（化学工艺专业论文）几种β环糊精衍生物的合成及对药物分子的包结作用.pdf

摘要 坏糊精及其衍生物具有不同疏水空腔和亲水表而，可以选择性键合各种客体 分子形成包结复合物，大大改善客体的多种性质如水溶性、挥发一陀、稳定性等。 因此，环糊精及其衍生物在食品、医药、环境、卫生等多种领域得到了广泛应用。 本实验在碱性水溶液中合成了单2 一羟丙基b - j 不糊精、羟丙基一1 3 一环糊精、甲 基化1 3 一环糊精和羟乙基b 环糊精四种p 环糊精衍生物，并用薄层色谱、差示扫 描量热和红外光谱对其进行了表征。在此基础上，分别以母体虾糊精和四种衍生 物为主体分子，以苯甲酸、剥氧基苯甲酸、阿司匹林、甲睾酬和维生素d 2 为窖 体分子进行了分子识别研究，制备了包结物。由紫外一可见分光光度法测定了包 结稳定常数及形成包结物的主客体摩尔比，并对包结物进行了差示扫描量热和 红外光谱分析。结果表明：几种坏糊精衍生物与客体分子得到的包结物是完全不 同于简单物理混和的新物质，包结物的水浴性比客体分子本身有了明显提高，除 维生素d 2 外，单2 羟丙基一b 一环糊精与其它几种客体分予形成的包结物比p 一环糊 精形成的包结物更加稳定。环糊精与苯甲酸、刘氨基苯甲酸、阿司匹林、甲睾酮、 维生素d 2 形成包结物采用的摩尔比( 主体：客体) 近似为：1 ：1 ，l ：i 1 ：1 ，1 7 ：i 和2 ：l 。在包结机制研究方面，由主体分子，客体分子，主客体物理混和物，包 结物的红外特征峰以及包结摩尔比推测了可能的包结模型。 关键词：p 坏糊精p 一坏糊精衍生物 睾酮维生素d 2 分了识别 苯甲酸对氨基苯甲酸阿司匹林 甲 增溶 a b s t r a c t c y c l o d e x t r i n sa n dt h e i rd e r i v a t i v e sc a l ls e l e c t i v e l yb i n dg u e s tm o l e c u l e st of o r m c o m p l e x e sw i t ht h e i rh y d r o p h o b i cc a v i t i e s i nt h i sw a y , m a n yp r o p e r t i e so ft h eg u e s t c o m p o u n d sa r eg r e a t l yi m p r o v e ds u c ha ss o l u b i l i t ya n ds t a b i l i t y s oc y c l o d e x t r i n s h a v eb e e nw i d e l yu s e di nt h es t u d i e so ff o o d ，p h a r m a c e u t i c s ，e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e a n ds a n i t a t i o n ，e t c i nt h i s p a p e r , f o u r1 3 - c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e s w e r e s y n t h e s i z e d ，t h e y a r e m o n o - 2 一h y d r o x y p r o p y l - b c y c l o d e x t r i n ，h y d r o x y p r o p y l 一1 3 一c y c l o d e x t r i n ，h y d r o e t h y l d - c y c l o d e x t r i na n dm e t h y l a t e d b c y c l o d e x t r i n t h ef o u rd e r i v a t i v e sw e r ec h a r a c t e r i z e d b yt l c ，d s c a n df t i r b e n z o i c a c i d ，p a m i n o b e n z o i ca c i d ，a s p i r i n ， m e t h y l t e s t o s t r o n e ，v i t a m i nd 2w e r eu s e da sg u e s tc o m p o u n d st os t u d ym o l e c u l a r r e c o g n i t i o np r o p e r t i e so ft h es y s t e m ，t h eh o s t g u e s tc o m p l e x e sw e r ep r e p a r e da n d c h a r a c t e r i z e db yd s ca n df t l r 、a n dt h e i rs t a b i l i t yc o n s t a n t sw e r ec a l c u l a t e d t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h e c o m p l e x e s a r ed i f f e r e n tf r o mt h e i r p h y s i c a lm i x t u r e s c o u n t e r p a r t s t h es o l u b i l i t yo f t h e s ec o m p l e x e si sg r e a t e rt h a np u r eg u e s tc o m p o u n d s e x c e p t v i t a m i n 1 3 2 ，t h ec o m p l e x e s f o r m e dw i t h i n o n o - 2 - h y d o r x y p r o p y l b c y c l o d e x t r i na r em o r es t a b l et h a nt h a to ft h e3 - c y c l o d e x t r i n a st h em o l a rr a t i o so f t h e s eh o s t g u e s tc o m p l e x e sw e r e1 ：lf o rb e n z o i ca c i d ，1 ：1f o rp - a m i n o b e n z o i ca c i d ， 1 ：lf o ras p i r i n ，1 7 ：1f o rm e t h y l t e s t o s t r o n e ，a n d2 ：l f u rv i t a m i nd 2 ，t h e i rc o m p l e x m o d e l sc o u l dt h u sb ed e d u c e df r o mt h e s er a t i o sa sw e l 】a st h e i ri rs p e c t r u m k e yw o r d s ：3 - c y c l o d e x t r i n d e r i v a t i v e sm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nb e n z o i ca c i d p - a m i n o b e n z o i ca c i d a s p i r i n m e t h y l t e s t o s t j l o n e v i t a n f i nd 2s o l u b i l i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导f 进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处j l - ，论文中币包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得垂注盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我同工作的同志对木研究所做的任何贡献均已在沦文巾 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字h 期：年月f = i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨注盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。1 亓j 意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权晚叫) 学位论文作者签名： 王吵导m l s 签- g ：巧长掀 签字同期：枷岁年2 月j闩 签字同期：衅知月j 刖舌 自1 8 9 1 年v i l l i e r s 发现环糊精至今已逾百年，目前已经发展成为超分子化学 最重要的主体之一，其间包含着众多科学家和科技工作者的智慧和劳动，人量的 实验证明了它在药物剂型、分析技术和临床诊断等方面具有实际应用的可能和价 值。在基础理论研究方面，环糊精及其衍生物作为天然和半合成人工受体越来越 发出诱人的光彩，坏糊精化学在前沿学科领域中与其他学科互相渗透更增加了其 魅力，与已有的人工受体相比，坏糊精在基础理论、生产和实际应用方嘶部更趋 成熟。进入2 0 世纪9 0 年代之后，关于环糊精研究发表的相关论文、专利、专利 应用、会议文摘和专著如雨后春笋，1 9 9 6 年几乎每天有4 篇新的关于环糊精的 文章问世。由a t w o o d 和l e h n 主编，于1 9 9 6 年出版的系列丛书超分子化 学总论( c o m p r e h e n s i v es u p r a m o l e c u l a rc h e m i s t r y ) 共11 卷，坏糊精是唯一单 列分卷，其中详细评述了坏糊精的结构、性质、基础和应用研究发展段生产实用 现状。山此可见，环糊精作为人工受体与此后发腱起来的冠醚、穴醚、上1 ：番、杯 芳烃等大环化合物相比，堪称超分子化学的先驱。环糊精i ，j _ 以剧生物技术方法大 量制备，生产成本上有很大竞争力。其本身没有毒副作用可以在医药、食品、 化妆品等方面作为辅剂广为应用，这些都极人地促进了环糊精化学的发展。 环糊精及其衙生物具有不同的疏水空腔和亲水表面，而且具有手性微坏境。 这种独特的结构使得环糊精分子作为主体模型可以与从无机化合物到有机化合 物，从中性到离子型化合物，以及包括稀有气体等在内的一系列客体分子发生包 结作用。包结后形成的包结物具有许多独特的性能，比如，溶解性能、化学反应 性能、p k a 值、扩散性能、电化学性能以及光学性能等也都将随之产生一定的 变化。具体的变化情况与客体分子的结构特点具有重要关系。相应的包结稳定程 度将随着客体分予的极性、立体结构和构象等囚素的不同而表现出一系列的差异 性。另外，当一些客体分子的j t 寸明显超出环糊精空腔时，环糊精还j 以通过剥 客体分子部分基团或边链作用而产生一定的以别效果。 当客体分子部分或全部被州：糊精空腔包围后，人大减少了同周i 目上不境的接 触，因而起至l j l e l ：多特殊的作用。这使得环糊梢在医药、食品、f 1 用品、化学一l 业 和农业中得到了广泛应用。研究结果表明坏糊精主要表现出以下优点： 1 使挥发性物质长期保持稳定 ( 1 ) 降低易挥发物质的挥发性，保持原有的气i 床、风味。 ( 2 ) 将有毒液态物质制成固体，容易保存，减少毒害。 ( 3 ) 调、1 ，芳香物质和其它挥发性物质的释放速率。 ( 4 ) 除去发臭物质的臭气，改善加工和使用条件。 2 使受热、光、氧不稳定的物质稳定化 ( 1 ) 使不删热物质在高温中保持稳定。 ( 2 ) 使紫外线和可见光下不稳定物质保持稳定。 ( 3 ) 伎易被氧化和分解的物质稳定。 3 改变物质的物理化学性质 ( 1 ) 增大难溶或不溶于水的物质的溶解度。 ( 2 ) 防止包素、荧光变化。 ( 3 ) 掩盖怪味、苦味，增加物质的使用价值。 ( 4 ) 改善易自行分解、解潮、粘性物质的稳定性。 4 水不溶物的乳化、液化，如油、脂肪、脂肪酸等的乳化 5 液体变固体，如烃、醇、酯、油、脂肪等 6 用作有机化学的催化剂，物质的分离、分析，医疗化验等 此外，纠：糊精在超分子科学，纳米利料和生物功能模拟材料等诸多方面都展 示了其卓越性能。可以预见，随着对环糊精研究的不断深入，还会丌辟出更多新 的应用领域，环糊精必将成为大有作为的一类超分子化合物。 第一章文龇练谜 1 1 环糊精化学 第一章文献综述 v i l l i e r s 最早从l k g 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 淀粉杆菌( b a c i l l u sa m y l o b a c t e r ) 的淀粉消化液中分离出3 9 可以从水中重结晶的物质。山于没有还原性和能被酸分 解，所以叫它“木粉”( c e l l u l o s i n e ) ，当时还不能确证它的结构和许多特殊性质。 1 2 年后，s c h a r d i n g e r 在1 9 0 3 年用分离的菌株消化淀粉得到两种晶体化合物，确认 e f 与v i l l i e r s 分离出的“爪粉”是同一种物质。为了区别，把与碘一碘化剀反应牛 成蓝一灰色晶体的叫作旺耶糊精( c y c l o d e x t r i n ，简称d c d ) ，生成红棕色晶体 的叫作b 环糊精( 3 - c y c l o d e x t r i n ) ，d e x t r i n 取自d e x t r o s e ，后者是葡萄糖的早期名 称。这种用碘液反应生成晶体的晶型和颜色判断一、1 3 - 环糊精的方法沿用至今。 s c h a r d i n g e r 成功地分离山纯芽孢杆菌取名软化芽孢杆菌( b a c i l l u sm a c e r a n s ) ， 至今仍然是生产和研究中经常使用的菌利- 。为了纪念他对建立环糊精化学基础的 贡献，环糊精也曾f l 卜s c h a r d i n g e r ”( 沙丁格) 糊精。继s c h a r d i n g e r 之后在环糊精 化学研究中起领导作用的是p r i n g s h e i m ，他发现这种结晶性糊精和它的乙酸化产 物能结合各种有机化合物生成复合体( c o m p l e x e s ) ，由于使用不适宜的冰点降 低法确定分子量，以及许多推测缺乏事实依据，这一时期的研究工作进展很慢。 环糊精化学的第二个发展阶段人概是从2 0 世纪3 0 年代中期到6 0 年代爪。 f r e u d e n b e r g 最先得到纯环糊精，著和他的合作者根据乙酰溴和多甲基化反应产物 的水解结果汇同文献报道的数据，提出s c h a l - d i n g e r 糊精是葡萄帖单元以麦芽挑方 式结合的环状分子，分子内只含一1 ，4 配糖键。随后于1 9 3 6 年提出了这些结晶性糊 精的结构。在1 9 4 8 】9 5 0 年，f r e u d e 盯b e l - g 和c r a m e r 又发现了y 环糊精并确认了结 构。1 9 5 3 年f r e u d e n b e r g 干t l c r a l n e r 共同获得一项德国专利，文中枞括了当时在药剂 中应用的重要方面。在这一时期加入此项研究的还有f r e n c h 和c r a m e r 两个研究 组，他们分离、表征了环糊精的物理化学性质，指出还可能存在环更大的分予以 及与其它有机分子生成的复合体。这- h , j 期的研究结果使人们认识到琊糊牛占 及有 可能应用于工业。虽已建立实验室规模刹备工艺，但山于f r e n c h 等在检测环糊精 的毒性时，可能在样品中引入了高毒性有机物，致使实验所用小白鼠全部，e 亡， 因此得出环糊精有毒的错误结论，这在很长一个时期内妨碍了环糊精产品在应用 领域中的丌拓研究。 从2 0 世纪7 0 年代以来，环糊精化学的研究进入了鼎盛时j 目。严弹的生测实验 结果袭明h ：糊精是无毒的，在有法定资格的单位出示毒理学研究结果之后，消除 第币文献综述 了人们的疑虑。从此，关于环糊精的研究工作进入了快速发展的黄会时期。第一 届环糊精国际专题讨论会于1 9 8 1 年在匈牙利布达佩斯召丌，第四届会议1 9 8 8 年于 德因慕尼黑召丌，此后每两年一次已成例会。 我国上不糊精的研究始于2 0 世纪7 0 年代术中国科学院兰州化学物理研究所、 微生物研究所及上海医药研究院等相继丌展了环糊精生成酶和制备上不糊精的研 究工作。到目前为止，p 一环糊精已工业规模生产，0 【一环糊精尚无工业级产品，只 有以0 【一环糊精为主要成分含大量淀粉降觯物的混合环糊精能推入市场。 环糊精化学基础研究最早涉及到的范围包括：类酶催化反应和不对称催化反 应。随着技术科学的发展，各种研究手段不断推陈出新。学科涮的交叉渗透为深 入探究和拓宽坏糊精化学的研究创造了条件。最先提出仿生化学( b i o m i m e t i c c h e m i s t r y ) + 词的b 1 e s l o w 在人酶结构没计和研究方i ：( 【i 成就卓著，因利他的合 作者提出r n a 选择裂解坏磷酸酯和转氨酶的模型而著名。模型暗示在设计人工 酶结构的时候，要设法构筑协同作用体系。2 0 世纪7 0 年代以米环糊精化学的快速 发展并成为构筑超分予的重要主体，得益于技术科学的进步。各种新分析技术的 完善和新仪器n 勺山台，吸引了各领域科学家的关注，推动了环糊精化学的发展， 其中具有代表性并已秘累一定经验的足二维核磁共振( 2d i m e n s i o n a ln u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c e ，2 d n m r ) 、x 射线衍射( x r a yd i f i r a c t i o n ，x r d ) 和坏糊 精结合客体过程热力学函数的变化。提供的数据可以判断溶液中或固态山坏糊精 或修饰环糊精与相应客体形成复合体的拓：t l 、形态、各原予或基团的空f q t l a 4 1 i ，从 c | 了解结合过程诱导的构象变化，和形成复合体的新功能。在收集、分析大最热 力学数据的基砌上，提供了从更总括的观点讨论和认识各种有机、无机客体被环 糊精或修饰环糊精结合的性质以及控制超分子互相作用的因素。 随着生产l 艺的逐步改进和不断筛选出新的高效微生物菌株，环糊精的产量 利纯度大幅提高。目前世界上环糊精的年总产量超过1 0 0 0 吨，1 3 - 环糊精价格从 1 9 7 0 年的2 0 0 0 荚元千克( 只能作精细化学利料出售) ，降到今天的儿奖元2 产 克，旺、y - 环糊精及一些衍生物也都以工业规模生产。各种环糊精和修饰环糊精 小断问世并投入市场为丌扎坏糊精新的应用领域提供了可能”。l 。 1 1 1 环糊精的结构和性质 坏糊精是环糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o d e x t r i ng l u c o s y l t r a tj 1 s f e r a s e ， c g t a s e ) 降角犁淀粉的产物，是 h 一定数量的d ( + ) 一吡哺葡葡糖通过。一1 ，4 营键首 尾相连形成的环状化合物。习惯上用一个希腊字母表示其葡萄糖单元数日。其中 最常见的是“一、d 一、y j 不糊精，它们分别捌有6 、7 和8 个葡萄糖译元。山于这 些葡萄糖单元数的差异导致它们在溶解度、空腔尺、j 、旋光度以及结品形状等性 鹕一聪殳献综述 质上也不尽相同。表1 1 列出了三种常见坏糊精一些基本性质i2 1 。 表1 1 - ，b - 和y - 环糊精的一些基本肚质 t a b l e l - 1s o m eb a s i cp r o p e r t i e so fo t - , 1 3 a n dy - c y c l o d e x t r i n s 坏糊精i j | 勺外形呈截锥状，其中的葡萄糖结构单元采取未扭曲的椅式构琢。作 为吡哺葡萄糖单元4 c - 构象的结果，坏糊精所有伯羟基均座落于环的一侧，即葡 萄糖单元的6 位羟基构成了环糊精截锥状结构的主断或称第一面( 较窄端) ，而 所有仲羟基座落于环的另一侧，即2 位和3 位羟基构成了环糊精截锥状结构的次 面或称第二面( 较阔而) 。图1 1 给出了6 一环糊精的模型。坏糊精的内壁山指向 空腔的c 3 和c 5r 卜的氢原予以及糖苷键氧原子上的孤对电子指向卒腔内部，使 坏糊精空腔内部产生较高电子云密度，从而表现出一些l e w i s 碱的特征。由于以 上特点，环糊精第二面的仲羟基使其大口端和外壁表现出亲水性而其空腔内部 则为疏水性。尽管环糊精的主面也由羟基构成，但由于6 位、【】三甲基的存在，使其 第一面也表现出一定的疏水性，环糊精的疏水性和亲水性区城可用图1 1 c 表示。 第一章史献综述 斛一囝一嫠域 a b 献悭域。 幽1 11 3 - 环糊精的结构图 f i gi is t r u c t u r eo f l 3 - c y c l o d e x t r i n c t 一、p - 、y - 环糊精在水中的溶解度不同，特别是b 一环糊精反常的低。这可能 是囚为坏糊精一个葡萄糖单元上的2 位仲羟基与相邻的3 位付r 羟基之问形成了分 子内氢键。由于q 一环糊精的一个葡萄糖单元处丁扭曲的位置，因此，其笫二而的 氡键网络是不完整的。一个分子中只有叫个氢键形成。与之相反，b 一环糊精的篇 二面可以形成完整的氢键带，使其表现出相刈刚性结构，这也许可以解释6 一环糊 精在水中相对较低的溶解度。y 坏糊精由于环尺寸较大，表现出定的柔眺。到 此其水溶性在三种常见环糊精中最高。随着温度的丌高坏糊精在水中的溶解度大 大增加，因此环糊精的提纯可通过重结品方法进行。b 坏糊精在水巾的溶解度随 温度变化可用f 面的经验公式表示： l m p f 3 8 8 0 0 2 1 一i 塑圭! ! t 其中i 1 1 为d 一环糊精在饱和溶液中所占的摩尔分数，t 为绝对温度1 4 i o 环糊精像淀粉样，可以贮存多年不变质。环糊精在碱乃至强碱性溶液中都 是稳定的，但酸可使环糊精部分水解生成葡萄秸和一系列非环麦芽糖。在1 0 0 。c 时，1 t o o l - l “h c i 存在下放置半小时即有一半的d 一环糊精水解掉。虽然川；糊精在 酸中不稳定，似由于其没有还原术端，对酸的稳定性比线状糊精还是高2 5 倍， 可见环状分子配糖键的断裂是一个慢过程而且初始阶段的水解速度比终了阶段 要慢得多1 4 j 。 环糊精与淀粉一i 同的一个重要物理性质是具有良好的结品。性。在u 、1 3 、v 一 月：糊精r pb 坏糊精最易制备成品体，浓水溶液( 如2 0 - 6 0 ) 在室温或冰箱。p 放置，特别是当刚玻j 离棒搅动时迅速生成大量白色粉术晶体。在2 5 以l i 稀 溶液室温下长时间放胃可生成2 m m x 2 m m x 2 1 n l n 甚至更大些的透叫立方船体。在 旋光显微镜加卜偏光情况下，观察到彩色消光现象。坏糊精由丁水中溶解发火， 1 ；易得到晶体但浓溶液( 1 2 左右) 在冰箱叶i 常时f 叫放置能得剑无色针状品体。 显微镜观察晶形是判断样品是否为环糊精以及哪一种师糊精的快速、简便方法。 常用试剂是碘液( 1 2 k i ) ，将欲鉴定的环糊精水溶液1 滴涂到载片上，在滴加的 样品e 再加1 滴碘液于室温下放置，当液滴边缘水分蒸发干i 时，于硅微镜下观察 生成的品体。晶体的形状随浓度变化。旺c d 1 2 k i 包结物品体在低浓度时为蓝一 黑色板状证六边形，而高浓度时则为黑色长针状。3 - c d 1 2 k i 晶体为棕黄一黄棕色 短针状品体。7 - c d 1 2 k i 为棕黄色小方块状晶体。这至今仍是判断环糊精种类的 最快速、可靠的方法。值得注意的是如果发现有小同晶形存在，则说明样r w l 不纯 i 3 | 。 1 1 2 环糊精的生产现状 3 1 环糊精的生产主要来自生物发酵，v i l l i e r s 在1 8 9 1 年最早描述坏糊梢是 淀粉丰1 菌( b a c i l l u sa m y l o b a c t e r ) 与淀粉培养制备的时候，所) - i j 的极可能是小纯 的菌株。至l9 0 3 年s c h a r d i n g e r 叙述由微生物软化芽抱杆菌( b a c i l l u sm a c e r a n s ) 制备环糊精的时候，使用的则是确切的环糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o d e x t r i n g l u c o s y lt r a n s f e r a s e ，c g t a s e ) 。此后，陆续分离出许多可以产生胞外c g7 f a s e 的 细菌，它们都是可诱导原始型细菌，在含淀粉培养基中繁殖时i ：1 分泌酶。在1 9 7 5 年以前关于c g t a s e 的研究都来自b m a c e r a n s ，其中某些菌株至今仍在! l 广：l p 应 崩。b m a c e r a n s 产的c g t a s e 作用淀粉主要生成c 【一c d ，同叫山有3 - c d 利少量 , - c d 。关于作用机理、影响坏糊精产率和3 种环糊精比例的因素也有详细的研 究报道。h o r i k o s h i 等在1 9 7 4 1 9 7 5 年公们从各种土壤中分离m 杆蔺，培养分泌 的c g t a s e 在碱性p h 6 1 0 5 范围有活性。编号为b a c i l l u sn o 3 8 2 产的酶作刚 马铃薯淀粉转化率赢达6 5 8 0 ，其中1 3 - c d 含量约7 0 ，可以不用溶剂从发 酵液中结晶分离出3 - c d ，被看作是环糊精生产中的一项重人贡献，至今仍住生 产中应用。长期以来没有号一或主要转化产物为y - c d 的c g h s e ，但在制备一c d 和3 - c d 的发酵液中大都含有一定比例的7 - c d ，只是= | 十含量少，水溶性大， 需要增加装置和过程爿能得到纯的产品，冈此7 - c d 的市场价格一直居高不下。 1 9 8 6 年k a t o 雨ih o r i k o s h i 从土壤中分离出一株菌n o _ 3 1 3 ，经鉴别是十l i 草卡t 菌属 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，由它分泌的c g t a s e 只催化形成7 - c d ，在酶水解液中没有 查出，3 - c d ，但产率只有5 。此后，德幽的w a c k e r 公司通过划微生物筛选， 分离出一株分泌7 - c dc g t a s e 的高碱性b a c i l l u s 菌，鉴定为b a c i l l u sf i r m u s 2 9 0 3 ，酶水解液。 j 只含很少量1 3 - c d 。作为底物制备环糊精的原料包括：区米淀粉、 马铃薯淀粉、可溶性淀粉、支链淀粉、木薯淀粉等。 环糊精的制备包括以下主要阶段： 菌种的筛选、培养、制备c g t a s e ； 从细菌培养液c p 分离c g t a s e 酶的纯化、浓缩、粉体化； c g r a s e # # l 淀粉或预水解淀粉为环状和非环状糊精： 从转化混合物中分离环糊精、环糊精的纯化与结晶。 生成的品体。晶体的形状随浓度变化。i t - c d1 2 - k i 包结物品体在低浓度时为监 黑色板状币六边形，而高浓度时则为黑色长钊状。b - c d l 2 k i 晶体为棕黄一黄棕色 短针状晶体。t - c d 1 2 k i 为棕黄色小疗块状晶体。这至今仍是判断环糊精种类的 最快速、可靠的方法。值得注意的是如果发现有不i 刊品形存在，则说明样断i 不纯 1 3 l 。 1 12 环糊精的生产现状p 环糊精的生产主霉来自生物发酵，v i l l i e r s 在1 8 9 1 年最早描述环糊梢是由 淀粉杆菌( b a c i l l u sa m y l o b a c t e r ) 与淀粉培养制各的时候，所j 的撇可能是小纯 的菌株。至1 9 0 3 年s c h a r d i n g e r 叙述由微k 物软化芽地杆菌( b a c i l l u s l l l a c e f a u s ) 制备环糊梢的i l t 候，使用的则是确切的环糊精葡萄精苯转移酶( c y c l o d e x t r i n g l u c o s y li r a n s t b r a s e ，c g t a s e ) 。此后，陆续分离出许多可以产生胞外c g f a s e 的 细菌，它们者i ；是刮诱导原始型钏卣，在含淀粉培养基中繁殖时叩分泌酶。仵1 9 7 5 年以前关于c g t a s e 的研究都来自b m a c e r a n s ，其中某些茼株至今仍枉牛产。p 应 崩。b m a c e r a n s 产的c g t a s e 作1 i = j 淀粉主要生成1 2 , 一c d ，同日_ j 山有b c d 干 _ 少量 7 - c d 。关于作j | 协【理、影响坏糊精产率和3 种环糊精i l f ，4 的因素也有许细的研 究报道。i l o r i k o s h i 等在1 9 7 4 1 9 7 5 年公柑从各种土壤中分离出杆茼，培养分泌 的c g t a s c 在碱性p h 6 l o 5 范围有活性。编号为b a c i l i h sn o 3 8 - 2 产的酶作刚 马铃薯淀粉转化率商迭6 5 8 0 其中d 。c d 含量约7 0 ，可以不用溶剂从发 酵液中结晶分离出b c d 被看作是环 ；| j 】精k 产中的一项驱人贡献，至今仍在生 产中应用。长期以来没有专一或主要转化广物为y - c d 的c g t a s e ，但在制备一c d 和1 3 - c d 的发酵液叶1 犬都禽有一+ 定比例的3 - c d ，只是f _ 【二j 含量少，水溶性大， 需要增加装置和过秤爿能得到纯的产品，冈此7 - c d 的市场价格一直居高不下。 1 9 8 6 年k a t o 和h o r i k o s h i 从十壤中分离出一株菌n o _ 1 3 ，经鉴别是枯草杆菌属 ( b a c i l l u ss u b l i l i s ) ，由它分泌的c g y a s e 只催化形成y - c d ，在酶水觯液巾没有 查出b c d ，但产率城有5 。此后，德幽的w a c k c r 公口j 通过刘微生物筛选 分离山一株分泌3 - c dc g t a s e 的高碱性b a c i l l u s 菌，鉴定为b a c i l l u sf i r u q u s 2 9 0 3 ，酶水解液中只含很少量1 3 - c d 。作为底物制备环糊精的原料包括玉米淀粉、 马铃薯淀粉、一j 溶性淀粉，支链淀粉、木薯淀粉等。 环糊精的制备包括以f 主要阶段： 菌种的筛选、培养、制备c o t a s e ； 从细菌培养液中分离c g l a s e 酶的纯化、浓缩、粉体化： c g r a s e 转化淀粉或预水解淀粉为环状和非环状糊精； 从转化混合物中分离环糊粘、环糊精的纯化与结品。 从转化混合物中分离环糊精、环糊精的纯化与结品。 始一带文献绢：进 日u 三项属于生物化学与生物工程技术，后一项是化学与化工过程。按照现行 有效生产实用原则，应当首先考虑安全问题：选择适宜的微生物菌株、小心控制 发酵条件和酶分离条件以保证符合安全要求的舰格。美幽食品添加剂联合专门委 员会( f a q w h oj o i n te x p e r tc o m m i t t e eo nf o o da d d i t i v e s ) 曾对食品用酶提出详 细标准，要求原材料中不含有害和不确定物质：铅、砷及总重金属含量要分别低 于1 0 ，3 ，4 0 p p m ；没有抗体活性：微生物污染：大肠类1 3 0 g ，无沙门氏菌，无 大肠杆菌，总活菌计数 5 0 ，0 0 0 g 。如果食品用酶来自遗传学改性的微生物需要 评价供体、受体和最后的克隆株( c o l o n e ) 。 表1 2 列j 了目前国外环糊精及其衍生物卜产概况。 表1 - 2 国外环糊精及其衍生物生产概况 t a b l ei 一2p r o d u c t i o n so f c y c l o d e x t r i n sa n dt h e id e r i v a t i v e si nf o r e i g nc o u l l t l i e s 环糊精的制备和生产与应用) r 发互为因果，产品成本的下降有利于应用开发 和扩大市场，反过来积极拓宽二次丌发，扩大应用范围也会刺激生产能力的扩大 和采取措施降低成本。目自i 坏糊精的生产嘶临的挑战和解决问题的途径主要有以 下几方面： ( 1 ) 筛选优良菌种。一足具有更高的产酶量，其二足所产酶具有选择降解 淀粉能力，主要生成或只生成种c d 。 ( 2 ) 用遗传工程方法提高一种c g t a s e 的产量。德冈的w a c k e l 。公司得到的 克隆株( 嵌合体基因) b f i r m u s2 9 0 3 具有更高的产7 - c g t a s e 能力。采用遗传工 程方法有可能得到集酬热、高产、专一性丁_ 一身的产c g t a s e 克隆株，以适合人 舰模牛产的需要。同时还应考虑所产c g t a s e 的安全性，以符合在食品和医药方 面使用的限定规格。 ( 3 ) 需要进一步揭示决定各种c g t a s e 的生产特异性( 不同一，b 一，y c d 比例) ，以及c g t a s e 与d 一淀粉酶之问差别的内在凶素。并进而有可能有理论依 据地去设计具有改进生产特异性，减少抑制生产的突变体( m u t a n t s ) 。长远日标 是构筑仅生产t l 一，1 3 - c d 或7 - c d 的突变体。 ( 4 ) 引入或设计先进的生物反应器、反应工艺：引入或设计先进的分离、 纯化技术与装霄；组建高效、经济、安全的生产流程。 ( 5 ) 利用基因工程方法克隆k l e b s i e l l ao x y t a c am 5 a lc o t a s e 的丛因组建嗽 合体基因，在转基因马铃薯植物的块茎中生产环糊精，这种大胆的尝试已初获成 功。将这种转基因植物块茎在转入温室之后种植1 4 周，有o 0 0 1 o 0 1 内源 淀粉( e n d o g e n o u ss t a r c h ) 转化为环糊精。随l 刿细菌c o t a s e 基因在马铃薯块茎 中表达运送到淀粉质体，具有生产环糊精的活性。以上捕述的是一种“分了耕作” ( m o l e c u l a rf a r m i n g ) 的模式，这是一个廉价生产环糊精的诱人途径。 除生物发酵法外，t a h a h a s h i 和o g a w a 曾报道过一例全化学合成路线：山八 乙酰基麦芽糖出发，最后将得到的葡萄 ! i 糖衔生物闭环，成功的合成了u c d 。 1 1 3 环糊精的修饰 从环糊精的分子性质看，它们还有很大的局限性。所以要适应不同的应用目 的，就需要刑。环糊精进行化学修饰。修饰环糊精( m o d i f i e dc y c l o d e x t r i n s ) 是指 在保持大环基本骨架不变的情况下引入墩代基。因此，修饰后的环糊精也叫肺糊 精衍_ ：物。通过化学修饰，至少可在以下儿个方面改变环糊精的化学、物理性质。 ( 1 ) 引入基刨调1 ，在不同溶剂体系中的溶解度，特别是包结物和超分予复合 体的溶解度。 ( 2 ) 改变包结配位能力，得到高选择性的分子受体。 第一章文献综述 ( 3 ) 引入催化活性基团( 功能基团) ，作为人工酶模型，探时酶催化反应的 机理。 ( 4 ) 引入特殊原子或基团，构筑研究弱相互作用力模型。 ( 5 ) 引入特殊基团，构筑有特殊功能的超分子和自集成超分子聚集体。如分 子管道、分子器件等。 因此，环糊精化学修饰方面的工作在很多情况下是必不可少的。但由于环糊 精具有特殊结构和性质，刘其进行化学修饰，特别是选择性化学修饰、分离和纯 化至今仍是一个难点。目日口，刘环糊精的修饰基本是按以下策略进行： ( 1 ) 从羟基直接进行修饰。 ( 2 ) 将环糊精分子的羟基选择性的转变为亲核性更高的基团，然后弓亲电性 分子缩合。 ( 3 ) 将环糊精分子的羟基选择性的转化为可离去基团，与亲核性分了反应。 ( 4 ) 利用其它特殊化学反应进行选择性修饰。 1 1 4 重要的环糊精衍生物 11 41 酯类衍生物 这类衍生物包括那些取代基以酯键与环糊精c 2 ，c 一3 ，c 一6 位连接的修饰环 糊精，其中最为重要而又有实际应用意义的是磺酸酯、羧酸酯和氨基甲酸酯。通 过磺酰化( t o s y l ) 化生成的环糊精磺酸酯是修饰坏糊精的重要中间体，选用适宜 的亲核试剂( 碘、卺氮化物、硫代乙酸戊酯、羟胺、烷基胺) 进攻与t o s y l 基棚 连的碳原子进行亲核取代反应，可以得到系列功能化环糊精。其中最有代表m 佝 是单6 一对甲苯磺酰一1 3 一环糊精( m o n o 。6 o t s 一6 一c d ) ，它可与多种亲核试剂反应生 成6 位单取代产物，如图1 2 。典型的m o n o 6 o t s b c d 合成方法是在无水呲啶 中进行f i j i s - t ，本实验室采用坏糊精与对甲苯磺酰氯在碱性水溶液中合成了 m o n o 6 o t s b c d ，产率达3 7 悼j 。 1 1 4 2 醚类衍生物 醚衍生物是取代基与吡哺葡萄糖单元的c 一2 ，c 一3 ，c 6 位以氧原子连接f j j f f l 饰坏糊精。从使用观_ j 考虑，这类修饰环糊精中最重要、研究得最多的是甲基、 乙基与羟丙基醚，国外部已有工业缴规模产品，并存各种生产技术- + ，应用。制备 方法有二：其。是坏糊精羟基直接与硫酸= 甲酯、硫酸二乙酯、卤代烷、环氧 化物等烷基化试剂反应1 】：其二是，首先将坏糊精硪酰化，再通过驳代碳酰幕 向c 一6 位引入烷基。 第一章义献综述 o 【 o l 工一一n h r r ii 。，n 1 _ - s c o c h ，a l k y io 。p o l y a l k y la m i n e s ，a l k , it h , o r 2d e r i v a t i v e so fp d - g l u c o s e ，1 3 - d g a l a c t o s e dm a n n o s e ，b - d a n dl f r u c t o s e r 1 o h 一n h p h 幽1 2 环糊精6 何单墩代方法 f i gl 一2m e t h o d sf o rm o n o s u b s t i t u t i o na lt h e6 - p o s i t i o no f c y c l o d e x t r i n s 1 1 ，43 去氧环糊精 在去氧环糊精中有两种类别，一类作为最终，“物包括s 一和n i i 一及氢原子代 替一o h 基的衍生物【l 4 1 ，粥一类是作为中问体可以进一步衍生化的有一c l ( b r , 1 ) 矛i j 坏 氧基修饰的环糊精衍生物。去氧卤代环糊精本身相当敏感，主要用作引入其它基 团的中间体。另外，在保留卤素原子引入其它取代基时，应当选择后引入卤素原 子的路线【，j 。 1144 特殊功能化的修饰环糊精 这类坏糊精箝于牛物包括桥联环糊精，糖基修饰坏糊精，嵌入生物小分子、发 色团、荧光基团等功能綦闭或引入其它大环结构的衍生物15 - 1 6 l 。在研究这些新的 衍生物时发现了许多极其有趣的现象。如l l a r a d a 等将以p e g 位模板制备的一 环糊精多轮烷存1 0 的氧氧化钠水溶液r 1 _ i 与环氧氯丙烷反心，然后在2 5 的氢 氧化钠水溶液中除去封端剂，通过凝胶渗透色谱榆测发现，所得到的产物是一种 管道状高分子，平均每个分子管道由1 5 个多桥联环糊梢单元构成，这种管道状 高分子在药物传输等方幽i 具有潜在的应用价值。通过对它们的研究可以获得如何 从人们生活的宏观 丛界去描绘分子机械的微观世界的方法。在这领域的研究虽然 历史不长，但极具诱惑力，日前虽仍处于璀础研究阶段，但极有希望丌发h j 新材 料【”1 。 肇躬 拦 簖挚 睥。 销一章义i 酞综述 幽l ，3 由坏糊精制箭的分子管道模7 弘 f i g1 3m o d e lo f t u b u l a lp o l y m e rf r o mc y c l o d e x t r i n s 1 1 5 环糊精包结物的制备及表征 1 1 5 1 包结物的制备“”1 1 在水溶液中的制备方法 将环糊精与客体共溶于水中是制备包结物的最一般方法。使用这种方法时水 的存在是绝剥必需的。有时根据需要禽有有机溶剂的水体系也可以使用，尤其客 体分子是疏水的或其熔点高于1 0 0 。c 的，不能很好的分散存环糊精水溶液中，这 时可以考虑使用有机溶剂( 如甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙腈等) ，但需要注意 的是有时分离山的是含溶剂分子的三元包结物。在m 成包结物过程中自n 热处理 不仅可以加快包结物的形成，也有利丁保持包结物的某些物理化学性质。为了加 快包结物的形成，在有些情况下可以用超声技术来增加搅拌强度。 ( 1 ) 共沉淀法( c o p r e c i p i t a t i o n ，c p ) 共沉淀法即搅拌或振荡环糊精的溶液与客体分子或其溶液的混合物，这是比 较常用的方法。环糊精的溶液可以是凉的、热的、中性的、碱性的、酸性的，根 据客体分子的性质而定。将讣算好配比的主客体加到一起，在s t 。