p a r e d w i t hi n d i v i d u a l sw i t ht h ec cg e n o t y p e ，t h e c | 时入g e n o t y p ei n c r e a s e dt h er i s ki nd e v e l o p i n gl u n gc a n c e ri ns m o k e r s ( a g ea n dg e n d e ra d j u s t e do r = 2 0 4 3 ，9 5 c i = 1 0 9 0 3 8 2 7 ) w i t ht h es u b j e c t s b e i n gs t r a t i f i e db yt u m o rh i s t o l o g y ，c o m p a r e dw i t hi n d i v i d u a l sw i t ht h ec c g e n o t y p e 。i n d i v i d u a l sw i t ht h ec | 时kg e n o t y p ec a r r i e da ni n c r e a s e dr i s ko f l u n gc a n c e ri ns q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s ( s c c ) ( a g e ，g e n d e rs m o k i n gs t a t u s a d j u s t e do r = 2 0 7 3 ，9 5 c i = 1 0 2 5 4 1 9 1 ) 3t h ed i s t r i b u t i o no ft h ev e g f + 4 0 5 g cs n pg e n o t y p e sa m o n gh e a l t h yc o n t r o l sd i dn o ts i g n i f i c a n t l yd e v i a t e f r o mt h a te x p e c t e db yh a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u m ( pv a l u e 0 0 5 ) w h e nt h e o v e r a l ll u n gc a n c e rc a s e sw e r ec o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s ，n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew a sf o u n di nt h ed i s t r i b u t i o n so fg e n o t y p ea n da l l e l eo fv e g f + 4 0 5 g c ( pv a l u e o 0 5 ) w h e nt h eo v e r a l ll u n gc a n c e rc a s e sw e r ec a t e g o r i z e d b ys m o k i n gs t a t u s ，h o w e v e r ，t h eg c + c cg e n o t y p ew a sa s s o c i a t e dw i t ha s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dr i s ko fs m o k e r sc o m p a r e dw i t ht h eg gg e n o t y p e ( a g e a n dg e n d e ra d j u s t e do r = 2 4 0 2 ，9 5 c i = 1 17 7 4 9 0 4 ) w h e ns t r a t i f i e db y t u m o r h i s t o l o g y ，c o m p a r e d w i t hi n d i v i d u a l sw i t ht h eg g g e n o t y p e ， i n d i v i d u a l sw i t ht h eg c + c cg e n o t y p ec a r r i e da ni n c r e a s e dr i s ko fl u n g c a n c e ri n s q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s ( s c c ) ( a g e ，g e n d e rs m o k i n gs t a t u s a d j u s t e do r = 2 2 10 9 5 c i = 1 0 81 4 517 ) 4t h ec o m b i n e de f f e c to fv e g f 6 英文摘要 - 2 5 7 8 c aa n d + 4 0 5 g cs n po nl u n gc a n c e rw a sa n a l y z e d i tw a ss h o w nt h a t t h et w os n p sw e r en o ti nl i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m ( d = o 2 714 9 ) c o n c l u s i o n s ：1s m o k i n gm a yi n c r e a s et h er i s ko fd e v e l o p i n gl u n gc a n c e r 2v e g f 2 5 7 8 c as n pw a sa s s o c i a t e dw i t ht h er i s ko fl u n gc a n c e r w h e n s t r a t i f i e db ys m o k i n gs t a t u s ，c o m p a r e dw i t hi n d i v i d u a l sw i t ht h ec cg e n o t y p e ， t h ec | 心nk g e n o t y p ei n c r e a s e dt h er i s ko fl u n gc a n c e ri ns m o k e r s 。w h e n s t r a t i f i e db yt u m o rh i s t o l o g y ，c o m p a r e dw i t ht h ec cg e n o t y p e ，i n d i v i d u a l s w i t ht h ec a + a ag e n o t y p ec a r r i e da ni n c r e a s e dr i s ko fl u n gc a n c e ri n s q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s ( s c c ) 3t h ec o m b i n e dg c + c cg e n o t y p eo f v e g f + 4 0 5 g cs n pw a sa s s o c i a t e dw i t has i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dr i s ko f s m o k e r s ，c o m p a r e d w i t ht h eg g g e n o t y p e w h e n s t r a t i f i e db yt u m o r h i s t o l o g y ，c o m p a r e dw i t ht h eg gg e n o t y p e ，i n d i v i d u a l sw i t ht h eg c + c c g e n o t y p ec a r r i e da ni n c r e a s e dr i s ko fl u n gc a n c e ri ns q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a s ( s c c ) k e yw o r d s ：v e g f ；l u n gc a n c e r ；p o l y m o r p h i s m ；s i n g l en u c l e o t i d e ； s u s c e p t i b i l i t y ；r i s k 7 研究论文 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌发病风 险的相关性研究 ! 量 翮吾 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性 肿瘤。据全国肿瘤防治办公室报道，我国肺癌己成为男性恶性肿瘤发病率 之首，在女性为发病率第二位，由肺癌导致的死亡居男性和女性恶性肿瘤 死亡率的第一位川。因此，肺癌的预防及早期诊断已成为肺癌研究的重点。 新血管不断增生在肿瘤特别是恶性肿瘤的形成、生长、侵袭及转移过 程中扮演了相当重要角色1 2 卅。v e g f 是目前已知的最重要的血管生成调控 因子，并且一些研究提示肺癌的血管生成及不良预后与其表达量增加相关 【5 。人v e g f 基因位于染色体6 p 2 1 3 ，包括8 个外显子和7 个内含子【8 , 9 1 。有 研究结果表明v e g f + 4 0 5 g c 、v e g f - 4 6 0 t c 与v e g f 在活体内表达活性 增加相关 1 0 - 1 2 】。此外v e g f 一2 5 7 8 c a 和一1 15 4 g a 也表现出与v e g f 在活 体内表达量的相关性t 1 3 - 1 a 】。因此推测：该基因多态性有可能通过影响v e g f 的表达量从而影响肿瘤的发生和发展。本研究采用病例对照研究方法， 研究中国北方汉族人群v e g f - 2 5 7 8 c a 和+ 4 0 5 g c 单核苷酸多态性 ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 与肺癌发病风险的关系。 材料与方法 1 研究对象 本研究包括肺癌患者1 7 2 例，健康对照个体1 8 4 例。病例组为2 0 0 3 年9 月至2 0 0 9 年9 月在河北医科大学第四医院胸外科住院行手术治疗的 患者，所有患者术前均未经化疗或放射治疗，除外其它癌症患者及合并某 些和血管增生相关的疾病如子宫内膜异位症；呼吸窘迫综合征；慢性心衰； 慢性呼吸衰竭，糖尿病等。均为汉族以排除种族间可能存在的基因差异。 且无明确致癌因素长期接触史。肿瘤的病理类型均经河北医科大学附属第 四医院手术切除标本的病理报告确定，其中鳞状细胞癌6 2 例、腺癌4 l 例、腺棘细胞癌1 7 例、小细胞肺癌2 6 例、其他病理类型( 包括大细胞癌、 研究论文 印戒细胞癌、透明细胞癌、肉瘤样癌、细支气管肺泡癌等) 2 6 例。1 8 4 例健康对照为河北医科大学第四医院进行健康体检的人员。患者及健康对 照来自石家庄市及周围市、县，且均为汉族，彼此无血缘关系。有专人详 细询问记录肺癌组及患者组的年龄、性别和吸烟情况。现吸烟或曾吸烟每 天5 支以上并持续两年以上者被定义为吸烟个体。本课题涉及的所有研究 对象均签有知情同意。 2 主要实验设备、仪器与器皿 s w - c j 2 f d 型净化工作台苏州安泰空气技术公司 离心机l x j 一6 4 0 1北京医疗仪器修理厂 台式离心机p q 1 6 0 0 a 上海培清科技有限公司 电子天平p b 3 0 2 2 s瑞士m e t t l e r 公司 p c r 扩增仪m a s t e r c y c l e r 5 3 3 3德国e p p e n d o r f 公司 d y y - 1 2 稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂 医用微波炉( m i c r o w a v eo v e n )上海中达医学应用研究所 e p p e n d o r fr e s e a r c h 移液器德国e p p e n d o r f 公司 d y y i i l 2 8 a 型电泳槽北京市六一仪器厂 2 0 2 2 a 型电热恒温烤箱上海阳光实验仪器公司 m d f u 5 0 v 8 6 低温冰箱日本三洋公司 凝胶成像分析仪a l p h a l a n g e r2 2 0 0 美国a n l a i 公司 h j 3 恒温磁力搅拌器江苏金坛医疗仪器厂 h 1 微型混合器上海彭氏实业有限公司 澳柯玛冰柜青岛澳柯玛公司 海尔冰箱b c 1 6 5 d青岛海尔集团 冰盒上海复日科技有限公司 m d f u 5 0 v - 8 6 低温冰箱日本三洋公司 3 主要实验试剂 t r i t o n - x10 0 s i g m a t r i s ( 三羟甲基氨基烷)s i g m a e d t a ( 乙二胺) s i g m a s d s ( 十二烷基磺酸钠)s i g m a 蛋白酶km e r c k ，g e r m a n y 研究论文 1 0m m o l ld n t p s 北京赛百盛生物有限公司 琼脂糖 s i g m a 溴化已锭 s i g m a l o o b pd n a l a d d e r 北京赛百盛生物有限公司 t a q d n a 聚合酶北京赛百盛生物有限公司 限制性内切酶： b s m f i n e w e n g l a n db i o l a b s b g l i i f e r m e n t a s 引物合成 北京赛百盛生物有限公司 4 实验方法 4 1 本实验中所用试剂的制备 4 1 1d n a 提取液的制备 1 mt rishcl(ph=8o)lml o 5 me d t a 2 m l 1 mn a c l l m l 加水至 1 0 0 m l 4 1 2t e 缓冲液的制各 1 mt r i s - h c l l m l 0 5 me d t a 0 2 m l 加水至 1 0 0m l 4 1 35 0 x t a e 贮液的制备 t r i s 2 4 2 9 冰乙酸 5 7 1 m l o 5 m o l 1e d t a 10 0 m l ( p h = 8 o ) 加水至 1 0 0 0m l 4 1 45 x t b e 的制备 强s 5 4 9 e d t a - n a 2 3 7 2 9 硼酸 2 7 5 9 加水至 1 0 0 0m l 4 2 基因组d n a 的制备：采用蛋白酶k 消化饱和氯化钠盐析法【1 6 1 。具体 - 一一一 1 n 研究论文 操作程序如下： 4 2 1 采取肘静脉血约5m l ，加入枸橼酸钠抗凝剂o 8 5m l 轻摇。 4 2 2 将加有o 8 5m l 枸橼酸钠的血液标本置于5 0m l 离心管中，加预冷蒸 馏水至5 0m l ，反复颠倒混匀，2 5 0 0r p m 室温离心1 5 分钟。 4 2 3 缓慢倾倒上清，沉淀物中加入预冷的o 1 t r i t o n x 1 0 0 至5 0m l ，同 上离心，倾倒上清，用预冷蒸馏水洗涤l 2 次，沉淀物即为白细胞。 4 2 4 沉淀物中加入3m ld n a 提取液，充分混匀，悬浮白细胞。加1 0 s d s 1 5 0 d ( 终浓度为o 5 ) ，振荡。 4 2 5 加入蛋白酶k 至终浓度为1 0 0 p g m ( 1 约4 0 0 p 1 ) ，混匀，3 7 c 水浴过 夜消化。 4 2 6 加入5mn a c l1 2m l ，振荡2 5 秒，2 5 0 0r p m 室温离心1 5m i n 。 4 2 7 将上清倒入另一盛有8m l 无水乙醇的玻璃瓶中，反复颠倒。 4 2 8 挑出d n a 至内置有7 0 乙醇1m l 的e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0r p m 室 温离心5m i n 后弃去乙醇，自然晾干。 4 2 9 以2 0 0 “1t e 溶解d n a ，4 。0 放置至少2 4 h 。 4 2 1 0 鉴定：将提取的基因组d n a ，在o 8 琼脂糖凝胶中电泳( 恒压8 0 v ， 电泳缓冲液l x t b e ) 3 0 分钟后，将凝胶移至0 【成像系统下进行观察。 4 2 1 1 定量：用无菌去离子水将鉴定合格的d n a 用溶解液稀释适当倍数， 在紫外分光光度仪上测量2 6 0n n l ( o d 2 6 0 ) 和2 8 0n n l ( o d 2 8 0 ) 两个波 长的吸光度( o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值大于1 6 ) ，将可用的d n a 置于2 0 冰箱储存备用。 4 3 稀释d n a 备用：将t e 溶解的d n a 用无菌蒸馏水按比例稀释，终浓 度为1 0 0n g i t l ，在震荡器上震荡2 0 秒后短暂离心备用，此即为p c r 反应 中的模板d n a 。 4 4 引物的合成：v e g f 2 5 7 8 c a 多态特异性上游引物为：5 - g g a t g g g g c t g a c t a g g t a a g c 3 ，下游引物为5 - a g c c c c c t l 盯t c c t c c a a c 一3 。 v e g f + 4 0 5 g c 多态特异性上游引物为：5 a 1 t 酗肌t g c t t g c c a t t _ 3 ，下游引物为：5 - g t c t g t c t g t c t g t c c g t c a 3 。 4 5 扩增v e g f 2 5 7 8 c a 并 i + 4 0 5 g c 基因的反应体系： 灭菌去离子水 1 0 8m 1 0 x p c r 缓冲液 2 4 1 t 1 研究论文 p c r 染料 2 o 山 上游引物 1 o p l 下游引物1 o p l 10m m o l ld n t p s 0 4 i - t l t a q 酶 o 4 山 模板d n a2 0 d 将上述反应液轻弹混匀、短暂离心以便集中反应液于管底。 4 6 依据设计的循环参数进行扩增，反应条件： 4 6 1v e g f 2 5 7 8 c a ：9 4 c 预变性5m i n ，以后按9 4 c 变性4 5 s ，6 0 5 c 退 火4 5 s ，7 2 延伸4 5 s ，3 5 个循环后，7 2 延伸7 m i n 。 4 6 2v e g f + 4 0 5 g c ：9 4 。c 预变性5