（应用化学专业论文）萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与合成.pdf

大连理t 大学硕士学位论文 摘要 本文首先设计合成了一个在生理p h 值下，对c d ”高选择性的比率荧光探针l a 。此 探针以4 ，5 双取代- 1 ，8 萘酰亚胺为荧光团，二( 2 一吡啶甲基) 胺( d p a ) 和另一个2 毗 啶甲基为受体，通过金属离子对4 、5 位胺基供电性的影响而实现比率荧光检测。该探 针表现出了良好的选择性，即使是高浓度的生理广泛存在的离子( 包括：n 矿、k + 、m 矿 和c a 2 + ) 也不会影响探针的响应。值得注意的是，探针1 a 对c d 2 + 和z n 2 + 在信号上实现 了很好的区分。因为，c d 2 + 和z n 2 + 在元素周期表的同一主族，有着相似的性质，所以， 同类的探针通常表现出对c d 2 + 和z n 2 + 相同的信号响应( 包括波长的移动和强度的变化) 。 但是，c d ”和z n ”与探针l a 的作用产生了相反的荧光信号变化c d 2 + 削弱了共轭胺基 的供电性而使荧光信号蓝移( 由5 3 1 腿蓝移至4 8 7r i m ) ，而z n 2 + 诱导共轭胺基脱氢使 荧光信号红移( 由5 3 ln r f l 红移至5 5 8a m ) 。所以，实现了对c d 2 + 方便而明显的检测。 并且据我们所知，这是首个针对两种不同的客体，经历不同的分子内电荷转移过程 ( i c t ) ，实现相反波长移动的荧光探针。 为了进一步了解这一特殊的识别过程，通过结构衍生和n m r 滴定实验，随后对探 针1 a 受体结构和选择性的关系进行了研究。分别用3 吡啶甲基和2 吡啶乙基代替原有 的2 吡啶甲基结构，得到了探针1 b 和l c 。紫外和荧光光谱研究表明探针1 b 和l c 对c a 2 + 或z n ”都没有明显的响应，这一结果同时也与n m r 滴定实验结果相吻合，表明2 吡啶 甲基结构在识别作用中起到了至关重要的作用。不同与经典的d p a 对离子强烈的螯合 作用，辅助的2 吡啶甲基结构更多的是起到构建受体空间结构的作用。 萘酰亚胺的特殊的4 ，5 位空侑j 结构带来了此探针特别的光谱响应，所以，在研究的 最后部分，对萘酰亚胺3 , 4 位的合成，以及受体的合成进行了初步的探索和合成的改进。 关键词：比率荧光探针；萘酰亚胺；i c t ；分子识别 大连理工犬学删十学位论寇 襄囊赫燃菊枣躐滋囊i 瑟辩瀚瓣黪霉臻s e n s o r f o rc a d m i u m 娄参嚣惠萝卷巷专 融t l l i sa r t i c l e ，# h i g h l y 鞘l # b t i + r a t l o m e t r i cf l u o r e s c e n ts e n s o rl 捧w a ss y n l h e s i z e df o r c i镩h ；西l# a 疆w o r ku n d e r p h y s i o l o g i c a lp h f a l a g e b a s e d o f t 甓知舔痨螽秘e 拳 藩袋零蘸藏纛蝣潞嚣蠢# 螽戮嫦繇臻繇燃粼撼嘉黪鹾露# 漱瓣 a n o f f l e r 2 - p i e o l y lg r o u p 嚣st h er e c e p t o r b e c a u s et h em e t a l c a t i o nw i l li n f l u e n c et h e e l e c t r o n - d o n a t i n ga b i l i t yo ft h en hm o i e t y t h es h i f t so ft h ew a v e l e n g t hc a nb ee x p o e t e d s e n s o rl a 蠹瓣教爨勰啦燃g o o d 袋毳。聪链露。e v e n 磷建糕套l 黪韶i 鑫鲤掰敷嫩o f p 龄s l o l o g e a i | ya b 辩d a m 嫩辩臻嚣赋耘扩躺分，瓤翔麟獬攘s i g r 燃| s w i l l n o tb ea f f e c t e d i np a r t i c u l a r , s e l l s o rl as h o w se x c e l l e n ts i g n a ld i s c r i m i n a t i o nb e t w e e ng d 2 + a n d 辩扩b e c a u s ec d 2 + a n dz 矿瓣i nt h e 幽嘴醛她p e r i o d i ot a b l e , a n dh a v e 撼i 瓣攀莓嚷象蒋蛰臻糟瓣嚣棼黼礤鬻鼓擎辫鹱酝粼蠛黪稔锱馘爨t h e m , 瓤簿峨 t h e 婊i f t so fw a v d e n g t ha n dt h ec h a n g e so f n t e n s i t y h o w e v e r , u p o r t 翩i n t e r a c t i o n 州维 c + a n dz n 2 + s e n s o rl as h o w sr e v e r s ew a v e l e n g t h8 h i l * ”d 2 + 懈d u st h ee l e c t r o n d o n a t i n g a b i l i t y o f t h e n h n m i e t y a n d c a u s e s b l u e s | 嫒o f 濑e m i s s i o n 删v e t e n g t h ( f r o m 5 3 i 粼姆4 8 7 | | 盛甍w 瓤- r e a s 搿9 瓣渤黼滴鑫确鼢n 鞭m o e y a n d t i 瓣r e d 薮瓣嘏鹣 e m i s s i o n ( f r o m5 3l 料mt o5 5 8n m xt h e r e f o r e ，t h ee o n v e n i e n ta n dc o n s p i c u o u sd i s c r i m i n a t i o n o ft h et w oc a t i o n # i s e a l i z e d t oo u rb e s tk l l o w l e d g e ，i ti st h ef i r s tf l u o r e s c e n ts e n s o rt h a t 尊麟 毽瓣哟擎建受燃装鬻搿麓毒s s 滞# 擎。畦 壤鲻嚣1 交薛霉甏 逢魏辩锈鼗瓣晷羹滋擎随 t of a l r 氇e rm l d e r s t a n dt h i su n i q u ep h o t o p h y s i c a lp h 岱m o m e n a , s t m 淑u r ed e r i v a t i o na n d n m rs t u d i e sa r ec a r r i e do u t t or e v e a lt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u e t t b ga n ds e l e c t i v i t y , s e n s o rl ba n di e 辩姆翱瓠蒯u s i n g3 - 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二胺摹双取代一l ，8 萘酰豫胺为母体，利用其4 ，5 位的特殊空间结构 帮4 ，5 经不弱夔反应活往静特轰，会成了一令黪e 矿毒蹇逡撵性豹跑搴荧毙分子搽铮l g 。 另外，通过对新构懑的受体进行结构衍生和椭关的光谱考察，进一步揭示了新受体络构 和客体相互作用的必系。由于c d 2 + 是一种对人体十分有害的重金属，所以，本工作将对 进一步毽示c d 2 + 对象物抟的毒拨提供有力静工具。与此霹瓣，颞受体缝椽秘功能关系黪 研究，将为未来设计拜发新的荧光分子探锌褥供借鉴。存鬣籍的工作中，铮对多步爱疲 收率低的特点，对反应路线进行了改进，同时，也对3 , 4 ，- - 胺基1 ，8 - 茶酰亚胺的合成进 行了老u 步的尝试。 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与台成 文献综述 荧光探针的最大特点就是能够将微观的识别事件或微环境的变化转变成荧光，作为 信号为辨界所感知。因此荧光信号的重要性不富而喻，它的性能直接决定了人们对识删 事磐戆羯錾。瑟搴文，氇萼莓麸荧笼信号这令方甏进行分类，谤论荧光痿跨瓣凌存簧遴穰 制及其影响因素。 1 1 “开一关”模式：基于强度变化的荧光信号 ， “辩一关”模式楚矮篱擎静逻辑门，在z 芑土表瑗隽强液鹣感应交讫，逛裁是荧党 团在浆一波长下针对识别事件只改变其荧光强度( 图1 1 ) 。强度变化包括荧光增强矛 荧光淬灭( 减弱) 两种，而增强溅性能优于淬灭型。有多种光物理原理能够使荧光强度 发生变织，丈髂可分建疆下三类。 霹 埘 餮 匕睑 图1 1单通道“开关”式传感器示意图。a ) 电路擞比图；b ) 光储号响应；c ) 响应对传感器和洋 灭剂浓艘的影响。电源象征着仪器因豢，电压决定了输出信号的绝对值。灯泡代表糟传感器，光线 上朗横扳表示淬灭效应。 f i g 1 ，l s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o ni na n a l o g yw i t he l e c t r i cc i r c u i t 。对s p e c t r o s c o p i cr e s p o n s eb ，a n dt h e i n f l u e n c e o fr e s p o n s eo ns e n s o r a n dq u e n c h e rc o n c e n t r a t i o n sc l i n t h ec a s eo f s i n g l ec h a n n e l o n _ 3 f f s e n s o r t h ee l e c t r i cp o w e rs o u r c es y m b o l i z e sa l li n s t r u m e n t a lf a c t o r s a n di t s v o l t a g e ”d e t e r m i n e st h e a b s o l u t e v a l u e o f t b eo u t p u ts i g n a l t h e b u l bs y m b o l i z e s t h es e n s o r e l e m e n t a n d t h e d i a p h r a g m o n t h e o u t p u tb e a ms t a n d sf o rt h eq u e n c h i n ge f f e c t s 1 1 1 分子内光诱爵电子转移”1 分予内光诱导电子转移( p h o t o i n d u e e de l e c t r o nt r a n s f e r , p e t ) 是指魄子绘体或者电 子受体蓠先受光激发，激发态的惫予受俸每电予给体之阀裁卷是激发态豹瞧子给俸写穗 子受体之间的电子转移过程。这样就得到了分予内的完全的电荷分离。通常的p e t 荧 光分子探针体系是幽荧光团( f l u o r o p h o r e ) 、舆有客体结合位点的受体( r e c e p t o r ) 和连 菝譬( s p a c e r ) 缀残，荧必塑秘受依逶遥烷基镶豹连接髯连接在一起。露瘸豢理魏国1 2 所示。大多数情况下，荧光团受光激发后激发淹的能量足以氧化探针分子的受体部分， 2 墨 火涟理工大学硕士学位论文 受钵毁藤占毒孰遴( h o m o ) 奄予傻囊荧毙霞的h o m o 转移，夔褥荧必嚣熬激发态激 子不自够回落至原洙的基态，觚褥阻止了荧光潮的荧光发辩过程，即p e t 导致荧光淬 灭。 - u 二h 删。u 荧光囝 l u m o 拜0 拱o h o 赫。 束站台蹙休荧光翘站台受体 溷l 。2 p e 下缀瑾 f i g 1 2p r i n c i p l eo f p e t 图1 3a ) “o f f - o n ”荧光分子开燕； b ) “o n - o f f ”荧光分子开必 f i g 1 3a ) “o f f - o n ”f l u o r e s c e n c es w i t c h e s ；b ) “o n o f f f l u o r e s c e n c es w i t c h ( f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ) 受钵结会客簿瑟，氧纯毫锭舜嵩，僮褥受俸静h o m o 在憨量上低子荧巍溺熬 h o m 0 ，上述p e t 过程存热力学上变为不可能，结果是荧光得到了恢爱，这样就鬟蕊 了荧光的“关开”过程( “o f f - o n ”s w i t c h 图1 3 a ) 。逐有一种情况熄，当受体未结 会客体瓣，著没毒发生p e t ，那么荧龙保持；警受 搴结合客俸磊，探针受竞激发导致了 荧光豳刘受俸部分的电子转移，荧光被淬灭，这样就实现7 焚先的“开一关”过程( “o n - o f f ” s w i t c h 图1 3 b ) 。 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与合成 1 1 2 分子间的荧光淬灭( 增强) 作用 荧光化合物与重原子或过渡金属碰撞后系间窜越到三线态而造成荧光淬灭1 4 l 。分子 间的作用也可以抑制荧光团分子内自身的活动，提高分子的刚性，从而得到荧光强度的 大幅度增大。这一类型的典型代表是三芳甲烷染料，比如结晶紫和孔雀绿。这类染料在 液体溶液中是没有荧光的，但是一旦被吸附在刚性的表面或是被蛋白质粘合就会发出强 烈的荧光p j 。 除了分子内的光诱导电子传递，分子间的光诱导电子转移也可以淬灭荧光，只要保 证电子受体与电子供体保持足够近的距离。这一原理被运用在“分子灯标”d n a 测序 技术中【6 l 。也可以将分子间电子传递的供体受体对构建存蛋白质分子传感器中，被分析 物结合前后引起蛋白质构象的变化而改变供体受体之间的距离，从而产生明显的荧光 响应信号。荧光染料的聚集也能够淬灭荧光，这是由于发生了激发单体和未激发单体之 间的电子传递，这一效应也被应用到识别中。 1 1 3 溶剂参与的荧光淬灭 传感器大多应用在水溶液中，或是固着在某一固体物质的表面而裸露在水溶液中。 大多数荧光团在水中都有极低的量子产率，由于传感器与被分析物的作用而改变了荧光 团的外部环境，从而增加了其量子产率，这一特性可被应用到识别中。溶剂分子参与的 氢键的形成与破坏也能够强烈的改变荧光的强度。具有最低m r * 激发单线态的分子在溶 液中是非发射的( 个别小分子羰基化合物如丙酮、2 ，3 丁二酮等例外) ，它的荧光开关 作用主要是通过氢键的作用将最低能量激发单线态由n n * 激发态转变为7 1 7 9 * 激发态，使 荧光从无到有。如氢键供体溶剂甲醇增加了1 芘甲醛分子觚激发态的能量，从而使其 量子产率比在非极性的正己烷中高1 0 0 倍。 以上原理被广泛的应用在荧光探针的设计中，尤其是p e t 更是得到最多的关注。 但是这些探针终究做不到严格的定量检测，尤其是在生物传感器中大多需要两个发色 团，一个荧光团和一个淬灭团，这都给微量检测带来了困难。 1 2“或一或”模式：内标式荧光探针 1 2 1 内标 信号校准意味着为荧光信号树立一个标准，使之只取决于被分析物的浓度而不受其 他一切因素的干扰。在通常的荧光光谱测试中，得到的信号总是同时与从标准样得到的 信号作比较来分析样品的信息。这里的标准样可以是探针在特定的浓度下加入计量好的 被分析物，通过改变被分析物的浓度就可以得到一个标准函数，或是一条标准工作曲线， 然后将荧光响应信号带入到这一标准函数( 或标准工作曲线) 中就可以得到被分析物的 浓度。这一方法对于微环境检测却是很难实现的，主要因为： 4 太涟理工大学硕士学位论文 | ) 微巧缓孛矮耀准确遮知遴搽锋分子豹浓度；探铮分予豹识别缝簸瞧会蘧着肄阕 的流逝而衰减。荧光团会产生光潆白等反应。 ( 2 ) 微环境中单分子级别上，探针分子和被分析物都悬，1 ；均匀分散的，这样就需疆 给每点都建立一个标准函数，驻然这是小可能的。 裁忿，懿栗我稻簧褥蜀徽琴缓孛禳分辑耪躲分毒及性筑信息，藏霉簧建立舅终一黉 方法，也就是让单分子级别上的缳点都具肖自动校准功能。这意味着响应中不但饕包 括被分析物的识别信号，同时还霈要有另外一个信号来补偿其他因素对识别造成的午 挽。“野关”逻辑怒一维豹，显然镞不到这一点。 ，r、 f a l ：k d | = 竺l( 1 1 ) 。 ，m 触 在爱筵单兹l ：l 式结会中，被分辑物浓壤淤】可以摄摄方程式1 1 囊测定豹荧必强 度，褥到l 钍。这璧。代表未络合披分析物辩的荧光强度，靠。代表荧毙深针饱和孵候 的荧光强度，k d 代表解离常数。分子和分母的强度差能够补偿背景信譬，得到的比值 可以计算被分析物黝浓度。虽然，、如i n 和磊。是相互关联的，但是要仪证它们是张完 全一糕条 隼下溺餐豹数篷帮是骰誉弱豹。 解决办法之一是引入到探针分予中某一个参眈染料，能够和探针中酶荧光团一起受光激 发，并翻发射出，1 i 同波长的光。这样就得到了第二个独立的信息通道作为参比( 图l ，4 ) 。 参比逸簿静恰当，衣荧光光谱中就可敬雩导到嚣个峰值：自赛缀大发射程瓢，参比的最大 发射程如。参陀静僚号是在同样斡实验条件下测定静，因惩方程式1 1 的分子积分霹帮 除以如n 2 ) ，得到的方程式1 2 就可以用来计算被分析物的浓度【7 】，这样就建立起了内 = ( 器j ( 1 2 ) 图1 4 教通道“开- 必”式传感器示意图。a ) 电路豢比图；b ) 光储号响应；c ) 响应对传感器和淬 灭剂浓度的影响。 f i g 1 4 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o na ) ，s p e c t r o s c o p i cr e s p o n s eb ) a n d t h e i n f l u e n c e o f r e s p o n s e o 玎s e n s o r a n dq u e n c h e rc o n c e n t r a t i o n s0i nt h ec a s eo f t w o - c h a n n e | o n - o f fs e n s o rw i t hp e r m a n e n t l y s w i t c h e d o i l ”r e f e r e r l ? 2 。 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与合成 标。这里r = 1 ( x 1 ) i , o f o 2 ) ，r 。i n = k i 。( 九1 ) ，k f o 2 ) ，r m 。= i m 。o o i r 。f o 2 ) 这种策略得到了比较多的应用。典型的例子就是基于葡萄糖的生物传感器 8 1 。g o v i n d r a o 所报道的葡萄糖比率荧光探针是基于大肠杆菌葡萄糖结合蛋白( g b p ) ，在g b p 的突变异种l 2 5 5 c 上标记了环境敏感荧光团6 丙酰基。2 二甲胺基萘( a c r y l o d a n ) ，而 在半胱氨酸的氮末端标记了环境1 i 敏感荧光团钌配合物( - - ( 2 ，2 联吡啶) 1 ，1 0 邻二 氮杂菲9 异硫氰酸酯) 。结合葡萄糖后，极性敏感的a c r y l o d a n 暴露在溶剂中，导致了 其荧光强度下降。另一方面，钌配体并不受葡萄糖的影响，作为参比信弓荧光保持。 在这种方法中，对识别事件响应和不响应的两个荧光染料可以同时被激发，也能够 同时检测到它们的荧光发射，能够补偿实验过程中仪器所造成的不稳定。原则上结果也 具有可重复性。另外，如果两个染料类似的分散在被测样品溶液中，那么双波长比率信 号可以用来计算被分析物浓度。在被分析物的某一浓度范围内( 视方程式1 2 中k d 而 异) ，这一校准方法对于探针分子是可以做到定量检测的。 但必须指出的是，探针分子会随着时间降解，荧光染料部分也会发生光致漂白等现 象。这些作用对于小同的分子效果是不一样的，那么对于识别荧光团和参比荧光团的结 果也是不一样的，因此这种方法所得到的比率信号具有时间依赖性。另外，识别荧光团 和参比荧光团是独立发射荧光，与识别1 i 相干的外部因素对两者荧光光谱的影响也是1 i 同的，这些都会给测试结果造成很大的误差。换句话说，这种探针是不能够重复精确的 定量数据的。因此就需要建立起一种更加先进的校准方法。 1 2 2 基态“或一或”开关 上面讨论的参比荧光染料荧光恒定，对被分析物的识别不敏感，即第二信息通道对 识别并不具有开关功能。因此可以采取另外一种策略j 就是两条信息通道相互关联，存 在着某种形式的作用，当探针识别客体的时候，荧光发射在两条通道中被重新分配，这 样子识别事件就同时由两个信息通道来表达。如图1 5 所示，两个“o n 。o f f 门由一个 开关控制就形成了一个“o r - o r ”f - j 。实现这一操作可以通过引入参比荧光染料由两个 荧光团来实现，也可以不需要参比荧光染料由一个荧光团来实现。引入的参比荧光染料 与识别荧光染料相同时采用的是激基复合物原理( e x c i m e r ) ，若不相同时采用的就是 荧光共振能量转移原理( f r e t ) 。对不引入参比荧光染料，即荧光探针只含有一个荧 光团的情况，则需要识别荧光探针在结合客体前后具有两个不同的基态。 6 火连理工火学硕士学位论文 砖 棼 辍t 5 基态“戚或”式倦感器示意越。a ) 电路粪魄围；蚣光信譬喻戏；c ) 瑜蹴对转戆器鞍淬哭 裁浓度游影蠛。 f i g i 5 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o na ) s p e c t r o s c o p i cr e s p o n s eb ) a n dt h ei n f l u e n c eo f r e s p o n s eo ns e n s o ra n dq u e n c h e rc o n c e n t r a t i o n sc ) i nt h ec a s eo f s i m p l et w o - c h a n n e ls e q l s o rb a s e do n g r o u n d s t a t eo r - o rs w i t c h i n g ，t h es w i t c h o na n a l y t eb i n d i n go c g u i sb e t w e e nt w or e p o r t e r so rb e t w e e n t w og r o u t , d - s t a t ef o r m so f t h es 剐粼r e p o 竹e l 1 2 2 1 激籀复合物【9 】 如果两个相同的荧光翻( 主璎是多环芳烃) 彼此间的躐离和俄鼹合适，当其中一个 茨爽鞭嫒激袋以瑟赣会稻努癸一个链予蒺态戆茨光西形戚溆肇复合凝( e x e i m e r ) ，冀荧 光发瓣毙潜盼特征袭现是舔来静肇体麴发射蜂减弱或蠢滚必，取褥代之静是一个新麓、 强而宽的、长波长的无振动精细结构发射峰。由于形成这种激基复合物需要激发态分予 玛基态癸子这剿“碰撞”躐囊3 ，5 a ，鞠此茨巍团阉豹距离是激基复合貔形成霸破坏黪 荧键。襄熏备静分子窝露潮力改变嚣令焚先馥之辩戆距离蠢鼗离，熟焉缕合客俸藏器革 体激撼复合物的荧光光谱变化就能够袭达课题被识别的倍息。萘、蕙、院等荧光团由予 具有较长的激发单线态寿命，易形成激撼复合物，常常用于此类探针的设计中。 t2 式1 1 基于激纂复合物原理的荧光探钟 s c h e m e1 i f l u o r e s c e n tp r o b e sb a s e do ne x c i m e rm e c h a n i s m 7 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与合成 金属离子与化合物1 的醚链配位形成类冠醚状，改变了两个芘荧光团的位置，导致 单体和激基复合物荧光发生改变【1 0 】。与c a 2 + 和c d 2 + 作用时两个芘被拉远，激基复合物 荧光下降，单体荧光增加。而有意思的是与c u 2 + 作用时两个芘被拉近，单体荧光下降， 增加激基复合物荧光，并伴随着波长的蓝移。化合物2 有四个芘荧光团，形成两对激基 复合物【l ”。磷酸根离子进入空腔与酰胺键的作用使得芘彼此间分开，激基复合物荧光下 降，单体荧光增加。 1 2 2 2 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 是指在两个不同 的荧光团中，如果一个荧光团( 供体d o n o r ) 的发射光谱和另一个荧光团( 受体a c e e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时( 一般小于1 0 0a ) ，就可 以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受 体的荧光发射。进一步讲，就是在供体的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向 受体转移的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。供体分子被激发后，当 受体分子与供体分子距离合适，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级 问的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体 被激发。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光淬灭；如果接受体也是一种 荧光发射体，则呈现出受体的荧光。由于受体的荧光波长要长于供体的荧光波长，因此 f r e t 可以观察到双发射波长，从而满足双信息通道的要求。f r e t 严格受到供体和受 体距离的影响，如果识别事件能够改变供体和受体之间的距离，那么两个波长的荧光强 度就会发生变化，从而可以用它们的比值来表达识别事件。 f r e t 主要应用在生物医学领域。最有代表性的是r o g e ry t s i e n 等人研究出的 c a 2 + 荧光探针3 ( 见式1 2 ) ，分别以蓝色荧光蛋白或蓝绿色荧光蛋白( b f po r c f p ) 和 发射绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白( g f po ry f p ) 作为能量的供体和受体i l3 1 。c a 2 + 的结 合能够加强荧光蛋白间的能量共振转移，从而使得长波荧光增强。 大连理工大学硕士学位论文 式1 2 辇予f r e t 鹃e 荧必搽孝 s c h e m e l 2f l u o r e s c e n tp r o b e f o r c a 2 + b a s e d o nf r e t m e c h a n i s m f r e t 近年来广泛的应用存擞物酶的活性检测中。化合物4 是一个梭测磷酸二醣孵 溪毽豹荧悲攘铮p 4 1 ，毙量襞毒摹彝受俸分剩是霉豢素彝荧嵬索类荧走繁辩。l i 鸯羹磷酸二爨 酶时，发生能量共振转移，主要发射荧光素的荧光。在磷酸二酯被磷酸二貉酶水解詹褥 豆素和荧光素分离，f r e t 停止，以发射香豆索的荧光为主。化合物s 綦于相同的原溅， 甚至供髂和受体都一样，中间的逐接摹对9 一态酝胶酶敏感，因此可用予内酰胺酶的 活经徐测”。 隶409nm黜fret = u m 拶2 4 5 式13 貉子f r e t 的酶游性检测荧光搽针 s c h e m e1 3f l u o r e s c e n tp r o b e sf o re i y z y m ea c t i v i t yb a s e d 锶f r e t f r e t 也用存研究蛋白的结构和溶液中鬣臼蛋白的相飘作用，还被运用到核酸结构 研究、核酸调控，梭酸降解、寡核昔酸从核糖体上释放等许多方面。 1 2 2 。3 其有基态碧糖豹摹发色滋双遥遭魄搴荧竞薅应( “生动型”i c t ) 翻 9 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设讣与合成 荧光双通道表达除了可以通过双荧光团实现外，也可以由具有双通道功能的单个荧 光团来完成。这样的荧光探针通常在结合客体前后具有两个不同的基态，因而有两个不 同波长的激发光谱，能够分别激发基态异构体从而发射出双荧光。此类探针除了可以实 现荧光的比率检测，还能够实现吸收光谱的比率检测。在这类探针中应用得最多的就是 分子内电荷转移原理( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) 。典型的i c t 荧光探针所具 荧光团是一个强的推拉电子共轭体系，即通常所说的d a 型分子，共轭体系的供电子 部分或者是拉电子部分是受体的一部分，受光激发会产生从电子供体到电子受体的电荷 转移( i c t ) 。当受体结合被分析物后，作为受体的供电子部分或拉电子部分供拉电子 能力被改变，整个发色体系的7 r 电子结构重新分布，前后形成不同的基态，从而带来了 吸收光谱、激发光谱以致荧光光谱向长波或短波的移动，这类i c t 探针被k n u tr u r a c k 定义为“主动型” 1 6 1 如果在基态时参与荧光团共轭的那部分受体不与被分析物作用， 而是在受光照射处于激发态后才发生作用，这样的探针被定义为“被动型”i c t 荧光探 针。“被动型”i c t 探针在结合被分析物前后只有一个基态，但具有不同的激发态，因 此吸受光谱小会发生改变，只有荧光光谱会有波长的移动。这一类型将在下一小节中介 绍，这里只介绍“主动型”i c t 荧光探针。另外需要指出的是，对于识别阳离子型i c t 荧光探针，由于在激发态发生了排斥作用，阳离子被部分挤出，荧光光谱就4 ：会发生吸 收光谱和激发光谱那么大的波长蓝移【3 】。 酸碱变色指示剂可以看成i c t 最早的应用。后来t s i e n 开创性地将荧光团引入到 传统的阳离子配位受体中得到了识别细胞内c a 2 + 的i c t 荧光探针6 【1 。7 i ，c a 2 + 被络合后， 由于其拉电子效用改变了基态的电子分布，实现了吸收光谱和荧光光谱的比率响应。化 合物7 【1 8 l 、8 则是基于相同原理分别识别m 9 2 + 、z n 2 + 的比率荧光探针。i c t 多用于离 子的简单识别，对于复杂的生物体系还有待于开发。 善np 驴飞 67 式1 4“主动型”i c t 荧光探针 s c h e m e1 4a c t i v e - i c tf l u o r e s c e n tp r o b e s b 不论是由双荧光团产生还是由单个荧光团的不同形式产生的“或或”开关，都具 有波长变化带来的灵敏度高、可视检测等优点。但和引入荧光强度恒定的参比染料的方 法相比，并不具有明显优势。除了能够排除仪器和与被分析物相关的干扰外，它们依然 1 0 火连理工大学硕士学位论文 浸骞辫决耋动较准瓣翘题。困麓掰寿这些类蘩戆“或或”野关，两令发射戆态都是囊 不同的两个慕态产缀的，而不同的基态所受到的影响因素以及影响的稷度都是不同酶， 这必然导致两种荧光受到的干扰也是不同的，谨们的比值必然会受这些因素的影响，具 有波动性，不能够究全用来作定鬃测试。 。2 。3 激发态“或一鼗“并关 臻真正实现信号的自动校准和对被分析物的定量检测，就需要找到一种新的信号响 应原瑕，即能够补偿除了与被分析物相关以外的所有干扰因素的影响。根据以上的讨论， 这释黎理还需要潢麓虢下勇蛰嚣煮要袁( 翔嚣t 6 爨示) ： ( 1 ) 两个信息通道由单个荧光分子产生； ( 2 ) 两个信息通道相互之间必须紧密联系，两个波段的荧光强度等比率地与非被分析 物翱荚鹣绣有于扰翻豢援关联，这样强度豹魄毽方能够彻底攘除这些于亳| | i 。 强1 6 激发态“或一袋”式佟惑器黎纛錾。棼电路类院藿；蝣蠢髂号响应；。) 瓣残褥鹞惑器秘滓 灭剂浓度的影响。 f i g 1 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o na ) s p e c t r o s c o p i cr e s p o n s eb ) a n d t h e i n f l u e n c eo f r c s p o n s e o ns e n s o r a n dq u e n c h e re o n e e n t r a t i o n sc ) i nt h ec a s eo f t w o - c h a n n e lo r - o rs e n s o rw i t ht h es w i t c ho c c u r r i n gi nt h e f a s te x c i t e d - s t a t er e a c t i o n ， 隳做到这一切，唯一的办法就是需要荧光分子能够发缴快速而可逆转换的激发态反 应。如图1 。7 所示，分子a 受光激发后，两个激发态a 峙b 迅速达到动态平衡，弗 笺够程辕辫羯阗霖羚强定。交予a 耩b 之羯戆穗互转获安在舂狭，逮凌远运裹手辍瓣 和非辐射跃迁，因此影响其中一个激发态的任何因素也会同时以相同比率去作用于另外 一个激发态，这样就可以补偿那拨动态和不确定因素的干扰，两个波长的强度比值就是 恒定熬。 萘酰亚胺类镉离子比率荧光探针的设计与合成 c 窘 苞 8 d 心 a t = = 二二二= b a o b 图1 7 单荧光分子激发态反应示意图。单一基态a 激发到a 。激发态a + 与b + 迅速达到动态平衡， 速度远远快于辐射和非辐射跃迁。 f i g 1 7t h ed i a g r a mo f t h eg r o u n d - s t a t ea n de x c i t e d s t a t et r a n s f o r m a t i o n so f t h er e p o r t e rd y ei nt h ec a s e o f e x c i t e d - s t a t e0 r - o rs w i t c h i n g ( af a s tr e v e r s i b l ee x c i t e d s t a t er e a c t i o n ) t h ee x c i t m i o n ( s h o w na sa l l u p w a r da r r o w ) w i t ha ni n t r a m o l e c u l a rr e l a x a t i o n ( c u r l ya r r o w ) i sa nu l t r a f a s tt r a n s i t i o nf r o mt h eg r o u n da t ot h ee x c i t e da + s t a t e t h ea + b e q u i l i b r i u mw i t ht h ee x c i t e db + f o r m ( s h o w n b yh o r i z o n t a la r r o w s ) w i t hk i n e t i cc o n s t a n t sk + a n dk i se s t a b l i s h e df a s t e rt h a nt h ee m i s s i v e ( s t r a i g h tv e r t i c a la r r o w s ) a n d n o n e m i s s i v e ，q u e n c h i n g ( c u r l ya r r o w s ) t r a n s i t i o n sa + - aa n db _ bt ot h eg r o u n ds t a t t h ee m i s s i v e t r a n s i t i o n sg e n e r a t ef l u o r e s c e n c eb a n d sa td i f f e r e n tw a v e l e t i g t h s ，ha n d k s 1 2 3 i 光诱导质子转移 通常芳香羟摹( 酚类化合物) 在基态和激发态时具有不同的质子解离常数，受光激 发质子更加容易脱去，激发态时酸性增大，即这一类化合物激发态的p k 要小于基态的 p k a 。比如苯酚的p k a 和p 磁分别是1 0 6 和3 6 ，2 - 萘酚的分别是9 3 和2 8 。同样的对 于芳香质子受体( 芳胺或芳环氮杂原子) ，激发态时碱性增大，激发态的p 要大于基 态的p k 。比如2 - 萘胺的p 磁和p k a + 分别是