（细胞生物学专业论文）毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星dna的分析及进化的研究.pdf

中文摘要 麂亚科动物虽然形态相似，但是却具有多样化的核型，这在哺乳动物进化中 十分罕见，也倍受进化生物学家和细胞遗传学家的关注。毛冠鹿隶属麂亚科毛冠 鹿属，该属仅有毛冠鹿一种动物。以前的研究发现毛冠鹿是一种染色体多态的动 物，其中雌性毛冠鹿的染色体众数2 n = 4 6 , 4 7 ，4 8 ，雄性毛冠鹿的染色体众数 2 n = 4 7 4 8 ，但是其染色体进化和物种进化一直不是很清楚，所以，本文通过毛 冠鹿线粒体基因组全序列，测定其基因组大小和毛冠鹿五种卫星d n a 探讨毛冠 鹿染色体进化和物种进化。 1 通过p c r 方法克隆了毛冠鹿线粒体基因组全序列。毛冠鹿线粒体基因组 ( 全长1 63 4 7 b p ) ，具有典型的哺乳动物的线粒体基因组结构和组成。还具有一 些与已经报到的麂属动物不同的特点。n a d h 4 l 的基因的起始密码子是g t g ， 它在鹿科动物中比较罕见，只有在驯鹿和梅花鹿中有报道。c y tb 基因( 全长 1 1 4 3 m ) ，在终止信号t a g 前，有一个a a a 的亚终止信号。这一点与驯鹿相似。 根据线粒体重链上的1 2 个蛋白编码基因，系统发生学分析表明麂亚科为单系群， 包括毛冠鹿属和麂属，毛冠鹿属与麂属为姐妹群关系，通过分子钟计算毛冠鹿属 与麂属至少已经分离了4 3 0 万年。 2 运用流式细胞术，以人的基因组( 2 c = 7 0p g ) 为参照，测定了雄性毛冠鹿 细胞和雌性毛冠鹿细胞中d n a 含量分别为4 9 6 2p g 和4 9 7 1 p g 值，并通过公式计 算出毛冠鹿的基因组大小2 4 3 1 0 9b p 。发现毛冠鹿的基因组虽然大于赤麂，但是 小于从麂亚科中分离出比毛冠鹿晚的小麂，因此推测其已经经过了较长时间的独 立进化。 3 克隆了毛冠鹿五种卫星d n a ，并通过测序，s o u t h e r n 杂交和荧光原位杂交证 明了这些序列的特征。通过卫星i 和卫星i i 杂交不同核型发现信号出现在大 部分染色体的着丝粒区域，并且卫星i 在一号和三号染色体臂间，卫星i i 在一 号染色体上也出现臂间和x 染色体的臂间都出现信号。这些数据支持毛冠鹿在染 色体进化过程中，也经历了染色体的串联融合和罗伯逊易位。我们通过卫星i 杂 交2 n = 4 7 再 的核型还发现毛冠鹿的染色体在进化过程中出现了x 染色体与常 染色体的融合，这种融合促进了物种染色体的进化。卫星i i i 存在于狍和獐的基 因组中，而不存在于空齿鹿属、鹿属、黏鹿属、麂属、美洲鹿属和驯鹿属动物中， 被认为是“古老”鹿的遗迹。本文克隆毛冠鹿的卫星i i i ，通过荧光原位杂交发 现其仅存在于一对小染色体的着丝粒区域。卫星不存在獐的基因组中，而存 在于新近进化的物种的麂属和美洲鹿属动物中，被认为是很“年轻的”卫星 d n a 。卫星的s o u t h e r n 杂交确定其存在于毛冠鹿基因组之中。獐属于 t e l e m e t a c a r p a l i a 鹿，但是毛冠鹿属于p l e s i o m e t a c a r p a l i a 鹿。 因此，毛冠鹿可能 与p l e s i o m e t a c a r p a l i a 鹿( 鹿亚科和麂亚科) 的祖先关系很近。卫星vs o u t h e r n 杂交发现卫星v 仅存在于雄性的毛冠鹿中。通过荧光原位杂交发现其仅分布在y 染色体的着丝粒区域和长臂的异染色质区域，从其分布可以看出，毛冠鹿的y 染 色体可能最近出现了扩增，并暗示麂亚科动物染色体进化较为复杂。 关键词：毛冠鹿麂亚科线粒体基因组卫星d n a 荧光原位杂交进化 n a b s t r a c t t h es p e c i e so f m u n t i a c i n a e ，c e r v i d a ea r em o r p h o l o g i c a ls i m i l a r i t yb u tc o n s i d e r a b l e d i v e r s i t yo ft h e i rk a r y o t y p e s ，w h i c ha r er a r ei nt h em a m m a le v o l u t i o na n dg r e a t i n t e r e s tt oe v o l u t i o n a r yb i o l o g i s t sa n d c y t o g e n e t i c i s t s t h et u f t e dd e e ri sas o l es p e c i e s i n e l a p h o d u s ，m u n f i a c i n a e p e r v i o u sr e p o r t ss h o w e dt h a t t h e r ew a se x t r e m e c h r o m o s o m a lp o l y m o r p h i s mi nt h es p e c i e so fe l a p h o d u sc e p h a l o p h u s ，i n c l u d i n gt h e 2 n 24 6 4 7 4 8i nf e m a l ea n d2 n = 4 7 4 8i nm a l e b u tt h ee v o l u t i o no fi t sk a r y o t y p e sa n d s p e c i e si ss t i l lu n c l e a r , s oi nt h ep r e s e n ts t i l d y , w ec l o n e dt h em i t o c h o n d r i a lg e n o m e a n df i v es a t e l l i t ed n a si nt h et u f t e dd e e r , i no r d e rt or e s e a r c ht h ec h r o m o s o m e e v o l u t i o na n ds p e c i e se v o l u t i o n 1 t h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo ft h et u f t e dd e e rw a sd e t e r m i n e db yp c r t h e m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ( 1 63 4 7 b p ) c o n t a i n st y p i c a lg e n ec o n t e n ta n do r g a n i z a t i o no f m i l o c h o n d r i a lg e n o m ef o u n di nm a m m a l s s e v e r a lu n u s u a lf e a t u r e sd i s t i n g u i s h e dt h i s g e n o m ef r o mo t h e rm u n t j a c sm i t o c h o n d r i a lg e n o m e s t h es t a r te o d o no fn a d h 4 l a p p e a r st ob eg t g , w h i c h i sr a r ei nc e r v i d a e b u th a sb e e nd e s i g n a t e da sa ni n i t i a t o r o f r a n g i f e rt a r a n d u sa n dc e r v u sn i p p o nn a d h 4 l t h ec y tbg e n e ( 11 4 3 n 0h a sa s u b t e r m i n a la a af o l l o w e db yt h es t o pc o d o nt a g ：t h i si ss i m i l a rt ot h a to fr a n g i f e r t a r a n d u s b a s e do nt h e1 2hs t r a n dp r o t e i n - c o d i n gg e n e s ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sw e r e c a r r i e do u tt oc o n f i r mt h a tam o n o p h y l yo fm u n t i a e i n a e ( e l a p h o d u s + m u n t i a c u s ) t h ee l a p h o d u sa n dm u n t i a c u sw e r et h es i s t e r - g r o u pr e l a t i o n s h i p sa n dt h ee l a p h o d u s h a dd i v e r g e df r o mm u n t i a c u ss p e c i e sm o r et h a n4 3m y a 2 ，c v a l u e so fm a l ea n df e m a l et u f t e dd e e rw a sd e t e r m i n e db yf l o wc y t o m e t r y u s i n gh u m a nl y m p h o c y t ec e l ld n ac o n t e n t ( 2 c = 7 0p g ) a sas t a n d a r d r e s u l ts h o w s t h a td n ac o n t e n tf o rm a l ea n df e m a l ea r e4 9 6 2p ga n d4 9 7 1p g ，r e s p e c t i v e l y t h e g e n o m es i z ei s2 4 3 x 1 0 9b p ，t h eg e n o m es i z eo ft u f t e dd e e ri sl a r g e rt h a nt h a to f i i i i n d i a nm u n t j a c ，b u ts m a l l e rt h a nt h a to ft h ec h i n e s em u n t j a c ，w h i c hh a dd i v e r g e d l a t e rt h a nt u f t e dd e e rf r o mt h em u n t i a c i n a es u b f a m i l y i t sa s s u m e dt h a tt h et u f t e d d e e rh a de v o l v e di n d e p e n t e n t l yar e l a t i v el o n gt i m e 3 f i v es a t e l l i t ed n a sw e r ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e db ys o u t h e mb l o to r f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) f i s hs t u d i e sw i t hs a t e l l i t eia n ds a t e l l i t e i it od i f f e r e n tk a r y o t y p eo ft u f t e dd e e rm e t a p h a s ec h r o m o s o m e sl o c a l i z e db o t h s a t e l l i t ed n a sa tt h ep e r i c e n t r o m e r i cr e g i o n so fm o s to fc h r o m o s o m e s t w op a i r so f t u f t e dd e e ra u t o s o m e s ( c h r o m o s o m e s1a n d2 ) h a di n t e r s t i t i a ls a t e l l i t eis i t e sw i t ha p a i ro ft h e s ea u t o s o m a lp a i r s ( c h r o m o s o m e s1 ) a l s oe x h i b i t i n gi n t e r s t i t i a ls a t e l l i t e i i s i g n a l s a ni n t e r s t i t i a ls i t eo nt h exc h r o m o s o m ew a sf o u n dt oh a v es a t e l l i t e i s i g n a l s t h e s e d a t aw e r eu s e dt om o r e p r e c i s e l y d e f i n et h ec h r o m o s o m e e e n t r o s o m e - t e l o m e r ef u s i o na n dr o b e r t s o nt r a n s l o c a t i o ni nt h et u f t e dd e e rk a r y o t y p e s w 。甜。f o u 。坩也砒。x 。m 。m 。侄a n 。撕。n ；n m 。佃舭dd e 。，。：。f4 ，熏 ，n d r i v e sk a r y o t y p ee v o l u t i o n t h es a t e l l i t ei i id n af a m i l yw a si s o l a t e df r o mt h e g e n o m eo f r o ed e e ra n dc h i n e s ew a t e rd e e r ，h o w e r v e r , i tw a sn o td e t e c t e da m o n gt h e o t h e re i g h td e e rs p e c i e se x a m i n e df r o mt h eg e n e r ao fa l c e s ，c e r v u s , d a m a , m u n t i a c u s , o d o c o i l e u s ，a n dr a n g i f e r i ti sar e l i co ft h e o l d d e e rs p e c i e s i nt h e p r e s e n ts t u d y , w eg e n e r a t e das a t e l l i t ed n a c l o n ef r o mt h et u f t e dd e e r f i s h s t u d i e sw i t hs a t e l l i t ei i it ot u f t e dd e e rm e t a p h a s ec h r o m o s o m e sl o c a l i z e ds a t e l l i t e d n aa tt h ep e r i c e n t r o m e r i cr e g i o n so fap a i ro fs m a l lc h r o m o s o m e s t h e r e f o r e ，i ti s a l s op r e s e n ti nt h eg e n o m eo ft u f t e dd e e r s o u t h e r nb l o ts t u d i e sw i t hs a t e l l i t ei v t o t u f t e dd e e rg e n o m i cd n ad e m o n s t r a t e dt h a ts a t e l l i t ei va l s op r e s e n ti nt h et u f t e d d e e i ti sa y o u n g s a t e l l i t ed n a n o te x i s ti nt h ec h i n e s ew a t e rd e e r t h ec h i n e s e w a t e rd e e rb e l o n g st ot h et e l c m e t a c a r p a l i a , b u tt h et u f t e dd e e rb e l o n g st ot h e p l e s i o m e t a c a r p a l i mt a k et o g e t h e r ，t h i sm i g h ti m p l i c a t et h a tt h et u f t e dd e e rm a yb e c l o s e l yr e l a t e dt ot h ea n c e s t o ro f t h ep l e s i o m e t a e a r p a l i a ( c e r v i n a ea n dm u n t i a c i n a e ) s o u t h e r nb l o ts t u d i e sw i t hs a t e l l i t evt ot u f t e dd e e rg e n o m i ed n ad e m o n s t r a t e dt h a t s a t e l l i t eva l s op r e s e n ti nt h em a l et u f t e dd e e r f i s hs t u d i e sw i t hs a t e l l i t evt o t u f t e dd e e rm e t a p h a s ec h r o m o s o m e sl o c a l i z e do nt h ep e r i c e n t r o m e r er e g i o na n d h e t e r o c h r o m a t i nb l o c ko nt h el o n ga l t no fyc h r o m o s o m e t h eh e t e r o c h r o m a t i nm i g h t b e a m p l i f i e d o nt h eyc h r o m o s o m ev e r y r e c e n t l y i t f u r t h e rh i n t st h a tt h e c h r o m o s o m e se v o l u t i o nh a v em o r ec o m p l e xr e a r r a n g e m e n t si nt h em u n t i a n c i n a e a n i m a l s ， k e yw o r d s ：t u f t e dd e e r , m t m t i a e i n a e ，m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ，s a t e l l i t ed n a , f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n , e v o l u t i o n v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： l 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 彗坐 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名逊雏 日期：蝴。s 2 毛冠鹿线粒体基因组牟序列和i ! 星d n a 的分析及进化的刎究南京师范大学硕士学位论文 第一部分综述 第一章现存麂亚科动物系统发生学研究进展 目前在分类学上，鹿科( c e r v i d a e ) 分为四个亚科：鹿亚科( c e r v i n a e ) ，麂亚 科( m u n t i a c i n a e ) ，獐亚科( h y d r o p o t i n a e ) 和美洲鹿亚科( o d o c o i l e i r m e ) 。我们目前 实验室主要研究的毛冠鹿属于麂亚科，因此本文主要介绍麂亚科动物的研究进 展。并且我们也将介绍一下獐的研究概况，这主要是由于獐与麂亚科动的关系一 直倍受关注，并且獐曾经在分类学上也属于鹿亚科。 现存的麂亚科动物 麂亚科是由1 9 0 7 年的德国科学家k n o t t n e r u s m e y e r 提出的分类单元，其中包 括麂属动物和毛冠鹿属动物( g r u b b ，2 0 0 0 ) 。现存的已经发现的麂亚科为2 属1 1 个种( 表1 ) ： 表1 麂亚科现存的物种 t a b l e1t h ee x t a n ts p e c i e so f m u n t i a e i n a e 属名种名英语名拉丁名 毛冠鹿属毛冠鹿t u f t e dd e e re l a p h o d u sc e p h a l o p h u s 麂属 婆罗溯黄麂b o m e a n y e l l o w m u n t j a c m u n t i o c u 5a t h e r o d e s 黑麂 b l a c km u n t j a em u n t i a c u sc r i n i f i o n s 菲氏麂 f e a sm u n t j a c m u n t i a c u s e a e 贡山麂 g a o l i g o n gm u n t j a c m u n t i a c u sg o n g s h a n e n s i s 赤麂i n d i a nm u n t j a c m u n t i a c u sm u n g a k 叶麂 l e a f m u n t j a em u n t i a c u s p u t a o e n s i s 小麂c h i n e s em u n t j a cm u n t i a c u sr e e v e s i 罗氏麂r o o s e v e l t sm l i n t i a cm u n t i a c u sr o o s e v e l t o r u m 长山麂t r u o n g s o n m u n t j a c m u n t i a c u st r u o n g s o n e n s i s 越南大麂 g i a n tm u n t j a em u n t i a c u sv u q u a n g e n s 括 毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究南京师范大学硕士学位论文 现存麂属动物发现及分布 麂亚科中最早命名的动物是c e r v u sm u n t j a k ( 即赤麂) ，是由z i m m e r m a n n 于 1 7 8 0 年在印度尼西亚的爪洼岛发现的，目前其主要分布中国的广东、广西、云 南及海南各省和印度尼西亚、马来西亚等国家和地区。1 8 1 5 年r a f i n e s q u e 在当 时仅发现赤麂一种动物时根据其与鹿属动物明显不同的特征，建立了麂属 ( m u n t i a c u s ) 的分类单元。第二个被命名的麂属动物是小麂，它是由o g i l b y 于 1 8 3 9 年在广东省广州附近发现并命名的，目前大部分学者认为现存小麂有两个 亚种，即指名亚种，其分布在中国大陆的亚热带地区，和台湾亚种，其仅分布在 台湾地区( 马世来等，1 9 8 6 ，盛和林等，1 9 9 2 ) 。 第三个命名的麂属动物是黑麂，是由1 8 8 5 年s c l a t e r 在中国浙江省宁波获得 标本而命名的，但是目前只发现黑麂分布在浙江省西部，安徽省南部，江西和福 建省北部，处于北纬2 7 5 3 0 。，东经1 1 7 1 2 1 5 。，仅7 6 5 万平方公里的狭小区 域( o h t a i s h ia n dg a o ，1 9 9 0 ，盛和林等，1 9 9 2 ) 。随后发现的麂属动物菲氏麂，它是 由t h o m a sa n dd o r i a 于1 8 8 9 年在缅甸的丹那沙林( t e n a s s e r i m ) 省( 现名德林达 依省) 发现的，目前主要分布在中国的云南和西藏、老挝、缅甸和泰国等国家地 区境内( o h t a i s h ia n dg a o ，1 9 9 0 ，盛和林等，1 9 9 2 ) 。 随后麂亚科动物新种的罗氏麂的确认却是一个曲折的过程。1 9 2 9 年3 月1 6 日，作为k e l l e y r o o s e v e l t s 亚洲探险的一部分，c o o l i d g e 在老挝的m u o n gy o ( c a 北纬2 1 。3 07 ，东经1 0 2 0 ) 发现的一头雄性的类似已经发现的麂属动物，并由 o s g o o d 描述和命名为罗氏麂( a m a t oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。但是随后的6 0 多年里，一直 再没有关于罗氏麂的报道，因此起是否真正是一个新种，引起了世界上很多学者 的争议( 马世来等，1 9 8 6 ，g r o v e sa n dg r u b b ，1 9 9 0 ) 。直到1 9 9 5 年1 月两位美国 生物学家w gr o b i c h a u d 和g b s c h a l l e r 在老挝的l a ks a o 村庄( 北纬1 8 。2 0 7 ， 东经1 0 5 0 ) 重新发现了罗氏麂( a m a t oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。随后的近半个多世纪都没有 新的物种发现，直到1 9 8 2 年，世界著名的动物学家g r o v e s 在马来西亚的s a b a h 地区发现了= - = 种新的麂属动物，命名婆罗洲黄麂( m u n t i a c u s a t h e r o d e s ) ( g r o v e s ， 1 9 8 2 ) ，但是对于这是否是一个新种还存在争议，有学者认为其仅是赤麂的一个 亚种( 马世来等，1 9 8 8 ) 。随后的1 9 8 8 年施立明院士和马彩霞发现了来至云南贡 山县的麂的染色体众数为2 n = 86 ，2 n = 9 早，虽然染色体数目与黑麂相同，但是染 毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究南京师范大学硕士学位论文 色体形态与以前发现的黑麂的染色体形态有差异( 施立明，马彩霞，1 9 9 8 ) ，1 9 9 0 年马世来等学者把这种麂定名为贡山麂( m u n t i a c u s g o n g s h a n e n s i s ) ( 马世来等， 1 9 9 0 ) 。1 9 9 4 年在越南的中东部的长山( 以前成为a n n a m i t e ) 发现了新的麂亚科动 物，并命名大麂属( m e g a m u n t i a c u s ) ，并定名为越南大麂( m e g a m u n t i a c u s v u q u a n g e n s i s ) ( e v a n sa n dt i m m i n s1 9 9 4 ；t o u ee ta 1 1 9 9 4 ) ，但是随着分子系统发 生学研究发现，越南大麂应属于麂属，因此目前定名为m u n t i a c u sv u q u a n g e n s 捃 ( s c h a l l e ra n dv r b a ，1 9 9 6 ，t i m m i n se ta 1 1 9 9 8 ) 。1 9 9 8 年g a o 等学者在越南长山发 现了长山麂( m u n t i a c u st r u o n g s o n e n s i s ) ( g a oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 和1 9 9 9 年a m a t o 等 学者在缅甸的北部p u t a o 镇发现了麂亚科的另一个新种叶麂( m u n t i a c u s p u t a o e n s i s ) ，并通过分子系统学的一些研究发现其属于麂属( a m a t oe ta 1 ，1 9 9 9 ， d a t t ae t a l ，2 0 0 3 ) ，在2 0 世纪末，这种大型哺乳动物还能在一个亚科中发现这样 多的新物种是十分罕见的。 毛冠鹿的命名及分布 毛冠鹿隶属于麂亚科毛冠鹿属，毛冠鹿属目前仅发现毛冠鹿一种动物。其是 由1 8 7 1 年著名的法国昆虫学家h e n r im i l n e e d w a r d s 在中国四川发现的新的物 种；并根据这种小鹿头上有一簇毛丛挡住了一对不分叉的小角。e l a p h o s ( 希腊语) 一种鹿，o d o u s ( 希腊语) 一颗牙齿：这代表着雄性毛冠鹿的獠牙。k e p h a & ( 希腊 语) 头部，l o p h o s ( 希腊语) 毛冠：毛冠鹿在前额和角基部的四周有一簇毛丛，而命 名为e l a p h o d u sc e p h a l o p h u s 。随后根据形态学的一些差异，随后于1 8 7 4 年和1 9 0 4 年又发现并命名了毛冠鹿两个亚种e cm i c h i a n u s 和e ci c h a n g e n s i s ( 盛和林等， 1 9 9 2 ) ，但是也有学者认为不存在亚种，而是地理因素造成了这些形态差异 ( g r o v e sa n dg r u b b ，1 9 8 7 ) ，目前毛冠鹿主要分布在缅甸的东北部和中国的亚热 带地区，处于北纬2 4 到3 4 度，东经9 8 到1 2 2 度之间茂密的树林中靠近水源的 地方( o h t a i s h ia n dg a o ，1 9 9 0 ) ( 图1 ) 。 毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究塑室塑蔓盔兰堡主兰垡堡奎 图i 毛冠鹿的分布图( o h m i s h ia n dg a o ，1 9 9 0 ) f i g1 t h em a p o f t u f t e dd e e r ( o h t a i s h ia n dg a o ，1 9 9 0 ) 獐的发现及分布 獐( h y d r o p o t e s i n e r m i s ) 隶属獐属，是由英国鸟类学家及自然学者郇和( r o b e r t s w i n h o e ) 于1 8 7 0 年在江苏省镇江市发现并命名的，主要分布在江苏，沿海草滩 区，浙江省舟山群岛，江西省鄱阳湖，湖北的洞庭湖和朝鲜等地区( 盛和林，1 9 9 2 ) 。 獐的第2 以及第5 掌骨从近端到远端连续( m e t a t a l s a lb r i d g e ) 。而鹿亚科和麂亚 科动物只近端残留、远端消失( p l e s i o m e t a c a l p i ) ；与此相反，美洲鹿亚科残留着 远端( t e l e m e t a c a l p i ) 。獐属于无角的鹿种，上犬齿长成特别发达的獠牙。在鹿科 4 毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究南京师范大学硕士学位论文 进化过程中而随着角的发达，犬齿退化。獐由于古老的形态学特点( 具有鼠鼷腺， 无额头腺) ，具有在鹿科进化过程中过渡状态的核型，因此被认为和许多鹿的祖 先十分相近( n e i t z e l1 9 8 7 ；f o n t a n aa n dr u b i n i ，1 9 9 0 ；y a n ge ta 1 ，1 9 9 7 ；w a n ga n d l a n ，2 0 0 0 ；l i na n dl i ，2 0 0 6 ) 。两者之间的麂却有小型角和较大的獠牙，由于獐可 能是二次失去角，所以也有学者认为从麂的祖先中分化出来的( g r o v ea n dg r u b b ， 1 9 8 7 ) 。 麂亚科分子系统学研究 随着p c r 技术的发明，测序技术的改进以及系统发生学算法的发展，分子系 统发生学有了很大的发展。由于线粒体d n a 是共价闭合的环状双链d n a ，总是 通过母系遗传方式来传递，作为独立的核外遗传物质和具有很高的拷贝数，这个 分子很容易从不同组织中提纯：脊椎动物的线粒体基因组比核基因组小而简单， 并且线粒体分子中缺乏内含子和基因间序列，没有重复序列；并且线粒体几乎没 有重组发生；在哺乳动物中，线粒体的核苷酸序列进化速度比核d n a 要快，进 化速度是单拷贝d n a 的5 1 0 倍等特点，这些特点对线粒体在分子系统进化研究 中特别有用。可以通过对其的研究追踪物种的起源，和让我们更好了的了解到物 种进化的时间( 李硬，王小明，1 9 9 7 ) 。 在分子系统发生学也广泛的用于研究麂亚科以及鹿亚科的进化分化关系。通 过麂亚科动物的线粒体d n ar f l p 图谱，1 2 sr n a ，1 6 sr n a ，q 盯b 基因和 d 1 0 0 p 区的系统发生法系揭示了毛冠鹿与麂属为姐妹属关系( l a qe ta 1 ，1 9 9 3 ； a m a t oe ta 1 1 9 9 9 ) 。运用7 种麂亚科动物的线粒体基因n a d h 4 l 和n a d h 4 基因 的序列分析发现毛冠鹿与麂属动物在系统发生树基部就发生了分离。通过多种鹿 科动物样品的线粒体基因组序列中的d 1 0 0 p 和o , tb 基因的系统发生分析，支持 传统分类学上的鹿亚科为单系( l u d te ta 1 ，2 0 0 4 ；p i t r ae ta 1 ，2 0 0 4 ；r a n d i e t a 1 ，1 9 9 8 ；r a n d ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ，在对美洲鹿亚科动物的o , tb 基因分析中发现，狍属 ( c a p r e o l u s ) 和獐( h y f l r o p o t e s ) 聚成一支( r a n d ie ta 1 ，1 9 9 8 ；p i t r ae ta 1 ，2 0 0 4 ) ，并 推测现存的獐是在进化过程中完全失去角的( r a n d ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。h a s s a n i n 和 d o u z e r y ( 2 0 0 3 ) 运用多基因进行分析得出的结果支持p l e s i o m e t a c a r p a l i a 和 t e l e m e t a c a r p a l i a 的分类单元：并且最近g i l b e r te ta 1 ( 2 0 0 6 ) 通过2 个核基因标记 毛冠鹿线粒体基园组全序剜和卫星d n a 的分析及进化的研究南京师范大学颂士学位论文 ( a l a l b ，p r k c i ) 和2 个线粒体基因标记( c y t c 0 1 , ) 支持毛冠鹿属和麂属组 成的麂亚科为单系群；并通过分子钟计算出现存的鹿科动物的起源时间不超过 9 6m y a ，并且麂亚科的起源时间为7 8m y a ，与董为研究员发现古老的麂亚科 动物化石为中新世后期( 距今大约7 9 百万年) 相吻合( d o n g e la l ，2 0 0 4 ) ，但是 由于缺少更多化石发现，因此我们想通过毛冠鹿的线粒体基因组全序列的克隆， 与已经报道的鹿科，包括麂亚科动物的线粒体基因组全序列的进行系统发生关系 分析和物种之间分歧时间的研究，以便更好地了解麂亚科动物进化的方式。 6 毛冠鹿线粒体基因组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究南赢师范大学硕士学位论文 第二章麂亚科动物细胞遗传学研究进展 随着1 9 5 2 年著名的华裔科学家徐道觉( t a oc h i u hh s u ) 先生发现在人类染 色体制片过程中采用低渗溶液预处理能得到分散得非常好的中期染色体和1 9 5 6 年蒋有兴( j o eh i nt j i o ) 先生用该法确定人类二倍体细胞的染色体数不是统治了 3 3 年之久的4 8 ，而是4 6 后，细胞遗传学有了飞速的发展。人们也立即运用这种 方法开始对其他物种核型进行研究，其中也包括了麂亚科动物。 麂属动物的核型的研究 美国两位学者d h w u r s t e r 和k b e n i r s c h k e 在对赤麂动物细胞的染色体众数 进行观察时发现，雄性的赤麂细胞只有七条染色体，而雌性只有六条。他们开始 很不相信这样大型的哺乳动物只具有这样少的染色体，并且与它同属于一个属的 小麂的染色体众数为2 n = 4 6 ( w u r s t e r a n db e n i r s c h k e ，1 9 6 7 ) ，经过多次的重复实 验，他们坚信自己的实验结果，并于19 7 0 年以“i n d i a nm u n t j a c ，m u n t i a c u sm u n t i a k ： ad e e rw i t hal o w d i p l o i dc h r o m o s o m en u m b e r 为题发表在s c i e n c e 杂志上。这 一发现，开始使麂亚科动物受到越来越多细胞遗传学家的关注。1 9 7 2 年w u r s t e r 在马来西亚有捕获一头雌性赤麂，染色体众数为2 n = 8 ，1 9 8 1 年段幸生等对雌性 和雄性黑麂的染色体进行研究发现，其染色体众数也为2 n = 8 ，但是染色体形态 与2 n = 8 赤麂的染色体形态有明显的差别；雄性黑麂的染色体众数为2 n = 9 ( 段 幸生等，1 9 8 2 ) 。1 9 8 3 年以后s o m a 和t a n o m t o n g 等学者分别发现了菲氏麂的染 色体众数为2 n = 1 2 ，1 3 ，1 4 早1 4g ( s o m ae ta i ，1 8 3 ，1 9 9 7 , t z n o m t o n ge ta i ，2 0 0 5 ) 。 随后1 9 8 8 年施立明等学者发现了的贡山麂的染色体众数也为2 n = 8 7 ，2 n = 9 3 。 毛冠鹿核型的研究 1 9 8 3 年张锡然等学者发现雌雄两种毛冠鹿的核型，雄性染色体众数为2 n = 4 8 ， 雌性染色体众数为2 n = 4 7 ( 张锡然等，1 9 8 3 ) 。1 9 8 4 年，王宗仁和全国强学者对 北京动物园所饲养的两头雌性毛冠鹿进行了染色体组型分析，通过淋巴细胞染色 体计数，结果表明，染色体众数2 n = 4 6 ( 王宗仁和全国强，1 9 8 4 ) 。1 9 9 1 年，施 毛冠鹿线粒体基园组全序列和卫星d n a 的分析及进化的研究南京师范大学碗士学位论文 立明等学者对来自云南的两雄性毛冠屁进行研究，报道了另一新核型，染色体众 数2 n = 4 7 。核型中不配对的染色体为一条大的近端着丝粒染色体，一条中等大小 的近端着丝粒染色体和一条小的端着丝粒染色体，并观察毛冠鹿细胞减数分裂时 的联会复合体，发现毛冠鹿中的x 染色体包含一个x 和常染色体的易位( s h ie t a 1 ，1 9 9 1 ) 。本实验室2 0 0 5 年和2 0 0 6 年又报道y - 种新的核型。到目前为止，我 们在毛冠鹿种内已经发现了6 种不同的核型，6 种核型的核型模式图如图2 所 示： 核型，瀚黼勰鼽 纛l 涨锡黼螂， l2 34 52 22 3x y2 n = 4 8 核型：n n 辑拜冀ki i a 一 熏早。张锡然等。， l23452 22 3 x 2 n = 4 7 核型，鑫矗t i f fh h 熏囊 一 肴再早。王宗仁，全国强，。， l23452 2 x x 2 n = 4 6 核型。n n 豫 l 托 囊 纛i 。；毗碰。钓， l2 34 52 22 3x y2 1 1 = 4 7 i i l l 黼张ha t n 一一 觚旱“，：嘶， 核型5 i23452 22 3x x2 n = 4 8 i l l l 黼蹦a a 阶 l 。酬删， 12，452 22 3x y2 n = 4 8 核型。n n 砭疆棒孔a 一 熏 辛。粘伟红等，：。， t 2345 7 t ，2 3 x x 2 n = 4 7 图2 ，毛冠鹿6 种不同核型的核型模式图 f i g2 s i xk i n d so f k a r y o t y p e so f t u f t e dd e