（细胞生物学专业论文）小鼠卵巢snon表达水平与卵泡发育的相关性研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 小鼠卵巢s n o n 表达水平与卵泡发育的相关性研究 中文摘要 s k i s n o n 属于s k i 原癌基因超家族，它们在细胞中的高表达可以引发细胞癌变和肌 肉末端分化。s k i s n o n 是转化生长因子1 3 超家族介导的信号通路中的重要调节因子，它 们以同源或异源二聚体的形式发挥作用，其中异源二聚体的活性更高。研究发现，s k i 在大鼠的闭锁卵泡中表达。目前对s n o n 的研究仅仅是在原癌转化和细胞增殖等方面， 而其在卵巢中的功能还不为人知。因此，本实验的目的是研究s n o n 在不同发育时期卵 巢中的表达情况，以此来推断其在卵泡发育及黄体化过程中的生物学功能。我们以新生 小鼠和促性腺激素处理的未成熟小鼠为研究对象，观察s n o n 在卵泡发育、闭锁及黄体 化过程中的表达情况，进而推断s n o n 在卵巢中的功能。另外，本文还对s k i 在小鼠卵 巢中的表达做了初步研究。 实验结果显示：在卵泡发育的早期阶段( 如原始卵泡装配、原始卵泡向初级卵泡发 育) ，s n o n 在整个卵巢中均呈现阴性。s n o n 的表达最早出现在出生后7 天小鼠卵巢的 间质细胞中。随着卵巢的发育，s n o n 在间质细胞中的表达量逐渐上升。膜细胞从间质细 胞中分化出来后，膜细胞中也呈现阳性表达，但是颗粒细胞中始终没有s n o n 的表达。3 周龄的小鼠卵巢中开始出现小、中型有腔卵泡，这类卵泡的膜细胞开始分化为内外两层， s n o n 只在外膜细胞中表达，在内膜细胞中没有表达。另外，卵巢的上皮细胞中也呈现 s n o n 的强阳性。 在促性腺激素引起的卵泡发育过程中，卵巢中膜细胞和间质细胞中呈现强的阳性表 达，而在颗粒细胞中呈现阴性。在间质细胞中，s n o n 呈现持续表达，不受卵泡发育阶段 的影响。s n o n 在膜细胞中的表达不是均一的。在小卵泡中，s n o n 只是在外膜细胞中表 达，而在内膜细胞中没有，随着卵泡的发育，在大的有腔卵泡中，内外膜细胞中都呈现 出阳性。在整个发育过程中，健康卵泡的颗粒细胞中始终没有s n o n 的表达。在黄体形 成过程中，s n o n 的表达量呈明显上升。一般来讲，小鼠注射h c g 后1 0 小时发生排卵。 h c g 处理1 2 小时后，即排卵之后不久，s n o n 在黄体化的颗粒细胞中有表达，但是比较 微弱，h c g 处理4 8 小时后，黄体中s n o n 的表达呈现高的水平。t u n e l 染色和免疫组 织化学染色结果显示，当卵泡发生闭锁时s n o n 在其颗粒细胞中呈现强阳性。 关键词：s n o n ；转化生长因子1 3 超家族；卵泡发育；闭锁卵泡；黄体化 中图分类号：q 2 8 山东师范大学硕士学位论文 r e l a t i o n s h i pb e t w e e ns n o ne x p r e s s i o na n d m o u s ef o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t a b s t r a c t s l d s n o nb e l o n gt ot h es k if a m i l yo fp r o t o - o n c e p r o t e i n s t h e yc a l li n d u c eb o t ho n c o g e n i c t r a n s f o r m a t i o na n dt e r m i n a lm u s c l ed i f f e r e n t i a t i o nw h e ne x p r e s s e da th i g hl e v e l s s k i s n o n a r ei m p o r t a n tr e g u l a t o r so fs i g n a lt r a n s d u c t i o no f t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t as u p e r f a m i l y s k ia n ds n o na r et r a n s c r i p t i o nf a c t o r st h a tf o r mb o t hh o m o d i m e r sa n dh e t e r o d i m e r s ，a n dt h e l a t t e ri sm o r ea c t i v e s k ih a sb e e nd e m o n s t r a t e dt oe x p r e s si nt h eg r a n u l o s ac e l l so fa t r e t i c f o l l i c l e s a l t h o u g hs n o np r o m o t e so n c o g e n i ct r a n s f o r m a t i o na n dc e l lp r o l i f e r a t i o n ，n o t h i n gi s k n o w na b o u ti t sr o l ei no v a r i a nf u n c t i o n s ot h ep u r p o s eo ft h ep r e s e n ts t u d yi st ol o c a t et h e s n o np r o t e i ni nt h eo v a r i e sa n dt of u r t h e re l u c i d a t ei t sb i o l o g i c a lr o l ei nt h er e g u l a t i o no f f o l l i c u l o g e n e s i sa n dl u t e i n i g e n e s i s w ea s s e s s e df o rt h ef i r s tt i m et h ee x p r e s s i o na n d f u n c t i o n o fs n o ni nm o u s eo v a r y , e x a m i n e dt h ec e l l - s p e c i f i cl o c a l i z a t i o na n dr e g u l a t i o no fs n o n p r o t e i nl e v e l sd u r i n gp o s t n a t a l o v a r i a nd e v e l o p m e n t ，a sw e l la s g o n a d o t r o p i n - i n d u c e d f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ，o v u l a t i o n ，a t r e s i aa n dl u t e i n i z a t i o ni ni m m a t u r em i c e i na d d i t i o n ，w e e x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no fs k ii nt h eo v a r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ed a t ai n d i c a t e dt h a td u r i n gt h ee a r l ys t a g e so ff o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t ，s u c ha sf o l l i c l ea s s e m b l y , p r i m a r yf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n tf r o mp r i m o r d i a l f o l l i c l e s ，s n o ni m m u n o r e a c t i v i t yw a sn o td e t e c t e di nt h ew h o l eo v a r y p o s i t i v es t a i n i n gf o r s n o nw a sd e t e c t e df o rt h ef i r s tt i m ei nt h ei n t e r s t i t i a lc o m p a r t m e n ta d j a c e n tt ot h ef o l l i c l e sa t 7d a y sa n dt h ep a t t e mo fi m m u n o s t a i n i n gr e m a i n e dc o n s t a n t a t3w e e k so fa g ef o l l i c l e sr e a c h t h es m a l la n dm e d i u ma n t r a ls t a g e s a tt h e s es t a g e s ，t h e c ac e l l sd i f f e r e n t i a t ei n t ot w ol a y e r s ， t h e c ae x t e r n aa n dt h e c ai n t e m a s n o nw a sd e t e c t e di nt h e c ae x t e r n al a y e r , b u tw a sn o td e t e c t e d i nt h e c ai n t e r n a b e s i d e s ，o v a r i a ns u r f a c ee p i t h e l i a lc e l l ss h o w e dac l e a ri m m u n o r e a c t i v i t yf o r s n o n d u r i n gg o n a d o t r o p i n i n d u c e df o l l i c u l a rg r o w t h ，e x t e n s i v ei m m u n o r e a c t i v i t yw a sa p p a r e n ti n t h e c aa n ds t r o m a lc o m p a r t m e n t sb u tn o tg r a n u l o s ac e l l s i nt h ei n t e r s t i t i a lc o m p a r t m e n t ，t h e p a t t e r no fi m m u n o s t a i n i n gf o rs n o nr e m a i n e dc o n s t a n ta n dw a sn o ta f f e c t e db yt h es t a g eo f i i i 山东师范大学硕士学位论文 f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t w i t h i nt h et h e c al a y e r ss n o ns t a i n i n gw a sh e t e r o g e n e o u s i nt h es m a l l f o l l i c l e s ，s n o nw a so n l yd e t e c t e di nt h et h e c ae x t e m al a y e r , a n dw a sn o td e t e c t e di nt h et h e c a i n t e r n a w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h ef o l l i c l e s ，t h ep o s i t i v es t a i n i n gw a sd e t e c t e di nb o t ht h e c a e x t e m aa n dt h e c ai n t e m ao ft h el a r g ea n t r a if o l l i c l e s d u r i n gt h ef o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ， g r a n u l o s ac e l l sd i dn o tc o n t a i nd e t e c t a b l el e v e l so fs n o ni nt h eh e a l t h yf o l l i c l e s d u r i n g g o n a d o t r o p i n i n d u c e do v u l a t i o na n dl u t e i n i z a t i o n ，an o t a b l ei n c r e a s ei ns t a i n i n gi n t e n s i t yw a s o b s e r v e di nn e w l yf o r m e dc l g e n e r a l l y , 10 ha f t e rh c g i n j e c t i o n ，f o l l i c l e sb e g i no v u l a t i n g ， a n ds u b s e q u e n t l yc lf o r m a t i o ns t a r t s t h ed a t ai n d i c a t e dt h a t12ha f t e rh c g i n j e c t i o n ，s n o n w a se x p r e s s e di nt h el u t e i n i z i n gg r a n u l o s ac e l l sb u ta tl o wl e v e l s ，i nc o n t r a s t ，4 8ha f t e rh c g c le x h i b i t e dh i g hl e v e l so fs n o ns t a i n i n g s n o nw a ss t i l ln o td e t e c t e di ng r a n u l o s ac e i l so f d e v e l o p i n g f o l l i c l e sa tt h es a m et i m ep o i n t s s n o ni m m u n o r e a c t i v i t yi na t r e t i cf o l l i c l e s ： a t r e s i ao c c u r r e di nf o l l i c l e sd u r i n ga l ls t a g e so fd e v e l o p m e n tu pt ot h el a r g ea n t r a ls t a g e w e t h e nd e t e r m i n e dt h er e l a t i o nb e t w e e ns n o np r o t e i ne x p r e s s i o na n df o l l i c l es t a t ei nt h e i m m a t u r em i c e t h ep r e s e n c eo fa t r e t i cf o l l i c l e sw a sa s s e s s e db yt u n e l t h er e s u l t ss h o w e d w h e na t r e s i aw a si n i t i a t e di naf o l l i c l e ，as t r o n gs n o ns t a i n i n gw a sd e t e c t e di nt h eg r a n u l o s a l a y e r s k e yw o r d s ：s n o n ；t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ；o v a r y ；f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ；a t r e t i c f o l l i c l e ；l u t e i n i z a t i o n c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：q 2 8 i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本 栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：徐z 五 导师签字： 学位论文版权使用授权书 聊闲 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：徐2 之 导师签字： 签字日期：2 0 0 ，年6 月7 日 签字嗍2 。7 日 山东师范大学硕十学位论文 第一章文献综述弟一早义陬琢迎 1 1 卵泡的发育过程及调节因素 卵泡是卵巢的结构功能单位。卵泡由处于中心的卵母细胞和周围包裹着的颗粒细胞和 膜细胞构成。卵泡的启动、生长、成熟及排卵是一个极其复杂的过程，受到多种影响因素 的调节。这些影响因素大体可以分为两类：1 、促性腺激素和类固醇激素对卵泡的调节是 通过卵泡细胞上的相应受体而实现的；2 、卵泡的发育还依赖于各种生长因子在卵母细胞 和颗粒细胞之间、颗粒细胞和膜细胞之间的信号传递作用。 1 1 1 卵泡发育 卵泡发育是一个以形态变化为特征的动态变化过程，同时伴随着卵泡功能的分化【l 】。 一般根据其形态变化可分为：原始卵泡( p r i m o r d i a lf o l l i c l e ) 、初级卵泡( p r i m a r yf o l l i c l e ) 、 次级卵泡( s e c o n d a r yf o l l i c l e ) 和成熟卵泡( m a t u r ef o l l i c l e ) 四个阶段。每个原始卵泡由一 个卵原细胞和其外包裹着的一层扁平的鳞片样的颗粒细胞构成，卵巢中的卵泡大部分以原 始卵泡的形式存在。原始卵泡处于静止状态，一旦启动生长，便是一个连续不断的发育和 分化过程，要么变成优势卵泡，使卵细胞排放与成熟，要么中途闭锁。原始卵泡启动生长 后，颗粒细胞由鳞片样变成立方柱状，其中的卵细胞开始第一次减数分裂，并停止在第一 次减数分裂前期，成为初级卵母细胞，在初级卵母细胞和一层颗粒细胞之间出现了透明带， 此时原始卵泡发育为初级卵泡。随着颗粒细胞的增生，初级卵泡进一步分化为次级卵泡， 次级卵泡开始向卵巢深层迁移，并且在基膜外形成了膜细胞层，随着颗粒细胞的继续增生， 在卵泡中间形成了空腔，膜细胞层进一步分化为内膜和外膜。卵泡发育的最后阶段为成熟 卵泡，初级卵母细胞完成了第一次减数分裂，释放出第一极体，形成次级卵母细胞，然后 卵泡发生排卵，卵泡剩余部分形成黄体。 1 1 2 多f 9 泡发育过程的主要调节因素 1 1 2 1 促性腺激素 促性腺激素主要指卵泡激活素( f s h ) 和黄体生成素( l h ) ，是垂体分泌的两种直接 调控动物繁殖活动的糖蛋白激素。f s h 和l h 是卵泡发育和分化的调控因子，它们均为生 物大分子物质，不能透过细胞膜，可以与细胞膜上的相应受体结合，通过g 蛋白偶联机制 激活腺苷酸环化酶，使细胞内c a m p 增加或引起钙离子内流，从而对细胞的代谢或功能产 1 山东师范大学硕士学位论文 生影响。f s h 会导致颗粒细胞增生、内膜细胞分化以及颗粒细胞间隙连接增加，从而促进 卵泡的发育和有腔卵泡的形成。当有腔卵泡发育到优势卵泡选择时期，卵泡内的雌激素浓 度增加，同时f s h 诱使颗粒细胞合成l h 受体，卵泡对促性腺激素的敏感性逐渐由f s h 向l h 转移【2 1 。l h 可以促进膜细胞分泌雄激素，从而保证颗粒细胞有充足的底物形成雌激 素。到卵泡排卵阶段，l h 在f s h 的协同作用下促使卵泡破裂排卵【3 】。有资料表明，f s h 对卵泡生长发育的调控远比l h 重要。卵泡期高水平表达l h 可导致卵泡闭锁、受精力降 低【4 】。 1 1 2 2 类固醇激素 卵巢分泌的类固醇激素( 雌激素、雄激素和孕激素) 对卵泡的发育成熟有重要的作用。 卵泡膜细胞在l h 的作用下将胆固醇通过一系列的代谢反应转变成雄激素。之后，雄激素 被转运到颗粒细胞内，颗粒细胞以此为底物产生雌激素。雌激素除了作用于中枢调节促性 腺激素外，在卵巢水平上能直接调节卵泡发育成熟，研究表明，雌激素可协同f s h 促进卵 泡发育。f s h 在雌激素的协同下，促进颗粒细胞增生并诱发卵泡产生l h 受体，从而使卵 泡对l h 的敏感性增加。当在优势卵泡中加入雌激素拮抗剂后，卵泡迅速发生闭锁1 5 一。因 此，雌激素是卵泡发育成熟并排卵不可缺少的调节因素。 孕激素为卵巢所分泌，主要作用于子宫内膜和子宫肌，为受精卵着床做准备并维持妊 娠。另外研究表明，孕激素抑制原始卵泡的装配和启动【刀，在排卵过程中，孕激素对颗粒 细胞的功能、卵泡破裂以及颗粒细胞黄体化起到调节作用，孕激素拮抗剂可以抑制l h 引 发的颗粒细胞黄体化。雄激素是在卵泡膜细胞中合成的，在l h 作用下产生雄烯二酮和睾 酮，并转运到与颗粒细胞中。在卵泡发育早期，雄激素可以促进卵泡生长，在此期间，睾 酮在芳香化酶的作用下生成雌激素，用雄激素处理卵泡后，颗粒细胞增殖，卵泡直径扩大， 卵泡数目和黄体数目相应增加。雄激素不仅可以促进卵泡生长，也可以增强卵泡刺激素调 节的颗粒细胞分化，此外，还有研究表明高水平的雄激素可以抑制卵泡发育，促进卵泡闭 锁。因此，孕激素和雄激素也可以直接调节卵泡生长和发割4 ，8 】。 1 1 2 3 生长因子 生长因子是体内一大类具有特殊的生物活性的小分子多肽，它们的生物学作用广泛， 它参与组织形态学变化的调节，并对细胞分化、迁移及功能性活动具有调节作用。近年来 发现其在卵泡发育过程中也有重要的作用。生长因子属于一个庞大的家族，该家族成员在 基因核苷酸序列、受体结合活性发现具有同源性，其家族成员中在卵泡发育方面比较重要 2 山东师范大学硕士学位论文 的是表皮生长因子家族( e g f ) 、胰岛素样生长因子家族( i g f ) 、转化生长因子家族p ( t g f d ) 和成纤维细胞生长因子家族( b f g f ) 。 ( 一) 表皮生长因子家族 表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 是卵巢局部重要的调节因子，是由5 3 个氨基酸残基构成的多肽【9 】。最早从小鼠颌下腺中分离出，之后在多种组织中检测到。e g f 是通过调节细胞核内基因转录实现其作用的，配体与其受体结合后激活蛋白激酶c 进而影 响其下游因子调控细胞内基因转录。卵巢内的e g f 主要来源于血液循环和卵巢局部合成， e g f 在卵泡的颗粒细胞、膜细胞、卵母细胞和黄体细胞中均有表达。 e g f 可以刺激颗粒细胞的分裂、增生和分化，还可以抑制卵泡的细胞凋亡。c h u n 等【l o 】 对早期窦状细胞的体外培养实验结果显示，颗粒细胞为主要的凋亡细胞，e g f 对细胞凋亡 的抑制率达3 2 。另外e g f 是一种很强的促细胞分裂因子，不但能促进卵母细胞减数分裂， 也间接调节卵母细胞质成剥1 1 】。在正常的生理条件下，卵泡液内e g f 的含量很高，卵母 细胞上存在e g f 的受体，e g f 可以穿过透明带与其受体结合激活酪氨酸激酶，促进卵母 细胞的成熟。研究认为，e g f 能够加速卵丘细胞之间间隙连接的消失、加速卵丘扩张还可 以使卵母细胞中蛋白合成增加，从而促进卵母细胞成剥1 2 】。有研究认为e g f 可以调节甾 类激素的合成，。在体外培养的小鼠卵泡中加入e g f 则雌二醇的分泌量成剂量依赖性降低 【1 3 1 。e g f 还可以通过调节垂体功能来影响卵泡发育，e g f 间接促进垂体细胞f s h 、l h 、 泌乳素合成与分泌，并影响f s h 、l h 受体表达【1 4 ，15 1 。 ( 二) 胰岛素样生长因子 i g f 分为i g f 1 和i g f 2 两种类型，因其结构与胰岛素相似而得名，在局部以自分泌 或旁分泌方式发挥重要的调节作用。人体内多数组织能自身合成i g f ，其生物学功能是通 过与特异性的靶细胞表面受体结合而实现的，能够促进有丝分裂，刺激r n a 和d n a 的合 成从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。 近年来大量研究表明，i g f 1 是参与卵巢完成正常生理功能的重要调节因子之一。在 卵泡的颗粒细胞中，i g f 1 与卵泡刺激素可以促进彼此受体的表达，进而增强二者的生物 学效应【1 6 1 。但是原始卵泡的发育不依赖于促性腺激素，而是受到某些调控因子的作用。 b a c h e l o t 等【1 刀将小鼠i g f 1 基因敲除后发现i g f 1 能引起卵泡在腔前卵泡或有腔卵泡早期 停止发育，且不排卵，此类小鼠也没有青春期。他们推论，i g f 可能在原始卵泡启动的过 程中发挥作用。实验表明，i g f 也在卵泡生长、发育、选择、排卵以及卵泡的闭锁中发挥 重要的调节作用【1 8 】。i g f 1 与其受体结合后可以促进颗粒细胞增殖并维持芳香化酶功能， 3 山东师范大学硕士学位论文 从而刺激雌二酮的分泌，增强卵泡对激素的敏感性并促进卵泡进一步发育。i g f 1 还可以 刺激体外培养的颗粒细胞增生，加强促性腺对卵泡发育的促进作用。r i v e r a 和f o r t u n e 1 9 , 2 0 研究发现，由f s h 诱导的i g f b p - 4 5 的降解，能够引起卵泡内i g f 1 浓度的升高，i g f 1 再协同f s h ，促进雌二醇的分泌，从而对优势卵泡的形成发挥作用。i g f 1 还可以促进卵 母细胞的成熟、受精和受精卵的卵裂。i g f 2 能够明显刺激人颗粒细胞分泌孕激素和雌激 素，在卵泡生长及优势卵泡的成熟过程中起着重要的作用。有研究表明，在闭锁卵泡中 i g f 1 转录水平降低，而i g f b p - 4m r n a 在闭锁卵泡的颗粒细胞中的表达。i g f 1 水平的 降低，使f s h 的芳香化作用减弱，致使卵泡芳香化酶活性降低，雌激素水平下降，从而引 起卵泡对促性腺激素不敏感，使卵泡发生闭锁 4 , 2 1 , 2 2 】。 ( 三) 转化生长因子1 3 在本章第- - d , 节1 3t g f p 信号通路分子在卵泡发育中的作用中有详细论述。 ( 四) 成纤维细胞生长因子 成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 是一类含1 4 6 个氨基酸的 多肽【2 3 】，在卵泡发育过程中起作用，可以促进颗粒细胞的增殖、抑制其分化，还可以促进 卵泡排卵及黄体化。b e r i s h ab 【2 4 】等发现b f g f 家族成员通过刺激血管发生、颗粒细胞增殖 来影响卵泡的发育过程，尤其是对于优势卵泡的终末发育。卵泡发育到排卵阶段，需要引 发酶促反应来使得卵泡发生破裂。b f g f 可以通过刺激排卵时卵泡周围毛细血管网的迅速 生成、促进胶原酶和纤溶酶原激活剂( p l a s m i n o g e n a c t i v a t o ，p a ) 的释放，降解胞外间质蛋 白，进而诱导引起卵泡壁破裂的酶促反应，促进排卵【2 5 1 。另外，在卵泡黄体化过程中，b f g f 可以通过刺激排卵时卵泡周围毛细血管网的迅速生成、使得新生血管进入颗粒细胞层并形 成窦状血管来诱发黄体化，给形成的新黄体提供营养【2 6 1 。 ( 五) 抑制素、激活素和卵泡抑素 抑制素( i n h i b i n ) 、激活素( a c t i v i n ) 和卵泡抑素( f o l l i s t a t i n ) 是一类亲水性的非类固醇 物质，由卵巢分泌可以通过内分泌机制调节垂体卵泡刺激素( f s h ) 的分泌，也可以以旁 分泌和自分泌的方式调节卵泡的发育、闭锁和黄体化过程。其中抑制素和激活素是卵泡颗 粒细胞所产生的，同属于t g f b 超家族，由不同的仅和p 亚单位组成。卵泡抑素则是一种 单链糖蛋白激素。抑制素能抑制垂体细胞合成和分泌f s h ，使血液中的f s h 含量下降，对 颗粒细胞和卵泡膜细胞具有有丝分裂源作用，还可以促进卵泡膜细胞分泌雄激素和抑制颗 粒细胞分泌孕激素。激活素的作用与抑制素相反，能刺激f s h 的分泌，抑制卵泡膜细胞分 泌雄激素。在卵泡发育的初期，激活素的表达量居多，起主要作用。随着卵泡发育成熟， 4 山东师范大学硕士学位论文 激活素的量逐渐降低而抑制素的表达逐级增强。在优势卵泡的选择过程中，抑制素可以刺 激卵泡膜细胞产生雄激素，保证颗粒细胞有充足的底物形成雌激素，从而促进卵泡的发育 和维持卵泡的生长。卵泡抑素是激活素的阻遏蛋白，它和激活素有很高的亲和力，可以与 其结合从而阻断激活素的作用。随着卵泡的发育卵泡抑素的量也逐渐上调，它可能与抑制 素协同抑制激活素的作用，起到促进卵泡发育的作用1 2 7 , 2 8 。 ( 六) 泌乳素 泌乳素是垂体泌乳素细胞所分泌的一种蛋白激素，在哺乳动物中，泌乳素除能作用于 垂体抑制促性腺激素的分泌外，还能直接作用于卵泡颗粒细胞，抑制卵泡刺激素诱导的颗 粒细胞芳香化酶的活性，是雌二醇的合成减少，并抑制排卵【2 9 。1 1 。高水平表达的泌乳素能 直接抑制卵泡的成熟及排卵，并能影响卵子的质量，但是，低水平的泌乳素表达又不能使 颗粒细胞产生孕酮，也不能维持黄体功能，还直接影响卵子发育成熟、卵裂和受精能力， 只有正常水平的泌乳素表达才能维持卵巢的正常功能，促进卵泡的正常发育和卵母细胞的 成熟。因此，泌乳素对卵巢内卵泡生长发育中起着重要调节作用【3 2 1 。 1 2s k i s n o n 蛋白与t g f p 超家族信号通路 1 2 1s l 【i 与s n o n 基因( 蛋白) 简介 s 虹癌基因最早是从禽类s l o a n k e t t e r i n g 逆转录病毒中发现的，这种病毒可以诱导鸡 胚细胞产生致瘤性转化的。随后，人类s k i 基因( c s l 【i ，位于l q 2 2 2 4 染色体) 、同家族 成员c s n o n ( 位于3 q 2 6 染色体) 以及s n o n 的三个不同的亚型( s n o n 2 ，s n o ia n d s n o a ) 也已相继被克隆。目前，s k i 及s n o n 的同源物在小鼠、非洲爪蟾、鸡、斑马鱼等动物中均 有发现。s k i 和s n o n 的过表达均可以引起鸡和鹌鹁的胚胎纤维原细胞的形态转化和锚着 独立性生长以及鹌鹑胚胎细胞的末端肌肉分化，但是与s k i 相比，s n o n 需要更高的表达量。 人类c s k i 和c s n o n 是分别由7 2 8 个和6 8 4 个氨基酸组成的核蛋白，n 端均含有一段由2 7 0 个氨基酸残基组成的保守序列，在c s k i 、c s n o n 及v s k i 间均高度保守，与其促细胞转化 和分化的功能有关；而c 端在其家族各成员间的同源性较低，但都含有一个极端保守区： 不完全的串联重复单位( t a n d e mr e p e r t s ，t r ) 及一个a 螺旋的亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ， l z ) ，可以介导形成同源或异源二聚体。s k i 蛋白在胚胎发育、肌分化、造血细胞形成及 肿瘤发生等多方面均有重要作用3 5 , 3 6 。 1 2 2s 恼与s n o n 的功能及其作用机制 5 山东师范大学硕士学位论文 最近研究发现，s k i 与s n o n 本身没有内在的催化活性，必须通过与其它细胞成分的相 互作用来发挥其功能。s k i 与s n o n 可以通过与s m a d 蛋白的结合从而抑制转化生长因子p ( t g f b ) 信号通路和骨形态发生蛋白( b m p s ) 信号通路。 1 2 2 1t g f p 信号通路及其细胞内的介导者s m a d s 蛋白 t g f d 超家族由一大类具有共同生物学特性的信号分子组成，约有4 0 种蛋白或蛋白类 似物，其生物学功能涉及的范围很广，如：细胞增殖、分化的调节、细胞外基质形成，免 疫抑制作用，粘附分子表达，胚胎发育及器官形成等都有关系。t g f p 可以抑制上皮细胞、 内皮细胞和淋巴样细胞的生长和引发细胞外基质的形成，b m p 则是脊椎动物发育过程中的 关键因子。t g f p 和b m p 信号分子先与细胞膜上的i i 型受体( t p r i i ) 结合，然后募集i 型受体( t p r i ) ，形成二聚体复合物，i 型受体上的丝苏氨酸蛋白激酶可以使与受体结 合的s m a d 2 、3 或1 、5 、8 蛋白复合体磷酸化而激活。激活后的s m a d 蛋白复合体与s m a d 4 结 合形成新的复合体进入细胞核，与核内其它的转录因子结合共同作用，激活其下游基因的 转录。 s m a d 蛋白家族是t g f b 通路细胞内的介导者，根据结构和功能的不同可分为三类：l 、 通路限制性s m a d ( r s m a d ) ，包括s m a d l 、2 、3 、5 、8 ( s m a d 2 、3 介导t g f b 和a c t i v i n 信号通路；s m a d l 、5 、8 介导b m p 信号通路) ；2 、共用性s m a d ( c o s m a d ) ，指的是s m a d 4 3 、抑制性s m a d ( i s m a d ) ，主要指s m a d 6 、7 。s m a d 蛋白( s m a d 6 、7 除外) 含有两个高度 同源的保守序列：在氨基端为m a d 同源结构域l ( m a dh o m o l o g o u sd o m a i nl ，m h l ) ，羧 基端则为m a d 同源结构域2 ( m a dh o m o l o g o u sd o m a i n2 ，m h 2 ) ，两者之间是可变的连接 序列，二者之间是可变的连接序列。s m a d 6 、7 不含有m h l 结构域。s m a d 蛋白m h l 结构域 含有特异的d n a 结合序列，而其m h 2 结构域则介导s m a d 蛋白之间及与调节蛋白之间的相 互作用。 1 2 2 2s k i ，s n o n 与t g f i j l 信号通路的调节 s k i s n o n 是如何在t g f p 信号通路中起作用的，至今还不是很清楚。普遍认为，s k i s n o n 是t g f p 信号通路的抑制因子，它们通过与s m a d 蛋白结合来抑$ 1 t g f d 信号通路的下 游基因的表达，但也有研究表明，s n o n ；i 生t g f p 信号通路中起到正向调节的作用【3 3 】。 s k i s n o n 可直接与s m a d 蛋白的m h 2 结构域结合。h e 等【3 4 】研究发现s k v s n o n 能与 s m a d 2 、3 、4 结合，突变其结合区域能够明显的削弱s k i s n o n 对t g f b 信号的抑制作用。并 且，突变的s k i s n o n 与s m a d 蛋白作用不能诱导鸡胚成纤维细胞的癌变。这说明s k i s n o n 影 6 山东师范大学硕士学位论文 响了c o s m a d 与r s m a d 的结合，从而阻止了s m a d 复合物进入细胞核，抑制其下游信号通路 的作用。另外，研究显示s l ( i 能够通过干扰t g f bi 型受体激活s m a d 2 、3 磷酸化的过程而阻 断t g f p 信号通路。同时证实在t g f p 信号通路未激活的状态下，过量表达的s h 能够诱导 无活性的s m a d 2 - 4 、s m a d 3 - 4 复合物的形成，也起到抑锘t j t g f b 信号通路的作用。s k i s n o n 可以募集转录抑制复合物( n c o r s m a t 、m s i n 3 和h d a c ) 来抑隹j t j t g f d 信号通路下游基 因的转录。组蛋白乙酰化是基因转录前的必要步骤，该复合物中的组蛋白脱乙酰激酶 ( h i s t o n ed e a c e t y l a s e s ，h a d c ) 可以通过使组蛋白去乙酰基化来抑制基因的转录( 图1 1 ) 。 另外研究发现，s k i s n o n 对s m a d 7 启动子的基础活性有负调控的作用【3 ”8 。 t g f p 对s k i s n o n 具有反馈调节的作用。s k i s n o n 均可被激活的t g f d 所降解。t g f p 刺激后，在细胞周围聚集的活化s m a d 3 使s n 0 n 很快降解，使得其下游的靶基因激活，2h 后，s n o n 表达增加，s m a d 3 介导的转录活性结刺”】。有趣的是，s k i 和s n o n 的被降解程度 对t g f d 有剂量依赖性。少量的t g f b 激活即可将s n o n 降解，而s k i 蛋白的降解则需要大量 的t g f d 激活信号通路【4 0 1 。之前有研究显示，s k i s n o n 均可与s m a d 3 结合，使禽类的纤维 母细胞发生转化，但s n o n 需要更高的浓度，这种差异可能是由于两者的代谢稳定性不同所 导致，l i 口s k i 更稳定，不易降解。进一步研究揭示，s n o n 是通过蛋白泛素化而被降解的， 而促分裂后期复合物( a n a p h a s e p r o m o t i n gc o m p l e x ，a p c ) 和s m u r f 2 是s n o n 降解所需的泛 素连接酶。s m a d 2 、3 蛋白可以募集泛素连接酶形成s m a d 3 a p c 、s m a d 2 s m u r f 2 复合物，之 后与s n o n 结合将其降解。除了s m a d 2 s m a d 3 介导的泛素化降解途径外，l e o n g 等 4 1 】发现一 种蛋白因子s k i p ( s k i i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) ，可以拮抗s k i s n o n 对t g f d 信号通路的抑制作 用。s k i p 与s m a d 2 s m a d 3 的m h 2 结构域结合，作为一种转录共激活物，s k i p 可以克服 s k i s n o n 的部分抑制作用，而s k i s n o n 的过表达对s k i p 的转录也有消弱作用。 7 山求师范大学硕士学何论文 n o v m a lc e l l s1 h i l l o rc e l l s 图1 一ls k i s n o n 在t g f d 信号通路中的负调控作用p f i g u r ei - 1n e g a t i v e f e e d b a c kr e g u l a t i o no f t g f bs i g n a l i n g rb y t h es k i s n o n 1 2 2 3s k “s n o n 在肿瘤发生中的作用 s k “s n o n 在肿瘤形成中的作用非常复杂m 。大量研究显示，作为原癌蛋白，s k i s n o n 的过量表达能够使正常细胞产生致瘤性转化，如在黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、胃 蜢和前列腺癌中均已发现s k i s n o n f f q 过表达。但是也有研究报道，s k i s n o n 在某些肿瘤细 胞中扮演抑癌角色。s h i n a g a w a l 4 3 1 等报道，s n o f f j 缺失增加了小鼠肿瘤的发生率，s n o 缺失 纯合体小鼠胚胎期致死，而杂台体小鼠对化学致癌物质的敏感性增强。这说明细胞需耍 s k i s n o n 的量维持在一定的生理水平爿行，过多或过少对细胞均有伤害。 s k i s n o n 在肿瘤发生中作用的复杂性可能与t g f b 在肿瘤发生中的双重作用有关。在 正常细胞中，t g f b s m a d s 可以通过抑制r b 蛋白的活化从而使细胞停止生长而停留在g l 期。 在非转化细胞及刖，瘤发生的早期阶段，t g f b s m a d s 的活化可抑制细胞生长。通过该信号 通路中因子的突变或癌基因的激活或过表达，十扰这个通路的生长抑制作用- 均可导致生 长抑翩反应信号减少，肿瘤快速生长和克隆增殖。而在肿瘤发生的后期，肿瘤细胞雀失了 t g f b 信号通路的抑制作用，进入到恶性化程度更高的阶段后t g f d 的刺激可以引起上皮 8 山东师范大学硕士学位论文 细胞向间质细胞方向转化，致使肿瘤的转移和浸润能力增加。因此，t g f 1 3 信号通路的功 能在肿瘤形成早期起到抑制肿瘤的作