（细胞生物学专业论文）拟南芥菜野生型和tam突变体小孢子发生和发育的比较研究.pdf

怨撼 器黼秽于 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研 究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、 观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：至，主堕 日 期：篮区! 恕撼 裴嘉蓑喜赢蕊 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州 大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保 存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和 借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发 表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位 仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：必导师签名：旌生日 o 2 黧挝 猫糍赢他r 摘要 拟南芥菜野生型进行同时型减数分裂，即减数分裂的第一次分裂后不形成细胞壁，没 有二分体时期，而在第二次分裂完成时，在四个子核之间同时形成细胞壁，分割成4 个细 胞，形成标准的四面体。而m a g n a r 等( 2 0 0 1 ) 分离了一种突变体，t a m ，试验发现2 7 。c 处 理2 4 h r 以上，进行连续型减数分裂，即减数分裂的第一次分裂伴随胞质分裂形成细胞壁， 将小孢子母细胞分为两个细胞，可称为二分体，接着进行第二次分裂，形成4 个细胞，或 者二分孢子中其中一个小孢子先进行分裂，形成“三分体”；并且该突变体从g 1 m 期开始 不同步。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 对拟南芥t a m 突变体的研究表明，该突变体由编码c y c a l ；2 的 基因突变引起，其减数分裂粗线期的小孢子母细胞出现的频率比野生型拟南芥高。 本研究通过普通光学显微镜及电子显微镜对拟南芥野生型( w t ) 及t a m ( 减数分裂延迟 不同步) 突变体小孢子发生和发育进行的研究证实了m a g n a r d 等( 2 0 0 1 ) 的结论：t a m 突变导 致小孢子发育延迟、减数分裂不同步、二分体表型和花粉异质性增加、活力下降。 进一步利用透射电镜对拟南芥菜野生型和t a m 突变体小孢子母细胞发育过程中细胞壁 的变化进行了研究。结果表明，t a m 突变体在减数分裂前期i 细线期以后，某些小孢子母 细胞被不规则的细胞壁所包围，出现了界限不清楚的“细胞壁”，并且胼胝质的沉积与野 生型相比变得不均匀。这可能是c y c a l ；2 蛋白的另一种作用形式。 在减数分裂前期i 的偶线期以后，野生型拟南芥和t t l y 突变体中都出现了胞质通道。 由于t a m 突变体为细胞减数分裂延迟不同步突变体，这就说明，拟南芥小孢子母细胞之间 胞质通道并不是细胞同步化的充分条件，很可能还需要其它因素的作用，即仅胞质通道本 身并不能保证细胞同步化，或者，胞质通道还具有其它方面的功能。 关键词：小孢予发生；雄配子体；胞质通道；减数分裂；拟南芥菜；突变体 一3 怨撼 淼黼 a b s t r a c t t h e m i c r o s p o r o g e n e s l sa n dm a l eg a m e t o p h y t ed e v e l o p m e n t o fw i l d t y p e ( w t ) a n d t a m ( t a r d ya s y n c h r o n o u s m e i o s i s ) m u t a n ta r a b i d o p s i s t g g l o n ow e r e i n v e s t i g a t e db yl i g h tm i c r o s c o p y a n de l e c t r o nm i c r o s c o p y m e i o c y t e si np a c h y t e n ew e r ef o u n dm o r ef r e q u e n t l yi n 凸抑t h a ni n w l l dt y p e s u g g e s t i n gt h a tp a o h y t e n ei n t a mi si o n g e rt h a nt h a ti nw i l dt y p e t h i sc o n c l u s i o ni s c o n s i s t e n tw i t ht h ef i n d i n gt h a tg y g a l ：2w a sp r e d o m i n a n t l ye x p r e s s e di nl e p t o t e n ei n p r o p h a s e i s t u d i e so nt h e c h a n g e o fc a l l o s e d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f m i c r o s p o r a n g l u mc e l l so fw l t d t y p e ( 、 叮) a n dt a m ( t a r d ya s y n c h r o n o u sm e i o s i s ) m u t a n ta r o b l d o p s i st h d i l o n d s h o w e dt h a t 。a f t e rz y g o b a n e t h e i rc e l | o s ew a l li sn o t t h e s a m et h i c k t h ec a l l o s ew a l lo fm l c r o s p o r a n g l u m1 5m o r ea n o m a l o u st h a nt h a to ft h e w i l dt y p e i tm l g h tt h eo t h e rr u c t i o no fg y g a l ；2 u n d e re l e c t r o nm i c r o s c o p y w ec o u l df i n dc y t o p l a s m i cc h a n n e l si nb o t hw i l dt y p e a n dt a mm u t o n tp l a n ta f t e rz y g o t e n e s u g g e s t i n gt h a tc y t o p l a s m i cc h a n n e i sa ；o n e c o u l dn o ts u f f i c i e n t l yr e n d e rt h eo c c u r r e n c eo ft h es y n c h r o n o u s c e l ld i v i s i o nd u r i n gt h e m i c r o s p o r o g e n l s l s o fa r a b t d o p s i st h a l a n a na r a b l d o p s l s t w on u c l e a rd i v i s i o n so c c u rb e f o r es i m u l t a n e o u sc y t o k l n e s i sy i e l d s a t e t r a do fh a p l o i dc e l l s i nt a m c e l ld l v l s t o n sa r ed e l a y e d r e s u l t i n gi nt h e f o r m g t o no f a b n o r m a li n t e r m e d i a t e s m o s tf r e q u e n t l yd y a d m e i o t i cp r o d u c t s o ri nr a r ec a s e s d y a d 鱼翌坚二竺塑鲨： p o l l e n ( t w og a m e t o p h y t e sw i t h i n o n ee x l n ew a l l ) t e m p e r a t u r e s h i f te x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tt h ep e r c e n t a g eo ft h ea b n o r m a li n t e r m e d i a t e si n c r e a s e da t2 7 。c t h e m o d eo fm e i o s i st u r n e df r o ms i m u l t a n e i t yt os e r i e s k e y w o r d ：m i c r o s p o r o g e n e s i s ；m a l eg o m e t o p h y t e ；o y t o p l a s m i c c h a n n e l ；m e i o s i s ； a r o o b i d o p s l s 亡h o l l o n q m u t a n t 一5 毂拱 淼戮菘斯 缩略词 缩略词表 l i s to f a b b r e v i a t i o n 英文全称 c a l l o s e e n d o t h e e i a lc e l l s e p i d e r m i s m i c r o s p o r o c y t e m i d d l e l a y e r n u c l e u s n u c l e o l u s t a p e t a lc e l l s v a c u o l e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m g o l g ib o d i e s m i c r o s p o r e p o l l e n g r a i n c e l l w a l l c y t o p l a s m i c c h a n n e l 中文名称 胼胝质 内层细胞 表皮 小孢子母细胞 中间层 细胞核 核仁 绒毡层 液泡 内质网 高尔基体 小孢子 花粉粒 细胞壁 胞质通道 p l a s m o d e s m a胞间连丝 c 酞 印 m m n t v 肽 g 附 阿 鱼竺笙二笙塑鲨： 拟南芥菜野生型和t a m 突交体小孢子发生和发育的比较研究 前言 被子植物是植物界进化程度最高的一类 它的孢子体高度发达，配子体则进一步简化 属显花植物，具有雌、雄蕊和双受精现象。 无独立生活的能力，终生寄生在孢子体上。 配子体的简化在生物学上具有进化的意义( 吴国芳等，1 9 9 2 ) 。雄蕊和雌蕊是直接与生殖 有关的花的组成部分，分别产生花粉( 小孢子) 和胚囊( 大孢子) ，以及雄性配子( 精予) 和雌性配子( 卵) 。并进一步经受精作用，完成植物的有性生殖过程( 陆时万，1 9 8 2 ) 。有 性生殖的出现，在植物的生活史中必然出现减数分裂，形成单倍体核相和二倍体核相交替 的现象。大小孢子的发生发育是完成这一过程的必经之路。因此。大小孢子的f 常发生、 发育也就成为植物繁殖、种族延续的前提。植物大小孢子发生、发育的过程，以及这一过 程是通过怎样的途径调控便成为植物研究者关注的方面。小孢子的发生、发育过程，以及 调控也随之成为植物发育生物学研究的一个热点。 1 花药形成、小孢子发生和减数分裂突变体的获得 1 1 花药形成 花药是由雄蕊原基的顶端部分发育而来的。初期的花药是一群具高度分生能力的细 胞，外面是一层表皮细胞( e p i d e r m a lc e l l ) ，中央有维管束，表皮与维管束之间是具有分裂 能力的幼细胞。随着花药的逐步长大，这一群细胞也逐渐形成具有四楞结构的花药雏体。 以后在花药四角的基本组织内，也就是在表皮细胞以内，出现一列大核的原始细胞，称为 孢原细胞( a r c h e s p o r i a lc e l l ) ，孢原细胞经过一次平周分裂，形成内外两层细胞层，在外而 的一层，称为周缘细胞( p a r i e t a lc e l l ) ，与表皮帽贴近；罩面的一层称造孢细胞( s p o r o g e n o u s c e l l ) ，造孢细胞经过不断分裂，形成大量小孢予母细胞( m i c r o s p o r o c y t e ) ，今后将发育成 9 毂撼 瑟嘉蓑薯滕鬻惝f 花粉( p o l l e ng r a i n ) 。 周缘细胞以后又进行一或数次平周分裂( 因植物种类而异) ，产生3 层或者多层细胞层； 外层细胞的体积较大，在发育早期称这层为药室内壁( e n d o t h e l i t t m ) ，细胞内含有多量的 淀粉；到花药成熟时，这层细胞向半径方向伸展扩大，并在垂周和内切向壁e 出现不均匀 次生加厚条纹，并木质化或栓质化，这些特殊的结构有助于花粉囊的开裂，称这层细胞为 纤维层( f i b r o u sl a y e r ) 。纤维层内的一层或几层细胞较小，称为中层( m i d d l el a y e r ) 。初期， 细胞贮有淀粉，在花粉发育过程中，往往被分解吸收，细胞被压破坏，萎缩消失。最内的 壁细胞层发育为大型的薄壁细胞，与造孢组织的细胞直接相连，成为花粉囊周围的特殊细 胞层，称为绒毡层( t a p e t u m ) ，这层细胞初为单核，以后核的分裂不伴随新壁的形成，出 现双核或多核结构；细胞质浓厚，液泡较小，细胞内还含有较多的r n a 和蛋白质，并有 油腊及类胡萝h 素等营养物质。随着花粉的发育，有些植物的绒毡层细胞的细胞壁不久被 破坏，各细胞的原生质彼此融合，成为多核的原生质团，继而变成粘稠的胶体溶液，渗入 到花粉细胞中去，成为花粉发育时的养料；而有些植物的绒毡层细胞的壁并不破损，而细 胞内的贮藏物质不断由细胞分泌渗出，被花粉母细胞吸收利用，形成花粉粒的外壁和外壁 周围的粘性物质。拟南芥绒毡层的发育就属于后者。所以绒毡层对花粉的发育极为重要。 如果绒毡层的功能异常，致使花粉粒不能正常发育形成，就可能导致花粉败育，失去生殖 作用。 当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，造孢组织的细胞也在不断分裂，形成大量花粉母 细胞( 小孢子母细胞) ，以后每个花粉母细胞经过两次连续的分裂，产生四个细胞，也就 是小孢子( m i c r o s p o r e ) 。 1 2 小孢予发生 孢原细胞进行平周分裂，产生内、外两层细胞，在内的一层为造孢细胞；造孢细胞经 过不断分裂，形成大量小孢子母细胞，这些细胞的体积大，核也大，原生质浓厚、丰富。 与壁细胞很不一样，小孢子母细胞进一步发育，进行减数分裂，即细胞进行两次连续的细 胞分裂，而分裂过程中d n a 只复制一次，生成四个单倍体小孢子。减数分裂过程中所发生 一1 0 熟黧 鬻蕊黔了 的胞质分裂有两种方式。一种是连续型( s u c c e s s i v e ) ，即减数分裂的第一次分裂伴随胞质 分裂形成细胞壁，将小孢子母细胞分为两个细胞，称为二分体( d y a d s ) ，接着进行第二次 分裂，形成4 个细胞，称为四分体( q u a r t e t ) 。另一种是同时型( s i m u l t a n e o u s ) ，减数分 裂的第一次分裂后不形成细胞壁，没有二分体时期，而在第二次分裂完成时，在四个子核 之间同时形成细胞壁，分割成4 个细胞。连续型多出现在单子叶植物中，4 个小孢子排列成 f = 1 字形。而双子叶植物主要为同时型，四分孢予呈正四面体排列。小孢子周围包裹着腊胝 质壁，胼胝质酶降解胼胝质壁，小孢子释放出来。小孢予核在贴近细胞壁的位置进行有丝 分裂，形成两个子核，一个靠近细胞壁，即生殖核( g e n e r a t i v ec e l ln u c l e u s ) ，另一个向着 大液泡，即营养核( v e g e t a t i v ec e l ln u c l e u s ) 。在两核间出现一个弧形细胞板，将小孢子分 割成生殖细胞( g e n e r a t i v ec e l l ) 和营养细胞( v e g e t a t i v ec e l l ) 。一般把具有生殖细胞的雄 配子体称为花粉，以区别于小孢子。与营养细胞相比，生殖细胞包含高度浓缩的细胞核和 少量的细胞质。大约7 0 的植物，花粉管在雌蕊生长的过程中完成生殖细胞的第二次有丝 分裂，形成两个精子细胞；另外一些植物( 例如十字花科) ，则在花粉释放出来之莳便已 完成第二次有丝分裂( m c c o r m i c k ，1 9 9 3 ) 。大的营养细胞不再进行细胞分裂，最终参与花 粉管的形成；生殖细胞则没入营养细胞的细胞质中( m c c o r m i c k , 2 0 0 4 ) 。一经授粉，花粉 粒与柱头发生亲水作用，营养细胞长出花粉管，其前端一直向前延伸。花粉管向前延伸的 过程中，营养细胞的细胞核和两个紧密并行的精细胞进入花粉管。最后，整个营养细胞脱 离花粉粒，进入快速生长的花粉管顶端。随后精细胞进入胚囊，整个花粉发育过程结束 ( m c c o r m i c k ，2 0 0 4 ) 。花粉发育的主要特征如图1 所示。 小孢子母细胞在进入减数分裂前，细胞的体积和核体积增大，细胞质增稠，r n a 和蛋 白质大量合成，核糖体群密集，质体、线粒体数量也大为增多。 毂撼 蓑篓燃器啪j 二 图1 大多数被子植物小孢子发生的示意幽 ( m c c o r m i c k ，2 0 0 4 ) 一1 2 恕拱 鬻蕊裂孢r 1 3 减数分裂突变体的获得 在酵母和果蝇中对减数分裂过程的研究已经比较深入，和这一过程相关的基因也已经 被克隆。减数分裂过程发生了许多复杂的事件，例如，d n a 的复制，染色体的配对和联会 复合体的形成等。从分子水平研究某个发育过程的一个有效途径，就是分离使发育某一步 骤中断的相应突变体。雄性配子体减数分裂以及以后花粉发育过程的突变体的分离也可以 用这种分离突变体的方法。 大量有效的t d n a 和转座子插入突变都使拟南芥成为分离减数分裂相关突变体的 最佳材料。就像在酵母和其他真核生物中一样，通过减数分裂过程每一阶段的特异突变体， 把减数分裂划分成一系列单一的事件进行研究。杨维刁。等( 1 9 9 9 ) 通过转座予( d s ) 插入 突变法得到了一与拟南芥小孢子及大孢子发生相关的突变体 ( 3 7 ，1 6 7 4 0 粒，即4 0 0 0 - - 6 5 0 0 粒 左右；萌发率大于8 5 ；每个果荚的长度也都在i c m 左右。t a m 突变体拟南芥每株结实 1 2 2 2 1 ，9 9 3 0 粒，即2 5 0 0 - - 3 0 0 0 粒左右；萌发率小于8 5 ；每个果荚的平均长度也 只有0 7 5 c m 。 2 5 觏拦 粼黼黔子 图3 自然状态下野生型和突变体一些特征 2 拟南芥菜野生型和c a m 突变体小孢子的发育过程 2 1 野生型拟南芥常温下小孢子的发育过程 最初的花药十分小，各类型细胞没有分化，不易区分。到了第一次减数分裂前期，从 花药横切面的半薄切片观察，拟南芥菜花药的中央是一个药隔维管束，两侧各有两个花粉 囊。早期的花粉囊可以划分出五层细胞( 图4 ) ，最内层的小孢子母细胞( m s ，m i c r o s p o r o c y t e ) 被连续的绒毡层细胞( t ，t a p e t a lc e l l s ) 所包围，向外依次是中间层( m l ，m i d l l el a y e r ) 、 内层细胞( e n ，e n d o t h e c i a lc e l l s ) 和外层细胞( e p 或e ，e p i d e r m i s ) ，每层都仅有一层细胞。 小孢子母缅胞减数分裂前期i 比一般有丝分裂要长，一般还可以分为五个阶段：细线期、 偶线期、粗线期、双线期和终变期。细线期和偶线期的小孢子母细胞明显大于周围的细胞， 呈多面体型，细胞质较浓，细胞中间有一个大的细胞核，并有明显的核仁。每个小孢予母 细胞的细胞壁都很薄，呈直线型( 图版i i t 1 、2 ，图版i i c 1 ) ，它们之间依靠胞间连丝再 相联系( 图片末附) 。这个阶段的绒毡层细胞为单核，细胞呈现不规则的矩形，细胞质也 相对较浓。绒毡层细胞之间以及绒毡层细胞和小孢子母细胞之间也有胞问连丝互相联系。 之6 一 瓤撼 冀嚣害箸禳邮 图4 拟南芥菜早期的花粉囊 在偶线期到粗线期阶段，小孢子母细胞的核仁逐渐偏向细胞核的一边，胼胝质在 小孢子母细胞的细胞壁的边角部分开始沉积，并且胼胝质的沉积基本均匀( 图版i i c 2 、 3 ) 。绒毡层细胞也由于只进行了核分裂而没有进行胞质分裂形成双核，绒毡层细胞的 双核状态将持续很长一段时间( 图版i i b 3 ) 。这个时期的电镜观察结果显示，小孢子 母细胞之间开始出现胞质通道( 图版i i c 4 、5 ) 。胼胝质围绕着每个小孢子母细胞继 续沉积，细胞壁进一步加厚，变得不规则，小孢子母细胞之间的距离变得越来越大， 但小孢子母细胞之间仍然通过胞间连丝相互联系。 随着减数分裂的进行，小孢子母细胞变成具有四个细胞核的结构。在稍晚一点的 时期，多核小孢子母细胞中，细胞核往往处在细胞的周围，呈近似四面体形状分布( 图 版i i a 3 ，图版l i b 4 ) 。胞质分裂初期，少量的胼胝质在小孢子母细胞的单个核之间 开始沉积，更多的胼胝质沉积导致细胞壁向内生长，即向心生长( 未附图) 。绒毡层细 胞中开始出现小液泡，而且细胞壁也开始退化。随着胞质分裂，每个小孢子母细胞产 生四个单一的小孢子，它们呈四面体型排列，因而称为四分体。每个四分体都是被 原始的小孢子母细胞的胼胝质壁以及在胞质分裂过程中和胞质分裂后沉积在小孢子上 厚厚的胼胝质所完全包围( 图版i i c 6 ) 。经过戊二醛处理的压片可以看出四分体的层 次结构( 图版i i a 4 ) ，而在单一的切片上仅可以看到四分体中的两个或三个小孢子( 图 2 7 毂撼 淼船淼惝r 版i i b 5 ) 。在胼胝质壁中，小孢子初生外壁出现，小孢子初生外壁的特殊位点沉积了 一些物质，最终形成孢粉素( 图版i i c 6 、7 ) 。这些孢粉素对塑造成熟花粉的外壤起 决定性作用。 绒毡层细胞分泌的胼胝质酶类物质使胼胝质壁逐渐降解，小孢子被释放，独立的 小孢子在花粉囊中成为自由的个体( 图版i i a 5 ，图版i i b 6 ) 。小孢子的外壁进一步 加厚，小孢子内部的小液泡也逐渐聚集成单一的大液泡，并将细胞核挤到细胞的边缘。 不对称的第一次有丝分裂产生两个细胞的花粉粒( 图版i i a 5 ) 。随着花粉壁的进一步 加厚，花粉表面出现规则的起伏，有沟有脊，也有明显的萌发孔( 图版i i a 6 ，图版 l i b 6 ) 。中层细胞开始变薄，加长。绒毡层细胞也逐渐降解。花粉完全成熟时，最初 的四层花粉囊壁只剩下两层细胞，即表皮细胞和内层细胞，中层和绒毡层细胞都完全 降解。 2 2 野生型拟南芥2 7 下小孢子的发育过程 通过戊二醛固定的花药的压片对照来看，2 7 。c 处理2 4 h r 以上的野生型拟南芥的小 孢子的发育过程与常温下野生型拟南芥小孢子的发育过程基本一致( 图版i i a 卜6 ，图 版i i i a 卜4 ) 。 2 3 拟南芥菜t 册l 突变体2 7 下小孢子的发育过程 拟南芥菜t a m 突变体为温度敏感型突变体，当2 7 。c 处理2 4 h r 以上便可呈现出突 变表型。减数分裂前期i 的细线期，拟南芥菜t a m 突变体的花粉囊也可以划分出五层 细胞：表皮细胞、内皮细胞、中层细胞、绒毡层细匏和小孢子母细胞。细线期和偶线 期的小孢子母细胞明显区别于周围的细胞，呈多面体型，细胞中间有一个大的细胞核， 并有明显的核仁。每个小孢子母细胞的细胞壁都很薄，呈近似直线型( 图版v b 1 ) ， 它们之问存在胞问连丝。 绒毡层细胞进入双核期的初期，小孢子母细胞和前一个时期没有太大区别，仍然 是含有较大细胞核，核仁比较明显，细胞壁为较直的初生细胞壁。但是在某些小孢子 母细胞中，出现些在半薄切片上表现为甲苯胺蓝染色相对较浅( 图版v b 2 、3 ，在 超薄切片上表现为电子反差小、不容易从细胞质中区别出来( 图版v c 1 2 ) 的界限不 明的“细胞壁”。从花粉囊的纵切面上来看，这些界限不明的“细胞壁”更多( 图版 2 8 黧拱 淼黜兹轳弛f v b 3 ) 。从超微结构上看，包裹这些小孢子母细胞的细胞壁很不均匀( 图版v c 3 ) ，小 孢子母细胞和绒毡层细胞之间有胞间连丝相联系( 图版未附) ，小孢子母细胞之间也存 在很多胞间连丝( 图版v c 4 ) ，并且可以看到胞质通道存在( 图版v c 5 、6 ) 。这个时 期绒毡层细胞中可以看到多层同心圆样膜结构( 图版v c 7 ) ，而且在这个时期的切片 中，很容易看到两个小孢子母细胞之间胼胝质沉积不规则。随着小孢子母细胞的进一 步发育，胼胝质在小孢子母细胞的细胞壁的边角部分开始沉积，并逐渐围绕着每个小 孢子母细胞继续沉积，但沉积仍然很不规则( 图版v b 3 、4 ) 。胼胝质沉积继续加厚， 沉积不规则的小孢子母细胞间的细胞壁上仍然存在明显胞质通道( 图版v c 8 ) 。 拟南芥菜t a m 突变体随着减数分裂的进行，小孢子母细胞并不同时形成具有四个 单一细胞核的四核结构，而是先形成一个不正常的中介物二分体( 图版v a 3 ，图 版v b 5 ) 。这个中介物二分体的每一个子细胞有时同时分裂( 图版v a 4 ) ，形成排 在一个平面上的四分体( 图版v a 6 ) ；或者二分体的一个子细胞先分裂，而另外。个 子细胞则处在未分裂状态，形成“三分体”，未分裂的子细胞要比已经分裂的子细胞大 ( 图版v a 5 、8 ) 。这个时期小孢子母细胞的发育非常不同步，可以看到二分体，“三 分体”和四分体同时存在于同一花粉囊中( 图版v b 5 ) 。此时花药之间的发育也不同 步，通过戊二醛处理的花药的压片上，既可以看到小孢子母细胞和二分体、四分体同 时存在( 图版v a 7 ) ，也可以观察到二分体、四分体和花粉粒同时存在的现象( 图版 v a 8 ) 。从这个时期的压片上也可以看出，四个单一的小孢子的排列并不是规则的四面 体型。 小孢子发育的不同步并不是发育的停滞，在t a m 突变体二分体一四分体阶段，每 个单一小孢子的初生外壁的特殊位点也会沉积一些物质，最终形成孢粉素( 图版v c 9 ) 。小孢子的外壁进一步加厚，小孢子内部的小液泡也逐渐聚集成单一的大液泡，并 将细胞核挤到细胞的边缘( 图版v b 6 ，图版v c 9 ) 。绒毡层细胞中存在大量的嗜锇性 小球( 图版v c 1 0 ) 。这些发育不同步的小孢子最终都将发育成成熟的花粉粒，但花粉 粒的大小不一，而且从图版v a 1 0 统计来看，有大约2 0 的花粉粒不饱满，可能成为 不育的花粉。 2 9 ， 熟撼 麓嘉蓑薯器蕊驴子 2 4 拟南芥菜t a m 突变体常温下小孢子的发育过程 拟南芥菜t a m 突变体在1 7 下发育完全正常，跟野生型拟南芥菜没有区别。常温 下( 白天2 5 。c 夜晚2 0 ) ，小孢子母细胞发育的早期野生型和突变体也没有明显区别； 但是当小孢子母细胞发育到四分体阶段，拟南芥菜l a i n 突变体的花粉囊中偶尔会出现 二分体( 图版i v a 3 ) ，四分体有时呈平面排列( 图版i v a 4 ) ，有时呈四面体型排列( 图 版i v a 5 ) 。四分体周围包裹的胼胝质壁被绒毡层细胞分泌的酶类物质降解，单的小 孢子释放，形成花粉粒，花粉粒的大小相对比较均一( 图版i v a 6 ) 。 3 0 黧撼 淼淼高孢r 讨论 1 野生型拟南芥和t a m 突变体拟南芥结实率和发芽率的差异 从图3 中可以看出在室温条件下，野生型拟南芥比t a m 突变体得到的种子数略高， 并且种子的萌发率明显高于t a m 突变体；改变拟南芥的生长温度，即在2 7 。c 恒温光照 培养箱中培养2 4 h r 以上，野生型拟南芥收获的种子数明显高于t a m 突变体，种子萌发 率也相对较高。这表明t a m 突变体虽然仍具有繁殖的能力，但是在一定程度上还是造 成了繁殖能力的损伤，导致产生种子的数量和种子的萌发率都相对降低。 从t a m 拟南芥2 7 。c 图版v a 1 0 统计结果来看，有近2 0 的花粉粒不饱满，这就 说明2 7 处理的t a m 拟南芥花粉的成活率下降。拟南芥s w 突变体( y a n ge t a 1 ， 1 9 9 9 ；s c h i e f t h a l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 、s y n l d i f l 突变体( b h a t te ta 1 ，1 9 9 9 ；b a ie ta l ，1 9 9 9 ) 和 a s y l 突变体( r o s se t a l ，1 9 9 7 ；c a r y le t a l ，2 0 0 0 ) 等都是对大小孢子同时产生影响，导 致植株不育。这种突变也有可能同时影响大孢子的发育和雌配子体的发育，最终也影 响到收获种子的数量及质量。不过这种可能需要通过大孢子发生的细胞学观测或分子 方面的试验进一步证实。 2 野生型拟南芥菜和t a m 突变体拟南芥菜小孢子发生过程中的差异 拟南芥菜t a m 突变体是温度敏感型突变体，它在1 7 下表型正常；在2 2 。c 下偶 有二分体表型；但在2 7 处理2 4 h r 以上，二分体表型占9 0 以上( m a g n a r dp a 1 ，2 0 0 1 w a n ge ta l ，2 0 0 4 ) 。根据戊二醛固定的花粉囊的压片和半薄切片的对比研究表明，野 生型拟南芥菜在室温和2 7 。c 下，小孢子母细胞的发生过程没有区别，并且拟南芥菜t a m 突变体在常温下也没有明显的表型，所以，我们选了择常温下野生型拟南芥菜和2 7 处理2 4 h r 的t a m 突变体做进一步的相应的比较。 从图版i i a 1 、2 ，图版i i i a 1 ，图版i v a 1 、2 ，图版v a 1 、2 可以看出在花粉 发育的早期不管是野生型还是突变体，也不管是室温下还是2 7 。c 处理2 4 h r ，处j 一细 期的花粉母细胞之间似乎没有太大差异。由于是压片，所以不容易得到较早时期的花 一3 1 毂撼 萎蒜蓑薯潞蕊 粉母细胞。从半薄切片来看，减数分裂前期i 的细线期( 图版i i b 1 、2 ，图版v b 1 ) ， 由于突变位点所编码的细胞周期蛋白a ( c y c a l ；2 ) 还没有表达，所以这个时期的小孢 子母细胞和周围的花粉囊各层细胞之间没有太大区别。 2 1 小孢子发生过程中细胞壁的差异 周期蛋白a 通常在g 2 m 期检验点附近出现( l e l l i l e r & o f a r r e l l ，1 9 8 9 ；d e n e l z e n & p i n e s ，2 0 0 1 ；g e l e ye ta l ，2 0 0 1 ) ，而且也在动物的减数分裂前期i 被发现( w o l g e m u t he t a 1 ，2 0 0 2 ) 。然而在减数分裂i 和减数分裂i i 过渡过程中并没有发现周期蛋白a 的存 在( g o ”n c z ye t a l ，1 9 9 4 ；o k a n o u c h i d ae t a l ，1 9 9 8 ；w o l g e m u t he t a l ，2 0 0 2 ) 。高等植物 中既含有周期蛋白a 也含有周期蛋白b ，但是它两者在减数分裂过程中的功能都是未 知的( w a n g e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 的研究表明，c y c a l ；2 是小孢子母细胞 正常减数分裂过程中所必须的，但是仅在减数分裂前期i 和末期i i 之前能够检测到， 并且在减数分裂前期i 的表达量最高，其表达的产物能够调节减数分裂i 和减数分裂 i i 的进程。通过野生型和t a m 突变体e d n a 序列的对比发现，t a m 突变体的5 号外显 子上一个碱基由c 变成t ，致使c y c a l ；2 蛋白的第2 8 3 氨基酸由苏氨酸变成亮氨酸， 进而导致蛋白折叠出现错误，最终导致突变体在粗线期对温度敏感，不能正常的调节 减数分裂的进程。传统上，人们又把减数分裂前期i 具体划分为细线期、偶线期、粗 线期、双线期和终变期5 个时期( 高欢欢，2 0 0 2 ) ，尽管各个时期之间是一个连续的 变化过程，但各个时期都具有各自时期的特点( 郑国铝，1 9 9 2 ) 从本试验的结果来看， 小孢子母细胞的细胞壁在粗线期出现异常现象：围绕某些小孢子母细胞的细胞擘很不 均匀( 图版v c 3 ) ，而且某些小孢子母细胞问的细胞壁上，胼胝质的沉积也很不规则， 出现在半薄切片上甲苯胺蓝染色相对较浅，在电镜下电子密度不高的“界限不明”的 细胞壁( 图版v c 1 、2 ) 。吕洪飞和余象煜( 1 9 9 9 ) 对杉木小孢子发生过程中胼胝质壁 的研究表明胼胝质沉积的不均和缺乏孢粉素导致杉木小孢予败育。这就说明胼胝质壁 的异常也是可能导致小孢子发生过程异常的一个原因。 由于a 型c y c l i n s 是一个多基因家族，每种基因具有不同的功能，并且可能产生非 单一的作用效果，而且这些周期蛋白都不是直接作用于细胞周期( c h a u b e t g i g o t n 。2 0 0 0 ) ；所以这些反常细胞壁的形成可能是c y c a l ；2 的另一种作用形式产生的表 3 2 靶撼 拟甫芥篇蕊秽于 型，也有可能是其它蛋白在细胞周期中起作用的结果。植物的细胞壁并不是简单的结 构，拟南芥小孢子母细胞的细胞壁就是在初生细胞壁的基础上又形成了次生细胞壁。 小孢子母细胞的初生壁是细胞在生长时形成的一层较薄的能随着细胞生长而扩展的 细胞壁，而次生壁的主要成分为胼胝质。不同层次的细胞壁的化学成分不尽相同，初 生壁由纤维素微纤丝网络组成，其中镶嵌了基质多聚体，包括半纤维素、果胶和蛋白 等。兰波特( l a m p o r t ) 和爱波斯坦( e p s t e i m ) 提出的细胞壁“经纬模型”假说，认为 纤维素和伸展素网络之间是通过环绕在微纤丝外的封闭型的伸展素环相互交联起来 的，而不是共价键结合在一起( 颜季琼，1 9 9 9 ) ，胼胝质则在这些初生壁上沉积。另 外细胞骨架影响细胞的形态发生与细胞壁形成，普遍认为周质微管决定着细胞壁微 纤丝的方向。在次生壁形成之前由一些随机排列的周质微管聚集成周质微管束，而这 种周质微管束的排列决定了次生壁沉积的模式( f a l c o n e ra n ds e a g u l l ，1 9 8 6 ；c h a r l e y e l a l , 1 9 9 9 ) 。决定周质微管聚集的因素还不能确定( 贺新强，崔克明，2 0 0 2 ) 。c a ”、钙 调素参与了次生壁形成的调节。c a ”通过对周质微管装配的调节影响次生壁加厚模式 ( f u k u d a & k o b a y a s h i 。1 9 8 9 ) 。拟南芥t a m 突变体中出现“界限不明”的细胞壁，可 能是c y c a l ；2 突变导致和此蛋白相互作用并作用于细胞壁的相关蛋白对细胞壁形成 的调控产生异常；或者破坏了合成纤维素或伸展素的酶类物质造成他们不能正常合成 交联；也许突变导致c a 2 + 或钙调素不能正常的调节决定细胞骨架形成的周质微管的排 列。c y c a i ：2 如何调控细胞壁形成? 通过作用于其它蛋白完成其功能将是今后需要进 - 步研究的问题。我们可以借助酵母双杂交系统分离鉴定和c y c a l ；2 相作用的蛋白 质，以期找到c y c a l ；2 的作用途径。 s t r a u s s 在1 9 9 8 年s c i e n c e 杂志中发表了一篇关于细胞壁的文章，他指出，细胞壁 是决定植物细胞命运的信使，细胞壁输出的信息有助于决定邻近细胞及被它包围住细 胞的性质，它还含有各种各样不为人知的分子信号成分，这些信号分子充斥于细胞壁 的片段中。细胞壁还有可能控制细胞的分化。这一观点已经被很多试验所证明( k r o p l d a r r y ll 吖以1 9 8 8 ；f r e db e r g e re ta 1 ，1 9 9 4 、1 9 9 8 ) 。拟南芥t a m 突变体减数分裂前期 i 中部分细胞壁的异常，可能导致细胞壁的信号途径中断，或者延迟，有可能成为导 致减数分裂前期【粗线期及以后的发育过程延迟的另一个原因。 3 3 毂撼 霾翥羞喜梳嚣黔r 2 2 小孢子发生过程中胞质通道的作用 胞质通道结构在高等植物小孢子发生过程中仅在一个较为短暂的时期出现。首先 在细线期开始出现，偶线期数量逐渐增加，而在凝线期直径扩大，宽度约0 5 - 1 hm ， 最大可以达到3 0 0 0 n m 以上( b a q u a r & h u s a i n ，1 9 6 9 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。当小孢子母细 胞进入粗线期以后，胞质通道又逐步堵塞，数量减少。一旦进入减数分裂中期i ，胞 质通道即行封闭( 聂秀菀，1 9 8 4 ) 。这些胞质通道相对于细胞壁的面积来说是相当大， 可以达到花粉母细胞间细胞壁的2 3 5 ( 郑国锅，1 9 9 2 ) 。本试验的结果表明，无论野 生型拟南芥菜还是t a m 突变体中都有胞质通道的存在( 图版i i c 24 ，图版v c 5 、6 、 8 ) ，但t a m 突变体到了胼胝质沉积基本完成以后仍有明显清楚的通道存在( 图版v c 8 ) ， 并没有如聂秀莞( 1 9 8 4 ) 及王新宇( 2 0 0 2 ) 所述在进入减数分裂中期i 后，胞质通道 便自行封闭。高等植物的小孢子发生过程中出现胞质通道的意义还不清楚，推测认为 这可能与细胞同步化有关( r a g h a v a n ，2 0 0 0 ；m a & p e t e r s o n ，2 0 0 1 ) ，不过也存在异议。 本试验的t a m 突变体为小孢子发生延迟的突变体，最终导致小孢子发育不同步。在此 突变体中胞质通道仍然存在，这就表明拟南芥t a m 突变体中胞质通道并不是细胞同步 化的充分条件。突变体中通道最终封闭的时期的推迟可能与小孢子发育的延迟有关。 也就是说，突变并没有影响到胞质通道的形成，只是在造成小孢子发育过程延迟的情 况下使胞质通道封闭的时期也相应的延迟。 对地钱的研究发现增殖期的细胞壁上偶尔出现胞质通道。在斑马鱼卵子发育过程 中，虽然细胞同样也是成簇为单位存在，并且其中的所有细胞都同步发育，但是非常 有意思的是始终没有发现有胞质通道在这些细胞间存在( s e l m a n e ta 1 ，1 9 9 3 ；m a t o v a & c o o l e y 2 0 0 1 ) 。一些苔藓植物的孢子( b r o w n & l e m m o n ，1 9 8 0 ) 以及裸子植物小孢子母 细胞( v a s i l & a l d r i c h ，1 9 7 0 ) 虽然其减数分裂也是同步的，但是始终没有发现有胞质通 道存在。这些试验证据都表明，胞质通道这种结构对于细胞同步化的实现也是不必要 的。因此，今后仍需要设计合理的技术路线，研究胞质通道在小孢子发生过程中的确 切功能。 2 3 小孢子发生过程中形成四分体的差异 到了四分体时期，常温下试验组，拟南芥菜野生型进行同时型减数分裂，即减数 3 4 翘撼 萎鐾嘉韶笛搿泡f 分裂的第一次分裂后不形成细胞壁，没有二分体时期，而在第二次分裂完成州，在四 个子核之间同时形成细胞壁，分割成4 个细胞，形成标准的四面体( 图版i 工a 4 ，图 版l i b 5 ) 。而2 7 。c 处理2 4 h r 以上的t a m 突变体中某些细胞的分裂模式已经发生了转 变，他们进行连续型减数分裂，即减数分裂的第一次分裂后立即形成隔壁，将小孢子 分为两个细胞，可称为二分体，接着进行第二次分裂，形成4 个细胞，但是，可能是 由于周期蛋白a 的影响，2 7 4 c 处理的t a m 突变体的第二次减数分裂可能同时进行( 图 版v a 4 ) ，也可能二分体中的某一个细胞先进行第二次减数分裂，形成“三分体”( 图 版v a 5 ) 。最终由于分裂模式的改变，在同一平面上形成四分孢子( 图版v a 6 ) 。连 续型多出现在单子叶植物中，而双子叶植物主要为同时型。 小结 本论文通过试验得到以下结果： 1 、证实t m a g n a r d 等( 2 0 0 1 ) 的结论：t a m 突变导致小孢子发育延迟、减数分裂才i 同步、 二分体表型和花粉异质性增加、活力下降。 2 、由于m a g n a r d 等( 2 0 0 1 ) $ 口w a n g 等( 2 0 0 4 ) 并没有在细胞结构上对t a m 突变体进行检 测。我们通过半薄切片和透射电镜的观察，发现突变体小孢子母细胞在偶线期到 粗线期发育阶段，出现“界限不明”的细胞壁。这可能是c y c a l ；2 的另一种作用 形式产生的表型。 3 、通过透射电镜的观察，发现t a