（化学工程专业论文）改性蒙脱土脱除黄曲霉毒素b2的研究.pdf

中文摘要 黄曲霉素是对人体危害最大的食品污染物之一，由于其高的毒性和致癌性， 世界卫生组织将其划定为一类致癌物。近年来，随着食品安全性要求的提高，开 发一种能高效脱除食品中黄曲霉素的材料是非常必要的，与此同时对黄曲霉素在 该材料上的吸附行为的研究有着深远的理论和实际意义。 本文开展了水体中脱除黄曲霉素b 2 的吸附过程的研究，开发了新型复合吸 附材料c u p t 脚m m t 并对其吸附机理进行了初步探讨。考察了温度和p h 值对吸附效果的影响并确定了最佳的作用温度和p h 值：研究了该吸附过程的动 力学和热力学性质。实验结果表明：该材料在温度为4 0 c 一5 5 。c ，p h 值为6 - 8 时 吸附效果最佳；随着温度的升高，温度对吸附量的曲线分为( 2 0 5 0 ) 的渐升 段和( 5 0 8 0 ) 的渐降段，前一段的h 0 ，a g 0 是自发的吸热过程，后一 段的a h 0 ，a g 0 是白发的放热过程。吸附动力学实验结果说明吸附过程在l 小时内达到平衡，且动力学曲线与假二阶方程有很好的相关性，表明吸附过程存 在化学吸附。吸附等温线对f r e u n d l i c h 模型有很好的相关性，说明吸附应为单分 子层吸附。等温线的延伸表明该材料对黄曲霉素b 2 的最大吸附容量为1 5 m g g 。 运用x r d 、i r 、e p r 、x p s 、n m r 、u v 和热分析等现代表征手段分析了吸 附前后材料结构的变化，并从微观角度对吸附机理进行探讨。x r d 谱图分析得 到吸附后材料层间距增大，这是由于黄曲霉素b 2 与c u ( i i ) 在层间发生反应从而 改变了原有的柱撑结构。应用m 、原子吸收及孔隙度分析证明该吸附剂为多孔 型结构，性质稳定。e p r 谱图分析得到吸附后材料出现了新的超精细结构，说明 层间部分进入晶格的c u ( i i ) 与黄曲霉素b 2 的羰基发生配位作用。t g - d t a d t g 谱图分析得到吸附后材料的d t g 曲线在5 2 5 。c 处有c u ( i i ) 与黄曲霉素b 2 形成的 螯合环的分解速率峰，说明配位反应主要发生在层间。另外，由于静电作用和物 理吸附的存在，x p s 及1 3 c n m r 等图谱分析显示黄曲霉素b 2 在材料表面也有 所结合。 关键词：黄曲霉素b 2 蒙脱土吸附机理 a b s t r a c t a f l a t o x i ni so n eo ft h em o s th a r m f u lf o o dc o n t a m i n a n t st oh u m a nb o d y ，b e c a u s e o fi t ss t r o n gt o x i c i t ya n dc a r c i n o g e n i c i t y ，t h ew o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o nd e s i g n a t e di t a sc a r c i n o g e n so fc l a s si w i t ht h ei m p r o v e m e n to ff o o ds a f e t yr e q u i r e m e n t s ，i ti s n e c e s s a r yt od e v e l o pah i g h l ye f f i c i e n ta d s o r b e n tt or e m o v ea f l a t o x i ni nf o o d a tt h e s a m et i m e ，s t u d i e so i lt h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro fa f l a t o x i no nm a t e r i a lh a v e f a r r e a c h i n gt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r ，t h ea d s o r p t i o np r o c e s so fa f l a t o x i nb 2r e m o v a lf r o mw a t e rw a s s t u d i e d ；an e wa d s o r b e n t - - c u p t m a b - m m t i s p r e p a r e d a n di t s a d s o r p t i o n m e c h a n i s mi sd i s c u s s e di n t h i sp a p e r t h ee f f e c t so ft e m p e r a t u r ea n dp ho nt h e a d s o r p t i o na r es t u d i e da n dt h eb e s tt e m p e r a t u r ea n dp h a r ed e t e r m i n e d t h ek i n e t i c s a n dt h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e so fa d s o r p t i o np r o c e s sa r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o wt h a t ：t h ea b s o r p t i o nr e s u l t sa r eo p t i m u mw h e na t at e m p e r a t u r eo f 4 0 5 5 a n dp hv a l u e sb e t w e e n6a n d8 w i t ht h ei n c r e a s i n go ft e m p e r a t u r e ，t h e t e m p e r a t u r ea n da d s o r p t i o nc a p a c i t yc u r v e i sd i v i d e di n t oa ni n c r e m e n t a lp a r tb e t w e e n ( 2 0 5 0 ) ca n d ad e g r e s s i v ep a r tb e t w e e n ( 5 0 8 0 ) c ，a n dt h ef o r m e rp a r ti ss p o n t a n e o u s e n d o t h e r m i cp r o c e s s ，t h el a t e rp a r ti ss p o n t a n e o u se x o t h e r m i cp r o c e s s t h ea d s o r p t i o n k i n e t i c si n d i c a t et h a tt h ea b s o r p t i o np r o c e s sc a nb a l a n c ew i t h i no n eh o u r , a n dt h e k i n e t i c sc u r v ep r o v i d eg o o dc o r r e l a t i o nw i t ht h ep s e u d o s e c o n d o r d e rm o d e l ，w h i c h i n d i c a t et h ee x i s t e n c eo fc h e m i c a la d s o r p t i o n t h ei s o t h e r mh a sag o o dc o r r e l a t i o n w i t hf r e u n d l i c hi s o t h e r l nm o d e l ，w h i c hs h o w st h a tt h ea d s o r p t i o ni sm o n o l a y e r a d s o r p t i o n t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r ms h o w st h a t t h el a r g e s ta d s o r p t i o nc a p a c i t yi s 1 5 m g g t h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s mi si n v e s t i g a t e df r o mm i c r o c o p i cf i e l db ya n a l y z i n g t h ea d s o r b e n tb e f o r ea n da f t e ra d s o r p t i o nr e a c t i o nu s i n gx r d ，i r ，e p r ，x p s ，n m r ， u v ，t h e r m a la n a l y s i sa n do t h e rm o d e ma n a l y s i sm e t h o d s t h ea n a l y s i so fx r d s p e c t r as h o wt h a tt h ei n t e r l a y e rs p a c ei n c r e a s e sa f t e ra d s o r p t i o n ，d u et ot h e r e a c t i o no f a f l a t o x i nb 2a n dc u ( i i ) i nt h ei n t e r l a y e r ，w h i c hc h a n g et h eo r i g i n a lp i l l a r e ds t r u c t u r e t h ea d s o r b e n ti ss t a b l ea n dm u l t i p o r o u s ，w h i c hi sp r o v e db yi r ，a t o m i ca b s o r p t i o n a n db e t v o l u m e p o r ea n a l y s i s t h ea n a l y s i so fe p rs p e c t r as h o wt h a tan e w u l t r a f i n es t r u c t u r eo ft h ea d s o r b e n ta p p e a r sa f t e ra d s o r p t i o n ，w h i c h i n d i c a t ea c o o r d i n a t i o nb e t w e e nt h ec a r b o n y l i na f l a t o x i nb 2a n dt h ec u ( i i ) i nt h e m o n t m o r i l l o n i t el a t t i c e t h ea n a l y s i so ft g d t a - d t gs p e c t r as h o wt h a t an e w d e c o m p o s i t i o n r a t e p e a ka p p e a r a t5 2 5 a f t e ra d s o r p t i o n 。w h i c h i n d i c a t et h e f o r m a t i o no ft h ec h e l a t er i n gb e t w e e na f l a t o x i nb 2a n dc u ( i i ) a n dp r o v ec o o r d i n a t i o n r e a c t i o no c c u r sm a i n l yi ni n t e r l a y e r i na d d i t i o n ，a sar e s u l to fe l e c t r o s t a t i ce f f e c ta n d t h ee x i s t e n c eo fp h y s i c a la d s o r p t i o n x p sa n d1 3 c 删ra n a l y s i ss h o wt h a ta f l a t o x i n b ，i sc o m b i n e di nt h es u r f a c eo ft h em a t e r i a l k e yw o r d s -a f l a t o x i nb e ，m o n t m o r i l l o n i t e ，a d s o r p t i o n ，m e c h a n i s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：刘珐佐 签字日期： 矽口7 年歹月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：亨4 泼位 v 签字日期：如叩年r 月3f 日 导师签名： 签字日期： 大学硕士学位论文 第一章文献综述 11 黄曲霉紊 1 1 1 黄曲霉素的性质 第一章文献综述 黄曲霉素( a f l a t o x i n s ) 是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种剧毒物质，主 要有b ，、b 卜g 帅gm ，、m 2 等类别。黄曲霉素的危害性在于对人及动物肝脏 组织有破坏作用可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉素耳最 为多见，其毒性和致癌性也最强。据报道黄曲霉素日的毒性为氰化钾的1 0 倍， 为砒霜的6 8 倍，致癌力比二甲基硝胺高7 0 倍，是导致肝癌的主要因素之一，1 9 9 3 年黄曲霉索被世界卫生组织( w h o ) 的癌症研究机构划定为一粪致癌物。 黄曲霹素是一组化学结构类似的化合物，其基本结构为二呋喃环和香豆桑， 黄曲霉素b ，是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即台有一个双呋喃环和一个氧杂 萘邻酮( 香豆囊) ，前者为基本毒性结构后者与致癌有关。 图【1 黄曲霉囊分了结构 f i gi - ln cs 帆c t u ro f a f l a t o x i n 在紫外线下，黄曲霉素b 】，b 2 发蓝紫色荧光，黄曲霉素g 1 ，g 2 发绿色荧光。 黄曲霉毒素的相对分子量为3 1 2 - 3 4 6 ，熔点2 0 0 - 3 0 0 c 。难溶于水，最大溶解度 只有1 0 p p m ，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶丁石油醚，己烷 或乙醚中。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在口h9 - 1 0 的强碱溶液中分解迅速。黄曲霉素纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素b t ， 大学硕士学位论文 第一章文献综述 b 2 的分解温度为2 6 8 c ，紫外线对低浓度黄血霉毒索有一定的破坏性 1l2 黄曲霉素的分布 黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中，在大豆、 稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶，奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲 霉毒索。在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出宰比较高，在我国，产 生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄益霉。1 9 8 0 年铡定了从1 7 个省粮食中分离的 黄曲霉1 6 6 0 株，广西地区的产毒黄曲霉最多，捡出辜为j 8 。总的分布情况为 华中，华南，华北产毒株多，产毒量也大，东北，西北地区较少。 圈l - 2 黄曲霉素污染圈片 f i g1 - 2 p o l l u t i o np i c t u r 器o f a f l a t o x i n 黄曲霉毒素进入机体后，在肝脏中的量较其他组织器官为高，说明肝脏可能 受黄曲霉毒素的影响最大。肾脏，脾脏和肾上腺也可检出。黄曲霉毒索如不连续 摄入，一般不在体内积蓄。一次摄入后约l 周即大部分排出。黄曲霉素b 。在动 物体内经细胞内质嘲微粒体混合功能氧化酶系代谢，在微粒体混舍功能氧化酶系 的作用下a f b 】发生脱甲基、羟化及环氧化反应，主要代谢产物为a f m ，、a f p l 、 a r q l 和a f b l - 2 ，3 - 环氧化物。 1 13 黄曲霉素的危害 上世纪6 0 年代，在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进 口的花生粕有关。进一步的调研证明，这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污 染这些研究工作堆终使人们发现了黄曲霉( a s p e r g i l l u st a a v u s ) 产生的有毒代谢物 质黄蓝霉毒素( a f l a t o x i n s ) ，这种毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲 霉也能产生黄曲霉毒索，但产量较少。从此，黄曲霉素的毒性和致癌机理引起了 世界各国科学家的关注【1 。 大学硕上学位论文第一章文献综述 黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关。 黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。研究表明，黄曲霉毒 素对细胞的毒性作用，是干扰信息r n a 和d n a 的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成， 导致动物全身性损害【2 j 。黄曲霉毒素b 】胄邕与t r n a 结合形成加成物，黄曲霉毒素 - t r n m j l 3 成物能抑讳j f j t - r n a 与某些氨基酸结合的活性，对蛋白质生物合成中的必需 氨基酸，如赖氨酸，亮氨酸，精氨酸和甘氨酸与t r n a 的结合，均有抑制作用，从而在 翻译水平上干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢。 ( 1 ) 黄曲霉毒素与动物疾病 黄曲霉毒素中毒( a f l a t o x i c o s i s ) 主要对动物肝脏的伤害，受伤害的个体因动物 种类，年龄，性别和营养状态而异。研究结果表明，黄曲霉毒素可导致肝功能下 降，降低牛奶产量和产蛋率。并使动物的免疫力降低，易受有害微生物的感染。 此外，长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒。通常年幼的动 物对黄曲霉毒索更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱，降低生育 能力。降低饲料利用率，贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降，而 且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素m l 和m 2 。据美国农业经济学家统计，由于食 用黄曲霉毒素污染的饲料，每年至少要使美国畜牧业遭受1 0 的经济损失。在我 国，由此而带来的畜牧业损失可能会更大。 ( 2 ) 黄曲霉毒素与人类的健康 人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是通过食用被黄曲霉毒素污染的食物。对 于这一污染的预防是非常困难的，因为真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍 的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相 关的标准监督企业执行。但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控 制。在发展中国家，食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性。 亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变 ( l i v e rc e l lc a n c e r , l c c ) 呈正相关性。长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被 认为是导致肝癌，胃癌，肠癌等疾病的主要原因。1 9 8 8 年国际肿瘤研究机构 ( i n t e r n a t i o n a la g e n c yf o rr e s e a r c ho nc a n c e r , i a r c ) 将黄曲霉毒素b 1 列为人类致 癌物。除此以外，黄曲霉毒素与其它致病因素( 如肝炎病毒) 等对人类疾病的诱发 具有叠加效应沁j 。 黄曲霉毒素b 1 的半数致死量为0 3 6 毫克公斤体重，属特剧毒的毒物范围( 动 物半数致死量 1 0 毫克公斤) 。它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎，肝硬 化，肝坏死等。临床表现有胃部不适，食欲减退，恶心，呕吐，腹胀及肝区触痛 等；严重者出现水肿，昏迷，以至抽搐而死。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致 癌物质，其致癌力是奶油黄的9 0 0 倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大7 5 倍，比 大学硕士学位论文 第一章文献综述 3 ，4 一苯并芘大4 0 0 0 倍。它主要诱使动物发生肝癌，也能诱发胃癌，肾癌，直肠癌 及乳腺，卵巢，小肠等部位的癌症。 鉴于黄曲霉毒素对人体及动物体的危害如此严重，食品黄曲霉毒素的污染与 防治显得尤为重要。本课题旨在寻求一种简单、实用、高效、快捷的方法去除食 品或饲料中的黄曲霉毒素的材料与方法，有重要的理论和实际意义。 1 1 4 黄曲霉素的分析及去除方法 黄曲霉素的危害性大，存在范围广，世界上已有6 0 多个国家对它们进行限量 控制，其中最严格的是欧盟( e c ) 在1 9 9 9 年1 月1 日颁布的e cn o 1 5 2 5 9 8 号法令， 规定直接提供人类食用的食物及组成食品的组分中的黄曲霉毒素b 1 的含量不得 大于2 鹇k g ，黄曲霉毒素b l ，b 2 ，g i 和g 2 的总量不得大于4 鸺k g 。1 i4 l 。另外，1 9 9 5 年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为1 5 9 9 k g ，美国联邦政 府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量( b 1 + b 2 + g 1 + g 2 的总 量) 不能超过1 5 p g k g 。人类消费的牛奶中的含量不能超过0 5 9 9 k g ，其他动物饲 料中的含量不能超过3 0 0 9 9 k g 。我国政府对各种食物中黄曲霉毒素的最高允许量 见。表1 1 表1 1 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量 t a b l e1 1t h eu p p e rl i m i tc o n t e n to fa f l a t o x i n si nf o o dc h m a 食品名称 最高允许含量( g g k g ) 玉米，花生，坚果和干果2 0 ( 黄曲霉毒素b 1 ) 花生仁制品( 按原料折算)2 0 ( 黄曲霉毒素b 1 ) 大米，香油等食用油1 0 ( 黄曲霉毒素b 1 ) 其他粮食，发酵食品，淀粉类制品5 ( 黄曲霉毒素b 1 ) 牛乳及其制品黄油，新鲜猪组织等0 5 ( 黄曲霉毒素m 1 ) 针对这一新的限量要求，世界上许多国家都展开了新的黄曲霉毒素检测方法 的研究。下面将就近年来国内外对黄曲霉毒素检测方法的研究进行系统阐述。 1 1 4 1 前处理方法 首先是样品的提取，一般采用一定溶剂系统从食品中提取黄曲霉素，最常用 的溶剂系统有不同比例的甲醇水系统k 一 ，另外，不同比例的氯仿水溶液，乙腈 水溶液也可作为提取黄曲霉毒素的溶剂系统。在粉碎好的样品中添加一定量的 提取溶剂后高速振荡提取或超声波提取，快速过滤，备用。 4 大学硕士学位论文第一章文献综述 其次是净化与富集过程，黄曲霉素检测属于痕量分析，不管采用何种提取方 法，提取物中干扰检测的化合物需通过一定的前处理方法将其除去，对样品中的 黄曲霉素进行富集。最初采用的前处理方法是液。液萃取技术，通过黄曲霉素在 不同极性溶剂中溶解度的差异进行富集【吼9 i 。现在逐渐被固相萃取( s p e ) 技术所取 代。s p e 柱中通用的固定相有硅胶，c 1 8 键合相【l m 眨 ，f l o r i s i l 硅土以及交联有抗 体的免疫亲合柱( i a c ) t ”。6 l 。免疫亲合柱对黄曲霉毒素抗原有一一对应的特异性 吸附，这种吸附又可以被极性有机溶剂洗脱，它将提取、净化、浓缩一次完成， 大大简化了前处理过程，提高工作效率，提高了方法的准确度、精密度和灵敏度。 目前，使用最多的是美国v i c a m 公司的a f l a t e s t r p 柱，它已为a o a c 方法采用。 s o b o l e v 等报道了另一种净化方法，黄曲霉毒素经甲醇水( 8 0 ：2 0 ) 提取后， 经过一个装有氧化铝小柱的单一清洗步骤，可以被液相色谱仪、光化学反应器和 荧光检测仪定量测定。此氧化铝小柱对黄曲霉毒素b 1 的检出限为1 0 9 9 k g ，从花 生中得到黄曲霉毒素b 1 b 2 ，g 1 和g 2 在5 0 ，2 5 ，7 5 及2 5 9 9 k g 。水平上回收率分别 为8 7 2 ，8 2 0 ，8 0 ，0 ，8 0 2 ，该小柱的费用较低，从而使检测费用得到了 显著下降。 美国r o m e rl a b s 公司的多功能柱( m f c ) 是一种特殊的固相萃取柱。以极 性、非极性、离子交换等几类基因组成填充剂，可吸附样液中脂类、蛋白质、糖 类等干扰物，而使待测a f 成分不被吸附直接洗脱。w i l s o n 和r o m e r | 1 州在进行h p l c 分析前用这种多功能小柱纯化了多种农产品提取液，净化效果同样理想，降低了 费用。 1 1 4 2 检测方法 1 薄层分析法( t l c ) 现行国家标准“食品中黄曲霉毒素的测定”，美国药典矛n w t 0 关于“中草药中 污染物，残留安全和质量评价指南”附录4 中都采用了t l c 法( 单向或双向展开) 检测，薄层板展开后，在3 6 5 n m 紫外灯下，a f b l ，b 2 ，g 1 和g 2 分别显示紫色、蓝紫 色、绿色和绿色荧光。t l c 法是过去检测黄曲霉素最常用的方法，至今仍为中外 检测机构所用。其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将黄曲霉素从样品 中提取出来，经柱层析净化后，再在薄板上展开以分离，利用黄曲霉素的荧光特 性，根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分复杂的样品需双 向展开，方可获得较高的灵敏度。 t l c 法的优点是：属于常规检测方法，是经典的方法，设备简单，检测费用 低廉，一般实验室均可完成；缺点有：操作繁琐、费时，提取和净化效果不甚理 想，灵敏度较差，对操作人员身体健康存在较大程度的威胁| l 。 大学硕士学位论文 第章文献综述 2 液相色谱法( h p l c ) h p l c 法是近年来发展起来的一种方法，原理是经高效液相色谱仪( 用o d s c 1 8 柱) 加柱后衍生系统分离，用荧光检测器测定，用于黄曲霉毒素检测的检测器 主要有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器以及安培计。h p l c 荧光检测器对 黄曲霉毒素的检测灵敏度l l h p l c 紫外检测器高3 0 4 0 倍。采用h p l c 荧光检测器 进行检测，黄曲霉毒素b 1 和g 。荧光强度较强但在含水的溶剂中容易发生淬灭，因 此，一般需对黄曲霉毒素进行柱前或柱后衍生化以提高它们的检测灵敏度。黄曲 霉毒素的分析大多数采用的是r p h p l c 法。与其配套的柱后衍生系统有我国国标 规定的碘衍生化法，也有国外的溴衍生化法，还有较为先进的电化学衍生化法和 光化学衍生化法。目前，该方法多用到免疫亲和小柱( 我国国标方法 g b t 1 8 9 7 9 2 0 0 3 中也用到该产品) 来净化分离，净化效果优异，是生物学与化学 结合的典范产物。 ( 1 ) 柱后溴衍生化荧光检测 d u n n e 等人分析了很多粉末状的调味品，采用免疫亲合柱进行前处理， 过溴化吡啶( p b p b ) 进行柱后衍生，h p l c 荧光检测器进行定量检测，将之发 展成为一个新的的柱后衍生方法。 s t r o k a 等i _ 】人联合欧洲1 2 个国家的1 6 个实验室认证了柱后溴衍生化检测花 生酱、阿月浑子酱、无花果酱及辣椒粉中黄曲霉毒素方法的准确及可靠性，该方 法即将成为a o a c 的法定方法。该联合实验研究主要足为了评价免疫亲合柱净化 h p l c 柱后溴衍生荧光检测法在检测欧盟限量以下黄曲霉毒素的有效性。柱后溴 衍生化可通过k o b mc e l l 、在流动相中添加溴化物或柱后经p b p b 衍生，最后用荧 光检测计检测。他们在空白基质中分别添加了2 个含量水平的黄曲霉毒素： 2 4 n g m l 以总黄曲霉毒素( 1 0 n g m l 。的b 1 ) 和9 6 n g m l l 总黄曲霉毒素 ( 4 0 n g m l 1 的b 1 ) ，黄曲霉毒素总量的回收率是7 1 9 2 ，回收率的r s d 为 4 6 2 3 3 ，而其中b l 的回收率则是8 2 1 0 9 ，其平均r s d 为3 1 2 0 0 。重 复性试验，黄曲霉毒素总量检测结果的r s d 为1 4 1 3 4 2 ，黄曲霉毒素b 1 的r s d 为9 1 3 2 2 。统计结果表明，h o r r a t 值小于1 0 ，在如此低浓度的a f 水平下 该方法的实验室组内精密度和组间精密度是可接受的。 ( 2 ) 柱后碘衍生化荧光检测 美国、法国、加拿大和南非等过的2 4 个实验室联合认证了免疫亲合柱净化 h p l c 柱后碘衍生化荧光检测法检测玉米、花生及花生酱中的黄曲霉毒素，该方 法已为a o a c 认定为a o a c i u p a c 法定方法 2 翔。他们用2 种方法检测：一是溴化 后荧光分光光度计( s f b ) 检测黄曲霉毒素总量，二是反相h p l c 柱后碘衍生化 ( p c d ) 检测各个黄曲霉毒素的量。1 2 个试验组用s f b 方法，9 个试验组用p c d 6 大学硕士学位论文 第。章文献综述 方法，另外3 个试验组同时用两种方法检测。回收率实验中添加3 个含量水平的黄 曲霉毒素：1 0 ，2 0 ，3 0 r i g m l 1 黄曲霉毒素总量。s f b 方法和p c d 方法都达到较 好的回收率。国家标准g b t1 8 9 7 9 2 0 0 3 采用了p c d 方法。 ( 3 ) 柱前衍生化荧光检测 我国出口茶叶中a f b l 检验方法( 行业标准s n 0 3 3 9 9 5 ) 采用氯仿提取，硅 胶小柱净化，三氟乙酸衍生，i 心一h p l c 一荧光法测定，测定限为l n g g - 1 李左卿等 人采用免疫亲合柱与三氟醋酸柱前衍生化联用对蜂蜜和酒中的黄曲霉毒素测定 建立了方法学，在样品e e 添n 2 5 9 9 k g j 黄曲霉毒素进行1 0 次测定，平均回收率分 别为g 1 7 3 1 ，b 1 9 1 6 ，g 2 9 0 2 ，b 2 7 6 6 。实际最低检出限为6 2 5 p g 。对比 柱前和柱后衍生的灵敏度，柱前衍生要比柱后衍生的灵敏度高3 倍左右。 ( 4 ) 柱后光化学衍生化荧光检测 在线电化学衍生( k o b r ec e l l ) 和在线光化学衍生装置都是直接连在色谱柱 和荧光检测器之间，不同的是前者需要流动相中加入b r ，b r 。在电流作用下被氧 化成单质溴，与a f b l 和a f g 】反应，生成荧光更强的产物，而后者不需要在流动 相中加任何试剂，样品液在缓缓流经光化学衍生器中被紫外灯管照射的网状通路 时，a f b1 和a f g l 荧光大大提高。以上4 种灯检测限均为0 0 5 9 9 g - 1 水平【二i n j 。 ( 5 ) 正相h p l c 荧光法 林海丹等e 副报道采用免疫亲合柱净化，以无水甲醇、无水甲酸、二氯甲烷、 正己烷、醋酸乙酯( 1 0 ：1 0 ：2 0 0 ：2 4 0 ：4 0 ) 为流动相，不需衍生化、硅胶h p l c 柱荧光检测果仁中四种黄曲霉毒素，最低检测含量0 1 甥g 。 该法的优点是：可准确分离黄曲霉素各种毒素( b 1 ，b 2 ，g 1 ，g 2 ，m 1 ，m 2 ) ， 检测快速而且定性定量准确，检测限是目前所知黄曲霉素检测方法中最低的，可 以做为仲裁法使用；缺点是仪器设备价格高昂，传统前处理方法相对繁琐，若用 到免疫亲和小柱则会使样品检测费用增高，对工作人员的身体健康仍有一定程度 的威胁弘o j 。 3 酶联免疫法( e l i s a ) 免疫分析技术是国际上2 0 世纪7 0 年代出现的一种新的免疫测定技术，其原理 是抗体和抗原之间的特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定 的灵敏度。在黄曲霉毒素分析过程中是最为引人注目的方法之一，因为他们具有 高度的灵敏度和选择性，而且具有快速和大批量检测的能力。竞争性酶联免疫吸 附实验( e l i s a ) 从1 9 9 5 年起已成为a o a c 检测黄曲霉毒素的官方方法口7 | ，国标g b t 5 0 0 9 2 2 第二法即为e l i s a 法。该方法的优点是：检测速度快捷，对人体危害小； 缺点是：重复性差，试剂寿命短，需低温保存，假阳性概率较高，需要配置专门 的酶标仪，对一些含盐量高、脂肪含量高的样品需要进行额外的适当的处理。 大学硕上学位论文 第一章文献综述 4 荧光光度法( i a c s f b ) i a c s f b 法也同样是我国国标方法的一种。原理是利用黄曲霉素各种毒素的 荧光特性，用荧光光度计测定样品中黄曲霉素的含量。大致过程是：试样先经甲 醇水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉素特殊抗体的免疫亲 和柱净化( 生物免疫学原理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能) ，黄曲霉素键 合在免疫亲和小柱的抗体上，用蒸馏水将柱上的杂质除去后，以甲醇将目标化合 物洗脱下来，加显色剂于专用的荧光光度计中测定样品中的黄曲霉素含量。 该方法的优点是：对检测人员身体健康无危害，检测样品速度迅速，灵敏度 高，适宜于大量样品检测，且定量准确；缺点是：检测费用较高，需配备专门的 设备，尚不能对单一的毒素进行检测。 5 其他检测方法 随着科技的发展和检测技术的不断更新，今年来出现了一些比较高效的黄曲 霉素检测方法，如( 1 ) 荧光偏振免疫测定( f p ) ，该方法的主要原理是荧光标记的 毒素在样品缓冲液中与未荧光标记的毒素对特异性抗体的竞争性结合。分子质量 越大，分子旋转速度越慢，f p 值越大。m o h a m m a dsn a s i r 等1 2 8 j 人报道了用基于 f p 的装置检测不同谷物中的黄曲霉毒素。( 2 ) i u t s e r s ( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s a a e f i n g ) 技术用于黄曲霉毒素的检测，u s e r s 是一项新的生物- 心4 4 - 片技术，它采用 表面增敏拉曼散射显微镜采集数据，这个生物芯片本身包含捕获固定于s e r s 活 性金属表面的生物分子的点。( 3 ) 水平衰减全反射比傅立叶变换红外光谱法 ( f v m ) ，该法采用水平衰减全反射比( h o r i z o n t a la t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t a n c e ，a t r ) 技术获得傅立叶变换红外光谱( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f i a r e ds p e c t r o s c o p y ，f t i r ) 可 用来检测油籽及油籽产品中黄曲霉毒素的含量，这是一种比较新的分析方法。( 4 ) 加压薄层色谱法( o p t l c ) ，该法是t y i h a k 在1 9 7 9 年提出的，它结合了经典薄层色 谱法，高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点而发展起来的一种能提高薄层分 离效率的平面液相色谱技术。 a l is h e i b a n i ( 伊朗) 等利用离子迁移谱( i m s ) 对植物果实中黄曲霉素b l 和b 2 的浓度进行了检测1 1 。 离子迁移谱是最近几十年发展起来的对微量化学物质进行检测的一种方法。 目前它在检测各种化学物质，尤其是毒品和爆炸物方面获得了广泛应用。离子迁 移谱仪( i m s ) 的基本原理是：首先使被检测的样品蒸汽或微粒离化形成离子， 然后让离子在一弱电场中产生漂移，并测量出离子通过电场所用的时间，进而根 据离子所用的漂移时间可以计算出离子的迁移率( 迁移率的定义是指在单位电场 强度作用下离子的漂移速度) 。由于在一定的条件下，各种物质离子的迁移率互 不相同，因而也就导致不同的离子通过电场的漂移时间各不相同。这样， 我们 大学硕士学位论文 第一章文献综述 就可以根据漂移时间的测量来间接达到对样品的分离和检测1 1 。 尽管i m s 工作在大气环境气压下，它的探测灵敏度仍然很高，可以达到 1 0 一1 0 。1 4 9 ，和质谱分析技术以及其他一些检测技术相比，i m s 有着诸如仪器简单、 体积小、重量轻、功耗低和分析时间快等许多优点，对一些化合物的分析起着重 要的作用。这使得i m s 技术在近3 0 年的时间里得到了飞速的发展。 a l i s h e i b a n i ( 伊朗) 等通过实验对离子迁移谱( i m s ) 检测黄曲霉素b l 和 b 2 的检测限进行了确认实验；从检测限，量化限以及线性动力学范围方面与薄 层色谱，高效液相色谱等黄曲霉素检测方法进行了比较。最终证明，离子迁移谱 在检测黄曲霉素a f b l 和a f b 2 方面能够达到较好的检测限为0 1 n g p 。 综上所述，对一般农作物和食品，样品提取液可通过各种s p e d x 柱、m f c 柱、 i a c 柱，进行净化和富集。i a c 高特异选择吸附，但价格较贵。对中药样品，除 i a c 柱外，各种小柱很难建立统一的操作条件( 洗脱液的配比) ，即使运用i a c 柱仍 有一些中药成分被吸附在柱上，尤其影响直接用荧光分光计进行检测。定性和定 量测定中，t l c 是经典方法，般实验室均能完成，虽不断改进，抗干扰、精密 度仍有缺陷，对化学成分复杂的中药样品困难较大。e u s a 和i a c 荧光法使用安 全，操作简便、快捷，适合大批量样品筛查，但由于适用酶、抗体，对保存条件、 时间又有一定要求，其次在研制抗体时，交叉反应主要考虑的是其他真菌毒素及脂 肪、蛋白、糖的干扰，没有考虑中药中化学成分的干扰，因此用e l i s a $ 1 j 剂盒测中 药假阳性率高，各实验窒检测结果差异大，此外目前运用的单克隆抗体难以区分 a f b l 或b 2 ，这两种方法和微柱法一样检测总量。h p l c 荧光检测，无论是柱前三 氟醋酸衍生，还是柱后溴化或碘化衍生，其检测灵敏度、精密度均可满足a f b 检 测要求，后两者在线衍生更提高检测自动化强度，只是需增加衍生反应装置，i a c 在线衍生h p l c 荧光检测是当前国内外黄曲霉毒素检测的主流。采用速测技术 f 最好是胶体金速测卡) 进行限量检测，初步筛查后，再用i a c 在线衍生h p l c 法进 行确证，可能是解决大批量进出口农作物、食品、中药，甚至是大型活动如2 0 0 8 年 北京奥运食品安全检测的最好方法。 几种常用检测方法在检测限( l o d ) ，量化限( l o q ) 和线性动力学范围( l d r ) 方面的比较o1 l 且隋况，见表1 2 。 9 大学硕士学位论文 第一章文献综述 表1 2 几种检测方法介绍 t a b l e1 2i n t r o d u c t i o no fs o m ed e t e c t i o nm e t h o d s 总之，随着液相色谱，免疫亲和技术的进一步发展，对黄曲霉素的检测速度 越来越快，各种方法各有优缺点，这些技术在将来的食品、中药、农作物等的黄 曲霉素类毒性物含量检测上将起到举足轻重的作用。 1 1 4 3 黄曲霉素的预防与处理 黄曲霉素污染严重的食物和饲料，应该废弃；对于轻度污染的食物和饲料， 经适当的处理符合国家标准才以食用。通常处理黄曲霉素污染的食物和饲料的 方法有：化学脱毒法、生物脱毒法和物理脱毒法_ 引。 很多化学物质可和黄曲霉素发生化学反应，使之生成无毒无害物质，但大多 数条件苛刻( 高温、高压) 、适用性和安全性差而无法使用，运用亚硫酸氢钠溶 液或石灰水处理饲料是使用较多的两种化学脱毒法。 一些微生物可以转化降低黄曲霉素的毒性，乳酸菌可以把黄曲霉素b 1 代谢 为黄曲霉素b 2 ，从而降低毒性达一千倍以上。 最经济可行的是物理脱毒法，常用的有：萃取法、吸附法、热处理法和辐射 法。 ( 1 ) 萃取法：使用溶剂可以萃取食用油籽( 花生、棉花籽) 中的黄曲霉素，可 作溶剂的有乙醇、丙酮、异丙醇、环己基甲醇等，但费用高，只适用于处理动物 饲料。 1 0 大学硕士学位论文 第一章文献综述 ( 2 ) 吸附法：一些矿物质能够吸附捕获黄曲霉素分子，如硅酸铝盐、沸石、 膨润、活性硅藻土，但大量添加这类吸附剂会降低养分的浓度。 ( 3 ) 热处理法：在高温或高压条件下，黄曲霉素分子会发生分解生成低毒或 无毒的物质，如2 6 0 。c 条件下处理玉米可使黄曲霉素含量下降8 5 。 ( 4 ) 辐射法：太阳光、微波、红外辐射、紫外线以及伽玛射线都可以破坏黄 曲霉素的分子结构，从而降低其毒性，但强射线( 紫外线以及伽玛射线) 也会破坏 营养物质的结构。 1 1 4 4 吸附材料的筛选 为了研究用吸附材料对黄曲霉素的吸附作用，本实验在材料制备过程做了大 量工作，曾制备出多种复合材料对黄曲霉素进行吸附。综合考虑后，我们发现层 状硅酸盐类吸附剂是去除黄曲霉素的理想材料。 目前对蒙脱土的改性材料有很多，主要有无机，有机以及无机一有机复合改 性。赵保林等1 3 3 j 对不同材料改性蒙脱土的研究进展进行了系统的论述，并指