（细胞生物学专业论文）大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨.pdf

人豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑茵机制的初步探讨 研究生：石姗姗 指导教师：谢明杰教授 专业：细胞生物学 研究方向：微生物学 摘要： 本文对脱脂豆粕中提取大豆异黄酮的最佳提取溶剂、最佳提取条件及人豆异黄酮的抑菌 活性、抑菌机制进行了研究。实验结果表明：乙醇作为提取大豆异黄酮的最佳溶荆，最佳提 取条件为乙醇浓度6 0 ，提取温度7 0 ( 2 ，物料比1 ：1 8 ，提取时间2 h ，提取次数2 次。采用 该方法从睨啃豆粕中可提取大豆异黄酮的量为0 4 5 。超声提取一次，3 0r a i n 所得大豆异黄 酮的提取率比加热回流法提取1 2 0 m i n 的提取率高约4 6 ，与加热回流提取二次，提取2 4 0 r a i n 的提取率致。将大豆异黄酮用于抑菌实验，发现人豆异黄酮具有抑细菌和抑真菌活性，其 中对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李 氏菌、白色念珠苗、犁头霉菌和米曲霉均有明显的抑制作用，但对大肠杆菌和酵母菌无抑制 作_ i j ，其抑菌作用的成分是其甙元形式。以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究大豆异黄酮的抑 菌机制，结果表明大豆异黄酮能够抑制菌体对数生长期的分裂。扫描电镜结果显示，菌体表 面皱缩、出现囊泡状或不规则形状的突起状结构甚至出现干瘪、扭曲变形等。透射电镜结果 显示，菌体出现质壁分离的现象，细胞膜破裂，细胞质固缩，凝集成块，解体出现空腔。呼 吸代谢抑制实验结果显示：大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的呼吸代谢有抑制作用，这种抑制 主要是通过抑制t c a 途径而起作用。因此，可以推测大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的抑制 作用可能是破坏细菌细胞l 圾细胞膜的完整性，抑制蛋白质的合成和抑制细菌的呼吸代谢等 多种作用的综合结果。 关键词：脱脂豆粕人豆异黄酮抑菌活性抑菌机理 a 人豆异黄酮抑菌活性的研究及抑葡机制的初步探讨 第一章文献综述 夫豆，为豆科植物黄豆的成熟种子，我国古代称为“菽”，英语里的s o y b e a n ，是中国“菽” 的译音。我国是人豆的故乡，早在5 0 0 0 年前就已开始栽培人豆。随着中外文化的交流，大豆 于公元7 世纪传至日本，1 7 世纪传至欧洲，1 9 世纪传至美国，渐而遍布世界 1 j 。目前，世界 上已有5 2 个国家和地区种植大豆，年产量超过一亿吨，品种有5 0 0 余种【2 l 。我国是主要的大 豆生产国，年产量居世界第三( 位于美国、巴西之后) ，达2 0 0 0 多万吨。过去我国8 0 以上 的大豆都作为油料加以使用，提油后的豆粕主要用于肥料和饲料。近年来随着人们对大豆 及其制品的营养作用和保健功效研究的深入，发现大豆除不含胆固醇，是优质蛋白质和油脂 的重要来源外，还含有许多有益的生物活性物质，如表1 1p l 。在这些生物活性物质中，大豆 异黄酮因具有明显的生物学活性已越来越引起社会和学术界的普遍关注，是近年来世界各国 科学家研究的热点。 大豆生物活性物质来源及作用 t a b l e l - 1 f u n c t i o n a n d s 0 i l l 诺o f a c t i v i t y “b s 胁x 霉洫帅锄 1 1 大豆异黄酮的来源、分布、结构及代谢 1 。1 1 丈豆异黄酮的来源、分布及影响因素 自然界中异黄酮的资源十分有限，只局限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中，如大豆、 墨州哥小一豆、苜蓿和绿豆等植物中，而人豆是唯一含有异黄酮且含量在营养学上有意义的 5 人豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 食物资源，这一点赋予了大豆及人豆食- 铺特别的重要性。大豆异黄酮是大豆生长中形成的一 类次生代谢产物是生物黄酮中的一种，由丁_ 它是从植物中提取且与雌激素有相似结构，因 此也称其为植物雌激素。人豆异黄酮在人豆种子中的含量较低，仅为种子重量的千分z 一左 右，主要分布丁大豆种子的子叶和胚轴，其中8 0 - 9 0 的异黄酮存在于子叫中，浓度为0 1 一0 3 ：胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较商，为1 一4 ，但由于胚只占种子总重量的 2 ，因此尽管浓度很高，所占比例却很少( 1 0 - - 2 0 ) 4 1 1 5 1 1 6 1 。人量的研究表明，来自不同 国家的大豆，由于品种、生长环境、田问管理的差异，大豆异黄酮的含量存在一定的变化。 其中基因型的差异是决定大豆异黄酮组成和含量不同的根本原因，除此之外，栽培时期和地 理环境也影响大豆中异黄酮的含量和组成。大豆异黄酮的含量受气候影响，干热的气候条件 f ，大豆异黄酮含量低，供水量充足或湿度较大地区生长的大豆中大豆异黄酮的含量高；大 豆异黄酮的含量与地理环境中的纬度和海拔呈正相关，纬度越高，日照时间越长，大豆中异 黄酮的含量越高用1 8 l ；不同的加t 方法对大豆异黄酮的影响。表现为水洗加工可大大降低异黄 酮的含量；加热和发酵处理会改变大豆异黄酮的结构形式，使其易被机体吸收 9 1 1 0 ，但不会 改变其含量。 1 1 2 大豆异黄酮的组a , a e a 构 大豆异黄酮主要是指以3 - 苯并吡喃酮为母核的化合物，迄今为止从大豆中共分离出1 2 种 大豆异黄酮异构体，分为游离型的甙元( a g l y c o n s ) 和结合型的糖甙( g l u c o s i d e s ) 两类，甙 元包括染料木素( g m b 把缸) 、大豆素( d a i d z e i n ) 和黄豆黄素( g i y d 曲i ) 三种。结合型糖甙 由三种甙元衍生而成，主要以染料木甙( g e n i s t i n ) 、大豆甙( d a i d z i n ) 和6 - o 丙二酰基染料 木甙( 6 - o - m a l o y l g c n i s l i n ) 等九种形式存在，大豆异黄酮主要以糖甙形式存在，占总量的 9 7 - 9 8 ，甙元占总量的2 - 3 1 3 l 【“】。甙元的结构见表1 2 和图1 1 ，糖甙的结构见表1 _ 3 和图 1 - 2 。 表1 2 大豆异黄酮甙元的结构 ! ! 坐! 兰! 业虫堡垡垒醴型 r 1r 2a g l y m n s 6 查皇墨重墅塑堕垩丝竺婴塾墨塑堕塑型塑型生堡塑 8 图1 1 大豆异黄酮甙元的结构 v l g 1 - 1s t r u c t u r eo f a g l y c o n s 表1 - 3 大豆异黄酮糖甙的结构 1 j | b l e1 _ 3s t r u c t u r e o f g l u c o s i d e a h 墅坠 墅塑塑堂 hho h d a i d 凼( 大豆哟 0h h 0 c h 3 hh oh ho a h h c o c h 3 c o c h t c o c h t g e n 蛐( 染料木雨 g l y c i t i n ( 黄豆南 6 - o - a c e t y d a i d z i n ( 6 - o - 乙酰基大豆甙、 6 - o - a c e t y g e n i s f i n ( 6 - o - 7 , 酰基染料木甙) 6 - o - a c e t y g l y c i t i n ( 6 - 0 - 乙酰基黄豆甙) hh c o c h 2 c o o h 6 ，- o - m a l o n y d a i d z i n ( 6 - o - 丙二酰基大豆甙1 0h c o c h 2 c o o h 6 - o - m a l o y l g c n i s t i n ( 6 m 丙二酰基染料木甙) !竺! 坠! 兰翌! ! ! 旦竺 竺：翌些墨受! ! 些堕：! ：亘三坠苎茎皇空 7 渗将 人豆异黄酮抑菌活性的刊f 究及抑苗机制的初步探讨 图1 2 大豆异黄酮糖甙的结构 l v i g 1 - 2 s t r u c t u r e o f g l u c o s i d e s 近年来的研究结果表明天然甙类的分子结构并不是活性的最佳状态，大豆异黄酮的生 理活l 生主要是大豆异黄酮甙元的活性，大豆异黄酮甙须在b 葡萄糖甙酶作用下水解成甙元形 式才能被吸收利用。因此评价大豆异黄酮的生理活性，不仅要看大豆异黄酮的含量，更重耍 的是看它存在的结构形式。 1 1 3 大豆异黄酮的吸- 收与代谢 人豆异黄酮主要在人体肠道内代谢和吸收，再传递至肝脏，并进入肠肝循环。肠道内菌 群对大豆异黄酮的代谢起决定作用，并影响大豆异黄酮的生物利用率【1 2 i 廿1 。食物中的大豆异 黄酮主要通过两种途径吸收。a g l y c o n s 可从小肠直接吸收，具体吸收机制尚不清楚，有人认 为可能是由于a g l y n s 呈脂溶性且分子空间结构较小，使a 四y c o n s 可通过小肠壁e 的绒毛上皮 细胞的被动扩散而直接吸收；但有人却持相反意见，认为大豆异黄酮在小肠的吸收是通过主 动运输：g l u c o s i d e s 不能通过小肠壁，它须由结肠中细菌y y l g , 的p - 葡萄糖甙掷。半乳糖甙酶 水解成甙元形式，才能被结肠壁吸收入血。因此，结肠是决定大豆异黄酮生物利用率的主要 部位1 1 4 1 。在大豆异黄酮的代谢过程中，肝脏也起着关键性作用。动物实验表明，黄酮类化合 物在肝脏参与i i 型反应，o h 基团主要与葡萄糖醛酸和硫酸结合，此外也可能发生去甲基化 等反应。大豆异黄酮随胆汁分泌到肠腔后，火部分被肠腔内微生物通过杂环裂解的方式降解 和代谢，产物吸收入血后人多由肾脏排出，末被吸收的随粪便排出，其中c 把n i s m n 的最终代 谢产物为对乙基苯酚俨t t l l y l p h o i ) 和4 - 羟苯基2 丙酸，d a i d z e i n 的终产物为异黄烷类化合物雌 马酚( c q u 0 1 ) 和氧去甲基安哥拉紫檀素( o - d e s m e t h y l a n g o l e n s i n ) 嘲。膳食中的大豆异黄酮 也可通过乳汁分泌，o c - m s 检测发现，啦成年泌乳妇女的乳汁中平均含有2 d o i l “v l 庸勺大豆 异黄酮【1 “。大豆异黄酮在生物体中的生物利用度，受个体著异、h o t e 方式和膳食中纤维素的 含鼙等冈素影响。植物油可提高人豆异黄酮的生物利用度，谷物纤维可降低大豆异黄酮的生 8 查呈量墼里塑堕鋈丝塑塑塑丝塑堕垫型塑望兰堡盟 物利用度，其中a 毋y c o n s 的生物利用度显著高一j ：g l u c o s i d e s d a i d z e i n 高t - g c n i s t c i n 1 7 1 。 1 2 大豆异黄酮的性质和生理功能 i 2 i 大豆异黄酮的性质1 ( 1 ) 显色 异黄酾类化合物与其它黄酮类化合物相比，由丁a 、b 、c 环共轭程度比较小，因此仅呈 微黄色、灰白或无色，紫外线下多显紫色。 ( 2 ) 旋光性 大豆异黄酮的甙元不具有旋光陛，但对于糖甙型的人豆异黄酮，由于结构中引入了糖基 而具有旋光性，且多为左旋。 ( 3 ) 溶解性 大豆异黄酮甙元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶及稀碱液中极 易溶丁二甲基弧硼m s o ) 。当甙元中的羟基被糖甙化后，水溶性增强，脂溶性降低。 ( 4 ) 酸碱性 由丁异黄酮分子中有酚羟基，教其显酸陛，可溶于碱性水溶液及吡啶中。其酸性强弱与 酚羟基数目的多少和位置有关。 ( 5 ) 还原性 大豆异黄酮的甙元具有多酚羟基结构，以o e n i s t c m 为例，其7 位羟基上的氧原子。同时受 着苯环( a 环) 大p 键的p 巾共振效应和其对位( 1 0 f 1 2 ) 上的吸电子基团一羰基的诱导效应，这 两种效应共同作用的结果，使得氧原子上的电子云向大p 键方向转移，对氢原子的吸引力相对 减弱很多，因此这个酚羟基上的氢原子在外来作用下，容易与氧原子脱离形成氢离子，发挥 还原效应，这也是大豆异黄酮能够抗氧化、具有还原性的结构基础。 1 2 2 大豆异黄酮的生理功能 ( 1 ) 抗肿瘤作用 流行病学研究显示，东亚地i x 人群的乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的发病率远低于西方工 业化国家，这种差异与东亚地区食j = i j 较多的大豆制品有关。据统计，娅洲人均大豆的消费量 是美国的2 m 5 0 倍，豆制品中具有抗肿瘤作用的成分，一般认为是其含有的低甲硫氨酸、高肌 醇六磷酸、皂甙、制醇和异黄酮，其中夫豆异黄酮的抗癌效应是主要的【”i 。z e m i n g 等i i _ 含不 9 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 同浓度大豆异黄酮的食物喂饲人鼠，发现l l i s t e 姗n d a i d 口如能够显著延k 乳腺癌细胞的潜伏 期，降低肿瘤的发生率、减少肿瘤的发生数目，但对已经生长的癌细胞则没有拇制作用例。 b a r n e s 以n - 甲基亚硝基脲( n m u ) ； j 1 7 ，1 2 二甲基苯井蒽( d m b a ) 建立了人鼠乳隙癌模型， 然后分别用含有大豆异黄酮的饲料( i 纽) 和不含大豆异黄酮的饲料( i i 组) 哺养，结果显 示，饲养i 组人鼠乳腺癌的发生数目显著低于l i 组。刘颖等利用m 兀怯、集落形成实验、透 射电镜及流式细胞仪的方法，观察g e i l i 咖i n 对体外培养的人胃癌s g c - 7 9 0 1 细胞的抑制和诱导 细胞发生凋亡的作用，其结果也表明g - e n i s t e i n 对人胃癌细胞的体外增殖有抑制作用，且随剂 量增加，抑制作用增i 非“。近年来关于大豆异黄酮抗癌的动物实验及体外实验研究很多，但 其作用机制尚未完全阐明，目前提出的人豆异黄酮抗癌机制主要有以下几种观点：雌激素 和抗雌激索样作用；抑制拓扑异构酶的活性；增加抗氧化酶活性：抑制酪氨酸蛋白激 酶俨i 目活性；抑制新生肿瘤的血管形成；诱导癌细胞凋亡分化及与抗癌药协同作用等。 究其真正的作用机制，研究者认为可能是e 述作用机制的综芒尸。 ( 2 ) 对血管的防护作用 随着人类生活水平的提高心血管疾病已成为危害人类生命的高发性疾病。据统计，心 血管疾病是绝经后妇女死亡的主要原因，美国每年用于治疳0 血管疾病的费用超过1 2 0 0 亿美 金，其中高血脂症是引起心血管疾病的重要原因之一。所谓高血脂症是指血胆固醇、甘油三 酯和低密度脂蛋白( l d l ) 浓度过高，而高密度脂蛋白( h d l ) 浓度过低。研究显示大豆异 黄酮可显著降低u ) l 的浓度和甘油三酯的含量，并通过干预血小板和凝血酶作用减少血栓的 形成，酣匦d 血管疾病发生的几率嘲。a n d e r s o n 等对3 8 项大豆异黄酮与血脂或胆固醇关系的 研究资料进行分析，发现有3 4 项研究证实大豆异黄蹲 剞锋血脂作用刚。a i i m ( h y 将大豆蛋白利 用乙醇洗脱法使其中的大豆异黄酮的含量由9 4 1m 刚嗥降至0 9 7 n l 刚罾然后用洗脱后的大豆 蛋白喂饲青春期翥 糇，并与喂饲未经洗脱的大豆蛋白组比较。发现未洗脱组猕猴的总胆固醇、 l d l 、极低密度脂蛋白( v l d l ) 及载脂蛋白等含量显著低_ 】二洗脱组而珈) l 却显著高于洗 脱组。若将乙醇冼脱下的大豆异黄酮重新加同到洗脱组中，结果二组的血脂无显著差异嘲。 n e s t e l 每天 止绝经前妇女摄入大豆异黄酮( 4 5 m g 5 1 0 周) ，发现大豆异黄酮可明显改善其动脉 顺应性，对心血管起到显著的保护作用。更年期妇女服用异黄酮( 8 0 r a g d ) 5 1 0 周，血管弹 性可增强2 6 削阳。目前关于人豆异黄酮在心血管疾病中的作_ i = j 机制可概括为：u ) 暖体调 节作用；抗氧化作用；抑制血管平滑肌绷胞的增殖；抗血栓形成；维持血管反应性；抑制细 1 0 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 胞粘附；改变参与动脉硬化斑块形成的特殊生长因子的活性等脚归l 。 ( 3 ) 预防骨质疏松症作用 人们对大豆异黄酮在治疗和抑制与激素相关的癌症，如前列腺癌、乳腺癌等癌症及刚氐 人体胆固醇、防治心血管疾病等方面已经进行了较多的研究，但对其预防骨质疏松的效果只 是在近年来才开展一些j 二作。1 9 9 5 年，世界下生组织以夏威夷岛的7 0 岁以上的日本妇女为对 象，进行了大豆异黄酮的排泄量与骨密度关系的病因学调查研究结果显示，骨密度高的群 体其尿中的异黄酮排泄量也较多，而尿中异黄酮排泄量又与大豆异黄酮的摄取量成正相关， 说明大豆异黄酮的摄取量与骨密度有一定的关系。p o t t e r - 等对6 6 名绝经的妇女进行了膳食干预 实验，并由此说明大豆异黄酮对骨密度的影响。他将受试者共分为3 组，每组分别给与酪蛋白、 酪蛋白+ 异黄酮( 5 6 m g ) 、酪蛋白+ 异黄酮( 9 0 r a g ) 。实验共进行了驯司。结果发现，食用酪蛋 白的一组妇女，腰椎骨矿物质含量( b m c ) 和腰艟目密度( b m d ) 下降了1 5 食用酪蛋白 + 异黄酮( 5 6 m g ) 的组，b 忙和b m dr 降t o 5 ，食用酩蛋白+ 异黄酮( 9 0 m g ) 的一组， b m c 和b m d 增加了2 。a l e k e l 对6 9 ：g 未绝经妇女的膳食干预实验也证实了大豆异黄酮具有 抑制股野以及腰椎骨骨密度刚氐的作用口”。p i c h e r i t 的实验结果还表明。给已经患有骨质疏松 症的大鼠喂饲大豆异黄酮，它不能起到治愈的作用【3 2 1 。p o t t e r j 用1 7 a 雌二醇作为对照，进一 步对大豆异黄酮的两种主要成分d a i d z e i l l 和c , e n i s t e m 损失的能力进行比较研究，发现 d a i d z e l n 能更有效地预防卵巢切除大鼠的骨损失 3 0 l 。关于大豆异黄酮抑制骨密度刚氐的作用机 制，a d m a h d i 等认为是大豆异黄酮能够增强肠道对钙离子的吸收，从而提高了骨的形成能力 删。 ( 4 ) 弱雌激素和抗雌激素作用 大豆异黄酮与人体雌激素的结构相似，在人体内能起双向调节平衡作用。长期的临床实 验证明，对丁低雌激素水平者，大豆异黄酮能代替雌激素和雌激素受体( e r ) 结合，表现弱 的雌激素样作用，用于防治一些和激素水平下降有关的疾病，如更年期综合征、骨质疏松、 血脂升高等；而对于高雌激素水平者，大豆异黄酮则能干扰雌激素和e r 结合，表现为抗雌 激素样作用【3 l ，可防治乳腺癌和子宫内膜炎等。2 0 世纪4 0 年代中期，研究者注意到澳大利亚某 牧场中的绵羊生殖能力极强，经研究发现这是因为牧场中含有特殊的三叶草植物。进一步的 研究表明，此三叶草中含有g e i l i s i e i n 和d a i d z 豳的前体鸡豆黄素a 和刺芒柄花素，它们在绵羊 的体内被b _ 葡萄糖甙酶分解为g i 咖加和d a i d 日由后而起作用。这是人们首次观察到异黄酮具 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 有雌激素样作用，由此掀起了研究大豆异黄酮的热潮。妇女更年期综合症是由丁妇女绝经后 卵巢分泌的雌激素减少而造成的，食用人豆异黄酮食品可弥补阂绝经减少的雌激素，从而减 轻或避免引起更年期综合症。澳人利的科学家研究发现，更年期妇女如果每天食用4 5 9 大豆， 其更年期综合症的发病率就会降低4 0 。n 咿c a 对1 0 0 0 多名日本妇女做了为期6 年的跟踪调查， 发现大豆异黄酮可明显减轻由于更年期潮热而引起的不适症状。s h u u 在兔、羊的子宫和 m c f - 7 1 细胞雌激素受体中将3 h 标记的1 7 b - 雌= 醇用g e n i s t e i n 、d a i d z e i n 替代，他发现如果以 1 7 b - 雌二醇相对摩尔结合力定义为1 0 0 ，则删d z e i l l 仅为0 1 g e n i s t e i n 为0 9 就相当于1 7 b 雌二醇的0 1 1 。尽管大豆异黄酮的雌激索活性比内源性雌激素低，其活性相当于雌二 醇的1 0 - s 1 0 3 ，但由丁血液中大豆异黄酮的浓度远远高于内源性雌激素，因此它可以发挥与内 源性雌激素相似的作用。关于大豆异黄酮的抗雌激素作用，研究者给去卵巢小鼠皮下注射雌 二醇的同时再加上1 0 m g 的染料木素，发现其生殖道的雌激素活i 生比单独使用雌二醇低5 4 。 ( 5 ) 抗菌消炎作用 早在几千年前的中国文献中就记载了大豆有治疗肠炎的作用，现代研究表明这种作用主 要与大豆异黄酮有关。h a l i n a 等用g e n i s t e i n 治疗由2 ，4 ，6 三硝基苯磺酸( t n b s ) 诱导的豚 鼠回肠炎，发现g 饥i 咖i i l 有一定的抗炎作用聊。n a i m 的实验结果表明，大豆异黄酮的浓度为 o 0 5 时即具有显著的抗真菌活性1 3 5 1 。吴定等将大豆异黄酮添加到灌肠中，结果细菌总数比 对照组低了4 5 5 生霉时间比对照组延迟了两天吲。关于大豆异黄酮抑葭机制的研究比较 少，k a t a l z y n a 等人用同位素标记法研究火豆异黄酮的抑菌机制，发现q 舳能够干扰某些 细菌d n a 、m 蛆和蛋白质的合成叨。近年来，学者们研究黄酮类化合物对病原微生物的抑制 和杀灭作用，认为其抑菌机理可能有以下几方面：酚类物质通过破坏细胞壁及细胞膜的完 整性，导致微生物细胞释放胞内成分或引起膜的电子传递、营养吸收、核苷酸合成及衄甲活 性等功能障碍。酚类化合物及其衍生物一般呈弱酸性，能使蛋白质凝固或变性，故有杀菌 和抑菌作用。酚类化合物通过抑制微生物的呼吸代谢作用，使其供给细胞生命活动所必需 的能量和合成代谢所需的碳架及还原力无法生成，新陈代谢受阻导致菌体死亡。可与细菌 遗传物质d n a 或r n a 结合，从而改变细菌生理抑制生长瑚i 。 ( 6 ) 提高机体免疫力作用 大豆异黄酮可提高机体的非特异性免疫和特异性免疫功能。1 m 给大鼠喂饲d a i d z e i n ， 发现d a i d z e i n 可提高人鼠的脾重量，使其脾脏生成l g m 的作f i j 增强，外周血淋巴细胞禽鬣增 1 2 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 多，还能提高瑚胞和n i 建自t t 胞的活性，以此抑制肿瘤细胞的生长。w h g 等在体外培养脾淋巴 细胞的实验中发现，人豆异黄酮能显著提高伴刀豆素a ( c o n a ) 或脂多糖( l p s ) 诱导的脾 淋巴细胞增殖反应，与对照组相比，c o n a 诱导组提高2 2 4 9 ，i p s 诱导组提高1 1 2 。通过酶联免疫测定发现，大豆异黄酮还能促进g o r i a 诱导t 淋巴细胞产生自细胞介索2 ( i l - 2 ) 雨l 白细胞介索( i l - 3 ) 。l b - 2 在淋巴细胞的增殖过程中起轴心作用，可激发和维护淋 巴细胞的生长，最终导致淋巴细胞的分化和增殖，维护免疫自身稳定，i l 一3 则能刺激各类血 细胞的增殖p 卅。 ( 7 ) 抗氧化作用 大豆异黄酮具有较强的抗氧化作用，可以使血液和组织中的抗靴酶活性增强、脂质过 氧化物水平。b 降4 0 l 。大豆异黄酮的抗氧化特性首先是通过清除活性氧自由基预防脂质过氧 化的产生和阻断脂质过氧化的链式反应米发挥其作用的1 4 1 】。自由基性质活泼，及易于与其他 物质发生反应而形成新的自由基，而且其反应往往是链式反应。自由基的这种强氧化作用使 其所参与的反应直接或间接地对机体造成危害。研究表明，大豆异黄酮能抑制脂质的过氧化， 其含有的7 、4 两个酚羟基作为供氧体能与自由基反应，使之生成相应的离子或分子，可抑制 自由基的产生。清除、熄灭自由基，终止了自由基的连锁反应【4 2 l 。 1 3 大豆异黄酮的提取及分离纯化 1 3 1 大豆异黄酮的提取 大豆异黄酮是大豆生长过程中的一类次生代谢产物，至今已发现主要由1 2 种化合物组成 即9 种葡萄糖甙和3 种相应的配糖体。异黄酮在大豆中的含量根据品种、栽培地等的不同差异 较大，但总的来说较低，为o 1 - 0 5 ，这使得大豆异黄酮的提取、分离相当困难。大豆异黄酮 的提取，目前多从种子中直接提取m l ，也有从大豆胚芽和脱脂豆粕中提取。提取大豆异黄酮 的方法很多，主要是根据被提取物的性质及伴存的杂质来选择合适的方法，如溶剂萃取法和 碱提取酸沉淀法等郴1 。溶荆萃取法是目前最常用的提取大豆异黄酮的方法，该法的优点 是提取率高且产品不易变l 生。所选用的有机溶剂有乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇等。刘大川 通过渤0 对比实验确定含水甲醇为浸提大豆异黄酮的最佳溶剂其提取流程为大豆粕一浸泡 提取一提取液( 弃豆渣) 一萃取液浓缩一树脂分离一洗脱一浓缩一干麒明。碱提取酸沉淀法 是用碱性水域碱性稀醇将原料中的大豆异黄酮浸出，然后浸出液经酸化后析出人豆异黄酮。 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 该方法浸出效果好，但浸山杂质多，不利于后续的提纯，且碱l 生浓度旦过高，会破坏大豆 异黄酮的结构。因此该法使用的不普遍。我国学者姜浩魁发明的提取大豆异黄酮的方法已申 报国家发明专利，其提取t 艺流程概括如图1 - 3 。 1 i3 2 大豆异黄酮的分离纯化 大豆异黄酮的分离纯化包括大豆异黄酮与大豆其它复杂成分的分离和其单体闯的分离。 分离纯化的方法有溶剂萃取法、铅盐处理法、大孔埘脂法、柱色谱分离法、超滤法、超临界 c 0 2 萃取法和结晶法等h s l 4 a l 。汪氏对几种分离纯化的方法进行了比较，发现采用有机黼0 萃 取法分离大豆异黄酮，具有简便易行，成本较低。一次性处理样品大等优点，但产品纯度较 低。柱层析法是分离大豆异黄酮的一种有效技术，该法具有操作简便，回收率高，产品纯度 高等优点，但一次性处理量较小，成本相对较高。常用的吸附剂有硅胶、硅藻土、氧化铝、 聚酰胺和大孔树脂等，其中利用聚酰胺拄进行分离纯化，以乙酸乙酯甲醇为洗脱剂梯度洗脱 效果好：采用大孔树脂吸附技术，以5 0 左右浓度的乙醇作为洗脱剂分离效果好。除e 述分 离技术外，最近也有人利用高速逆流色谱法( h s a 3 c ) 来分离不同组分的大豆异黄酮。如d u 等利用h s c o c 法使用两种分离柱( 2 6 0 m l 的小柱和1 2 0 0 m l 的大枉) ，在乙烷乙酸乙酯丁 醇甲醇乙醇一水( 1 ：2 ：1 ：1 5 ：1 ) 的溶剂系统下分离大豆异黄酮。其中小柱溶剂的流速为 2 m l m i n ，火柱为5 m h m i n ，转速均为7 0 0 i p m 。结果小柱可从5 0 0 r a g 粗样品中得到3 3 r a g d a i d z e l n , 4 l i n gg e n i s t i n ，2 7 r n g6 ，旬一m a l o n y l d a i d z e i n ，和2 4 n l g6 - o - m a l o n y l g e n i s t i n ：人柱可从 3 9 粗样品中得到2 0 3 r a gd a i d z e i n ，2 4 1 m gg e n i s t i n ，1 5 8 r a gf f - o - m a k m y l d a l d z m 和1 3 5 m g 6 - o - m a l o n y l g e n i s t i n ，其中全部组分的纯度都超过了9 0 【4 9 】。y a n g 等采用h ! ；c 。c 法使用了 三种溶剂系统( 氯仿甲醇水；氯仿甲醇正丁醇冰；甲基间丁酪四氯氟南一0 5 三氯乙酸) ， 从粗大豆粉中提取出7 种不同极性的异黄酮组分( d a i d z e i n 、d a i d z i n 、f f - o - a c e t y d a i d z i n 、 g e n i s t i n 、6 - o - a o e t y g e n i s t i n 、g l y c i t e i na n dg l y c i t i n ) ，每种组分的纯度为9 8 , - 9 9 。由于大 豆异黄酮的组分复杂，往往采用种方法不能获得理想的分离效果因此目前一般将几种方 法联崩以取长补短。 1 4 本研究的意义 我国大豆资源丰富，但过去8 0 以上的大豆都作为油料加以使用，提油后的豆粕主要用 。瑚巴牟4 和饲料。如果能将百粕作为提取大豆异黄酮的原料，这不仅能变废为宝、使生物资源 1 4 大豆异黄酮抑曲活性的研究成抑菌机制的初步探讨 得到再生、保护环境、而且还能增加大豆附加值( 目前高纯度的大豆异黄酮每毫克售价达1 3 9 美元) ，提高其经济效益，可谓一举两得。但由于人豆中所含的异黄酮含量极少，仅为 0 1 n 5 俐，因此研究大豆异黄酮的提取和分离纯化有重要的应用价值。i ；t 前，国内外关于 人豆异黄酮的提取方法的研究很多，概括起来主要有水提法、有机溶剂萃取法，碱提取酸沉 淀法等，但由_ r 所用提取的原料不同，因此提取方法各有差异，其中溶剂萃取法使j _ | | 的最为 厂泛。已报道的溶剂萃取法所采用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。本文以脱脂豆 粕为原料，通过比较研究不同溶荆对人豆异黄酮提取率的影响，确定实验室提取大豆异黄酮 的最佳溶剂和最佳提取条件。随着现代科学的发展，超声波技术以其工艺简单、无需加热、 提取快速、提取率高等特点，在动、植物材料有效成分的提取中正发挥着越来越重要的作用。 它是通过超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应和搅拌作用，加速植物材料 中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率。缩短提取时间 5 1 - 1 。本文考查了超声波 ( 频率为2 0 k h z ) 对大豆异黄酮提取率的影响，并与溶剂萃取法进行比较，旨在获得提取大 豆异黄酮的工艺条件。 此外由于食品中含有丰富的营养物质，因此在加工、运输和贮藏过程中易被微生物污 染而造成食品腐败变质，为延缓和阻l t 微生物的作用在食品中加入防腐剂是采用的主要措 施之一。目前世界各国公开使用的食品防腐剂已超过5 0 种，经常使用的有十几种，一般分为 三大类：一是天然提取物，是从植物和动物中分离、制备的天然物质；二是化学合成物，是 目前食品防腐剂中用量最大的；三是用发酵法制取的生物防腐剂。由于有些化学防腐剂具有 致癌或潜在致癌的可能性，有些可能会引起积累性中毒现象，因此，世界各国开始, g k i h 物、 植物和微生物中寻找天然存在的高效、安全、低毒的天然食品防腐剂。大豆异黄酮具有多种 生理功能，除已被大量实验所证实的抗舯瘤作用、对血管的防护作用、类似女性雌激素作用 和抗激素作用和抗氧化作用外，还有报道大豆异黄酮具有抑菌活陛，但关丁大豆异黄酮抑菌 作用的实验研究，至今在国内外尚未见到相关文献。本文对大豆异黄酮的抑菌作j ； ；i 和抑菌活 性的成分进行了研究，井对其抑菌机制进行了初步探讨，旨在为将其开发成天然食品添加剂 提供理论依据。 1 5 人豆异黄酮抑菌活性的研究及抑苗机制的初步探讨 全脂人豆粉 山 正己烷脱脂 山7 5 0 c8 h 脱脂大豆粉 山 7 0 酒精+ o 3 乙酸混合提取液 山 过滤室温2 h 滤渣 山6 5 减压浓缩至一定体积 山 第一步水解( 踟水浴1 5 h ) 山 冷却 、l 5 _ 1 叫曲流速 聚酰胺层析柱( m 3 0 x 5 0 c m ) 山7 0 酒精洗脱 收集洗脱液 山 第二步水解( 加硫酸8 0 c 水浴酸解2 0 h ) 山 1 0 n a o h 中和 山 减压浓缩( 6 5 ) 山 丙酮纯化 山 结晶 山 异黄酮甙元 图1 3 火豆异黄酮的提取1 艺 f i g 1 - 3e x t l a c f i o no f s o y b e a ni s o f l a v o n e 1 6 大豆异黄酮抑菌活性的研究技抑菌机制的初步探讨 第二章大豆异黄酮的提取 2 1 实验材料与方法 2 1 1 妥验特许 2 1 11 药1 】i i 与试剂 脱脂豆粕：由大连调味品厂提供 染料木素、染料木甙、犬豆素和人豆甙标准品：购白美国s i 蛐a 公司，含量为9 9 9 9 9 2 1 1 2 主要仪器 p e r k i n - e l m e rl a m l x i a1 7u v m ss p e c t r o p h o t o m e t e r ：日本岛津 恒温水浴箱：江苏省金坛市医疗仪器厂 7 2 2 光栅分光光度计；中国厦l j 仪器分析厂 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 大豆异黄酮标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的g e n i s t e i n 标准品l m g ，以9 5 z , 醇溶解，定容至1 0 m l ，精密吸 取0 1 、0 3 、0 5 、0 7 、0 9 m l 标准品溶液分别置于1 0 m l 容量瓶中，并各加9 5 7 , 醇1 0 m l ， 再加蒸馏水稀释到刻度，摇匀。以l m l 9 5 z , 醇加水到l o m l 作空白对照，测定2 6 0 h m 下的 吸光值，以g e n i s t e i n 的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线见图2 - 1 。 y = 0 1 3 4 8 x 一0 1 0 3 2 o24681 0 染科木素浓度( ug b l ) 图2 - 1 染料j 小素标准品的标准曲线谴：叉士s p 门：弓 f 遮2 - ls t a n d a r dc u l w co f s t a n d a r dg e n i s t e i n 1 7 单装餐 大豆异黄酮抑镯活性的研究及抑菌机制的初步探讨 21 2 2 人豆异黄酮的测定方法 精密吸取0 5 m l 样液，加9 5 乙醇1 o r a l ，再如蒸馏水稀释至1 0 m l ，摇匀。以l m l 9 5 乙醇加水到l o m l 作空白对j 【，在2 6 0 n r a 处测得光密度，根据标准曲线的同! j = _ 1 方程，计算山 人豆异黄酮的提取率。 大豆异黄酮提取率( ) = 提取液中大豆异黄酮总量 所用脱脂豆粕量 2 1 2 3 蛋白质含量的测定：f o l l i n - 酚法测定提取液中罔蛋白的含量 标准曲线制作：分别配制0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 h g m l 牛血清白蛋白标准溶液。 取标准溶液i m l 试剂加入5 m l f o l i n 酚试剂甲，混均，室温下反应1 0 m i n 后加入0 5 m l f o l i n 一 酚试剂乙，立h 口混均，在3 0 。c 水浴中反应3 0 m i n ，然后在5 0 0 h m 下测定其吸光值。以蛋白 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线见图2 - 2 。 黑 0 5 辩 鬈 0 0 0 ，1 0 20 30 40 5 o 6 蛋白浓度( m g m l ) 图2 - 2 蛋白质浓度测定标准曲线；星j 耳士s p 九；多 f 嘻2 - 2s t a n d a r dc u r v eo f p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n 1 8 人豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 提取液蛋白浓度的测定：将被测溶液稀释适当倍数后，取l m l 加入5 m lf o l i i i - 酚试剂 甲，混均，室温下| 反应1 0 m i n 后加入0 5 m lf o l i n - 酿 n 乙，立即混均，在3 0 。c 水浴中反 应3 0 m i n ，测定5 0 0 r i m 吸光值，对照标准曲线，确定样鼎中的蛋白浓度。 蛋向提取率( ) = 提取液中蛋白总量 1 0 0 所用脱脂豆粕量 2 1 2 4 单因素实验 分别考查乙醇浓度、浸提温度，浸提时间，物料比，溶剂p h 值，浸提次数对大豆异黄 酮提取率的影响。 2 1 2 5 正交实验 在单因素实验基础上，采用b 正交表进行正交实验 2 1 2 6 超声提取大豆异黄酮 称取8 份5 9 脱脂豆粕a 出复过2 0 目筛) ，加入6 0 # j z - 醇溶液9 0 m l ，分别用2 0 k h z 的 超声波提取5 、1 0 、1 5 、加、2 5 、3 0 、3 5 和4 0 分钟，定容后测定大豆异黄酮的含量。 2 2 结果与讨论 由于大豆中所含的异黄酮含量极少，仅为0 1 - 0 5 ，因此从脱脂豆粕中提取火豆异黄酮 的关键，是尽可能提高大豆异黄酮的提取率，减少蛋白和糖等杂质的溶出。本文通过研究有 机溶剂的提取条件和超声波对大豆异黄酮的提取率的影响，得到了实验室提取大豆异黄酮的 工艺条件，为今后的工业化生产提供可靠的实验数据和经验。 2 2 1 不同有机溶利对大豆异黄酮提取率的影响 不同有机溶剂浸提脱脂豆粕后测定的大豆异黄酮提取率的实验结果见表2 - 1 。由表可知， 选_ q 不同的有机溶剂漫提脱脂豆粕，大豆异黄酮的提取率差别很大。其中利用甲醇和乙醇作 为提取溶剂，人豆异黄酮的提取率明显高于丙酮和乙酸乙酯，但从安全、环保等因素考虑， 我“j 选_ i = j 乙醇作为提取人豆异黄酮的溶剂。 1 9 大豆异黄酮抑菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 表2 - 1 不同有机溶剂对大豆异黄酮提取率的影响 t a b l e 2 - 1 e f f e c t o f d i f f e r e n t o r g a n i cs o l v e n l s o n t h e e x t r a c t i o n 2 2 2 乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响 乙醇浓度对人豆异黄酮提取率的影响结果见图2 - 3 。由于蛋白的含量高低影响大豆异黄 酮以后的提纯效果，所以选择的标准应以大豆异黄酮的提取率高而蛋白含量低为指标。由图 可知，最佳的乙醇浓度为6 0 。 嚣0 6 菥0 5 藏 n j 3 04 05 06 07 0 乙醇浓度( ) 巧一 器 幅鬟 1 0 舞 5 图2 - 3 乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响；蠡叉士弓pn ：弓 f i 9 2 - 3 e f f e c t o f d i f f e r e n t e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s o n t h e e x t r a c t i o n r a t e 1 人豆异黄酮：一，蛋自 盔里墨塑墅塑堕堑丝竺翌塞丝塑堕塑型塑塑生堡塑一 2 2 3 温度对大豆异黄酮提取率的影响 温度对人豆异黄酮提取率的影响结果见图2 4 。 0 6 墓0 5 譬0 4 鞘0 , 3 露o 2 篙0 1 二 o 4 0 5 06 07 0 8 0 温度( c ) 2 5 2 0 嚣 _ i i | l 1 5 甾 嗽 皿 1 0 觚 5 图2 _ 4 温度对大豆异黄酮提取率的影响谚：文尘s p n 4 弓 f i g 2 - 4 e f f e c t o f d i f f e r e n t t e m p e r a t u r t s o n t h e e x t r a c t i o n r a t e 一大豆异黄酮；蛋自 由图可知，随着温度的升高，大豆异黄酮的提取率和蛋白的溶出量也随之增大a 当温度 升高到8 0 时，大豆异黄酮的提取率增加不明显，但蛋白的含量增加的却非常明显，综合考 虑，选择7 0 c 作为最佳提取温度a 2 2 4 物料比对大豆异黄酮提取率的影响 物料比对大豆异黄酮提取率的影响结果见图2 - 5 。 一0 6 叠o 5 盛0 4 篷0 3 嫠0 2 l d0 1 k 0 物料比 2 0 1 5 叠 盛 1 0 蛊 嘲 5 图2 5 物料比对火豆异黄酮提取率的影响疬汉士5 p 几：多 f i 9 2 - 5 e f f e c t o f d i f f e r e n t r a t i o o f e t h a n o l a n d r a w m a t e r i a l o n t h e e x t r a c t i o n 犬豆异黄酮；+ 蛋白 2 1 太显异黄酮抻菌活性的研究及抑菌机制的初步探讨 结果显示，当物料比较小时，随着镕蕲0 用量的增加，大豆异黄酮的提取率增加，但当物 料比大于1 ：1 8 后，大豆异黄酮提取率增加不明显，故选择物料比为1 ：1 8 。 2 2 5 提取时间对大豆异黄酮提取率的影响 提取时间对大豆异黄酮提取率的影响结果见图2 - 6 。由图可知，随着提取时间的增加大 豆异黄酮的提取率也增加徊超过2 h ，人豆异黄酮的提取率开始降低，但蛋白的含量却在增加。 网此提取时间不易超过2 l i 。 1 1 522 53 提取时间( h ) 2 5 2 0 善 丽 1 5 群 辎 也 1 0 嘲 5 图2 - 6 提取时间对大豆异黄酮提取率的影响疰：又士5 pn 哆 f j 醇6 e f f e c t o f d i f f e r e n t e x t r a a i o n t i m e t h e e x t r a o n 一大豆异黄酮- _ 蛋白 2 2 6 提取次数对大豆异黄酮提取率的影响 提取次数对大豆异黄酮提取率的影响结果见图2 - 7 。结果显示，随着提取次数的增加， 犬豆异黄酮的提取率逐渐增加，但提取2 次后大豆异黄酮提取率增加的不明显，从节约能源考 虑，选择提取次数为2 次。 (一恃蚤鞘暇椒球旧k 一 查星墨堕塑塑望塑丝塑竺塞墨塑堕塑型竺塑生塑塑 一0 6 嚣0 s 誊o _ 谴0 3 蓑0 2 旦o 1 0 提取次数 4 2 0 1 5 叠 群 1 0 岩 嘲 5 图2 - 7 提取次数对大豆异黄酮得率的影响蒹j 叉士5 pn = 多 f i 9 2 - 7e f f e c to f d i f f e r e n te x t r a c t i o nt i m e so nt h