（发育生物学专业论文）sfrp3过表达对小鼠早期牙齿发育的影响.pdf

! 堡些些堂! 兰堡! 兰堡堡! 摘要 本实验主要研究过量表达5 f r p 3 对小鼠早期牙齿发育的影响- 以期更深入的了解 w m 信号在牙= f 刮充质诱导牙齿发赢能力r f ，所起的作用。w r i t 基因家族中的许多基因 及其拈抗物和受体均在牙胚中表达，这表明w n t 信号在牙齿发育的起始阶段可能有 重要的作用。s f r p s 是新发现的蛋白质因子，在功能上s f r p s 似乎是作为w n t 信号 的调控因子，不同的s f r p s 与不同的w n t 配基结合来调控w n t 信号。前期研究发现， 在早期牙齿发育阶段，s f r p 3 和w n t 5 a 在磨牙间充质中都有表达。而研究基因的功能 最为常用的方法为功能缺失和获得，即基因剔除、r n a i 、过量表达等方法。在此我 们以慢性病毒( h i v - 1 ) 作为载体在磨牙间充质中过量表达s f r p 3 ，作为w n t 信号的 竞争性抑制剂来阻断w n t 信号的传导。主要研究工作包括：p n l _ i r e s 2 一e g f p 咖j 重组子的构建，慢性病毒的生产，慢性病毒感染磨牙间充质细胞过量表达a f r p 3 。 实验结果表明，以e g f p 作为报告基因发现慢性病毒对牙间充质细胞有高达5 6 的感染效率，也就是有大半的牙间充质细胞可以持续过量表达 3 ；而在e 1 3 5 州通 过慢性病毒表达载体在磨牙司充质中过量表达咖j 基因对牙齿的发育无显著的影 响。 关键词：5 f r p 3 基因，w r i t 信号通路，慢性病毒表达载体( h i v - 1 ) ，过量表达，转染， 组织重组 福址帅范人学坝i 哗位论文 a b s t r a c t t h i ss t u d ya t t e m p t e dt of i n do u tt h ee f f e c t so fs f r p 3o v e r e x p r e s s i o no nm o u s ee a r l y t o o t hd e v e l o p m e n t ，t h e n ，w ee x p e c t e dt om o r eu n d e r s t a n dt h er o l eo fw n ts i g n a l i n gi nt h e p r o c e s so ft o o t hg e r mi n d u c e d w n tf a m i l yh a v em a n ym e m b e r s ，t h e i ra n t a g o n i s t sa n d t h e i rr e c e p t o r si nt o o t hg e r m a l le x p l a i n e dt h a tw n ts i g n a l i n gm a yb ev e r yi m p o r t a n t d u r i n go r i g i n a t i o no ft o o t hd e v e l o p m e n t s f r p sw e r ef o u n dp r o t e i n sr e c e n t l y i nf u n c t i o n ， s f r p sm a yc o n t r o lw n ts i g n a l i n g d i f f e r e n ts f r p sr e c o g n i s e sa n dc o m b i n e sw i t hs p e c i a l w n tt oc o n t r o lw ms i g n a l i n g i no r rp r o p h a s er e s e a r c h ，w eh a v ef o u n dt h a ts f r p 3a n d w n t s aw e r ee x p r e s s e di nm o l a r g e tf u n c t i o na n dl o s ef u n c t i o na r eo f t e nu s e do fs t u d y i n g t h ef u n c t i o no fg e n e t h em e t h o d si n c l u d eg e n ek n o c ko u t ，r n ai n t e r f e r e ，g e n e o v e r e x p r e s s i o na n ds oo n w e0 v e r e x p r e s s e ds f r p 3t h r o u g hl e n t i v i r u sv e c t o r ( h i v - 1 ) ，a n d s f r p 3w o u l db r e a kt r a n s m i t t i n go fw u ts i g n a l i n g i nt h er e s e a r c h ，t h es t u d i e si n c l u d e d p n l i r e s 2 一e g f p s f r p 3w a sc o n s t r u c t e d ，l e n t i v i r u sw a sp r o d u c t e d ，a n ds f r p 3w a s o v e r e x p r e s s e di nm o l a rm e s e n e h y m ew i t hl e n t i v i r u sa sv e c t o r n 坨r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tl e n t i v i r u si n f e c t e d5 6 t o o t hg e r mm e s e n c h y m e c e l l s ，a n dt h e ym a yo v e r e x p r e s ss f r p 3w i t he g f p a sr e p o r tg e n e ；a te 1 3 5 ，o v e r e x p r e s s i n g s f r p 3i n m o l a rm e s e n c h y m ew i t hl e u t i v i r u sa sv e c t o rh a d1 1 0d i s t i n ce f f e c tf o rt o o t h d e v e l o p m e n t k e y w o r d s ：s f r p 3 , w n ts i g n a i 啦，l e n t i v i r u sv e c t o r ( h i v - 1 ) ，o v e r e x p r e s s i o n ，t r a n s f e c t i o n ， t i s s u er e c o m b i n a t i o n 1?- 福北帅 c 人学坝f 学位论文 中文文摘 w n t 信号系统已被证实在胚胎的发育中起指导分化和图式形成的重要作用，同 时新近的研究也证明了w n t 信号通路对成体的干细胞也具有重要的调控作用。w n t 基因家族中的许多基因及其拮抗物和受体也均在牙胚中表达，这表明w n t 信号在牙 齿发育的起始阶段可能有重要的作用。s f r p s 是新发现的蛋白质因子，在功能上 s f r p s 似乎是作为w n t 信号的调控因子，不同的s f r p s 与不同的w r i t 配基结合束调 控w n t 信号。研究基因的功能最为常用的方法为功能缺失和获得，即基因剔除、 r n a i 、过量表达等方法。前期研究发现，在早期牙齿发育阶段，s f r p 3 ( 见附录二) 和w n t 5 a 在磨牙问充质中部有表达。所以本实验主要研究过量表达s f r p 3 对小鼠早 期牙齿发育的影响，以期更深入的了解w n t 信号在牙日j 充质诱导牙齿发育能力中所 起的作用。研究结果对理解牙齿发育的分子机制有重要的意义，同时对理解哺乳动 物器官发生过程的分子机制也有普遍的意义。 研究内容： 为了探讨w n t 信号系统在牙胚组织诱导牙齿发育能力中所起的作用，我们利用 慢性病毒作为载体来过量表达s f r p 3 基因。由予慢性病毒的高感染率和能整合进入细 胞染色体而不发生基因重排，又可以感染非分裂期的细胞，并且具有高效整合、高 效转录、高效表达和宿主范围广的特点，因此它足真核系统基因转移的有力工具。 而s f r p 3 作为w n t 信号的竞争性抑制剂，其过量表达将会拮抗、阻断w n t 信弓通路 的传导。为此本研究主要做了以下工作： ( 1 ) 首先，把靶基因s f r p 3 亚克隆到慢性病毒表达载体p n l - i r e s 2 一e g f p 上，得到 我们所要的重组子p n l i r e s 2 一e g f p - s f r p 3 。 ( 2 ) d a _ - - 质粒系统( p n l i r e s 2 - e g f p 卅印j ，h e l p e r ，v s v g ) 转染2 9 3 t 细胞，产 生携带靶基因的慢性病毒，收集待用。 ( 3 ) 用收集到的慢性病毒液来感染牙间充质，再与无诱导能力的上皮重组，检测、 观察在间充质中过量表达s f r p 3 基因，对牙齿发育的影响。 研究结果： ( 1 ) 以酶切、连接、转化等常用的分子生物学技术构建p n l - i r e s 2 一e g f p - 5 3 q p 3 重 组子，并且用酶切的方法束挑选出阳性克隆。挑取的6 个单克隆全为阳性克隆。 因为此基因的亚克隆为非定向克隆，所以又以p c r 的方法来鉴定基因的插入 “i 一 祸矬帅范人学顺i 擘位论文 方向，在6 个阳性克隆中有4 个为正向插入方向的克隆。为了进一步确准，并 且送去公司测序确定插入方向以及序列的正确性，测序结果显示，插入方向以 及序列的准确性正如我们所预料。 。 ( 2 ) 本研究主要利用阳离子聚合物、磷酸钙法以三质粒系统( p n l - i r e s 2 一e g f p - s f r p 3 ，h e l p e r ，v s v g ) 转染2 9 3 t 细胞，并且列此两种方法进行 转染效率的比较，发现阳离子聚合物法的转染效率更高，对细胞的伤害也较小， 对细胞的生长情况要求较低，并且重复性比较强。我们又以生产出的病毒对 2 9 3 t 细胞和d s c p s 细胞进行感染，发现对2 9 3 t 细胞的感染效率极高，几乎 达到1 0 0 ，而对d s c p s 细胞的感染效率相对较低，病毒原液稀释1 倍后感染 2 4 h 、2 h ，经4 8 1 a 后观察感染效率分别约为5 0 、1 0 。 ( 3 ) 以携带靶基因的慢性病毒来感染e 1 3 5 的磨牙闯充质单细胞悬液2 h 后，与无 诱导成牙能力的e 1 3 5 的牙上皮重组，种植n d , 白鼠肾囊膜下生长三周，取出 组织块做冰冻切片，h e 、a z o n 染色观察结果。在此以空载的慢性病毒感染的 组织为对照，两结果对照发现，s f r p 3 的过量表达对牙齿的发育并无显著的影 响。 结论与讨论： 通过本实验的结果表明，e 1 3 5 时在磨牙间充质中过量表达s f r p 3 基因对牙齿的 发育并没有明显的影响，至于原因可以推测为以下几种：( 1 ) s f r p 3 基因只能特异性 的阻断w n t 家族中的一员，而其他的该家族成员也有类似的功能，所以只是阻断其 中一种w n t 信号传递，并不能对牙齿的发育造成可见的影响，所以我们下一步的工 作就是组合过表达多种s f r p s 来彻底阻断w m 信号传递；( 2 ) s , 挣p 3 基因并没有完全 阻断w r i t 信号传递，而w n t 信号在牙齿发育中的功能只要能达到一定很小的阈值便 可起到作用，而s f r p 3 基因过量表达后，w m 信号仍能达到该阂值；( 3 ) 因为在牙齿 的发育过程中，有错综复杂的信号通路的参与，它们彼此之日j 的关系也是相当复杂 的，有的功能相似，有的互补，有的为上下游关系，所以阻断w m 信号，也有可能 其功能被功能相似的信号所代替，也即w n t 信号通路在牙胚组织诱导牙齿发育中并 不是关键的信号因子。 f， 第l 章绪论 第1 章绪论 1 1 研究目的及主题 w n t 基因家族中的许多基因及其拮抗物和受体均在牙胚中表达，这表明w n t 信 号在牙齿发育中的重要性，所以研究w n t 信号在牙间充质诱导牙齿发育能力中所起 的作用，研究结果将对理解牙齿发育的分子机制有重要的意义 研究基因的功能最为常用的方法为功能缺失和获得，即基因剔除、r n a i 、过量 表达等方法。已经有研究结果表明，s f r p s 为w n t 信号的竞争性抑制剂，过量表达 s f r p s 则对w n t 的功能达到一种抑制或缺失的效果，所以将会拮抗、阻断w n t 信号 通路的传导。在小鼠牙齿的早期发育阶段。s f r p 3 ( 见附录二) 与w n t s a 在牙胚b j 充质 中均有表达，基于此，本实验试图通过过量表达s f r p 3 来拮抗、阻断w n t 信号，检 测牙齿的发育是否受到显著的影响。 1 2 文献综述 1 2 1 牙齿的发育 牙齿形成和其他器官形成一样包括三个基本过程，首先在正确的位置发生，然 后细胞增殖形成器官即牙胚雏形，最后细胞分化形成特异的器官即牙齿。这些过程 是通过口腔上皮组织和外胚间充质的交互作用实现的，这其中涉及由不同分子组成 的信号网络的调控，包括转录因子、信号分子、受体分子以及组织特异的基质蛋白 等，这些分子中有些在整个牙齿的发生发育中发挥作用。随着发育生物学研究的深 入，牙胚的发生发育机理逐步得到阐明。 l 211 哺乳动物牙齿发育的形态变化过程在研究哺乳动物时，通常以小白鼠为动物 模型。胚胎8 5 天( 在此表示为e 8 5 ，以下同) 时，胚胎中脑和后脑神经嵴细胞( c r e s t n e u r a lc e l l 。c n c ) 迁移到原1 3 ，后来会发育为牙间充质【1 勰4 】。e 1 0 5 时，牙齿发生部 位以及其类型已被决定，但此时并未出现形态学上明显的变化【5 , 6 , 7 1 。e 1 1 5 时，口腔 中牙齿发生部位的上皮组织局部增厚，上皮细胞为立方状，这些柱状细胞构成牙上 皮，此时称之为牙板期( 1 a m i n a rs t a g e ) ，这是牙齿发育过程中第一个可见的形态变化。 e 1 2 5 到e 1 3 5 期间，增厚的牙上皮开始不断分裂并向其下方的牙间充质组织入侵内 陷，并分泌一系列生长因子诱导周围的间充质聚集在下陷的牙蕾上皮周围，导致内 陷的上皮组织形成蕾状的结构，此时称之为蕾状期( b u ds t a g e ) 。牙蕾上皮细胞依旧呈 现高柱状，这一由柱状细胞构成的基底层上皮结构是牙齿发育中的标志性形态结构。 福吐帅地j 、学唧! i 学位谂之 e 1 4 5 到e 1 5 5 期间，持续增厚的牙上皮开始在周边发生艺曲，而在中心则生成控制 牙尖形成的临时性结构釉结节( e n a m e lk n o t ) ，在此并表达一系列的生k 因1 ：。 如s b b ，b m p 2 , b m p 4 , b m p 7 ，f g f 4 和f g f 9 s l 等，出于釉结节内的细肥发! j 捅亡，而 周边上皮细胞仍在增殖，这样整个牙上皮的不均衡生长，使得牙上皮的芏体彤态里 帽状，所以称此期为帽状期( c a ps t a g e ) 。e 1 6 5 以后，牙监e 进入钟状j | ( 1 ) c l is t g c ) ，此 时的牙上皮开始分化为前成釉质细胞，而日j 充质细胞分化为前成牙本质细胞，两类 细胞均进一步加长，细胞核迁移到远离基底膜的一端，并丌始，泌形成牙釉质和牙 本质的基质。由神经嵴衍生而来的问充质不但分化为成牙本质细胞，还能发育成未 束的牙榴骨 9 1 。 1 2 1 2 哺乳动物牙齿发育的分子机制 ( 1 ) 哺乳动物牙齿发育过程中上皮与间充质问的相互嚣导作用牙齿的生与：0 他胚胎嚣官的发生有着许多共性，也是由上皮和间充质之问的帽互作用而与黟组织 细胞能分化和有序结构的形成【i “。自乳动物的器官发育，从发育启动，形态发生到 终术分化，都是由构成器官的各组织问的相互诱导而发生的。这种诱导1 t i ) i j 包j 两 个部分：一个是能够产生片释放诱导因子的组织，即器官发育中诱导者或i 织者； 另一个罡肘这种诱导因子具有特定反应能力的组织，即反应者。就牙凶发育而击 诱导者是指能够诱导相邻组织表达特定基因，并指导牙齿发生的组织，改组织具有 诱导牙齿发育的潜能( o d o n t o g e a i cp o t e n t i a l ) ；而反应者则能对具有诱导牙齿发育i 苛 能的组织所发出的信号起反应，而被诱导进入牙齿发生：一涅，则改组织具有，jj 发 育灼被诱导潜能( o d e n t o g e n i cc o m p e t e n c e ) 。只有具有诱导牙齿发有沿能的诱导者和 具有牙齿发育的被诱导潜能的反应者同时存在时，牙齿的发育才能锝以进行。实验 肛胎学的组织重绁实验证明，在小鼠磨牙模型中，e 1 2 5 以阿，圹牙上皮与其他颅面 都经嵴来源的非牙问充质组织重组后，能发 i 形成牙齿的结构，所阻得出结沦：此 时牙齿发育的潜能位于牙上皮中，即牙上皮是牙齿发育的诱导哲d i j 2 1 。但q f r i 亚= 面 神经嵴来源的问充质才有牙齿发育的被诱导潜l j ，当牙上应与贝| f i i 神经吣米崩0 问充旷重组时则不能形成牙齿的结构。而e 1 2 5 咀后，诱导硝：凶发仃的矗能则4 哆刘 牙充质中，此时将牙上皮与其他任何颅面神经螭来张拍非牙州充质组够：。i 组均不 能形成牙齿的结均，而此时的牙问充质与? 牙l 皮组织量组则有牙齿舅：j 形成“。 在j 址胎发育中，矛澎i 性上皮与其下方舵外舱u j 觅质发生蚓工：q j ”，上皮中托成爿： i 号传递至外胚n j 充质中，托0 j 质j 。二彤? 7 ：j i 爻。一且：1 j 。l r ：仄旅：? 了成 - 。絮 4 第1 章绪论 牙信号，反过来它又可以指导上皮细胞获得成牙信号，形成成釉器，进一步形成牙 冠。 在牙胚发生早期，上皮与间充质的相互作用形成牙泵基。然后经历帽状期和钟 状期，在此过程中成牙潜能由成釉器上皮转移到了牙乳头f b j 充质，但如果没有成釉 器上皮的存在，牙乳头间充质将仍不能单独形成牙齿，这也说明在牙胚的后期发育 中仍需要上皮和问充质之自j 的相互诱导作用( i j f 。 最后，在牙胚发育的细胞分化阶段，牙乳头问充质细胞分化为成牙本质细j 地， 内釉上皮分化为成釉细胞，牙囊间充质细胞分化为牙槽骨和牙周纤维。即使在体外， 成牙本质细胞在无上皮的条件下也可分化，但在体内牙胚形成过程中，这些纫r t , i ，z 、 化的完成以及牙齿形态的形成，仍然依赖于上皮来源的成釉细月包和问充质来源的成 牙本质细胞问交互的组织间诱导。后期牙齿形态发育是早期的牙上皮和间充质之间 诱导交换的继续【l ”。 上皮与间充质之间又是如何相互作用的，已经有研究表明许多生长因子在上皮 与问充质相互作用中充当了诱导信号，这些生长因子在特定组织和特定阶段的表达 t 与其在器官发生过程中作为潜在的诱导信号功能相一致。在肛胎发育过程中上皮与 b j 充质之i 丑j 的作用是有序和相互的。其作用模型如图l 所示，这个梭型已得到了相当 多实验的支持【1 5 】在这个模型中，一个或一组特定的生长因子在组织a 中首先被表 达，通过扩散作用进入组织b 。组织a 可以是上皮，也可以是间充质。在组织b 中已 存在相关的受体，因此说反应组织对诱导物的反应是主动的，并非被动接受。受体 被活化后，导致组织b 中特定转录因子的表达，这些转录因子是第二组生长因子袭 达所必需的。第二组生长因子将信号反馈到原来的诱导者即组织a 中，诱导组织a 表 达另一组转录因子( 转录因子- 2 ) 。这样组织a 与组织bj 日j 的信号传递形成了一个信 号回路( s i g n a l i n gl o o p ) ，通过信号梯级链式传递，最终导致器官形成。 图1 还包含了另外两个特点，首先，如果转录因子1 和转录因子2 助能仅仅是信 号来回的相互传递，将不可能导致组织的连，货分化，因此应该押解为转录因子除了 调节生长因子表达外，在每一个阶段还调控特定结构基因的表达( 虚线箭头) 。其次， 转录因子对于激活下游基因足必要但不是充分的，这意味需要多种特定转录因子的 组合才能激活下游基因。是否是必要条僻通常可以通过基因敝除或功能缺失久上：# 来得以证实，如果将某些转录因子基因敲除或将它们突变，器官发育将停滞在某个 阶段，例如在l f = c 1 突变个体发育中，由于m s x l 基四突变导黝，? 7 在牙间充质中表 l 一 捐建师范大学硕十学位论文 达量减少，牙齿发育停滞在蕾状期，这说明转录因子m s x l 对b ，印4 表达是必要的1 。 在某些实验中发现，单一转录因子的存在并不能诱导下游生长因子的表达，认为很 有可能转录因子问的特异组合才对某个生长因子表达起到调控作用。实际情况可能 是不同的信号分子组合限定特定转录因子的表达。这些转录因子反过来又决定某个 或某些生长因子的表达，从而在牙上皮和间充质之间存在许多错综复杂的信号回路。 乍砍陶f 1 组织al i 然构麟冈2 c 转r 一瓠r 山ti 舒瞅b上 l 转球i 1 于l h # 。生k 闭+ r 2 如蓐 、 、 鼍 缩构壤蹰l 轴 上 转紊内f3 曲。， 结构基冈，蝴 步骠l步鞭2步棘， 图i 上皮与间充质之间相互作用模式图【1 5 i f i 9 2m o d eo f t h ea c t i o nb e t w e e ne p i t h e l i u m sa n dm e s e n c h y m e ( 2 ) 小白鼠牙齿发育中上皮和间充质之日j 相互作用的信号回路研究发现，b m p 、 f g f 之类的生长因子和含有同源框基因的转录因子在发育牙胚的不同部位和阶段均 有表达 8 , 1 6 1 。已经证实在早期牙齿发育中，生长因子作为上皮和问充质之间诱导的信 号分子，可以诱导相邻组织之间的基因表达和形态变化。用基因打靶的方法，敲除 m s x l ，m s x 2 ，d l x l ，d i x 2 、l e f t 和p a x 9 的研究工作也证明转录因子在牙齿发育中 的重要作用，其中任何一个转录因子的基因敲除小白鼠均表现出严重的牙齿发育缺 陷1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 , 2 1 】。在器官发育的上皮与间充质之间的相互作用中，生长因子基因的表 达和转录因子基因的表达存在明显的相关性。已知生长因子作为种旁分泌因子， 可在邻近的细胞组织中扩散，行使信号传导的功能，而转录因子则只在细胞核内部 发生作用，控制特定基因的表达。因此认为可能存在一种比较通用的发育模式，表 现为可在组织间扩散的生长因子即能调控转录因子，反过来它们的表达又被转录因 。 ” 第1 章绪论 子调控。细胞组织之间有序的相互作用正是通过这种调控所形成的信号回路而产生 效应的“”。 ( 3 ) 生长因子在早期牙齿发育中的表达牙胚细胞单独培养，不管是上皮还是问 充质，都无法阻止细胞分化甚至死亡【2 3 】，表明在牙齿发育过程中牙上皮和j 充质之 间的相互作用的重要性。研究表明可扩散的生长因子可以作为信号分子，在器官发 生中介导上皮与间充质之间有序的相互作用，激发或抑制有关基因的表达。这类生 长因子包括f g f s 、t g f d 家族中的b m p s 、w n t 家族和e g f 等1 2 3 1 。 b m p s ( b o n em o r p h o g e n e t i ep r o t e i n ) 足一种骨诱导物质，能在肌肉等，i t ：骨组织 中诱导新骨形成。b m p 可以以同型二聚体的形式或异型二聚体的形式( 如：b m p 2 7 和b m p 4 7 ) 与其受体结合，传导信号。在观察牙胚中b m p 的分布时发现，成釉嚣上 皮、牙乳头间充质细胞、前期牙本质内有丰富的b m p ，尤以成釉细胞及成牙本质细 胞中显著，提示b m p 在牙胚上皮一间充质相互诱导作用中有重要作用 1 3 】，b m p 4 是 最早被认定为介导这一诱导过程的信号分子。研究表明，b m p 2 。b m p 4 和b m p t 均在 牙胚中有所表达吲。e 1 1 5 到e 1 4 5 釉结节形成时，b m p 2 的表达就局限在釉结节 ( e n a m e lk n o t ) 的形成部位，并且诱导上皮和间充质表达删以及必z 、m s x 2 ，x e f l 等基因，b m p 2 影响细胞分化和成牙本质细胞的分泌功能【l ”。b m p 7 的表达模式与 b m p 2 极为褶似，并且砌棚霜阶妒7 在闯充质中均不表达。相比之下，b m p 4 在下颌的 表达模式在时空上表现出与牙齿的形态发生具有更加密切的相关性，所以认为b m p 4 在牙齿形态发生中扮演着信号中心的角色1 8 j 。b m f 4 是参与上皮与间充质楣互作用的 信号分子，可调控釉结节和l 晦近细胞的增殖和凋亡，早期作为上皮表达的信号分子， 在牙蕾期则作为外胚间充质的信号分子而存在【i 习。在还没有出现任何形态变化 饵1 0 5 ) 之前，b m p 4 就在下颁有表达，通过对，奎归的拮抗作用，而确定了日j 充质中 t p a x 9 、b a r x l 和p i t x l 及p f 肛2 ( 2 5 j 的表达部位，也预定了牙齿发生的部位。b m p 4 限制能 够决定磨牙形态的同源框转录因子b 嬲，在磨牙牙原基中表达。另外，b m p 4 还诱 导b l e h 在切牙间充质中表达口7 1 。组织重组( t i s s u er e c o m b i n a t i o n ) 实验表明，在e 1 1 5 时，诱导牙齿发育的能力位于牙上皮中，而e 1 2 5 时诱导牙齿发育的能力则转移到牙 胚组织的问充质中。b m p 4 的表达校式币好与这一过程相吻合，e l1 5 时8 m p 4 在牙上 皮中表达，而j ：u j t e l 2 5 时b m p 4 贝l j 在闻充质中表达【2 耵。而且利用体外器官培养技术 也证明t b m p 4 具有类似牙上皮( e 1 1 5 时，正表达b m p 4 的牙上皮) 能够诱导牙齿发育 的作用。b ! 仔4 能诱导牙州充质( 忑带上皮组织) 表达同源框基因m s x l 和m s x 2 、h m g 福建师范大学硕七学位论文 框基因皿和转录因子r 等，并产生相应的形态学变化。此外，b m p 4 本身亦能激 活牙间充质中的s t o p 4 的表达，同时还能反馈到牙上皮中，维持s h h f f u p 2 的表达并诱 导牙上皮釉结节的发育【”捌。因为b m p 4 基因缺失的小自鼠在牙齿形成之前就死亡 1 3 ”，所以b m p 4 是否能够作为牙上皮和牙日j 充质诱导成牙潜能的一个决定性的信号 在发育中起作用，还有待研究。但是b m p 4 在上皮中是一个非常关键的成牙潜能的信 号。 f g f 家族在哺乳动物的器官发生中也起着十分重要的作用。在f g f 家族成员中， 已知f e f 3 ，4 ，7 、8 ，9 和1 0 等均在发育的牙胚组织中有表达，它们在牙齿发育的整 个过程中发挥各自不同的功能【1 日。其q ，f g f s 和f g 9 在起始阶段( e 1 0 1 1 5 ) 的牙上皮 中表达，f a t s 的表达极为强烈，而，叠伊的表达较弱口”，因此将f g , r 8 视为牙齿发育启 动的第一个标志性的信号分子。f g f 8 通过诱导p a x 9 、p i t x l 和p i t x 2 的表达束参与限 定牙齿形成的位置 2 5 , 1 7 1 。f g f 8 还诱导b a r x l 在预定磨牙问充质中表达，以及以卵d 和 f g 3 在牙间充质中的表达1 3 l ，f g f 3 匏, 够刺激牙间充质细胞的增殖，而f g f l 0 却只能 刺激牙上皮的细胞增蒴，不能使牙间充质细胞的增殖p 3 l 。敲除f g f 3 和f f f l o 的d 、鼠来 见明显的牙齿缺陷口8 j q ”i ，但敲除f g f 3 和f g f l 0 共有的酪氨酸激酶受体f g f r 2 b 后， 牙齿发育停滞在蕾状期1 4 1 , 4 2 1 。但是，f g f 8 是否能指导口腔上皮形成牙齿还尚不清楚， 因为f g f 8 缺失的小白鼠，虽然切牙可以形成，但会缺失包括磨牙在内的其他第二腮 弓衍生物，而此时切牙的形成，很可能是由于f g f 9 的挽救作用”。在蕾状期到帽状 期的发育过程中，堆汐的表达加强，而f g f 4 的表达被w r i t 信号通路激活，f g f 9 和f g f 4 的作用都是刺激牙上皮和牙间充质细胞的增殖1 3 4 , 3 ”。用基因重组技术制备的f g f 4 0 被广泛用于牙齿形态发生的研究，与b m p 4 一样，外源性的f g f 4 可以部分取代上皮 的功能，诱导牙间充质中的m s x l 和m s x 2 基因的表达和形态学上的变化p ”。而且，外 源性f g f 4 植入实验表明：f g f 4 还可刺激牙胚间充质细胞增殖，诱导细胞表达 s y n d e c a n 1 ( 细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖) 和t e n a s e i n ( 胞外基质糖蛋白) 的形成，而 b m p 4 则不能。s y n d e c a n 1 和t e n a s c i n 均仅在牙胚的日j 充质中出现，被认为与牙齿形态 发生过程中b j 充质的集聚是密切相关的d ”。这些研究均表明f g f 在介导上皮与间充 质之间相互作用时起重要作用。 脊椎动物h e d g e h o g ( h h ) 基因家族有三个成员：s l f l a ( s o n i ch e d g e h o g ) 、i h h ( 1 n d i a h e d g e h o g ) 和d h h ( d e s e r t h e d g e h o g ) 。s h h 是唯一在牙齿发育中表达的胁，实验已经表 明鼢 信号在许多脊椎动物的器官形成和发育过程中起着不同的作用p ”。原位杂交 第1 章绪论 结果显示，在牙齿发育过程中s h h 最早在e 1 1 5 的小白鼠切牙牙基板的上皮中有表达， 说明跏 可能参与牙齿早期发育1 4 4 , 4 5 a 6 t 3 2 1 。并且以“纪作报告基囚的s h h 等位蔓囚敲 入小白鼠基因组，其鼢h 在口腔上皮的表达最早可以追踪到9 5 1 4 ”。诱导s h h 在牙上 皮表达的机制尚不清楚，但是b m p 在牙上皮和问充质的活性对维持跏 的表达是必 需的【2 9 1 。上皮表达s h h 可能刺激牙上皮分化来调节上皮增厚和下陷来形成牙蕾结构 【3 0 j ，有实验已经进行了证明，用浸泡s h h 的小球种植e i o 5 的鼠胚下颌可诱导其上皮 增厚，而在e i o 5 时用s h h 抗体阻断s h h 的活性可以使牙齿的发育停留在牙板期p “。 在蕾状期后，s h h 的表达在帽状期被限制在釉结节里，接下来扩散到周围的内釉上 皮和成釉器的中问层【4 2 】通过基因突变的方法进行基因分析发现f 腩信号通路上的其 他基因也不表达，进一步揭示了鼢 在牙齿发育中的作用。从牙上皮中剔除s m o 基因 ( 一种编码膜蛋白的基因，编码s h h 受体) 将导致上下颌的第一和第二磨牙不正常融 合，这与鼬 条件敲除小鼠的表型一致，既明s h h 信号可能除了在牙上皮内起作用， 也介导上皮与间充质相互作用【4 8 】。在h h 信号途径中，d i s p a t c h e d ( d 却) 在分泌 i h 的 细胞内通过控制h h 的总量来决定胚胎内m 冰平【4 9 , 5 0 1 。在所有的h h 信号传导通路中， d 卸都是必不可少的口“。j 了于s l l l l 信号减少而导致的人类忠h p e 疵时也会产生帽门 的牙齿表型。g f f 墓因编码s h l l 信号的转录效应元件，单独浓搿：三个钟基因中的任 何一个，都没有可见的牙齿缺损产生，但同时敲除g i u 和g l i 3 会使牙亡发育停止在 蕾状期以耔5 2 1 ，这进一步说明s h h 信号对牙齿发育的重要性。 脊椎动物w n t 基因家族是一庞大并且具有多样性的信号分子，在胚胎发育过程 中对模式形成、分裂增殖、细胞的分化及器官的形成部有重要作用【5 4 】。w n t 信号通 路在细胞内至少有三个分支：( i ) 经典的w n t 1 3 一c a t c n i n 途径( c a n o n i c a lw m p a t h w a y ) ， ( 2 ) 平行极性w r i t 信号通路( p l a n a r p o l a r i t yw ；l t p a t h w a y ) ，( 3 ) w n t ：c a 2 + 信号途径 ( w r i t c a 2 + d a t h w a y ) 1 9 8 1 ( 见附录一) 。w n t 信号传导通过f r i 乩l c 。工体家族实现 1 5 0 ，5 l 5 2 1 ，f r i z z l e d 为七次跨膜受蓐蜀白。w n t 信号的另一类型受z ；l r p 5 6 属于低密度 脂蛋白( l d l ) 家族1 5 3 , 5 5 】，在经x 雕j w n t $ c a t c n i ：诊径和w r i t c a 2 + 信号途径中，l r p 5 6 与f r i z z l e d 受体复合体为w n t 信号分子的受体，w r i t 信号分子同时与f h 7 z i c d 受体和 l r p 5 6 结合，形成配体受体复合物来o ：经煦的v ，叫# - c a t c h y , 途径蜀w r i t c a 2j 信号 途径【5 6 1 而在平行板性w r i t 信号辽路中，只需要f r i z ：l e d 受体的存在。已经确证， w m 信号的分泌性拮抗分子对调节w n t 信号活性超重要阼用，分i 0 性f r i z 丑e d 相关蛋 皂( c f r p s ) 作为v ，n 信号的可溶性罚节因子，与细2 诙上i c 一一：，1 r r 受体竞争住结合f 弋。 福睦师范大学碰十学位论立 w n t 信号分子 5 7 ”6 0 l 。通过s f r p s 在胞外屏蔽w n t 信号，避免经典的w n t f 3 - e a t e n i n 途 径、平行极性w r n 信号通路以及w r i t c a 2 + 信号途径的激活。w r i t 信号的另一拮抗分 子d i e k k o p f ( d 则是l r p s 6 的抑制性配体，一旦d k k 与l r p 5 6 结合，就会阻止 w n t - f r i z z l e d 和l r p s 6 间的相互作用，阻断w n t 信号的传导，但这只能阻断经典的 w n v l 3 - c a t e n i n j 鑫径和w n t c a 2 + 信号途径，却不影响w m 信号传导的平行极性w n 信号 通路口q 。如果在牙胚中过表达d i c k 基因，牙齿的发育将停滞在早期阶段这表明w n t 信号在牙齿发育的起始阶段有重要的作用。在发育中的口腔和牙胚组织中已经检测 到数种w m 基因的表达，并且大多数只在牙上皮中表达。在e 1 0 5 当牙齿发生部位和 模式形成被决定时，w n t 7 b 在口腔中预定牙上皮以外的区域表达p “。w n t t b 通过与s h h 信号相互作用而参与牙上皮边界的限定过程。在牙齿发生部位异位表达w n t 7 b ，能 抑$ u s h h 的表达，并导致牙齿发育被停滞。然而，在w n t t b 的表达部位异位表达s h h ， 不能抑s t j w n t 7 b 的表达，也不会诱导牙齿的形成1 6 l j 。因此认为，表达w n t 7 b 的细胞和 表达s h h 细胞之间的界限是由w n t 7 b 所激活的某种信号通路对s h h 的转录活性的抑制 而导致的【6 1 】。从e 1 1 5 起w n t l o a 和w n t l o b 就开始在磨牙和尖牙增厚的牙上皮中表达， 这些表达将一直持续到蕾状期四】，到了e 1 4 5 的帽状期，这两个基因仅局限在釉结节 中表达。此外，w n t 4 ，w n t 6 和另一种w m 受体f z - 6 都在牙上皮中表达，而w n t 5 a ，s k p 2 和咖j 的表达仅局限牙的间充质中1 6 2 】。如此众多的w n t 配基及其受体和调控因子都 在牙胚组织中表达，这表明w m 信号在牙齿发育中的重要性。已知l e f t 是w m 信号通 路的关键组成成分，e 疗基因剔除小白鼠的牙齿发育停滞在蕾状期p 删，这也进一 步说明w m 信号在正常牙齿发育中不可缺少的。最近也有实验证实，通过j 0 4 启动子 在牙上皮异位表达d t h w m 的一类拮抗物家族成d i c k k o p f ) 可以使牙齿的发育停 滞在蕾状期之前尽管这时牙上皮已经增厚【“。再者，有文献表明i “】，用外源性的 m f r z b l 蛋白( o n e o f f r i z z l e d r e l a t e d p r o t e i n s ) 抑制w m 信号的传导可使磨牙的发育受 到明显的影响，形成尺寸很小的牙齿，牙尖增多 6 6 l 。w n t 3 也在釉结节中表达，然而 通过削4 启动子在上皮中过量表达w n t 3 不会导致牙齿形态发生重大变化【6 “。因为一 些g i n 堪因缺失的小白鼠，包括阡h 盯，w t 9 2 ，w r i t 3 ，w n r 3 a , w n t 4 及w n t s a 的缺失导致小 自鼠不是在牙齿表型分析以前死亡就是在还没表现出表型前就死亡了。因此目前对 于w r i t 每个成员在牙齿发育中的作用还不清楚【5 t m 蚓。 “) 转录因子的表达与诱导过程是密切相关转录因子是一类d n a 结合蛋白，能 直接调控其他基因的活性。原位杂交实验表明一些重要的转录因子的基因，包括 第1 审绪论 膨吖，m s x 2 ，l e f l ，d l x l ，d l x 2 ，p a x 9 ，e g l ，p # x l 和p i t x 2 等，均在牙胚组织中表 达。这些转录因子的表达模式和上述有关生长因子的表达模式是相互重叠的，这沈 明这两类基因在组织的诱导过程中关系是相当密切的。基因敲除模型的构建使研究 转录因子在牙齿发育中作用成为现实，到目前为止，肱睇_ - 、l e f l - - 、p a x 9 - - 和p 妇2 - - 等基因敲除小鼠的牙齿发育大都停滞在营状期”7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 2 1 捌。 m s x 是一个同源框基因家族，人类和小白鼠的m s x 基因都均有三个成员：m s x ， m s x 2 和m s x 3 。其中m s x 3 仅在神经管背侧表达，而舰饼j 和m s x 2 在胚胎发育的许多器 官中均表达，而且，在这些器官发育过翌中，它们总是在上皮与间充质相互作用的 部位表达，这表明m s x l 和m s x 2 与这一过程有着密切的关系。有研究表明。小白鼠的 m s x i 和m s x 2 基因的表达模式与牙齿发生过程中的形态变化密切相关【6 9 1 。在e 1 1 5 时 m s x l 在牙间充质中表达极为强烈，但在上皮组织中并没有表达。与之相比，e 1 0 5 w r m s x 2 就开始在牙胚的问充质中表达，到了e 1 1 5 0 十m s x 2 与m s x l 同时在牙j | l 土；的阃充 质中表达，随后，m s x 2 在将要形成釉结节的上皮部位开始表达。s a t a k e t a t 9 4 0 l 和c h e n t i 等对m s x l 和m s x 2 基因剔除小白鼠的研究证实了m s x 基因在牙齿发育中的重要作用， m s x l 基因剔除的突变小白：的牙齿发育停滞在蕾状期阶段，而m s v 2 丛囚剔除的突变 小自鼠的牙齿发育表现出后期发育形态的缺陷【1 9 , 4 0 1 。另外，m s x l - m s x 2 双突变的小 自鼠牙齿发育停留在牙板期，说明这两个基因功e ? 有着重叠【4 3 】。m s x l 基因突变小 自鼠牙胚的基因表达检测发现许多基因表达水平下降，包括b m p 4 、飓3 、l e o ，d l x - 2 ， p t c 、s y n d e c a n 1a n dt e r m s c i n 1 4 , 1 7 , 3 2 。给予m s x l 突交的牙胚外源性的b m p 4 ，或者在 m s x l 突变的牙间充质中通过转基因异位表达b m p 4 可以部分。也啦m s x l 突变鼠的牙齿 形态，恢复一些下游基因的表达，比如明和d l x 21 1 4 , 1 5 , 2 9 1 。试验表明m 芷囡突变 会导致人类牙齿发育不全，进步说明了m 盯在牙齿发生中起亚要的作用【7 0 1 。彳试 验已经证明在牙齿发育过程中，m s x 基因主要起信号介导和化递的作用。牙上彦分 泌的b m p 4 、f g f 8 和s l l l l 能诱导问充质中的m s x l