（分析化学专业论文）基于压电和电化学技术的细胞生物传感研究.pdf

中文摘要 细胞是生命体结构和功能的基本单位，细胞研究是揭示生命奥秘 和征服疾病的基础环节之一。通过考察细胞的形态变化、功能变化和 周围生化环境的变化等内容，可以深入了解细胞的生理过程，这对生 命科学的自身发展和生物医药、分析技术和材料科学等的进步都将起 着重要的促进作用。本学位论文针对体外培养的细胞，利用电化学方 法和压电传感技术，在纳米粒子的细胞毒性研究、基于分子识别的细 胞检测和细胞凝集过程研究等方面开展了一些工作。主要内容如下： 1 使用循环伏安法和显微镜观测技术分别考察了三种纳米粒子( 二 氧化硅、硒和金纳米粒子) 和抗肿瘤药物5 一氟尿嘧啶( 5 f u ) 对人骨 肉瘤细胞m g 6 3 的单独和联合细胞毒性。实验结果表明药物和纳 米粒子均能够抑制细胞的生长繁殖，抑制率与化学剂量有关，其 中金纳米粒子的抑制效率最为显著。当三种纳米粒子分别和5 - f u 联合使用时，高浓度的二氧化硅纳米粒子与药物的联合表现出相 加效应，而高浓度的硒纳米粒子与药物的联合则表现出了协同效 应。该工作将有助于纳米粒子在生物医学和癌症治疗方面的应用 开发。 2 通过层层吸附将鼠抗人整合素p 1 单克隆抗体组装在玻碳电极表 面。基于细胞膜表面的粘附分子整合素p 1 和固定抗体之间的免疫 反应，利用电化学阻抗谱技术检测了人宫颈癌h e l a 细胞。对影响 细胞测定的一些影响因素，如修饰膜中的金纳米粒子浓度、修饰 膜的干燥时间、抗体浓度以及抗体的结合时间分别进行了考察和 优化。在最优实验条件下，电子转移电阻的增大幅度和细胞密度 在1 0 1 0 4 - 2 0 x 1 0 6c e l l sm l j 范围内呈线性关系，检测限可达 3 5 1 0 3c e l l sm l 一。 3 实时监测了人正常肝细胞l 0 2 在q c m 金电极表面的凝集过程。 两种植物凝集素c o na 和麦胚凝集素( w g a ) 均能引起细胞的凝 集，凝集过程表达的蛳与歙，信号与细胞正常贴壁生长过程表达 的q c m 响应有明显差异。由于c o na 良好的吸附性，细胞c o na 细胞凝集体对金基底的吸附能力较强，表现为蛳与a r l 信号的增 大和明显的q c m 质量效应。与此相反，由于w g a 不易吸附在金 电极表面，细胞w g a 细胞凝集体对金基底的吸附能力较差，表 现为蛳与a r 。信号的减小和细胞贴壁阶段时间的延长。显微镜平 行观察实验反映的信息与q c m 的测量结果完全一致。对细胞生长 和细胞凝集过程中的酶信号进行了分析，结果可分别由两个动力 学方程表示：z 、f o = a o + q e - 7 q + 7 + 矿k ，z 、f o = a o + a t e - 7 f l + a 2 e - 旧。另外， 实验还表明基于细胞凝集的q c m 测量技术可以用来区分正常肝 细胞l 0 2 和肝癌细胞b e l 7 4 0 2 。 关键词：电化学检测：压电传感；细胞；纳米粒子；整合素；凝集素 i i a b s t r a c t c e l li st h eb a s i cs t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lu r i to fa l lo r g a n i s m s c e l l r e s e a r c hi so n eo fe s s e n t i a ll i n k sr e v e a l i n gl i f em y s t e r ya n dc o n q u e r i n g d e s e a s e t h ed e e pa w a r e n e s so fc e l l u l a rp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e sc a nb e a c h i e v e db ye x p l o r i n gm o r p h o l o g i c a lc h a n g e ，f u n c t i o nc h a n g ea n d b i o c h e m i c a lc h a n g ei ns u r r o u n d i n g so fc e l l s i tm a yp r o m o t et h ep r o g r e s s o fl i f es c i e n c e ，b i o m e d i c i n e ，a n a l y s i st e c h n i q u ea n dm a t e r i a l ss c i e n c e i n v e s t i g a t i o n so nc y t o t o x i c i t y o fn a n o p a r t i c l e s ，c e l ld e t e c t i o nb a s e do n m o l e c u l a rr e c o g n i t i o na n dc e l la g g l u t i n a t i o np r o c e s sf o ri n 。v i t r oc u l t u r e d c e l l sb ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sa n dp i e z o e l e c t r i cs e n s i n gt e c h n i q u ei n t h et h e s i sa r eg i v e n t h em a i nw o r ki ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h ei n d i v i d u a la n dc o m b i n e dc y t o t o x i c i t yo f5 - f l u o r o u r a c i la n dt h e t h r e en a n o p a r t i c l e s ，s i l i c a ，s e l e n i u ma n dg o l dn a n o p a r t i c l e sa g a i n s t h u m a no s t e o s a r c o m am g 一6 3c e l l sw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gc y c l i c v o l t a m m e t r ya n dm i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ，r e s p e c t i v e l y i t i sf o u n d t h a tb o t ht h ed r u ga n dt h en a n o p a r t i c l e sw e r ea b l et oi n h i b i tc e l l p r o l i f e r a t i o ni nad o s e d e p e n d e n tw a ya n dt h ei n h i b i t i o ne f f i c i e n c yo f a un p sw a sm o s tp r o m i n e n t t h ec o m b i n a t i o no f5 一f u w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o ns i 0 2n p sa n ds en p sp r e s e n t e das i m p l e 。a d d i t i o n a n d s y n e r g i s t i ce f f e c t ，r e s p e c t i v e l y t h ep r e s e n t w o r k m a y b ec o n d u c i v ef o rt h ee x p l o r a t i o no ft h ea p p l i c a t i o n so fn a n o p a r t i c l e si n i i i b i o m e d i c i n ea n dc a n c e rt r e a t m e n t 2 m o u s ea n t i h u m a ni n t e g r i n1 31m o n o c l o n a la n t i b o d yw a sa s s e m b l e do n g l a s sc a r b o ne l e c t r o d eb yl a y e r b y l a y e ra d s o r p t i o n t h ed e t e r m i n a t i o n o fc e r v i c a lc a n c e rh e l ac e l l sw a sp e r f o r m e du s i n ge l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y b a s e do nt h ei m m u n o r e a c t i o nb e t w e e n i n t e g r i npl o nc e l lm e m b r a n ea n dt h ea n t i b o d yi m m o b i l i z e do nt h e e l e c t r o d e - s u r f a c e t h ef a c t o r si n f l u e n c i n gc e l l - d e t e c t i o n ，s u c ha st h e c o n c e n t r a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e si nt h em o d i f i e df i l m ，t h ed r y i n g t i m eo ft h em o d i f i e df i l m ，t h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i b o d ya n dt h e b i n d i n g t i m eo fa n t i b o d y , w e r ei n v e s t i g a t e d ，r e s p e c t i v e l y u n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ei n c r e a s i n g e x t e n to fe l e c t r o d e t r a n s f e r r e s i s t a n c ed e p e n d e dl i n e a r l yo nt h ec e l lc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f 1 0 x 1 0 4 2 0 x 1 0 6c e l l sm l 。1w i t had e t e c t i o nl i m i to f3 5 x 1 0 3c e l l s m l 3 t h er e a l - t i m em o n i t o r i n go ft h ea g g l u t i n a t i o np r o c e s so fh u m a n h e p a t i c n o r m a lc e l l s ( l - 0 2 ) a tt h eq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) g o l d ( a u ) e l e c t r o d ew a sp e r f o r m e d t w ol e c t i n s ，c o n c a n a v a l i na ( c o na ) a n dw h e a tg e r ma g g l u t i n i n ( w g a ) ，i n d u c e dt h ec e l l a g g l u t i n a t i o n ， r e s u l t i n gi nt h ed i f f e r e n t 蛳a n da r ir e s p o n s e sf r o mt h o s ec a u s e db y t h en o r m a lc e l la t t a c h m e n ta n d g r o w t h t h e c e l l - - c o na _ c e l l a g g r e g a t e sh a dh i g h e ra f f i n i t yf o rt h ea us u b s t r a t ed u et ot h ee x c e l l e n t a d s o r p t i o na b i l i t yo fc o na ，w h i c hw a sr e v e a l e db yi n c r e a s e d 蛳a n d i v s h i f t sa n dt h eo b v i o u sm a s se f f e c to fq c m i nc o n t r a s t ，t h el o w e r a d s o r p t i o na b i l i t yo fc e l l - w g a - - c e l la g g r e g a t e sw a sr e l a t e d t ot h e s a m ec h a r a c t e r i s t i co fw g a ，p r e s e n t i n gt h ed e c r e a s e d 蛳a n da ri r e s p o n s e sa n dt h et i m e e x t e n d e da d h e s i o np h a s e p a r a l l e lm i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n e x p e r i m e n t s w e r ea l s oc a r r i e do u ta n de x h i b i t e d c o m p a r a b l er e s u l t s t h e 蛳r e s p o n s e sd u r i n gt h ep r o c e s s e so fc e l l g r o w t h a n dc e l l a g g l u t i n a t i o n w e r ea n a l y z e du s i n gt h ee q u a t i o n s f 0 = a 0 + q e - 7 q + 矿7 + 矿7 奄a n d f 0 = a 0 + q e - 7 + a 2 e - 。k ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h ec u r r e n tw o r kp r o v e dt h a tt h eq c mm e a s u r e m e n t t e c h n i q u eb a s e do nc e l la g g l u t i n a t i o nw a su s e f u l f o rd i s c r i m i n a t i n g h e p a t i cn o r m a lc e l l s ( l - 0 2 ) a n dh e p a t i cc a n c e rc e l l s ( b e l 7 4 0 2 ) k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；p i e z o e l e c t r i cs e n s i n g ；c e l l s ； n a n o p a r t i c l e s ；i n t e g r i n ；l e c t i n v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：羔负弼凇p 年月产日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密 ( 请在以上相应方框内打“ ) 日期：v 浒 日期：加巾年 6 月够日 b 月毕日 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 第一章绪论 生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系。细胞是生命 体结构和功能的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动，有机体的 生理功能和一切生命现象都是以细胞为基础表达的。细胞研究是生命 科学的基本内容之一，也是现代生命科学发展的重要支柱之一【1 1 。开 展对细胞的研究工作，不论是对有机体的遗传、发育以及生理机能的 了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等，都是至关重要 的。绪论主要从分析化学的角度就当前细胞研究领域尤其是电化学和 压电细胞传感等方面的进展做一个简单的综述。 1 1 细胞传感分析概述 近几年来，随着半导体微细加工技术以及纳米技术的进步和发 展，分析技术微型化为细胞微环境的研究分析提供了强有力的手段， 以活细胞为敏感元件或检测对象的生物检测已经成为细胞生物学传 感研究领域的热点。而且随着人类基因组计戈1 ( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ， h g p ) 的完成，分子水平上基因和蛋白质的研究己满足不了人类对生 命科学的探索，而细胞水平研究的主要特点就是原位检测，即可在不 破坏细胞形态结构的情况下，用生化和物理的技术手段对细胞的生存 状态做一些定性或定量分析，研究细胞代谢过程中各种状态的变化， 对细胞、细胞的组分和细胞外产物进行定量的化学分析。因此细胞、 亚细胞水平的研究必将成为后基因时代生命科学研究的核心内容。 硕十学位论文 1 1 1 细胞传感研究的目的 离开对细胞以及构成细胞的各种细胞器的分子组成和功能的认 识，就不能了解以此为基础的生命体的生长、发育、衰老、遗传、进 化等生物学现象。w i l s o n1 9 2 5 年就曾经提出了一切生命的关键问题 都要到细胞中去寻找的名言。近1 0 0 年来，人们对细胞的认识水平得 到迅速的提高，并形成了一个重要的生物学分支细胞生物学。近年 来，基于细胞的药理学【2 3 1 、免疫学1 以及新药物的筛选【6 。刀等研究得 到了飞速发展。随着工程技术人员不断地开发出研究细胞的新手段和 新方法，对细胞研究的准确度和效率都得到了极大的提高，也进一步 促进了细胞学的发展进步。 细胞传感器技术出现在2 0 世纪8 0 年代，到9 0 年代细胞传感研 究已开始广泛应用于生物医学【8 】、环境监测9 1 和食品工程等领域。细 胞传感能阐明细胞的各种生命活动的本质和规律，更为重要的是，它 能检测外界物质和环境对活细胞的生理活动的影响，如药物对细胞的 生理行为的干扰，环境改变对细胞状态的影响等，这些信息对亚细胞 和分子层次的细胞研究提供了广阔的舞台。 1 1 2 细胞传感研究的内容 利用细胞表达的诸多信息，我们能够开展诸如细胞基本功能、细 胞力学行为、细胞电生理行为、药物筛选以及环境监测等的研究工作， 深入了解小分子、蛋白和基因的价值和功能。 实时动态的监测活体细胞可以检测单个细胞的生长、发育和凋亡 的功能信息，这也是全面了解细胞的生理性能及其机制的重要基础。 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 对多种专项传感器进行整合，可全面检测细胞的一些基本功能信息。 如y o n g 等f 1o 】设计了一个由两层透明多极硅电极和一层氮化硅薄膜组 成的细胞传感器，顶部和底部的硅电极含k o h 蚀刻腔，中层为1 “m 厚 且带有一直径为2 1 0 “m 微孔的s i 3 n 4 层，形成两个供细胞生活的液腔。 在细胞培养液流动时，会有单个细胞塞住微孔，从而可对单个细胞的 功能信息实施检测；把不同的离子敏感微电极( i s m e ) 和荧光成像等工 具结合，就能精确清晰地监测细胞内环境中的一、n h 4 、c 1 、m 9 2 + 和c a 2 + 等各种离子浓度的变化【】；利用细胞传感器与一敏场效应管 ( i s f e t ) 等结合对细胞外微环境的p h 值的变化进行测定，则可定量计 算细胞酸化率，从而分析细胞的代谢率1 2 1 等。而要对药物和细胞的作 用机制以及生物分子跨膜运动机制进一步了解的话，则必须发展出能 同时监测细胞内外环境的有效手段，目前这方面的报导很少。 一些外界的效应因子会改变活细胞的性能和特性，当这些外界因 素作用细胞时，细胞内部就会产生一系列新陈代谢的级联反应，并进 行自身调整以适应这种变化。例如，病毒感染会使得某些细胞细胞骨 架的变化1 3 】，荷尔蒙刺激会使得某些细胞产生移训1 4 】。研究活细胞的 力学性能可提供一种测量外界因素生物活性的方法，这种细胞传感器 的开发，也为研究活细胞的力学性能和响应提供了一种新的研究工 具。a n t o n i k 等【1 5 1 利用微细加工技术蚀刻出微米级的悬臂梁，通过特 殊的生物学处理后，将m d c k 细胞培养在该悬臂梁沉积有氮化硅的 一侧，细胞的机械运动会导致悬臂梁的偏转，利用激光反射技术，可 检测到细胞纳米级的悬臂偏转，当m d c k 细胞在不同毒素的刺激下， 硕士学位论文 会引起悬臂梁不同程度的偏转；g i a e v e r 等【1 6 】利用阻抗技术研究出了 一种细胞贴壁生长电极，可监测哺乳动物细胞的形状变化。 当外界刺激( 如光、电、药物等) 作用于可兴奋细胞( 如神经细胞、 肌肉细胞和内分泌细胞等) 时，细胞均会产生动作电位响应。通过膜 片钳( p a t c hc l a m p ) 技术1 7 。8 1 ，可以直接测量这种细胞膜电位，但无法 同时测定不同位置的动作电位，也不能实现细胞间的耦合测量，并且 对细胞有损伤。而通过微细加工技术制作的平面微电极阵歹i j ( m e a ) 和场效应阵列能同步、无损的记录多个可兴奋细胞或组织的动作电位 的传递 1 2 0 】，不仅可以研究神经元的电生理现象，也能研究细胞间的 通讯。 以往研究和评估药品的药理和毒理需进行动物活体测试，实验费 用昂贵、操作繁琐而且实验周期很长。细胞传感技术的出现极大地改 善了这种状况，人们仅需利用一定量的体外培养的活细胞，对其生物状 态变化进行检测便可实现高通量、快速有效的药物筛选。这不仅可以 通过活细胞对药物的响应来确定其对细胞的效用，而且还可以确定细 胞对药物反应的特异性。w o o l l e y 等2 1 1 利用金电极来测量活细胞的阻 抗和电位变化，考察了不同的抗癌药物对肿瘤细胞的作用效果，筛选 出了阿霉素( a d r i a m y c i n ) 、顺铂( c i s p l a t i n ) 等对卵巢癌和乳腺癌等细胞 有响应的药物，以及紫杉萜( t a x o t e r e ) 等效果较差的药物，这些结果与 扫描电镜和m t t l l 色分析法的测试结果吻合；k a i s e r 等【2 2 1 通过化学基 因分析发现抗肿瘤药物m a c b e c i ni i 对肿瘤抑制基因s a m d 4 表达显阴 性的克隆癌细胞有特效。 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 活体细胞对外界环境的变化比较敏感，通过适当的仪器装置可将 细胞状态的变化转化成可测的物理信号( 如声、光、色等) ，从而能 定性定量地进行环境监测。如对环境中重金属或农药等的浓度测量， 细胞传感技术检测的准确度高，检测限低，速度快，并且费用低廉。 如r a w s o n 等制作了一种工作寿命达到7 天的细胞传感器，可大范 围的检测水中除草剂，最低检测浓度为2 0 “gl - i ；k i z e k 等【2 4 1 设计了 一种细胞传感器，他们通过检测细胞生长过程中j u n 蛋白表达量的变 化，可定量检测了环境中重金属z n 2 + 的浓度。 1 2 细胞电化学检测 1 2 1 电化学生物传感器概述 电化学是研究电能和化学能之间的相互转化及转化过程中有 关规律的科学。电化学方法以电位、电流、电导和电量等物理参数 作为考察对象，研究被测物质的相关性质及其变化。随着超微电极 的出现、纳米技术的应用和发展、各种分析测试手段的联用以及多 学科的交叉渗透，使得电化学分析在方法、技术和应用等方面得到 了极大的发展。 生物传感器是以固定化的生物体成分( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、 抗原、生物膜等) 或生物体本身( 细胞、微生物、组织等) 为敏感材料、 与适当的化学换能器相结合产生的一种快速检测各种物理、化学和生 物量的器件。1 9 6 2 年，c l a r k 在纽约自然科学学会的论文集中首次提出 了“在化学电极的敏感膜中加入酶以实现对目标物进行选择性分析 的设想。1 9 6 7 年，u p d i k e 等【2 5 】就设计出了第一代生物传感器酶电极。 硕七学位论文 随后，生物传感器的发展极其迅速 随着微加工技术和纳米技术的进步 化方向发展。 分子讽别功照性蕨 现在的生物传感器已到第三代， 生物传感器正在向微型化、集成 化学牡 图11 生物传悬器的螅理不恿幽 通过一些特殊的转化元件( 如电援) ，借助于某些电子媒介体，就 可制作出操作简单、选择性高、灵敏度好的电化学生物传感器。 随着这些年电化学传感技术的发展以及新颖的生物材料的不断 出现，电化学生物传感器的种类得到了极大的丰富，并已经广泛应用 到生物检测( 如蛋白质研究、免疫分析、d n a 检测等) 中。f a n 等2 7 i 设计了一种e d n a 传感器，通过把二茂铁标记的d n a 自组装在金 电极上，利用d n a 发生杂化时其结构变化，导致电极表面和具有氧 化还原性质的二茂铁电子转移距离的增大，利用循环伏安法检测电化 学信号的变化，靶向d n a 浓度可检测到1 0p m ；又设计了一种基于 酶的原位e d n a 传感器，利用酶放大电化学电流信号能够很灵敏的 检测靶向d n a 杂化配对，检测浓度达到飞摩尔级，并能区分杂化中 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 单个的碱基序列错配现象；k e r m a n 等2 8 1 设计了一种激酶多肽修饰的 电化学生物传感器，用金纳米粒子作为标记物，通过电化学方法检测 了蛋白质的磷酸化作用；s a l i m i 等t 2 9 1 通过在玻碳电极上电沉积一层 n i o 纳米层，并再以电化学方法把血色素( m ) 固定在电极表面，得到 了n i o 和h b 之间的电子转移速率常数。该方法可用来设计无电子媒 介体或特殊试剂的生物传感器；m e d y a n t s e v a 等【3 0 1 将含有胆碱脂酶的 硝化纤维膜固定于银电极表面，通过戊二醛和正己烷将致病真菌 ( t r i c h o p h y t o nr u b r u m ) 抗体固定在纤维膜上，从而制得了用于检测致病 真菌抗原的电流型免疫传感器，最低检测量达到了l x l o 1 5m gm l ； y u 等3 u 在热解石墨电极表面垂直排列固定了大量的单壁碳纳米管 ( s w n tf o r e s t s ) ，并在其羧基化的末端固定了一层抗体，制成了一种 电流型免疫传感器，利用辣根过氧化物酶为标记物，检测了人血清白 蛋白中过氧化氢的量，检出限达到了1 州；y a n g 掣3 2 1 把a n t i - e c o l i 抗体固定到氧化铟锡微电极阵列上，制备了种可快速检测 e s c h e r i c h i ac o l i0 1 5 7 ：h 7 的电化学阻抗免疫传感器。 1 2 2 电化学检测技术在细胞传感研究中的应用 生物学和医学上细胞研究一般采用显微镜观察、分光光度测量和 流式细胞技术等。显微镜技术是利用光学系统或电子光学系统设 备观察细胞形态结构及其特性的技术，可用来研究细胞的生命活 动的基本规律；分光光度法主要通过t r y p a nb l u e t 3 3 1 、噻唑蓝( m t t ) 3 4 】 等染料对细胞进行染色，基于吸光度的测量可较准确的定量检测细胞 的活性，研究药物对细胞的作用；流式细胞技术t 3 5 1 是可对细胞或亚细 硕十学位论文 胞器进行快速测量的新技术，其特点是测量速度快，可进行多参数测 量。这几种技术有一些不足之处，有的操作繁琐，有的仪器昂贵，且 细胞的生长过程及药物对细胞的作用不能得到实时监测。由于这些生 物技术固有的局限性，因此越来越多的分析化学方法逐渐应用于细胞 研究领域。 细胞拥有并表达着一系列分子识别的元件，如受体、离子通道、 酶等，这些分子可以作为靶向分析物，在外界刺激下，将按照一定的 机制进行相应的生理功能活动。细胞成分复杂，其在基底或电极上的 粘附、生长以及凋亡都会引起相应的电化学信号的变化，所以应用电 化学技术手段( 如伏安法、交流阻抗技术、扫描电化学显微镜技术等) ， 可以对细胞进行快速有效地检测。 细胞的伏安法检测。伏安法( v o l t a m m e t r y ) 是一种最常用的电化 学研究方法。利用该方法可以判断电极反应的可逆程度，中间体、 相界吸附或新相的形成，以及偶联化学反应的性质等。m a t s u n a g a 等【3 6 1 首次报道了以伏安法监测了哺乳类动物细胞。他们以热解石墨电 极为工作电极，对老鼠噬碱性白血病细胞( r b l 1 ) 进行了检测，并研 究r b l 1 细胞的过敏性反应，开拓了伏安法在动物细胞研究方面的 应用；c i 等 3 3 9 1 用伏安法分别对红细胞和白细胞进行了测定，发现峰 电流值与两种细胞的数目都呈线性关系，同时研究了人白血病细胞 ( h l 6 0 ) 和人红白血病细胞( h e l ) 的伏安行为，并评价了抗代谢药物5 氟尿嘧啶的细胞毒性；随后，他们研究了顺铂脂质体对h e l a 细胞的 影响；l u o 等【4 0 3 研究了急性白血病细胞u 9 3 7 的伏安行为，并评估了 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 咖啡酸的细胞毒性。 细胞的阻抗法检测。该方法是一种利用小幅度交流电压或电流 对电极扰动，进行电化学测试的方法。因为该方法对电极表面性质 的变化非常敏感，可以很灵敏地研究细胞或蛋白质在基底表面的粘 附行为信息，近几年它在细胞研究领域的应用已经越来越多。 w e g e n e r 等1 4 1 1 利用细胞基底电阻抗传感( e l e c t r i cc e l l s u b s t r a t e i m p e d a n c es e n s i n g ，e c i s ) 技术监测了细胞在基底表面的粘附和铺展； l u o n g 等【4 2 】利用e c i s 技术监测了化学药物对细胞的影响，为体外筛 选药物提供了一种快速有效的方法；z h a n g 等4 3 1 利用电化学阻抗谱 ( e i s ) 和e c i s 技术监测了原始心肌细胞在基底的粘附行为；马青等4 4 1 利用阻抗方法检测了低氧对小鼠血液细胞的介电性能的影响，发现低 氧会使血液细胞的介电性能增强，导电性能降低。 细胞的s e c m 法检测。s e c m 基于电化学原理工作，可用来测量 微区内物质氧化或还原所给出的电化学电流。该技术可驱动非常小的 电极探针，在靠近样品处进行扫描，获得对映的微区电化学和相关信 息。样品可以为导体、半导体或绝缘体。s e c m 在生物学领域的引入， 对细胞研究的发展有着重要意义。l i u 等【4 5 1 在单细胞水平上，用s e c m 研究了人乳腺细胞中电荷转移反应，深入研究了不同类型细胞上跨膜 氧化还原动力学的差别；s h i k u 等f 4 6 1 利用s e c m ，通过一个微电极扫描 探针来监测了氧气的还原电流，定量研究了单个牛晶胚的氧气消耗 量；m i r k i n 等【4 7 1 利用s e c m 成像研究了不同类型的人乳腺细胞( m c f 7 和m d a m b 2 31 ) ，通过两种细胞氧化还原能力的差异可把它们区分 硕十学位论文 开，该方法可应用于人乳腺组织中恶性肿瘤细胞的分析检测。 目前，细胞电化学检测不再仅仅局限于细胞层次的研究工作，对 细胞生物大分子进行定量分析已成为热点领域。南京大学鞠烷先小组 4 8 - 5 1 近几年来制备了一系列的细胞传感器开展了卓有成效的研究工 作：利用细胞内的鸟嘌呤在p h = 7 4 的p b s 溶液中表现出一个不可逆 的还原电流响应，对a s p c 1 细胞等进行了直接电化学检测，发现抗 癌药物对细胞的电流响应有很大的影响；通过免疫反应把细胞固定于 电极表面，然后分别采用了循环伏安法、差分脉冲伏安法、电化学阻 抗谱等检测了白血病细胞k 5 6 2 、胃癌细胞b g c 膜表面的多糖，并检 测出细胞的数量。 1 3 细胞压电传感 1 3 1 压电传感概述 1 8 8 0 年，c u r i e 兄弟发现石英晶体受到外力作用时，晶体表面会 产生电荷，当撤除外力后，晶体表面又恢复到不带电的状态，这种现 象就被称为压电效应，又称为“正压电效应。随后，又发现在石英晶 体上加电压，可将电能转化为机械能，这就又称为“逆压电效应。具 有这种性质的材料称为压电材料。常用的压电材料包括压电石英晶体 ( p q c ) 和压电陶瓷等，前者的应用最为广泛。石英晶片有很多种切型， 最常用的压电石英晶片是沿着与主光轴成3 5 4 0 方向切割而成的a b 切 型，这是因为a t 切晶体具有两个优点：一是室温附近频一温系数小， 频率响应受温度波动的影响小；二是谐振频率高，具有较高的灵敏度。 _ 般晶片的厚度在o 1 0 3m m 之间，晶体表面的激励电极为金( 或银) 基丁电化学和乐电技术的细胞生物传感研究 膜电极，厚度为1 0 0r i m 左右。a t 切型的石英晶片在电场中以厚度剪 切( t h i c k n e s s s h e a r - m o d e ) 方式振动，其振荡频率由与晶片厚度成反比， 频率范围为1 2 0m h z 。当环境介质的质量、粘密度、电导和流变特性 等发生变化时，传感器就会给出相应的响应信号。 1 9 5 9 年德国物理学家s a u e r b r e y 根据单层无穷大薄板模型建立了 厚度剪切晶体频率变化与晶体表面沉积物质量之间的关系，提出了著 名的s a u e r b r e y 方程，即 矽2 磊嚣 ( 1 1 ) p q a 式中， 为没有涂层时石英晶体的谐振基频( h z ) ，岛为石英的密度 ( 2 6 4 8 x1 0 3k e c m 3 ) ，彳为石英谐振器电极面积( m 2 ) ，岛为石英晶片的厚 度( m ) ，a m 是沉积在电极上的刚性沉积物质量的变化( k g ) ，蛳为石英 晶振的频率改变量，亦即频移( i - i z ) 。从公式中可以看出，频移值， 与晶片负载质量a m 呈正比例关系。 g u i l b a u l t 在把相关的常数代入此式，推导出了适用于a t 切p q c 的 响应公式： 可2 - 2 2 6 1 0 州f o 筹 ( 1 2 ) 值得注意的是，s a u e r b r e y 方程是在真空及气相条件下导出的。外加质 量都是均匀地加到整个电极表面，形成刚性附着层，且外加质量不超 过晶体质量的2 【5 2 1 。当时研究人员一致认为石英晶片在液相中能耗 大，难于稳定振荡，所以只能在气相中应用。上世纪6 0 年代，k i n g 等 5 3 - 5 4 1 创造性地在晶体表面上涂覆上敏感材料，进行了一系列气相组 硕十学位论文 分的检测，并建立了至今一直沿用的以振荡频率来衡量吸附物质量的 工作方法，真正将压电技术应用到分析化学领域。上世纪八十年代初 期，美国的k o n a s h 等【5 5 1 和日本的n o m u r a 等5 6 1 分别报道了压电石英晶 片在液相中单面触液振荡成功，打破了之前压电晶片不能在液相中稳 定振荡的论断。姚守拙研究小组同时期也开始了压电石英晶体( p q c ) 液相振荡方面的研究，1 9 8 5 年首次报道- y p q c 在液相中存在停振温 度，第一次实现- 了p q c 在水溶液和醇、酮、酯、醚、芳烃、烷烃、卤 代烃等4 0 余种有机液体中的双面触液振荡，并对压电传感元件和振荡 理论进行了系统的研究1 5 7 - 6 0 1 。随后的几十年里，压电技术在液相中的 应用得到了很大的发展1 6 1 - 6 4 1 。目前液相传感已成为压电石英晶体传 感器的主要应用形式。 在一些发达国家( 日本、美国、英国等) ，盛行的观点就是压电 传感器就是一种质量传感器，所以称之为压电石英晶体微天平( p q c m ) 或石英晶体微天平( q c m ) ，应用于电化学检测领域的压电传感器则称 之为电化学石英晶体微天平( e q c m ) 。显然，这种观念是很片面的， 压电传感除了有质量效应之外，还存在着非质量效应。检测信号能灵 敏地反映晶体周围环境粘度、密度、应力、粘弹性、介电率、电导率、 溶胀、流变特性等的变化【6 5 1 ，这大大丰富了压电传感的理论研究和实 际应用。 1 3 2 压电传感技术在细胞研究中的应用 大多数细胞都是贴壁生长的，当细胞在压电石英晶体上发生粘 附、铺展、繁殖以及凋亡等一系列行为时，会对压电晶片的频率和电 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 阻产生影响。由于一般细胞的直径约为1 0 一3 0t x m ，比压电晶体表面声 波的作用距离大得多，所以粘附细胞只有一部分的体积参与晶体的振 荡；另外，压电晶片表面的粘附细胞不是均匀刚性膜，这是因为细胞 本身含大量的细胞液。因此细胞贴壁生长的粘弹性效应往往要超过质 量效应，p q c 信号变化主要来自细胞活动所导致的晶体表面粘、密度 变化，这种情况下s a u e r b r e y 方程不再适用。在压电传感器检测信号方 面，除频率外，一般还可以选用动态电阻和能量耗散因子( q c m d ) 等参数 6 6 - 6 9 】。通过这些检测信号，可以研究细胞的状态变化、细胞对 小分子( 包括药物) 的应激反应等方面的信息。细胞压电石英晶体传 感器近些年来发展很快。g r y t e 等7 0 1 首先以p q c 传感技术监测了非洲 绿猴肾细胞( v e r o ) 在金表面的粘附和脱附行为，开拓了该技术在哺乳 动物细胞贴壁研究中的应用；m a r x 等7 1 】监测了内皮细胞的粘附、铺 展和增殖过程；w i l l n e r 等【7 2 】基于压电石英晶体制备的免疫传感器，可 用来快速灵敏分析尿样中的沙眼衣原体细胞；t a n 等【7 3 1 利用压电技术， 研究了阿霉素和硒纳米粒子对b e l 7 4 0 2 细胞的联合细胞毒性；莫志宏 等【7 4 1 开发了压电细胞芯片( p c c ) ，动态研究7 h e p g 2 肝癌细胞的细胞 行为；c h e n 等【硎研制了可用于临床检测免疫表型急性白血病的压电免 疫传感器阵列，5 分钟内可完成对白血病细胞样品的检测，并能实时 动态地监测免疫反应过程；m a r x e r 掣7 6 1 发现，t c 7 上皮细胞$ 1 h e l a 细 胞粘附在压电晶体上由于细胞硬度增加而非细胞脱落导致的频率增 大；f r e d r i k s s o n 等【7 n z j i x t q c m d 测量技术，研究了猴肾上皮细胞和 中国仓鼠卵巢上皮细胞在石英晶体表面聚苯乙烯涂层上的粘附，同步 硕十学位论文 采集了细胞贴壁过程中石英晶体的谐振频率和能量耗散因子数据，为 细胞贴附提供了一种灵敏的检测方法。 1 4 本文构思 综上所述，利用一些现代分析化学手段，监测细胞各种生理活动， 研究细胞对小分子等的响应，对分析化学和细胞生物学的发展而言， 是一件非常有意义的工作。本论文结合电化学检测和压电传感技术， 在纳米粒子的细胞毒性、细胞识别和测量、细胞凝集过程等方面开展 了以下工作： 1 分别制备了二氧化硅纳米粒子、硒纳米粒子和金纳米粒子；基于 循环伏安法和显微镜观测调查了三种纳米粒子以及抗癌药物5 氟 尿嘧啶对人骨肉瘤细胞( m g 6 3 ) 增殖生长的影响；在此基础上进一 步研究了药物和纳米粒子联用的细胞毒性。 2 将鼠抗人整合素p 1 单克隆抗体通过层层吸附组装在玻碳电极上。 利用细胞膜表面整合素p 1 分子识别，使用电化学阻抗谱方法检测 了人宫颈癌h e l a 细胞。对影响细胞测定的因素，如修饰膜中的金 纳米粒子浓度、修饰膜的干燥时间、抗体浓度以及抗体的结合时 间也分别进行了考察和优化。 3 利用压电传感技术联合显微镜观察实时监测了两种凝集素一伴刀 豆球蛋白a ( c o na ) 和麦胚凝集素( w g a ) 诱导人正常肝细胞l 0 2 的 凝集过程；基于压电信号对细胞贴壁生长和凝集的动力学过程进 行了非线性拟合；基于细胞凝集现象建立了一种区分正常肝细胞 l 0 2 和肝癌细胞b e l 7 4 0 2 的压电检测新方法。 基丁电化学和压电技术的细胞生物传感研究 第二章体外三种纳米粒子与5