（细胞生物学专业论文）cabl酪氨酸激酶参与基因转录调控的分子机制的研究.pdf

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t e r m i n a ld o m a i n g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n s g r o w t hf a c t o rr e c e p t o rb o u n d p r o t e i n 2 g u a n i n en u c l e o t i d er e l e a s i n gf a c t o r s h i s t o n e a c e t 3 ，l t r a n s f e r a s e h i s t o n ed e a c e t y l a s e i m m u n o b l o t i m m u u o p r e c i p i t a t i o n n u c l e a r e x p o r ts i g n a l n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l r e t i n o b l a s t o m ap r o t e i n r n a p o l y m e r a s e i i p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o nw i t l lr e v e r s et r a n s c r i p t i o n s r ch o m o l o g y s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n5 s i g n a l t r a n s d u c t i o ni n h i b i t o r5 7 1 t b pa s s o c i a t e df a c t o r s 磁b o x b i n d i n gp r o t e i n t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s 3 摘要 真核基因转录的调控是当前细胞分子生物学的前沿研究领域，现有的研究 表明，许多重要生命现象的深层次问题都集结于此。真核基因转录的调控是一个 十分复杂而又协调有序的过程，不仅需要染色体结构的改变，而且还有众多蛋白 质分子的参与。c a b l 非受体酪氨酸激酶就是其中之一。c a b 基因编码1 4 5 k d a 的非受体酪氨酸激酶，它广泛存在于真核细胞中，目前关于c a b l 参与基因转录 调控活动的机制还不很清楚。广泛存在于细胞中的c a b l 对于细胞功能十分重要， c a b l 调控真核基因转录的研究无疑对理解细胞生命活动和疾病发生机理意义重 大。 本文通过瞬时转染、荧光素双报告系统检测、r t p e r 及r e a l t i m ep c r 等实 验结果证实，c a b l 促进内源和外源的c - - l o s 和p 2 1 基因的转录。我们发现c a b l 促 进e - f o s 的基因转录依赖于c a b l 的酪氨酸激酶活性和核定位功能。我们利用过表 达c a b l 和蛋白质免疫沉淀实验发现，在2 9 3 t 细胞中c a b l 和r n a 聚合酶i i ( r n a p i i ) 的大亚基共沉淀，并且过表达c a b l 能够增j j r n a pi i 大亚基的酪氨酸磷酸化 程度。表达r n a pi i 的大亚基c t d 表达质粒，发现c t d 能够抑s j e a b l 促进c - f o s 的 转录活性。染色体免疫沉淀实验结果表明，在体内c a b l 和r n a pi i 能被募集到 c - y o s 启动子的( 一7 4 一+ 1 8 5 ) 区域。总之，c a b l 能够通过磷酸化r n a pi i 促进 c - f o s 基因转录。本文首次报道了c a b l 对r n a pi i 大亚基的磷酸化能够促进o - f o s 基因的转录，并揭示了c t d 的酪氨酸磷酸化在r n a pi i 介导的基因转录中所发挥的 重要作用。 另外，我们利用瞬时转染2 9 3 t 、荧光素酶双报告检测及染色体免疫沉淀等 方法研究了c a b l 是否参与了p 2 1 基因转录调控活动，发现c a b l 能够协同p 5 3 促进p 2 1 基因的转录，这种协同作用还依赖于p 5 3 的完整构象和结构，在细胞内 c a b l 能够被募集到包含p 5 3 结合位点的p 2 1 启动子区域上。我们转染k 5 6 2 细 胞，荧光素酶双报告检测结果表明，c a b l 促进p 2 1 基因的转录可以不依赖于p 5 3 ， 可能通过活化s t a t 5 调控p 2 1 基因转录。本文确认了一种受c a b l 调控的下游靶 基因p 2 1 ，并且探讨了p 5 3 和s t a t s 在参与c a b l 调控p 2 1 基因转录中的重要作 用，为进一步深入研究c a b l 参与基因转录调控活动的机制奠定了基础。 关键词：c a b l ；基因转录调控：o - l o s ；r n a 聚合酶ii ；p 2 1 4 a b s t r a c t t h ec a b l p r o t o o n c o g e n e e n c o d e sa u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e d 1 4 5 k d a n o n - r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ，w h i c h i s p r e d o m i n a n t l y l o c a l i z e dt on u c l e u s t h e f u n c t i o no fc a b li sr e q u i r e df o rt h en o r m a lg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tb e c a u s ec - a b l d e f i c i e n tm i c ee x h i b i t e dt h ep h e n o t y p eo f e m b r y o n i co rn e o n a t a ll e t h a l i t y c - a b lh a s b e e n i m p l i c a t e di naw i d ev a r i e t yo f c e l l u l a rp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gt h er e g u l a t i o no f c e u g r o w t ha n ds u r v i v a l ，o x i d a t i v es t r e s sa n dd n ad a m a g er e s p o n s e s ，a c t i nd y n a m i c s ， s i g n a lt r a n s d u c t i o n , a n dg e n et r a n s c r i p t i o n a l t h o u g hi th a sb e e nk n o w nt h a tc a b l p a r t i c i p a t ei nt h er e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n ，t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so f c a b l r e g u l a t i n gg e n et r a n s c r i p t i o nr e m a i ni nl a r g ee l u s i v e ，a n dt h ek n o w l e d g eo fg e n e t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t e db yc - a n n e e d st ob e e x p a n d e d i nt h i s s t u d y , w es h o w e dt h a tc - a b lp r o m o t e dt h et r a n s c r i p t i o no fc f o sg e n e ， b o t he x o g e n o u s l ya n de n d o g e n o u s l y t h en u c l e a rl o c a l i z a t i o na n dt y r o s i n ek i n a s e a c t i v i t yo fc - a b lw e r er e q u r i e df o rt h ea c t i v a t i o no fc - f o sg e n e c a b lw a sa s s o c i a t e d w i t hr n ap o l y m e r a s e i i ( 州a pi i ) i n v i v oa n d a u g u m e n t e d t h e t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no f t h el a r g e s ts u b t m i to fr n a pi i i na d d i t i o n c a b la n dr n a p1 1 c o u l db er e c r u i t e dt ot h er e g i o no f c - f o sp r o m o t e r e x p r e s s i o no fc t d o ft h el a r g e s t s u b u n i to fr n a pi ii n h i b i t st h ea c t i v a t i o no fc - f o sp r o m o t e rb yc - a b l i th a sb e e n s u g g e s t e d t h a tp h o s p h o r y l a t i o no f t h el a r g e s ts u b u n i to f r n a pi ib yc a b li n v o l v e si n t r a n s c r i p t i o ni n i t i a t i o na sw e l la se l o n g a t i o n o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tc a b lp l a y sa n i m p o r t a n t r o l ei nt h e r e g u l a t i o n o fc - f o s g e n et r a n s c r i p t i o n a n dt h e t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no ft h el a r g e s ts u b u n i to fr n a pi ib yc - a ni si n v o l v e di n t h e r e g u l a t i n gp r o c e s s w ea l s os h o w e dt h a tc - a b l t y r o s i n e k i n a s e e x o g e n o u s l y a c t i v a t e dt h e t r a n s c r i p t i o no fp 2 1p r o m o t e ra n dc o r r e s p o n d i n g l ye n d o g e n o u s l yi n c r e a s e dt h ey i e l d o f p 2 1m r n a c - a b lc a nb er e c r u i t e dt ot h ep 5 3 b i n d i n gr e g i o no fp 2 1p r o m o t e r , p 5 3 i si n v o l v e di nt h ea c t i v a t i o no f p 2 1 p r o m o t e rb yc - a b l b yc o n d u c t i n gd u a l - l u c i f e r a s e a s s a yb yc o t r a n s f e c t i n gk 5 6 2c e l l s ( p 5 3 - d e f i c i e n tc e l l s ) 埘mc a b l ，s t a t 5e x p r e s s i o n p l a s m i d sa n dp 2 1 - l u cr e p o r t ，w es h o w e dt h a tc - a b lm i g h tp r o m o t et h et r a n s c r i p t i o no f p 2 1g e n ev i aa c t i v a t i n gs t a t 5 ，i n d e p e n d e n to np 5 3 r e s u l t sp r e s e n t e di nt h i sp a p e rh a sp r o v e dt h a tc - a n t y r o s i n ek i n a s ei n v o l v e d i n r e g u l a t i n gg e n et r a n s c r i p t i o n a n dt h e s e o r i g i n a l r e s u l t sw i l lb e h e l p f u l f o r 5 u n d e r s t a n d i n g t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fe a b lr e g u l a t i n gg e n e t r a n s c r i p i t i o n p 2 1 k e yw o r d s ：c a b l ；r e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n ；c - f o s ；r n ap o l y m e r a s ei i ； 6 第一部分前言 真核基因转录的调控是当前分子生物学的前沿研究领域，现有的研究表明许 多重要生命现象的深层次问题都集结于此。真核基因转录的调控是一个十分复杂 而又协调有序的过程，不仅需要染色体结构的改变，而且还有众多蛋白分子的参 与。c a b l 非受体酪氨酸激酶就是其中之一，它普遍存在于真核生物的细胞中， 参与细胞周期、d n a 损伤修复、肌动蛋白骨架维持、基因转录等多种重要细胞生 理活动。广泛存在于细胞中的c a b l 对于细胞功能十分重要，c a b l 调控真核基 因转录的研究无疑对理解细胞生命活动和疾病发生机理意义重大。 一染色质结构与基因活化 核小体是真核细胞染色质的基本单位。真核基因组d n a 在细胞核中储存在染 色质结构中。核小体的核心结构是由1 4 6 个碱基对的d n a 盘绕四对核心组蛋白的 八聚体外面近两周所构成。核小体核心组蛋白h 3 h 4 两对异源二聚体是核小体亚 颗粒的核心，它能稳定地与d n a 结合。h 2 a h 2 b 二聚体是核小体核心中较不稳定 的成分。核小体组装是一个干扰d n a 复制、基因表达和细胞周期进展的过程，因 此在细胞生命过程中极为重要。在核小体组装时，需要将四对核心组蛋白有序地 与d n a 结合，重新组成新的、有序的核小体。首先( h 3 h 4 ) 。与形成核小体核心 外的d n a 中段约1 2 0 碱基对相结合，随后两对h 2 a h 2 b 异源二聚体分别在结合了 ( h 3 h 4 ) 。的d n a 上下游结合，形成完整的核小体，并表现出排列周期有序的“串 珠状”核小体结构。确定d n a 序列与核小体的相对位置可以用核小体相位来表 示，其两种方式分别为( 1 ) 核小体旋转定位：d n a 相对于核心组蛋白八聚体表面 的方向性；( 2 ) 核小体翻译定位：核小体在特定基因序列上占据的位置。核小体 在特定的d n a 上定位是决定基因在细胞内能否被活化和转录的关键( p a r a n j a p e e ta 1 1 9 9 4 1p a z i ne ta 1 1 9 9 7 ；沈翊诽1 9 9 7 ) 。 真核细胞的基因及其转录活化需要的顺式作用元件在染色质中的状态对转 录效率也至关重要。尽管核小体的基本结构相同，但基因如果处在3 0 n m 直径以 上的高级结构甚至异染色质中，该基因就不可能转录。除此而外，如果基因和它 的重要转录元件如启动子、增强子等被特定的染色质结构间隔开，一般也不能转 录。9 0 年代中期以来，陆续在果蝇和哺乳动物基因组中发现了多种起间隔作用 的d n a 元件和d n a 蛋白质复合体，如隔离子、染色体特化结构、边界元件以及 核骨架结合区等。这些元件和它们相应结合蛋白所形成的复合体，使真核基因组 中的特定基因实际上处在多种活化程度不同的染色质区域内，它们的转录活性也 因此各不相同( b l a c k w o o de ta 1 1 9 9 8 ) 。此外，b 一珠蛋白基因簇远端上游的座 7 位控制区对0 一珠蛋白基因簇的特异而有序表达具有重要的调控作用，在转基因 动物中l c r ( 1 0 c u sc o n t r o lr e g i o n ) 的作用很可能参与调节染色质活性结构 ( h i g g s 1 9 9 8 ) 。由于上述调控现象的存在，使染色质不同区域出现不同的转录 活性，显示出染色质的位置效应的异质性。由此可见，真核基因的转录不仅需要 我们已经熟知的顺式作用元件和反式作用因子的相互作用，还会受到染色质效应 的影响。这种调控机理不同于基因在体外以裸露d n a 为模板的转录，而是转录前 的染色质结构调整( t s u k i y a m ae ta 1 1 9 9 7 ；w o r k m a ne ta 1 1 9 9 8 ： k a d o n a g a 1 9 9 8 ) 。 1 核小体结构的动态调整 在体内核小体的组装是一个动态过程，核小体有序的周期性结构可因特异转 录因子的加入或去除而改变，出现动态调整过程。染色质结构调整参与基因起始 转录的过程，可以四种状态说明：( 1 ) “串珠状”核小体甚至更高级结构中的基 因处于非活化的基态；( 2 ) 当蛋白质因子通过其d n a 结合结构域结合到染色质上， 局部的染色质转变为去阻遏状态，这一过程不需要a t p 和转录因子的反式活化结 构域的参与；( 3 ) 蛋白质因子结合染色质后，依赖于a i p 的存在介导了染色质结 构的调整，使染色质成为活化状态；( 4 ) 结合于染色质的蛋白反式激活结构域参 与募集启动子结合蛋白和转录起始前复合体，基因开始转录。由此可见，染色质 结合蛋白中的d n a 结合结构域是染色质结构动态调整的关键，而其中的反式活化 结构域主导基因的转录( p a z i ne ta 1 1 9 9 4 ) 。 染色质的核小体结构是基因转录的一种屏障，它封闭了d n a 与转录因子以及 r n a 聚合酶i i 的结合，对基因的转录起抑制作用。因此，进行染色质结构调整， 去除核小体的阻遏作用，促进转录因子与d n a 的结合是基因转录的前提( l u g e re t a 1 1 9 9 7 ；i m b a l z a n oe ta 1 1 9 9 4 ) 。近年来的研究证明染色质结构的调整是由被 称为染色质改构复合物( c h r o m a t i n r e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 的蛋白质来完成的。 己发现至少有两类复合物，一类为组蛋白乙酰转移酶及组蛋白去乙酰转移酶；另 一类为依赖a t p 的染色体改构复合物( a t p d e p e n d e n tc h r o m a n t i n r e m o d e li n g c o m p l e x e s ) ，或称为s w i s n f 复合物( k i n g s t o ne ta 1 1 9 9 9 ；k o r n b e r ge t a 1 1 9 9 9 ) 。该复合物能利用a t p 水解释放的能量改变核小体内d n a 与组蛋白的结 合( c o t ee ta 1 1 9 9 4 ；m a r t e n se ta 1 2 0 0 3 ；b o e g e re ta 1 2 0 0 3 ：r e i n k ee t a 1 2 0 0 2 ：k o b o re ta 1 2 0 0 4 ：k r o g a ne ta 1 2 0 0 3 ： m i z u g u c h ie ta 1 2 0 0 4 ) 。 s w i s n f 复合物含有a t p 酶的活性部位，按其a t p 酶活性部位的特性可分为 三类：s w l 2 s n f 2 、i s w i 和 l i 一2 ( m a r t e n se ta 1 2 0 0 3 ；e i s e ne ta 1 1 9 9 5 ； g o d m a r ke ta 1 2 0 0 0 ；k e n te ta 1 2 0 0 1 ) 。s w l 2 s n f 2 家族包含来源于酵母 的s w i s n f ( y s w i s n f ) 和r s c ，果蝇的b r m ，人类的h b r m 和h b r g l 以及小鼠的 8 m b r g l 等复合物。这些复合物分子量比较大，由“一1 5 个不同的亚基组成，其中 y s w i s n f 是最早发现的依赖a t p 的染色体改构复合物，因此一般以s w i s n f 复 合物代表所有依赖a t p 的染色体改构复合物。从人类细胞中纯化出的与酵母 s w l 2 s n f 2 复合物同源的多亚基复合物的分子量大约是2 m d a ，根据所具有的不同 a t p 酶解旋酶亚基，分别称为h b r g l 和h b r f ，二者有大约8 5 的序列相同。与 此二类蛋白质相关的复合物被称为b a f 复合物( b a f s ) 或b r g l 相关因子 ( b r g l 一a s s o c i a t e df a c t o r s ) ，其中b r g l 是b a f 的核心亚基( w a n ge ta 1 1 9 9 6 ) 。 b a f 复合物含有多种蛋白质，如b a f l 5 5 、b a f l 7 0 、b a f 5 7 、b a f 6 0 ，还具有与d n a 图1 1s w i s n f 复合物改变核小体位置的两种方式( v i g n a l i e t a l 2 0 0 0 ) a s w i s n f 复合物与染色质结合。b a t p 水解释能，改变了组蛋白 一d n a 的结合，进而改变了核小体的结构。c 核小体组蛋白八聚体产生位 置的顺式移动( 右侧) 与反式移动( 左侧) 。 9 结合的区域，c 末端有溴基区域，可结合多种核蛋白。目前的研究表明，b a f 复 合物共有两类，分别称为b a f ( 8 w i s n fa ) 和p b a f ( s w i s n fb ) ( n e e l ye ta 1 2 0 0 2 ) 。s w i s n f 复合物具有改变核小体的高级折叠结构的作用，主要体现在：1 、 改变核小体位置，包括使组蛋白八聚体产生位置的滑动( 顺式移动i n c i s - d i s p l a c e m e n t ，即核小体在同一d n a 分子位置的改变；反式移动i n t r a n s d i s p l a c e m e n t ，即核小体位置改变到不同d n a 分子处) ，同时加强了d n a 结合蛋白与核小体d n a 的结合。这种顺、反式移动取决于s w i s n f 与八聚体的比 率。s w i s n f 能有效地催化顺式移动，甚至在低比率情况下( 1 个s w i s n f ：2 0 0 核小体八聚体) ，而反式移动则要求二者比率很高，s w i s n f ：八聚体达到1 0 倍 之多( s u d a r s a n a me ta 1 2 0 0 0 ；v i g n a l ie ta 1 2 0 0 0 ) 。这种核小体的位置改 变是稳定的，甚至在除去a t p 、s w i s n f 或r s c 复合物的结合后，这种改变依然 存在( c o t ee ta 1 1 9 9 8 ；s c h n it z l e re ta 1 1 9 9 8 ；l o r c he ta 1 1 9 9 8 ：i m b a l z a n o e ta 1 1 9 9 6 ) 。2 、改变核小体结构，包括二聚核小体的形成，干扰组蛋白与d n a 结合；改变核小体d n a 的拓扑性以及移走并交换组蛋白( m i z u g u c h ie ta 1 2 0 0 4 ； f l a u se ta 1 2 0 0 1 ：s t r a h le ta 1 2 0 0 0 ) 。近年来，染色质改构复合物的研究 聚焦于它们对转录调控上，虽然它们也参与复制、修复和重组。s w i s n f 复合物 通过改变染色质结构而暴露启动子序列的结合位点，使转录因子能与特异性启动 子序列结合，促进r n a 聚合酶i i 与启动子的t a t a 结合形成转录起始复合物，从 而激活基因转录( p e t e r s o ne ta 1 2 0 0 0 ；b a z e t t - j o n e se ta 1 1 9 9 9 ；b e c k e t e ta 1 2 0 0 2 ) 。 2 核心组蛋白的可逆乙酰化与基因转录 在多细胞生物体内约有不超过1 5 的染色质处于动态的乙酰化调整过程中， 染色质的转录活性与组蛋白高度乙酰化状态相伴随。组蛋白去乙酰化会导致形成 阻遏性染色质复合物以至全染色体灭活。1 9 6 4 年时就有研究报道了组蛋白的乙 酰化促进r n a 的合成( a l l f r e ye ta 1 1 9 6 4 ) 。直到3 0 多年后才克隆了参与组蛋 白可逆乙酰化的两大类酶，即组蛋白乙酰基转移酶( h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e h a t ) 和组蛋白去乙酰基酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e ，h d a c ) ，它们调节核小体的 结构及其相关基因的转录活性。核小体核心( 主要是h 3 h 4 ) 组蛋白碱性n 端的 多个赖氨酸残基是可逆乙酰化参与调节基因转录的靶位点( d a v i e 1 9 9 8 ；s h i k a m a e ta l _ 1 9 9 7 ) 。 组蛋白乙酰基转移酶对基因转录的影响可能有下列几个方面：1 高等生物体 内最早发现的h a t 包括c b p p 3 0 0 、t a f i l 2 5 0 、p c a f 等能直接酶促核心组蛋白的 乙酰化，导致染色质的伸展甚至核小体局部结构的暂时缺失，为r n a 聚合酶的转 录起始和r n a 链延伸提供了足够顺利进行的空问：2 c b p ( c r e bb i n d i n gp r o t ej n ) 1 0 最初是以能结合c l m p 应答元件结合蛋白( c r e b ) 而发现的并得此名，实质上， c b p p 3 0 0 可与多种转录因子结合( 核受体及其辅助激活和抑制因子、t b p 、t f i i b 、 p c a f 、f o s j u n 、m y o d 、s t a t 、y y l 、e 1 a 、p 5 3 、r b 等) ，成为在细胞核内基因 转录调控因子间的桥梁，使不同渠道的细胞外信号在细胞核内协同或阻遏基因转 录；3 现已发现h a t 的底物不限于组蛋白，许多转录因子也可被b a t 乙酰化而调 节其活性，最为典型的是抑癌基因p 5 3 ，其蛋白c 端被c b p 乙酰化后可加强该蛋 白与其调控元件之间的亲和力，从而影响基因的转录( g oe ta 1 1 9 9 7 ) 。 核受体超家族是一类特异的d n a 结合蛋白，它们以同源或异源二聚体识别并 结合于甾体激素应答元件上，调节靶基因的转录。维甲酸受体和甲状腺素受体等 无配体结合时也存在于核内，此时核受体的单独存在对靶基因起负调控作用：当 相应配体与之结合后诱导基因转录的上调。近两年来陆续发现甾体激素类辅助激 活因子s r c 一1 和a c t r 都具有h a t 活性，成为一类新的h a t 。当已结合配体的核 受体结合在其元件上，就可募集上述具有h a t 活性的辅助激活因子，并可进而再 募集c b p p 3 0 0 等h a t 通过染色质调整激活靶基因。无配体存在时，核受体结合 在h r e 上通过s m r t 或n - c o r 等核受体家族抑制因子募集组蛋白去乙酰基酶h d a c 导致核小体的压缩和转录抑制。其它抑制性复合体如m a d m a x 对e - b o x 、b c l 一6 结合在干扰素激活基因应答元件时也可募集h d a c 并抑制基因转录。 尽管h d a c 一般认为是阻遏染色质活化和基因转录的，有时它们也存在于有 转录活性的染色质结构中，可见h a t 和h d a c 可以共同动态调节活化染色质中核 心组蛋白的乙酰化程度。核受体可能通过抑制因子参与负调节或募集h a t 起正调 控作用，因此它们可以在同一个h s e 上选择性地募集h a t 或h d a c 。近年来发现 核受体、y y l 、s w i s n f 等转录因子都可结合于核骨架( 核基质) 上，提示活性 染色质与核基质瞬间结合的方式可能决定了上述因子只特异地选择b a t 或h d a c 中种酶对染色质结构进行动态调整。 3 d n a 甲基化与染色质中基因转录的阻遏 特定细胞中正在转录或具有潜在转录活性的基因都处在开放的染色质中，此 时由于核小体相位的影响，基因周围出现d n a s ei 的敏感位点，然而染色质结构 的伸展或压缩环境如何建立、维持和调整尚不完全清楚。已知的事实是：“开放” 染色质结构较伸展，其中的核小体核心组蛋白呈高度乙酰化，与其协同的d n a 中 c p g 多为非甲基化状态。成年脊椎动物的基因组中6 0 一9 0 c p g 的胞嘧啶可被d n a 甲基转移酶修饰。甲基化阻遏基因的转录可能通过c p g 胞嘧啶甲基化。直接抑制 基础转录器件或特定转录因子如c r e b 与d n a 的结合：此外，9 0 年代初期b i r d 实验室发现了两种结合于甲基化c p g 的蛋白，命名为m e c p l 和m e c p 2 ( k a s se ta 1 1 9 9 7 ) 。这种能特异识别甲基化c p g 的转录阻遏蛋白为超越d n a 甲基化序列的限 制而产生广泛远端效应提供了线索。m e c p i 结合密集甲基化的c p g 区域，其作用 显而易见；然而m e c p 2 尽管只能结合单个甲基化的c p g ，它的出现却与甲基化在 胚胎发育过程中的作用时相一致。近年来发现m e c p 2 是一个染色质结合蛋白，它 对染色质中甲基化c p g 的亲和力远大于的裸露的甲基化d n a 位点。它有一个甲基 化c p g 结合结构域和一个阻遏予结构域，可参与远端染色质结构的调整。m e c p 2 与单个甲基化c p g 结合后可募集共阻遏蛋白( c o r e p r e s s o r ) ，其中最主要的是 h d a c ，促使染色质结构压缩，同时，在染色质上通过分子问的相互作用m e c p 2 的 效应更加强化，以致远端非甲基化区域染色质结构也被压缩，其它转录因子不能 稳定结合，从而阻遏基因的转录。 二真核生物基因的转录调控 1 顺式作用元件 真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的 i ) n a 序列( m b e r t se ta 1 1 9 9 4 ) 。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件， 包括启动子( p r o m o t e r ) 、增强子( e n h a n c e r ) ；近年又发现起负性调控作用的元件， 沉默子( s il e n c e r ) 。 真核启动子一般包括转录起始点及其上游约1 0 0 - - 2 0 0 b p 序列，包含有若干 具有独立功能的d n a 序列元件，每个元件约长7 3 0 b p 。启动子中的元件可以分 为两种：核心启动子元件( c o r ep r o m o t e re l e m e n t ) 指r n a 聚合酶起始转录所 必需的最小的d n a 序列，包括转录起始点及其上游一2 5 一3 0 b p 处的t a t a 盒。 核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。上游启 动子元件( u p s t r e a mp r o m o t e re l e m e n t ) 包括通常位于- - 7 0 b p 附近的c a a t 盒和 g c 盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能 提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同， 这使得不同的基因表达分别有不同的调控。 蹭强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在s v 4 0 病毒中发 现的长约2 0 0 b p 的一段d n a ，可使旁侧的基因转录提高1 0 0 倍，其后在多种真核 生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占1 0 0 - - 2 0 0 b p 长度，也 和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8 1 2 b p ，可以单拷贝或多拷 贝串连形式存在。 沉默子最早在酵母中发现，以后在t 淋巴细胞的t 抗原受体基因的转录和重 排中被证实了这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中 起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到，沉默子的作用可不受序列方向 的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用( f o xe ta 1 1 9 9 3 ： r iv j e re ta 1 】9 9 2 ) 。 1 2 2 反式作用因子 目前已经分离纯化或鉴定的反式作用因子有几百种，其中主要是各种基因调 控蛋白。以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t f ) 。r n a 聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。r n a 聚合酶i i 是一个多亚 基的蛋白质复合物，共有1 2 个亚基组成，其中有两个亚基的分子量在l o o k d a 以 上( y o u n ge ta 1 i 9 9 i ；c r a m e re ta 1 2 0 0 0 ) 。早在2 0 世纪8 0 年代中，人们就 已经发现在r n a 聚合酶i i 最大亚基的羧基末端有一段特殊的序列，是r n a 聚合 酶i 和r n a 聚合酶i i i 所不具有的，被称之为c t d ( c a r b o x y t e r m i h a ld o m a i n ) 结构( c o r d e ne ta 1 1 9 9 0 ：l e ee ta 1 1 9 9 7 ) 。该结构是由7 个氨基酸( 一t y r l s e r 2 一p r 0 3 一t h r 4 一s e r 5 一p r 0 6 一s e r 7 一) 为重复单位的高度保守的重复序列组成。自这一 结构发现以来，这方面的研究就成了人们关注的焦点和研究的热点。鉴于该结构 的特殊性，尤其是该结构仅仅在r n a 聚合酶i i 中存在的惟一特性。人们希望通过 对它的研究来进一步地认识和了解r n a 聚合酶i i 在基因转录和表达中的功能。 近十年来的研究表明，在m r n a 的加工成熟的过程中，c t d 结构通过与多种相关的 加工因子的结合而直接或间接地影响这些加工反应的进程( p a l a n c a d ee t a 1 ，2 0 0 3 ) 。c t d 重复单位的拷贝数目在不同的物种间具有差异。如在酵母中这 种以7 个氨基酸为重复单位的拷贝数目约为2 6 2 7 个，在果蝇中为4 4 个，而哺乳 动物和人则具有5 2 个这样的重复单位的拷贝。其拷贝数目随生物基因组复杂性 的增加而增加。另一个特点则是能够发生磷酸化和去磷酸化的循环反应( b a h m u s e ta 1 1 9 9 4 ：d a h m u se ta 1 1 9 9 6 ) 。在真核生物细胞内，存在着两种不同的r n a 聚合酶i i 类型，一种是c t d 结构没有发生磷酸化或者发生轻微磷酸化的类型，被 称之为r n a pi i a ；另一种是发生了高度磷酸化的类型，被称之为r n a pi i o 。这两 种类型可以发生相互转换而共同参与m r n a 转录和加工的偶联过程。磷酸化是 c t d 结构的一个非常重要的特点( t r e m b l e ye ta 1 2 0 0 3 ) 。 在c t d 结构的7 个氨基酸重复单位中，s e r 一2 和s e r 一5 氨基酸是发生磷酸化 的两个活跃位点，在t h r 和t y r 位点有时也会发现有轻微的磷酸化现象。f 是由 于c t d 结构中具有了这些可发生磷酸化的位点，所以才有了r n a 聚合酶i i 的两 种不同类型r n a pi i a 和r n a pi i o 型。结构上的不同也直接影响了它们各自的功 能。已经证实，r n a pi i a 与m r n a 转录起始的阶段有关，而r n a pi i o 则同转录的 延伸过程有关。在转录起始的初期，r n a pii a 与转录起始相关的顺式作用元件相 互作用，并形成了稳定的转录起始复合物而聚集在转录的起始区。待转录起始以 后，r n a pi i a 转变为r n a pi i o 的形式，参与到m r n a 的转录延伸的过程中。 在真核细胞中r n a 聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因 子共同协作( s t e f a ne ta 1 1 9 9 9 ) 。与r n a 聚合酶i i 相互作用的转录因子分别 1 3 称为t f i i ，r n a 聚合酶i l 结合t fi i 见图1 2 。 图1 - 2 r n a 聚合酶i i 结合转录因子( t l o r t o ne ta 1 2 0 0 2 ) 在生理条件下r n a 聚合酶i i 转录某个基因时通常需要2 0 种以上的蛋白 质因子结合于启动子上形成转录起始复合物。t b p ( 即原t f i i d ) 、t f i ib 和 t f i i a 与r n a 聚合酶i i 可在启动子上形成最低限度的复合物，开始转录 m r n a 。t f i i d