（神经生物学专业论文）触须自然刺激诱发的桶状皮层反应可塑性及其机制.pdf

浙江人学硕i ：学位论文中义摘要 触须自然刺激诱发的桶状皮层反应可塑性及其机制 浙江大学医学院： 硕士研究生： 导师： 神经生物学 黄明德 段树民教授 虞燕琴副教授 中文摘要 背景和目的：1 9 7 0 年w o o l s e y 和v a nd e rl o o s 定义了桶状皮层( b a r r e lc o r t e x ， b c ) 。b c 作为初级感觉皮层( s i ) 中的一个主要部分，其第1 v 层中每个b a r r e l - 与啮 齿类动物的面部须触须具有一一对应性，每个b a r r e l的神经元主要接受来自对应 一根主要触须的传入信息，并产生诱发反应。目前对b c 的研究主要集中在各种触 须刺激方式下的皮层代表区的分析以及离体情况下电刺激丘脑引起b c 诱发反应的 突触可塑性或者在体经验依赖性的突触可塑性研究。在在体情况下，不同频率的 触须自然刺激是否会引起b c 对触须反应的可塑性变化及其机制如何，却没有报道。 鉴于频率对于大小鼠的触须探索行为是一个非常重要的参数，而以往的突触可塑 性的诱发条件都是采用电刺激，故本实验主要研究在体情况下，不同频率的触须 自然刺激是否会引起b c 对触须反应的可塑性变化及其可能的机制。 实验方法：研究对象为s p r a g u e - d a w l e y ( s d ) 大鼠，雌雄不拘，2 2 0 9 - 2 8 0 9 ， 2 0 乌拉坦( o 8 m l 1 0 0 9 ) 腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上。记录电极位 置为：p ：1 8 2 5 m m ，l r ：5 5 m m ，h ：0 8 0 9 m m 。触须刺激由电刺激器控制气泵 产生气流，由玻璃微电极导出，气流方向由触须的正下方垂直于触须，一般引起 h 浙江人学硕l ：学位论文中文摘要 的触须振动为l m m 。当找到对应的主反应触须( p r i n c i p l ew h i s k e r ，p w ) 后，记录 单刺激诱发的皮层反应以及当不同频率( 1 0 0 h z l s 5 0 h z l o s 5 0 h z 2 s 2 0 h z 3 0 s 2 0 h z 5 s 5 h z l o m i n ) 条件刺激后的该诱发反应的可塑性变化。脑内微量注射容量为 1 p i ，匀速注射3 5 m i n 。触须剥夺试验中，无论s d 大鼠或i c r 小鼠，我们对出生后 第一周进行右侧触须齐根剪掉，连续7 天。正常对照组只对右侧进行模拟剪须行为， 但不真正剪须。一周后让触须正常生长至成年，i c r 鼠心脏灌流后取出大脑组织， 进行细胞色素氧化酶组化反应，镜下观察左右两侧大脑桶状皮层的结构差异。 结果：1 自然刺激下触须诱发反应在不同频率的条件刺激所产生的可塑性变 化不同。在高频l o o h z l s 、5 0 h z l o s 和5 0 h z 2 s 作为条件刺激时呈现出突触长时程增 强( l t p ) 现象，且频率越高其l t p 越显著；而在低频5 h z l o m i n 席0 激时诱发反应呈 现出突触长时程抑制( l t d ) 现象，这种变化的持续时间均超过l h 。2 0 h z 条件刺激 时诱发反应的可塑性变化不明显。2 在b c 第1 v 层微量注射a p v ( 2 - a m i n o 5 一p h o s p h o n o v a l e r a t e ，n m d a 受体选择性拮抗剂，2 0 0 m m ，1 9 1 ) 后，使 其发挥稳定作用后，再给予1 0 0 h z l s 或5 h z l o m i n 的条件刺激，前后由相同测试刺激所 诱发反应的可塑性变化明显减小了。3 在b c 第1 v 层微量注射k n 6 2 ( 1 - i n ，o - b i s ( 5 - i s o q u i n o l i n e s u l f o n y l ) 一n - m e t h y l 一一t y r o s y l 一4 - p h e n y l p i p e r a z i n e ，c a m k i i 的选择性抑制剂，5 m m ，l l - d ) ，使其发挥稳定作用后，再给予1 0 0 h z l s 的条件刺激， 诱发反应的可塑性变化也明显减小了。4 对出生后第一周进行右侧触须剥夺，1 w 后让其自由生长至需要体重的s d 大鼠，当给予1 0 0 h z l s 条件刺激之后，其诱发反应 的可塑性增强比正常大鼠要明显减小；而给予低频( 5 h z l o m i n ) 条件刺激之后， 诱发反应的长时程降低与正常对照组也明显减弱。5 k y n 的作用时间为4 0 9 0 m i n ， 在b c 第1 v 层微量注射k y n ( k y n u r e n i ca c i d ，广谱离子型谷氨酸受体拮抗剂， 1 0 m m ，1 p 1 ) 3 0 m i n 后，给予1 0 0 h z l s 条件刺激之后的反应幅度并未较k y n 给药前 的诱发反应有明显的增加。 i i i 浙江人学硕i ：学位论文中文摘要 结论：在体自然刺激能引起触须的诱发反应的可塑性变化，并与给予的条件 刺激频率具有一定的相关性，高频诱导出l 1 曙，低频诱导出l t d ；出生后第一周对s d 大鼠的感觉皮层的发育及其可塑性具有重要的作用；这种突触可塑性变化可能发 生在皮层，可能与不同频率时，皮层i 雏n m d a 受体的激活状态有关，c a m k i i 可能参 与其机制。 w 关鳝觑桶状皮层；主反应触须；自然刺激；长时程增强；突触可塑性 浙江人学硕i 二学位论义英文摘要 t h e p l a s t i c i t yo fe v o k e dr e s p o n s e so fb a r r e lc o r t e xb y n a t u r a ls t i m u l u st ow h i s k e ra n di t sm e c h a n i s m s d e p a r t m e n to fn e u r o b i o l o g y s c h o o lo fm e d i c i n e ，z h e ji a n gu n i v e r s i t y p o s t g r a d u a t e t u t o r h u a n gm i n g d e p r o f d u a ns h u m i n a s s o c p r o f y uy a n q i n a b s t r a c t b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e ：b a r r e lc o r t e x ( b c ) w a sf i r s t l yd e f i n e db y w o o l s e ya n dv a nd e rl o o si n 19 7 0 b c ，a sam a j o r p a r to fp r i m a r ys e n s o r yc o r t e x ( s i ) ， c o n t a i n s6l a y e r s l a y e ri vh a sa ne x q u i s i t es o m a t o t o p i cm a pw h e r ee a c hi n d i v i d u a l w h i s k e ri nr o d e n tf a c ei sr e p r e s e n t e di nad i s c r e t ea n a t o m i c a lu n i t ，t h e b a h e l ”e a c h n e u r o ni nt h eb a r r e lm a i n l yr e c e i v e si n f o r m a t i o ni n p u tf r o mi t sc o r r e s p o n d i n gw h i s k e r w h i c hi ss oc a l l e dp r i n c i p a lw h i s k e r ( p w ) a n dg e n e r a t e se v o k e dr e s p o n s e s c u r r e n t s t u d i e sa r em a i n l yf o c u so nt h ea n a l y s i so fe v o k e dr e s p o n s ei nb a r r e lc o r t e xb ya l lk i n d s o fw a y so fs t i m u l a t i n gw h i s k e r s nv i v oo rt h ee x p e r i e n c e - d e p e n d e n tp l a s t i c i t yo ft h e e v o k e dr e s p o n s e so fb cb ye l e c t r i c a ls t i m u l a t i o no ft h a l a m u s nv i t r o b u tt h e r ei sn o r e s e a r c ho ft h a tn a t u r a ls t i m u l a t i o nt ow h i s k e r sb yd i f f e r e n tf r e q u e n c i e sc a ni n d u c e p l a s t i c i t yo ft h ee v o k e dr e s p o n s ei nb ca n di t sm e c h a n i s m s b e c a u s et h ef r e q u e n c y i sa v e r yi m p o r t a n tp a r a m e t e rf o rr o d e n t se x p l o r a t o r yb e h a v i o r , a n dm e t h o d sf o re v o k i n g v 浙江人学顾i ：学位论文 英文摘要 p l a s t i c i t yi su s u a l l ye l e c t r i c a ls t i m u l a t i o np r e s y n a p t i c a l l y , s oi no u rs t u d i e s ，w ew a n t t o i l l u m i n a t ew h e t h e rd i f f e r e n tf r e q u e n c i e s n a t u r a ls t i m u l a t i o nt ow h i s k e r sc o u l di n d u c e s y n a p t i cp l a s t i c i t yo ft h ee v o k e dr e s p o n s ei nb c a n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m so ft h i s p l a s t i c i t ye v o k e db yn a t u r a ls t i m u l it ow h i s k e ra r ea l s oe x p l o r e d m e t h o d s ：s p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t sw e i g h i n g2 2 0 2 8 0 9w e r eu s e di nt h i ss t u d y , i g n o r i n gs e xd i s t i n c t i o n t h er a t sw e r ea n a e s t h e t i z e db yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no f u r e t h a n e ( 2 0 ，0 8 m l 10 0 9 ) t h er a tw a sf i x e di nas t e r e o t a x i ci n s t r u m e n t as m a l l c r a n i o t o m yw a sm a d ea c c o r d i n gt ot h ea t l a sa n dat u n g s t e ne l e c t r o d e ( f h c ) w a s i n s e r t e di n t ot h el a y e ri vo ft h eb a r r e lc o r t e x ( c e n t e r e d1 8 2 5 m mt ob r e g m aa n d 5 5 m ml a t e r a lt ot h em i d l i n e ，a n dad e p t ho fa b o u t0 8 - 0 9 m mf r o ms u r f a c eo fc o r t e x ) a w h i s k e rw a ss t i m u l a t e db ya na i rp u f ff r o mg l a s sm i c r o e l e c t r o d ew h i c hw a sg e n e r a t e d f r o map i c o s p n t z e rc o n t r o l l e db ya ne l e c t r i c a ls t i m u l a t o r t h ed i r e c t i o no fa i rp u f fw a s v e r t i c a lt ot h es t i m u l a t e dw h i s k e r t h ea m p l i t u d eo fv i b r a t i o no ft h ew h i s k e rc a u s e db y a i r f l o ww a sa b o u tlm m a f t e rp ww a si d e n t i f i e d ，w er e c o r d e de v o k e dr e s p o n s e so fb c a f t e rs t i m u l a t i n gt h ep wb yd i f f e r e n tf r e q u e n c i e s ( 10 0 h z ls 5 0 h z l0 s 5 0 h z 2 s 2 0 h z 3 0 s 2 0 h z 5 s 5 h z10 m i n ) a n dr e c o r d e dt h e c h a n g e so ft h e e v o k e dr e s p o n s e so fb c i n t r a c e r e b r a lm i c r o i n j e c t i o nw a sa c h i e v e db ym i c r o - s y r i n g e sw h o s ec a p a c i t yw a slp l ， a n do u ri n j e c t i o nv o l u m et ob c sl a y e ri vw a sa l s o1p 1 t h ei n j e c t i o nw a sf i n i s h e di n 3 - 5m i na ta v e r a g er a t e i nw h i s k e rd e p r i v a t i o ne x p e r i m e n t ，w et r i m m e da l lt h ew h i s k e r s o ft h er i g h tf a c ed u r i n gt h ef i r s tp o s t n a t a lw e e ki ns dr a t so ri c rm i c e i na d u l t ，t h e b r a i n sw e r et a k e no u ta f t e rd o i n gh e a r tp e r f u s i o n t h e nw ed i dc y t o c h r o m eo x i d a s e h i s t o c h e m i s t r yr e a c t i o nf o rt h eb r a i n s v i r e s u l t s ：1 c h a n g e so ft h ee v o k e dr e s p o n s e so fb cc a u s e db yd i f f e r e n t 浙江人学硕i ：学位论文英文摘要 f r e q u e n c i e so fc o n d i t i o n i n gs t i m u l iw e r ed i f f e r e n t l o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ( l t p ) o ft h e e v o k e dr e s p o n s ec o u l db es e e na f t e rh i 曲- f r e q u e n c y , s u c ha s10 0 h z1s ，5 0 h z10 sa n d 5 0 h z 2 ss t i m u l a t i o n t h eh i g h e rt h ef r e q u e n c i e s t h em o r eo b v i o u st h el t p l o n g - t e r m d e p r e s s i o n ( l t d ) o ft h ee v o k e dr e s p o n s eo fb a r r e lc o r t e xw a ss h o w na f t e rl o w f r e q u e n c ys u c ha s5 h z l0 m i ns t i m u l a t i o n t h ed u r a t i o no fa l lt h el o n g - t e r mc h a n g e s l a s t e df o rm o r et h a nlh b u tt h ep l a s t i cc h a n g eo ft h ee v o k e dr e s p o n s eo fb ca f t e r2 0 h z s t i m u l a t i o nw a sn o to b v i o u s 2 a f t e ri n j e c t i n ga p v ( 2 0 0 m m ，l 1 t 1 ) i n t ol a y e ri vo fb c ， t h ee v o k e dr e s p o n s e so fb cd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y a f t e ra p v i n j e c t i o n ，t h el o n gt e r m c h a n g eo ft h ee v o k e dr e s p o n s e so fb cc o u l d n tb eg e n e r a t e db ys t i m u l a t i o no f10 0 h zls o r5 h z l o m i n 3 a f t e ri n j e c t i n gk n 一6 2 ( 5 m m ，1 1 ) i n t ol a y e ri vo fb c ，t h ee v o k e d r e s p o n s e so fb cd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y a f t e rk n 一6 2i n j e c t i o n ，t h el o n gt e r mc h a n g eo f t h ee v o k e dr e s p o n s e so fb cc o u l d n tb eg e n e r a t e db ys t i m u l a t i o no f10 0 h zlsa g a i n 4 c o m p a r e dt o t h en o r m a ls dr a t s p l a s t i c i t y , t h o s es dr a t sw h o s ew h i s k e r sh a db e e n d e p r i v e di nt h e i rf i r s tw e e ka f t e rb i r t ht o o ko nad i f f e r e n tc h a n g e t h ee n h a n c e m e n to f t h ee v o k e dr e s p o n s e so fb ca f t e r10 0 h zlss t i m u l a t i o nw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p t h ed e c r e a s eo ft h ee v o k e dr e s p o n s e so fb ca f t e r 5 h z l0 m i ns t i m u l a t i o nw a sa l s oo b v i o u s l yr e d u c e db yt h et r i m m i n ga tt h ef i r s tw e e k 5 i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ee f f e c to ft h ek y nc o u l dl a s tf o r4 0 - 9 0 m i n t h i r t ym i n u t e sa f t e r i n j e c t i n gk y n ( 10 m m ，lp 1 ) i n t ol a y e ri vo fb c ，t h ea m p l i t u d eo ft h ee v o k e dr e s p o n s e s w a sa b o u th a l fl o w e rt h a nt h a tb e f o r ek y n ，t h e n10 0 h zlss t i m u l ic o u l dn o ti n c r e a s et h e e v o k e dr e s p o n s em o r et h a nt h a tb e f o r ek y n i n j e c t i o n c o n c l u s i o n ：t h en a t u r a ls t i m u l u st ow h i s k e rc a ni n d u c et h ep l a s t i c i t yo fe v o k e d r e s p o n s eo fb ci nv i v o ，a n dt h i sp l a s t i c i t yh a sac e r t a i nr e l e v a n c et ot h ef r e q u e n c i e so f t h en a t u r a ls t i m u l u s h i g h - f r e q u e n c ys t i m u l u sc a ni n d u c el t p ，l o w - f r e q u e n c ys t i m u l u s v i l 浙江人学烦i ：学位论文英文摘要 c a ni n d u c el t d ；t h ef i r s tp o s t n a t a lw e e kp l a y sa ne x t r e m e l yi m p o r t a n tr o l ei nt h e d e v e l o p m e n ta n dp l a s t i c i t yo fs o m a t o s e n s o r yc o r t e x ；t h e s es y n a p t i cp l a s t i c i t yc h a n g e s m a yo c c u ri nt h el e v e lo fc o r t e x ，a n dm a yb er e l a t e dt ot h ea c t i v a t i o no ft h en m d a r e c e p t o ra n dc a m k i ii nt h eb a r r e lc o r t e x k e yw o r d s ：b a r r e lc o r t e x ；p r i n c i p a lw h i s k e r ；n a t u r a ls t i m u l u s ；l o n g - t e r m p o t e n t i a t i o n ；s y n a p t i cp l a s t i c i t y 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特- 另w j d n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：青哏德， 签字日期；如j 。年1 月“同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘茔有权保留并向国家有关部门或机构送 交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝望盘鲎可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：董、咀袈、 签字日期：肋ld 年i e j 山日 翩躲反鲅 签字日期：妒f 。年f 、月彤日 浙江人学硕l ：学位论文 致谢 致谢 衷心感谢我的导师段树民和虞燕琴两位老师两年多来给予的精心指导和和严 格要求，他们深厚的学术造诣、杰出的思维、渊博的知识和严谨的工作态度使我 终生受益。 衷心地感谢罗建红和沈颖两位教授在我的实验和生活中给予的帮助和关心，罗 老师虚怀若谷的胸襟、敏锐的思维能力给我留下了深刻的印象，沈老师踏实的工 作作风、丰富的科研经验和忘我的工作热情使我终生难忘。 真诚的感谢浙江大学医学院神经生物学专业的全体老师和同学! 尤其是竺可 青、李静、邱爽、刘双双、季一飞等老师，朱炳、周瑞、吴振勇、曹静远、刘富 鑫、邵兴和艾恒等师兄师姐们，同窗朱佳、孙承龙、翁坚、张筱敏和李翠，师妹 孙缦利、柳浦青和师弟韩勇、邵渤羽、杜嵩等在我的实验和生活中给予了很大的 帮助和关心，在此致以深深的谢意! 最后特别感谢我的亲人朋友在我繁忙的学 - - j 科研中给予的理解、支持和帮助。 感谢我的家人和所有关心和帮助我的老师和朋友们! 浙江人学硕1 j 学位论义引言 触须自然刺激诱发的桶状皮层反应可塑性及其机制 1 引言 浙江大学医学院： 硕士研究生： 导师： 神经生物学 黄明德 段树民教授 虞燕琴副教授 在神经系统中，神经元通过突触相互联系形成神经回路。中枢神经系统的兴 奋性突触主要以谷氨酸为递质，突触前神经元释放谷氨酸，通过突触后的谷氨酸 受体( 包括a m p a 和n m d a 两种亚型) ，将突触前神经元的信号传递到突触后神经 元。谷氨酸与a m p a 受体结合，使突触后神经元去极化，从而产生脉冲发放。而 n m d a 受体与谷氨酸结合，将突触前电信号转变成突触后神经元内的c a 2 + 信号，启 动一系列生化级联反应，可导致突触的可塑性变化。 广义的突触可塑性包括突触传递可塑性、突触发育可塑性和突触形态的可塑 性，一般如未作特殊说明，即指突触传递可塑性。突触可塑性是神经科学领域近 年来进展最快、取得成果最大的研究领域。其主要表现形式长时程增强( l t p ) 和长时程抑制( l t d ) 现象已被公认为是学 - - - j 记忆活动的细胞水平的生物学基础。随 着有关研究的深入，现已发现突触传递的可塑性除了与学 - - - d 记忆功能关系密切外， 还参与了感觉、心血管调节等其它重要的生理或病理过程。 啮齿类动物体感皮层具有良好的组织学与功能上的拓扑对应关系，为可塑性 研究提供了有利条件。在啮齿动物体感皮层触须对应区b c 上特性相近的神经元群 聚集形成与触须分布一一对应的功能柱，这些功能柱在初级体感皮层上形成规则 浙江人学硕i ：学位论文 引苦 的排布【l 】。b c 是l 扫b a r r e l - 9 b a r r e l 之间的间隔( s e p t a ) 组成，前者主要接受来自丘脑 腹后内侧核( v e n t r a lp o s t e r i o r m e d i a l ，v p m ) 的兴奋性输入，后者主要接收丘脑后 核内侧群( p o s t e r o m e d i a lc o m p l e x ，p o m ) 的信号输入。该皮层无论在幼年还是成 年均表现出很强的经验依赖型可塑性，但与之有关的机制却研究较少。近年来这 方面的研究主要集中于在体或离体电刺激丘脑引起对应的桶状皮层的可塑性变化 2 - 4 。而对在体情况下给予触须自然刺激诱发的b c 可塑性却没有研究。 传统的突触可塑性大部分都是在突触前神经元给予一定的刺激，引起突触后 神经元兴奋性突触后电位( e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l s ，e p s p s ) 或抑制性突触 后电位( i n h i b i t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，i p s p s ) 。如神经元a 的轴突足够靠近神经元 b 并能使之兴奋的话，那么在这两个神经细胞或其中一个细胞上必然有某种生长过 程或代谢过程的变化，这种变化使细胞a 激活细胞b 的效率有所增加。与传统的突 触可塑性不同的是，我们的实验中记录的皮层诱发反应是由多级突触组成的。触 须感受到的外部信息先经三叉神经核，继而穿过脑干交叉至对侧丘脑，再经丘脑 皮层突触到达s 1 皮层【1 ，5 石】。我们用诱发反应的幅度和斜率的长时程变化来反映刺激 前后是否出现了可塑性，反映的是群体细胞的总体反应变化，而不像单突触反应 中那样，其斜率代表突触传递活性强弱。 在传统的突触可塑性实验中，当给予突触前神经元一个连续性的高频电刺激 ( 如1 0 0 h z ) 后，在突触后神经元上会记录到长时程增强的现象，即l t p ；而给予低 频刺激( 如1 h z 或5 h z ) 会诱导出l t d 。近来的研究表明，触须诱发的b c 反应是具有 频率依赖性的【7 - 9 。有人认为，接触物的粗糙程度可以引起不同频率的触须颤动， 在触觉探索过程中，动物触须的震动频率为4 1 5 h z ，在做行动决定前可以提高到 2 5 h z 甚至至l j 3 2 h z 。在猫与大鼠，三叉神经节细胞对外周的触须震动刺激的响应频 率可以达到1 0 0 0 甚至2 8 0 0 h z 。而在丘脑与皮层水平的神经元对触须震动频率的响 应要低得多。但如果用不同频率的触须刺激作为条件刺激，能否引起触须诱发的 b c 反应的可塑性变化却没有报道。故本研究首先用较低电阻的电极进行b a r r e l 皮层 的场电位记录，并分析b a r r e l 皮层的诱发反应的潜伏期、幅度、持续时间等。然后 用5 1 0 0 h z 的频率作为条件刺激刺激大鼠触须，观察触须自然条件刺激而不是传统 2 浙江人学硕，i 二学位论文引言 的电刺激前后的体感皮层诱发反应的可塑性变化。 研究发现体感皮层对外周感受器的传入信号的处理不仅是活动经验依赖性 的，而且还是发育时间依赖性的。早期的经历对皮层的发育及可塑性具有重要且 持久的影响。尽管大脑终生的可塑性是可能的，但这种可塑性在出生后早期的一 段时间内程度最大，因此也将这段时期称为关键期。过去的研究已证实，在运动、 视觉、嗅觉及听觉等系统的发育中均存在关键期。o l s o n 等的研究表明视觉皮层的 感受野的可塑性也呈现出一个关键期【1 0 】。故我们实验中对出生后第一周的s d 大鼠 进行触须剥夺，来观察b c 皮层可塑性是否也具有这样一个关键期。 在经典的突触可塑性中，谷氨酸被认为是兴奋性突触的神经递质，且大量研 究表明兴奋性氨基酸受体在神经网络结构里起到非常重要的作用。n m d a 受体被 认为参与了突触可塑性的形成。如果在我们的实验中桶状皮层也可产生类似突触 可塑性，那么其机制是什么? n m d a 受体受体是否参与? 我们知道，无论l t p 还是 l t d ，都要有c a 2 + 的流入，而c a 2 十启动下游一系列的级联反应需要与钙调蛋白依赖 性蛋白激酶i i ( c a l m o d u l i nk i n a s ei i ，c a m k i i ) 结合。有研究表明，c a m k i i 参与 了各种突触可塑性的改型i h 3 ，该酶在神经元的突触后致密物( p o s t s y n a p t i cd e n s i t i e s ，p s d ) 中含量丰富，为c a 2 + 依赖性的，可以和c a 2 + 结合，并在其自我磷酸化作 用过程中维持一个较长的活性【1 4 - 1 5 。那_ , c a m k i i 是否也参与了b c 皮层可塑性的机 制呢? 故此我们运用广谱离子型兴奋性谷氨酸受体的阻断剂k y n 和谷氨酸选择性 拮抗剂a p v 或者c a m k i i 的选择性抑制剂，来观察脑内注射拮抗剂后，对条件刺激 引起的皮层可塑性是否有影响。 g l a z e w s k i ( 1 6 】同时对触须剥夺引起的皮层诱发的抑制问题进行了研究，实验中 发现无论是一侧全剪还是一侧只剪一根触须，引起的三叉神经核和v p m 的反应都 没有出现显著的抑制现象，这提示这种抑制应该出现在丘脑水平以上。但有关触 须诱导的b c 可塑性到底起源于哪一突触水平还没有研究报道。故本研究中将采用 离子型谷氨酸受体的拮抗弃a k y n ，来研究突触可塑性的起源部位是在b c 还是在丘 脑。 浙江人学硕j ：学位论义 材料和方法 2 材料和方法 2 1 实验动物、器材与试剂 2 1 1 实验动物 s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠，体重2 2 0 - 2 8 0 9 ，雌雄不拘；i c r 成年小鼠。浙 江大学实验动物中心提供。 2 1 2 实验仪器设备 2 1 2 1生理信号采集与处理系统：p o w e r l a b4 3 0 ( a d i n s t r u m e n t s 公司，a u s t r a l i a ) 2 1 2 2 放大器：f o u r - c h a n n e ld i f f e r e n t i a la ca m p l i f i e r ( a - ms y s t e m s 公司，u s a ) 2 1 2 3 条件刺激器：p g 4 0 0 0 ad i g i t a ls t i m u l a t i o n ( c y g n u st e c h n o l o g y 公司) 2 1 2 4 压力刺激器：g e n e r a lv a l v eo p e r a t i o np i c o s p r i f z e ri i i ( p a r k e rh a n n i f i n 公司) 2 1 2 5 微量进样器：m i c r o l i t e rs y r i n g e s1l 容量( 上海高鸽工资有限公司) 2 1 2 6 金属微电极：( f h c ，b r u n s w i c k ，m e 公司) 2 1 2 7 双臂脑立体定位仪： s t o e l t i n g ( s t o e l t i n g 公司，u s a ) 2 1 2 8 低温恒冷冰冻切片机：l e i c ac m l 9 0 0 ( l e i c a 公司，g e r m a n ) 2 1 2 9 牙科钻：s t r o n e9 0 ( s a e s h i np r e c i s i o ni n d 公司，k o r e a ) 2 1 2 1 0电子天平：a l l 0 4 和a b l 3 5 s ( m e t t l e rt o l e d o 公司，瑞士) 2 1 2 1 1 体温恒定仪：m o d e l 一6 9 0 0 1 ( 深圳市瑞沃德生命科技有限公司) 2 1 2 1 2 蠕动泵：b t 0 1 1 0 0 型蠕动泵( 保定兰格恒流泵有限公司) 2 1 2 1 3 水浴槽：电热恒温水槽( 山海精宏实验设备有限公司) 2 1 3 实验试剂及配制 2 1 3 1 麻醉剂：取2 0 9 乌来糖( s i g m a z , ) 溶于8 0 m l 双蒸水中，待完全溶解后定 容为l o o m l ，即浓度为2 0 的乌拉坦。其麻醉用量为每1 0 0 9 s d 大鼠体重注射 0 8 m l ；每3 0 9 体重i c r 小鼠注射0 2 m l 。 2 1 3 2 0 2 m o l l ( p h 7 4 ) p b ：配制时，常先配制0 2 m o l l 的n a h 2 a 0 4 和0 2 m o l l 的n a 2 h p 0 4 ，两者按一定比例混合即成0 2 m o l l 的磷酸盐缓冲液( p b ) 。 4 浙江人学硕一i ：学位论义材料和方法 ( 1 ) 0 2 m o l l 的n a 2 h p 0 4 ；称取n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 1 2 9 ，加双蒸水至1 0 0 0 m l 溶解。 ( 2 ) 0 2 m o l l 的n a 2 h p 0 4 ：称取n a h 2 p 0 4 2 h 2 03 5 6 9 ，加双蒸水至1 0 0 0 m l 溶解。 ( 3 ) 0 2 m o l l p h 7 4 的p b 的配制：取19 m l o 2 m o l l 的n a i l 2 p 0 4 和8 1m l0 2 m o l l 的n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，充分混合即为0 2 m o l l 的p b ( p h 约为7 4 7 5 ) 。若p h 偏 高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可，使用时再用双蒸 水稀释1 倍。 2 1 3 - 3 孵育液( 用于细胞色素c 组化反应) ：每9 m lo 1 mp b ( p h 值为7 4 ) 中 加入二氨基联苯( d i a m i n o b e n z i d i n e ，d a b ，s i g m a 公司) 5 m g ，2 m g 的细胞色素 c ( s i g m a 公司) 和o 4 9 蔗糖，该试剂需现配先用。 2 1 3 44 多聚甲醛溶液( p h 7 2 ) ：往8 0 0 m lo 1 mp b ( p h 7 4 ) 中加入4 0 9 多聚 甲醛和4 0 9 蔗糖，加热溶解，待温度降为室温后加入0 1 mp b ( p h 7 4 ) 配制成l l ， 4 c 冰箱保存，使用前先过滤。 2 1 3 5 铬矾明胶液：0 s g 铬矾，5 9 明胶，加双蒸水至l l ，配制时须加热才能溶 解。 2 1 3 6 载玻片预处理：先用水洗净，然后用蒸馏水洗涤l 2 次，再用无水乙醇洗 涤2 3 次，晾干，再用经7 0 c 预热的1 的铬矾明胶液涂片后置于温箱烘干。 2 1 3 7 3 0 蔗糖溶液( 每1 0 0 m 1 ) ：3 0 9 蔗糖溶于7 0 8 0 m lo 1 mp b ( p h 7 4 ) 中， 待溶解后定容至1 0 0 m l ，4 c 冰箱保存，使用前先过滤。 2 1 3 8 k y n 溶液( 2 0 x 贮存液，2 0 0 m m ) ：用电子天平准确称取1 9 8 6 m g k y n ( 广 谱型兴奋性氨基酸受体阻断剂，s i g m a 公司) 溶于o 5 2 m l1 mn a o h 中，溶解后至 2 0 。c 保存，使用时o 9 生理盐水稀释2 0 倍，即为1 0 m m 。 2 1 3 9 a p v 溶液( 5 0 x 贮存液1 0 m m ) ：用电子天平准确称取0 9 8 5 m ga p v ( n m d a r 选择性阻断剂，s i g m a 公司) 溶于o 9 生理盐水中，定容为0 5 m l ，2 0 c 保存，使用时用o 9 生理盐水稀释5 0 倍，即为2 0 0 u m 。 2 i 3 1 0 k n - 6 2 溶液( 1 0 x 贮存液5 0 r a m ) ：用电子天平准确称取o 3 6 m gk n 一6 2 ( s i g m a 公司) 溶于d m s