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t h l 与a - r a f 相互作用的研究 中文摘要 在我们以前的工作中，我们实验室报导了新基因t h i 编码产物，t h l 蛋白， 无论在体外和体内都能够特异的与r a f 激酶家族中的a r a 馓酶结合，而非b r a f 或c r a f 1 目前t h i 功能未知，为进一步研究其可能具有的生物学功能，我们 首先构建了系列t h l 的缺失突变体，通过酵母系统和g s t - p u l l d o w n 实验证实 了t h l 蛋白n 端1 - 3 9 2 氨基酸组成的区域对于这种结合是至关重要的。在h e k 2 9 3 和s m m c 一7 7 2 l 肝癌细胞中，a r a 暖到血清刺激或癌基因r a s 和s r c 激活后表现为 与t h l 蛋白的结合增强。这促使我们进一步研究t h l 与a r 矗f 的结合究竟会对 a r a f 的激酶活性产生什么影响。我们发现在上述细胞系中过表达n 王1 后，a r a f 的激酶活性明显下降，并有明显的剂量依赖关系。而b r a f 和c r a 微酶活性并 不受影响。n o r t h e r n 检测显示a - r a f 的m r n a 水平有一定的下调，而w e s t e m 检测 不到a r a f 蛋白水平的明显变化，这表明t h i 可能在m r n a 水平影响了a g a f ( 拘表 达，但并没有影响到a r a f 的蛋白水平。上述结果提示了t h i 蛋白可能作为a - r a f 特异作用的蛋白发挥了对a r 枷q 调节作用，这种现象引起了我们的极大兴趣， 促使我们进一步观察t h l 是否籍此影响了r a f m e k e r k 这条通路而对细胞的生 物学行为产生影响。通过构建稳定表达t h i 的细胞株，经过流式细胞仪检测后， 我们发现细胞在g 0 g 1 期增多而s 期细胞数明显减少，这与我们观察到的细胞生 长速度减缓现象是一致的。 对t h i 蛋白的氨基酸分析表明该蛋白没有与己知蛋白相似的激酶域，这提示 其可能不具激酶活性而作为一种新的构架蛋白而发挥作用。为了寻找t h l 可能存 在的结合蛋白，我们运用酵母双杂交系统筛选人胎脑e d n a 文库，发现了e 6 a p 和n p 2 2 0 这两种新的作用蛋白，并在体内免疫共沉淀实验中证实了与e 6 a p 的相 互作用。e 6 a p 在泛素依赖的蛋白降解体系中作为一种泛素蛋白连接酶( e 3 ) 而 发挥作用【2 ，3 ，4 。这为我们进一步阐述t h l 蛋白的功能及在信号转导通路中可 能的作用机倦4 提供了有益的线索，有助于理解信号蛋白激酶家族r a f 同工酶各自 特异的功能。 关键词：酵母双杂交系统a r a f t r i b d r o p h o b i n l ( t h i ) e 6 a p ( u b e 3 a ) n p 2 2 0 s t u d yo ni n t e r a c t i o no ft h la n da - r a f a b s t r a c t a sd e s c r i b e di no u r p r e v i o u sw o r k ，ap u t a t i v en e wg e n et h l p r o d u c t ， t h l s p e c i f i c a l l yb i n d s t oa - r a fk i n a s eb u tn o tb r a fo rc - r a fk i n a s eb o t h nv i t r oa n d i nr i v e ( 1 ) t of l l r t h e ri n v e s t i g a t et h ep o s s i b l ee f f e c t so f t h lo n a - r a f , w ec o n s t r u c t e d ap l e t h o r ao ft h lp r o t e i nd e l e t a n t sf o ra - r a f b i n d i n gr e s e a r c ha n df o u n di - 3 9 2 a a r e g i o np l a yap i v o t a lr o l e a sar e s u l to fr a f k i n a s e sa s s a y s s u c hi n t e r a c t i o nb e t w e e n t h la n da r a fl e a dt oad r a m a t i c a l l yi n h i b i t h i o no fa - r a fk i n a s ea c t i v i t yw i t l la d o s e - d e p e n d e n tw a yw h i l en e i t h e rb r a fo rc r a fk i n a s ea c t i v i t yw a si n f l u e n c e d n o r t h e r n b l o t t i n gs u g g e s t e d w i t hd e c l i n e dm r n al e v e lo fa - r a f u p o n t h l o v e r e x p r e s s i o n ，h o w e v e r , t h ea - r a f p r o t e i nl e v e lw a s n o ta f f e c t e db yw e s t e r n b l o r i n g u s i n gt h ls t a b l ee x p r e s s i o nc e i l s w ea l s of o u n dt h a t c o n c o m i t a n ts t r e n g t h e n e d b i n d i n gb e t w e e na c t i v a t e da - r a f a n dt h lw e r eo b s e r v e da f t e rs e r u l ns t i m u l a t i n go r o n c o g e n i cr a s s r c s t i m u l a t i o n t h i si n t r i g u i n gp h e n o m e n o np r o m p tu st of u r t h e r i n v e s t i g a t e 血ec o r r e l a t i o nb e t w e e ns u c hi n t e r a c t i o np a t t e r na n dt h ee f f e c t so ft h l p r o t e i no nc e l lg r o w t ha n dc e l lc y c l e d e l a y e dc e l l sp r o g r e s s i o nw a sa l s oo b s e r v e d a n dc e l l sw e r e s t a y e d i ng 1p h a s ep r o v e db yc y t o m e t r y t h e s ea b o v es t u d i e so i la r a f m a y b ec o n t r i b u t et ot a k i n gai n s i g h ti n t ot h er a f - i s o f o r m s p e c i f i cf u n c t i o n so nt h e a s p e c to fg e n ec e l lg r o w t ha n dp r o g e s s i o n t h e s ed a t ap r o v i d ean e wc l u et o o u r u n d e r s t a n d i n go ft h ec e l l u l a rf u n c t i o no ft h io na r a t y e tt h e r ei s s t i l lal o tf o r s t u d y t os h e d l i g h t o nt h es p e c i f i cf u n c t i o no f r a f k i n a s ef a m i l yi nc e l ls i g n a l i n g w ea n a l y z e dt h et h lp r o t e i nf o rc o n s e r v e dd o m a i ns e a r c h i n g t oo u r s u r p r i s e ，e x c e p ts e v e r a lp h o s p h o r y l a t i o ns i t e sf o u n d ，t h et h l s e e m st o l a c kp o t e n t i a lk i n a s ed o m a i nc o r r e s p o n d i n gt op r e s e n t e dp r o t e i n t h i s s u g g e s t e dt h a tt h er i o n e n z y m a t i cf u n c t i o no ft h la n di tm a y b ef u n c t i o n s a ss c a f f o l dp r o t e i n i no r d e rt os e a r c h i n gf o rp o t e n t i a li n t e r a c t i o n p a r t n e ro ft h i ，w eu s e dt h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e mt os c r e e nh u m a nf e t a l b r a i ne d n al i b r a r y ，a n df o u n dt w oc a n d i d a t e sp r o t e i n s ： e 6 一a s s o c i a t e d d r o t e i n ( e 6 a p u b e 3 a ) ，n u c l e a rp r o t e i n2 2 0 ( n p 2 2 0 ) i n t e r a c t i o n b e t w e e nt h l a n de 6 a pw e r ep r o v e db yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y s e 6 a pf u n c t i o n s a s au b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s e ( e 3 ) i nu b i q u i t i n d e p e n d e n dp r o t e o l y t i c p a t h w a y 2 ，3 ，4 ，t h i sp r o b a b l yp r o v i d e u san e wc l u ei nu n d e r s t a n d i n g 2 t h l sf u n c t i o na n dt h em e c h a n i s mt h a tt h l p a t i c i p a t e s i nr a f m e k e r k s i g n a li n gp a t h w a y k e yw o r d s ：y e a s tt w oh y b r i ds y s t e m a - r a f t r i h y d r o p h o b i n1 ( t h l ) e 6 一a s s o c i a t e dp r o t e i n ( e 6 a p u b e 3 a ) n u c l e a rp r o t e i n2 2 0 ( n p 2 2 0 ) 缩略语表： m a pk i n a s e ：m i t o g e na c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ：m k k k ：m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s ek i n a s e k i n a s e ：m k k ：m i t o g e n a c t i r a t e d p r o t e i nk i n a s ek i n a s e ：e r k ：e x t r a c e l l u a l rs i g n a l r e l a t e dk i n a s e ：m e k ： e r k ( e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dk i n a s e ) a c t i v a t o rk i n a s e ：j n k ：j u n a m i n o t e r m i a n lk i n a s e ：r b d ：r a sb i n d i n gd o m a i n ：c r d ：c y s t e i n er i c h d o m a i n ：c r ：c o n s e r v e dr e g i o n ：b d ：d n ab i n d i n gd o m a i n ：a d ：a c t i v a t i o n d o m a i n ：u a s ：u p s t r e a ma c t i v a t i o ns e q u e n c e ：m p l ：m e kp a r t n e r 1 ： i p t g ：i s o p r o p y l 一b d - t h i o g a l a c t o s i d e ： 第一章t h l 与a - r a f 相互作用的研究 刖吾 哺乳动物m a p k ( m it o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 信号传导通路在细胞 对各种各样的刺激应答后一系列生化事件中发挥了重要作用，包括调节细胞的增 殖，分化，凋亡和存活 5 。它存在于所有真核生物，基本组成是一个三级激酶 级联反应，包括m k k k s ( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e s ) ， m k k s ( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e s ) ，和m a p k s 。这一信号传 导系统的组成不仅具有信号放大的作用，更重要的是为精确调节信号传递的强度 和持续时间提供了平台。哺乳动物中m a p k s 可分为四类：e x t r a c e l l u a l r s i g n a l r e l a t e dk i n a s e ( e r k l 2 ) ，j u na m i n o t e r m i a n lk i n a s e ( j n k l 2 3 ) ， p 3 8p r o t e i n s ( p 3 8 b r 6 ) 及e r k 5 5 ，6 ，7 ，8 。r a s r a f m e k e r k 通路是其 中最基本、研究最多的信号通路 已经知道，r a f 激酶家族位于这条通路的中间，是一类重要的胞质内丝苏 氨酸激酶，它们能被上游信号分子活化，继而激活下游效应蛋白。在信号转导过 程中发挥了重要作用 9 。r a f 激酶家族有三个成员：a - r a f 、b - r a f 、c r a f 从 酵母到人类都很保守 7 ，l o ，目前关于它们的各自独特的功能还不十分了解。 三者中相对于b - r a f 和c - r a f 来说，对a r a f 的研究和了解是最少的。在对细 胞外信号应答的过程中，它们活性受到不同的调节。除了共同的上游激活蛋白激 酶( 小g 蛋白r a s ，r h o 家族) 1 1 ，1 2 和共同的作用底物( m e k l 2 ) 1 3 ，1 4 ， 1 5 外，都可以和1 4 3 3 蛋白 1 6 ，1 7 ，1 8 作用保持各自构象稳定和激活状态。 生物和生化学上的研究表踢各个成员的功能有所重叠，但并不是冗余的。有报道 证明，r a f 激酶家族各成员在体内各种组织的分布也有其特异性n o r t h e r n 表明 c r a f 转录体几乎在体内各组织中都有较高水平的表达，而b - r a f 在神经系统及 睾丸中表达最高：a - r a f 主要特异分布在泌尿生殖系统和肾脏组织 1 9 ，2 0 。 w e s t e r n 检测显示a - r a f 蛋白的分子量为6 8 k d a ，是三个家族成员中最小的 2 0 。 c r a f 蛋白的分子量为7 4k d a ，而b - r a f 转录体可以通过不同的剪切形式可形成 分子量从6 7k d a 到9 9k d a 的至少1 0 种异构蛋白 2 1 。在不同的组织中，这些 异构体的表达各不相同，可能分别参与了某些特定的信号传导过程。另外，对 c - r a f 的大量研究表明，单单只有r a s 与c r a f 的结合不足以最大程度的激活 c r a f 2 2 要达到最大程度的激活，还必须要有第二信号的刺激一往往需要酪氨 酸激酶实现对c r a f 上酪氨酸位点的磷酸化 2 2 ，2 3 。a - r a f 同c r a f 一样相 对与r a s 微弱的激活a - r a f ，癌基因s r c 能够强烈的激活a - r a f ，并且r a s 和s r c 4 协同刺激后，a - r a f 活性达到了最大 2 4 ，2 5 而b - r a f 贝l j 不需要s r c 的帮助 2 6 ， 除了需要r a s 外，在p c i 2 细胞中需要其他的小g 蛋自如r a p l 的协同刺激 2 7 ： 在n i h 3 t 3 细胞中则需要t c 2 1 的帮助来使之达到最大程度的激活 2 8 。近来，研 究表明只有温和的r a f 活性对于细胞越过g l 期和细胞增殖是必须的，强烈的激 活r a f 激酶则导致凋亡 2 9 。总之，这些从侧面反应了它们之间功能相对具有特 异性的方面。 我们以前的工作证实了t h l 是a - r a f 的新的作用蛋白。t h l 是新基因t h i 的 编码产物，在组织中广泛表达并且高度保守。新基因t i l l 于2 0 0 0 年由b o n t h r o n d t 等人运用定位克隆的方法得到 3 0 。令我们吃惊的是，通过同源性分析，t h i 蛋白似乎不具有激酶结构域，我们推断其有可能类似m p l 蛋白 3 1 发挥了构架蛋 白的作用。由于细胞生命过程中的调节的特异性部分可以通过一些无激酶活性的 蛋白如构架蛋白，连接蛋白或锚定蛋白连接不同的特异性信号分子来达到选择性 的激活，分离或者引导信号复合物定位的目的 3 2 。基于这种认识，t h l 的蛋白 特点促使我们深入研究其对于a r a f 的调控。 尽管t h i 能够直接于a - r a f 结合，这种相互作用对于a - r a f 究竟有何影响还 没有得到研究。这里，我们分析了t h l 结合& - r a f 的区域，研究了这种作用对于 a - r a f 激酶活性的影响以及对于下游e r k 激酶通路的影响并且分析了其中可能的 机制，这些有助于对r a f 激酶家族有进一步的认识及调控细胞增殖方面的理解。 材料与方法 材料 l 、酵母双杂交系统相关产品： 我们使用c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s ，i n c 公司生产的钒觚e h a 腿rl e x a t w o h y b r i ds y s t e m ，这种酵母双杂交系统使用营养报告基因作为筛选标记。在 l e x a 酵母双杂交系统中使用的每一种质粒都带有特定的营养选择标记，能使转 入了相应质粒的酵母在缺少特定营养物的s d 培养基上生长。p l e x a ( d n ab d 质粒) ， p b 4 2 a o ( a d 质粒) 和p 8 0 p l a c z ( 含有l a c z 报告基因) 可使转入了相应质粒的酵母 分别生长在缺少h i s ，t r p 和u r a 的s d 培养基上。d n a 结合蛋白是原核l e x a 蛋白， 其构建在p l e x a 质粒上；d n a 转录激活蛋白是8 8 个氨基酸的酸性e c o l i 多肽 ( b 4 2 ) ，它构建在p b 4 2 a d 质粒上，可以激活酵母基因的转录。人胎肝文库e d n a 通过e c o r l 和x h o l 酶切位点插2 x 到b 4 2 基因的多克隆位点，形成h d l i b r a r y 质粒。 l e 烈酵母双杂交系统使用两种报告基因，带有6 个l e x a 启动子的l e u 2 基因和带有 8 + l e x a 启动子的l a c z 基因。当编码o n a 结合结构域的融合蛋白和d n a 转录激活结 构域的融合蛋白相互作用时， 整合在宿主基因组的l e u 2 营养报告基因使得l e u 营养缺陷型宿主细胞e g y 4 8 可以生长在缺少l e u 的s d 培养基上。当1 a c z 基因的转 录被激活时， 细胞将产生b 一半乳糖苷酶，使生长在含有x g a l 诱导板上的菌落 显兰色。 各种培养基，h e r r i n gd n a ，人胎肝c d n a 文库为c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s i n c 公司生产ap e g 、l i a c 、d m s o 、a c i dg l a s sb e a d s 为s i g m a 公司产品。各种氢基酸 为伯奥公司产品。 2 、p c r 引物： t h i f u l l e n g t h ( f l ) 由实验室已有质粒得到。 t h lf 1 ( 1 - 4 5 2 a a ) ( e c o r i + n o t l ) s e n s e ：5 一g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g 一3 a n t i s e n s e ：5 一t t t g c g g c c g c t t a g c a g g t g c t g a t c t c a t - 3 t h if 2( 卜3 7 2 a a ) ( e c o r i + n o t l ) s e n s e ：5 一g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g 一3 a n tis e n s e ：5 一a t t g c g g c c g c t t a a t c t t t a t t g a t g c t c 一3 t h if 3 ( 1 - i 9 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 _ g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g 一3 a n tis e n s e ：5 一t t t g c g g c c g c t t a g a a c a c t t c t a g c t g c t g 一3 t h if 4( 卜1 7 0 a a ) ( e c o r i + x h o i ) s e n s e ：5 一g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g 一3 a n t i s e n s e ：5 一t g c c t c g a g a a t a a g c c t a a c g g t g a a 一3 t h if 5( 1 6 4 4 5 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 一t g g a a t t c a t g t t c a c c g t t a t g c t t a t t t 一3 a n t i s e n s e ：5 一t t t g c g g c c g c t t a g c a g g t g c t g a t c t c a t 一3 t h if 6( 1 7 1 - 5 8 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 一t 从g g a a t t c t c t g a c g c a g g g t a c c a g g g - 3 a n tis e n s e ：5 一g a t g c g g c c g c t t a g t t c a c c a t g a t g - 3 t h if 7( 4 5 2 - 5 8 2 a a ) ( e c o r i + n o t l ) s e n s e ：5 一a g a g a a t t c c a c c a g c t c c t g c a c c 一3 a n tis e n s e ：5 一g a t g c g g c c g c t t a g t t c a c c a t g a t g 一3 引物合成生工。网织红细胞体外翻译试剂盒( t n t c o u p l e dr e t i c u l o c y t e l y s a t es y s t e m ) 。w i z a r dp l u sm i n i p r e p s d n ap u r i f i c a t i o ns y s t e m 购自于 p r o m e g a 公司。g l u t a t h i o n es e p h a r o s e b e a d s ，e n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) a s s a yk i t ，”s - m e t h i o n i n e 。a n t i m o u s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) s e c o n d a n t i b o d y 及a n t i r a b b i t - h e r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) s e c o n da n t i b o d y 购自 6 于a m e r s h a m 。p r o t e i n ga g a r o s e 购自于r o c h e c o m p a n y 。a n t i c - m y cm o n o c l o n a l a n t i b o d y 及m e k i 蛋白购自于i n v i t r o g e n ，n o r m a lm o u s ei g g 、a n t i a r a f a n t i b o d y 购自于s a n t ac r u zb i o t e e h n o l o g y ，y 一”p - a t p 购自北京亚辉生物技术公 司。o n p g ( o n i t r o p h e n y lb d - g a l a c t o p a n o s i d e ) 购自于s i g m a 公司。p e g f p n v e c t o rs e t 及p d s r e d l c 1 购自于c l o n t e c h 公司。p s l u e s c r i p t i i s k 购自于 s t r a t a g e n e 公司。p c d n a 3 1 m y c h i s ( 一) 购自于i n v i t r o g e n 。t a k a r am u t a n b e s t k i t 购自于宝生物工程有限公司。 限制性内切酶、r p m i 一1 6 4 0 培养基、小牛血清、g 4 1 8 、l i p o f e c t a m i n e “r e a g e n t 、 t r i z o l 为g i b c o 产品。t 4d n a 连接酶购自8 0 e h r i n g e r 公司。质粒抽提试剂盒、胶 回收试剂盒购自o u i a g e n 公司。p m s f 购自s i g m a 公司。n y l o n 膜( n + ) ，o t 一“p a t p 购自a m e r s h a m 公司。随机引物探针标记试剂盒购d p r o m e g a 公司。焦磷酸二乙酯 ( d e p c ) 、b 一巯基乙醇为f l u k a 产品。十二烷基肌氨酸钠( s l s ) ，十二烷基磺酸 钠( s d s ) 为a m e s c o 产品。x 光胶片为柯达公司生产。其余试剂均为进口分装或国 产分析纯。s m m c - 7 7 2 1 细胞购自于中科院上海细胞所。 仪器 a b l 3 1 7 全自动测序仪：p e 公司。 p c r 仪：b i o m e t r a 公司。 荧光显微镜：n i k o n 公司。 流式细胞仪( f c m ) 为美国b e c t o n d i c k i s o n 公司产品。 d n a 、r n a 电泳槽购自于华美公司。 紫外交联仪为b i o r a d 产品。 细胞培养箱为f o r m as c i e n t i f i c 公司产品。 杂交炉为b i o m e t r a 公司产品。 蛋白电泳装置为a m e r s h a mp h a r m a c i a 公司产品。 半干转移装置为b i o m e t r a 公司产品。 凝胶成像装置：上海复日公司。 h p l c 为s h i m a d z u 公司产品。 方法 一、多聚酶链反应( p c r ) 扩增目的c d n a 片断： t h l 的缺失突变体由p c r 反应获得。模板如下：p c d n a 3 卜m t c t h i ( 如以前论文 所述) 7 p c r 反应体系： 模板 1 0 b u f f e r 上游引物( 0 ，3 3 p g “1 ) 下游引物( 0 3 3 斗g “1 ) d n t p ( 1 0 x ) h 2 0 t a q 酶 5 0 u l 用于构建t h i 系列突变体的p c r 循环条件为9 4 。c3 0 s e e ，6 0 。ci m i n ，7 2 。c1 5 m i n ，共3 0 个循环，最后7 2 0 c 延伸1 0m i n 。 二、载体质粒的构建 将p c r 产物t h l 分别通过e c o ri + x h oi 或者e c o ri + n o t l 酶切位点插入到 l e x a 蛋白d n a 结合结构域d n a 的3 端e c o ri 和x h oi 或n o t l 酶切位点，构成 l e x a t h i 融合蛋白表达载体。 i 、分别将t h lp c r 产物和p l e x a 空载体用限制性内切酶酶切。2 0 微升酶反应体 积，3 7 消化2 h 。并进行d n a 琼脂糖电泳。 2 0 f 1 反应体系如下： d n a ( o 2 - 2 肛g 1 )7 0 “l 1 0 酶切缓冲液2 o l 限制性内切酶( 1 0 2 0 u 斗1 ) 1 o u l d d h 2 0 1 0 0 l l l 2 、用q i a q u i c kg e le x t r a c tk i t ( q i a g e n 公司生产) 回收o n a 片段t r i 和p l e x h 。 割下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1 5 m le p p e n d o r f 管中。按照每l o o m g 琼脂糖力h 入3 0 0 8 1 s i 液的比例加入s l 液，5 5 。c 水浴l o 分钟。使琼脂糖完全溶 解，每隔2 分钟颠倒混匀一次。再加入1 3 体积的异丙醇，混匀，5 5 0 c 水浴1 分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱中，静置1 分钟，1 0 0 0 0 1 2 0 0 眶离心1 5 秒， 倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱柱中加入4 5 0 斗i w 1 液，静置1 分钟，1 0 0 0 0 - 1 2 0 0 0 9 离心1 5 秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱 放入同一收集管中。重复一次。将吸附柱放入一干净的1 5 m le p p e n d o r f 管中， 在吸附柱中央加入3 0 m it 1 液，静置1 分钟后，1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 9 离心1 分钟。将 札止 埘 叫蛐叫呲施 ，u 1 1 5 m l e p p e n d o r f 管( 含目的片段) 贮存于- 2 0 0 c 备用。 3 、将t h l 和载体p l e x a 用t 4d n a 连接酶在4 。c 连接过夜，约1 6 h 。 每2 0 9 l 反应体系如下： 载体d n a ( o 卜2 9 9 p 1 ) 2 o u l 插入d n a ( 0 1 2 p g p 1 )1 0 o “l t o t 。连接缓冲液2 o u l t 。d n a 连接酶( 1 o u 9 1 ) 1 5 - 2 o “l d d h 2 0 4 5 - 4 o p l 4 、大肠杆菌e c a id h 5q 感受态细胞的制备( c a c l ：方法) 1 ) 挑取l b 固体培养基上生长的叵c a l f 单菌落，接种于2 0m ll b 液体培养基 中，3 7 恒温，2 2 0 r p m 振荡培养过夜( 约1 2 1 4 h r ) 。 2 ) 取0 5m l 新鲜培养菌液，接于5 0m llb j3 7 振荡培养至0 n 。= o 2 - 0 3 ( 约 2 h r ) 。 3 ) 收集菌液，离心5 0 0 0r p m x5m i n ，4 ：沉淀物重悬于预冷的2 0m l1 0 0 m m c a c l ：冰浴2 0 m i n 。 4 ) 离心5 0 0 0r p m 5m i n ，4 c ，弃上清。 5 ) 加预冷的卜2m l1 0 0 蒯c a c l 。吹打重悬沉淀，继续冰浴3 h r 后即为感受态 细胞，可立即转化。 6 ) 亦可用等体积预冷的无菌1 0 甘油- 1 0 0m mc a c l 。重悬( 4 ) 中沉淀的感受态 细胞，分装1 0 0 - 2 0 0u 1 管，保存于一8 0 备用( 6 个月左右) 。 5 、取5 微升连接反应混合物转化曼c o l fd h 5q 感受态细胞( c a c l 。方法) 。 1 ) 取2 0 微升连接反应混合物，混合于t 0 0 2 0 0 “1 感受态细胞，冰浴4 5m i n 一2 h r 。 2 ) 4 2 c 热休克2m i n ，迅速转移至冰浴。 3 ) 加入5 0 0 p l 新鲜l b 培养液，于3 7 c 缓摇孵育4 5m i n 。 4 ) 将转化的细胞涂布l b 固体培养板( 含抗生素a m p ) ，3 7 倒置培养至单菌落 出现。 6 、挑取3 4 个生长在含有a m p 的l b 固体培养板上的单克隆菌落，接种于2 0 m 1 含a m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c 恒温2 5 0r p m 振荡培养过夜约1 2 1 4 h ，用碱裂解 法少量制备细菌质粒d n a 。酶切鉴定含有阳性片段的质粒d n a ， 将相应的e c o i l0 h 5q 细胞保种，保存于一2 0 。 1 ) 挑取l b 固体培养基上生长的叵c o l i 单菌落，接种于2 0 m ll b 液体培养基 中，3 7 c 恒温，2 5 0r p m 振荡培养过夜( 约1 2 1 4 h r ) a 2 ) 取1 5m 1 新鲜过夜菌，室温离心8 0 0 0r p m x lm in ，尽弃上清。 9 3 ) 将沉淀细菌振荡悬浮于l o o p l 溶液i 。 ( 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖：2 5 f 1 1 mt r i s - c l ：l o m me d t a ，p h 8 。o ) a 2 o mt r i s c 1 ，p h 8 0 6 2 5 m i b 0 4 me d t a ，p h 8 0 1 2 5 0 m l 垦：煎煎蓥 ：z 3 q g d d dh ：0 5 0 0 m l 4 ) 加2 0 0 i r t l 新鲜配制的溶液i i ，倒置数次混匀。 ( 溶液i i ：0 2m n a 0 h ：1 s d s ) a i o mn a o h0 i m l b s d s0 5 m l c d dh 2 04 4 m l 5 ) 加入1 5 0 斗i 预冷的溶液i i i ，振荡混匀；离心1 2 0 0 0r p m x 5m i n ，4 。c ，弃 沉淀。 ( 溶液i i i ：k a c 缓冲液，3 0 mk ，5 0 ma c 一) a 。5 mk a c3 0 0 o m l b 冰乙酸 5 7 。5 m l c d dh 2 01 4 2 5 m l 6 ) 上清加入4 5 0 肛i 的苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，振荡混匀，离心1 2 0 0 0 r p m 5m i n 4 c 。 7 ) 取上层水相，加0 ，9m l 预冷无水乙醇，一2 0 静置2 h r 以上，离心1 2 0 0 0 r p m 1 5m i n 4 。 8 ) 将沉淀d n a 用7 0 乙醇洗一次，3 7 烘箱或超净台干燥d n a 。 9 ) 沉淀d n a 重溶于2 0 “lt e 缓冲液( 含r n a s e1 0 2 0 u g ) ，3 7 。c 水浴卜2 h r 后 进步酶切分析或保存于一2 0 c 。 ( t e 缓冲液：l o m mt r i s c 1 ：i m me d t a ) a t r i s 1 2 1 9 b e d t an a ：2 心00 3 7 9 c d dh 2 0 8 0 0 0m l q ! ! ：q 丝竖1 遢趔至伍盛 e d dh ：0 1 0 0 0 o m l p l e x a t h i ( f u l l e n g t h ) ：如以前论文所述 p l e x a t h i f i 的p c r 产物e c o ri + x h oi 双酶切，p l e x ae c o ri + x h oi 双酶 切，按上述方法回收，连接，鉴定。 b t e x a t h if 2 ：t h i f 2 的p c r 产物e c o rl + n o t l 双酶切，p l e x ae c o ri + n o t i 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p l e x a t h if 3 ：t h lf 3 的p c r 产物e c o rl + n o t l 双酶切，p l e x ae c o r ! + n o t l 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p l e x a t h i f 4 ：t h if 4 的p c r 产物e c o ri + x h oi 双酶切。p l e x ae c o ri + x h oi 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p l e x a t h if 5 ：t h if 5 的p c r 产物e c o ri + n o t l 双酶切，p l e x ae c o ri + n o t i 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p l e x a t h lf 6 ：t h lf 6 的p c r 产物e c o ri + n o t i 双酶切，p l e x ae c o ri + n o t l 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p l e x a t h if t ：t h if 7 的p c r 产物e c o ri + n o t i 双酶切，p l e x ae c o ri + n o t i 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p c d n a 3 - g s t ：g s t 的p c r 产物h i n di i i + e c o ri 双酶切，p c d n a 3h i n di i i + e c o ri 双酶切，按上述方法回收，连接，鉴定。 p e f b o s a r a f ( k d ) 一h a 2 真核表达质粒由l a r r ym k a r n i t z 提供( m a y o