（细胞生物学专业论文）鱼类tlr1和digirr基因的克隆和表达研究.pdf

浙征大学硬士学位论文 摘要 t l r - i l - 1 r ( i 讯) 超家族成员在介导免疫反应中具有非常重要的作用，其 共同特点是胞内区都含有一个t i l t 保守结构域t i r 超家族主要分为两个亚群： 一个亚群是胞外区富含亮氨酸重复序列( l r r ) 的受体，即t o l l 样受体亚家族； 另一个是胞外区含有免疫球蛋白( i g ) 结构域的受体，即i d l 受体亚家族；第 三个亚群由信号通路下游接头分子组成，印m y d 8 8 亚家族。t l r l 和s i g i r r 都 是t i r 超家族的成员，分别属于t i r 家族的t o l l 样受体亚家族和i d l 受体亚家 族。t l r l 是t l r 家族的重要成员之一，属于病原相关分子模式( p a m p ) 识别 受体，t l r l 可与t l r 2 形成异源二聚体从而识别三酰基脂肽和真菌的一些产物。 d i g i r r 是哺乳动物s i g i r r 的同源体，是t i l t 超家族中新发现的成员，属于孤 儿受体，目前认为s i g i r r 主要在t i r 超家族成员信号通路中起负调控作用。本 研究在河豚中成功克隆了2 个新基因，t l r l 基因( t n t l r l ) 和d i g i r r 基因 ( 1 陆d l g “t ) 。 t n t l r lc d n a , a f 列长2 5 8 7 b p ，其中5 u r t 长1 2 2 b p ，3 u t r 长7 4 b p ，o r f k 2 3 9 1 b p 。t n t l r l 基因编码由7 9 6 3 k 氨基酸组成、分子量为9 0 6 9 k d a 、p f 为8 4 3 的 多肽。在t n t l r l 多肽序列上存在多个潜在活性位点，包括1 3 个蛋白激酶c 磷酸 化位点，9 q - r q 端糖基化位点，1 个细胞黏附序列，3 个酪氨酸激酶磷酸化位点， 1 3 个酪蛋白激酶磷酸化位点，4 个十四酰基化位点。t n t l r l 具有l r r 结构域受 体亚家族的共同特征，胞外区5 8 21 氨基酸，包括5 个l r r 结构域；胞内区1 5 7 个 氨基酸，具有典型的t i r 结构域；此外，还具有5 7 个氨基酸的跨膜区和长2 3 个氨 基酸的信号肽序列。t n t l r i 在正常组织中为组成性表达，l p s 诱导并不能显著 改变r n r 1 在这些组织中的表达量。序列比对显7 贰- t n t l r l 与其它物种t l r l s 之 问有较高的氨基酸相似性，说明t l r l s 在进化中具有高度的保守性进化树分析 表明鱼类t l r l s 基因很有可能是哺乳动物t l r l 、t l r 6 和t l r l o 基因在进化过程 中的共同祖先，为研究鱼类t l m s 在进化和免疫反应中的作用打下了基础。 t n d i g i r rc d n a 序列长1 9 1 6 b p ，其中5 u t r 长1 1 2 b p ，3 u t r 长2 2 9 b p ， o r f 长1 5 7 5 b p 。t n d i g i r r 基因编码由5 2 4 个氨基酸组成、分子量为5 8 0 5 k d a 、 p ，为6 5 4 的多肽。在t n d i g l r r 多肽序列上的潜在活性位点包括6 个蛋白激酶 c 磷酸化位点，7 个n 端糖基化位点，8 个酪蛋白激酶i i 磷酸化位点，5 个十四 酰基化位点t n d i g i r r 同样具有l g 结构域受体亚家族的共同特征，胞外区2 3 6 个氨基酸，包括两个i g 结构域；胞内区2 7 2 个氨基酸，具有典型的t i r 结构域； 此外，还具有1 6 个氨基酸的跨膜区和长1 6 个氨基酸的信号肽序列。t n d i g i r r 在健康鱼所选组织中为非组成性表达，心脏、脑、皮肤和肝脏表达量较高，鳃和 肠组织中表达量稍低，而在肌肉中不表达。基因结构分析、多序列比对和进化树 分析都表明，鱼类d i g i r r 有其特殊性，主要表现在胞外区带有一段信号肽，与 3 浙江大学硕士学位论文 哺乳动物中对t l r s 信号通路起负调控作用的s i g i r r 结构不同，含有两个l g 域， 提示鱼类d i g i r r 胞外区很可能有接收信号的功能；另一方面，鱼类d 1 g i r r 胞 内t i r 结构域中对信号转导起关键作用的两个氨基酸残基只突变了一个，这种 胞内区保留的i l - 1 r 类似结构提示鱼类d i g i r r 也存在信号转导的功能。总之， d i g i r r 胞内和胞外结构所存在的特殊性，为鱼类d i g i r r 在功能特异性的研究 提供了一定的线索 关键词：河豚、t n t l r l 、t n d i g i r r 、基因克隆、组织分布、进化分析 a b s t r a c t m e m b e r so ft h et l r i l - 1 rs u p e r f a m i l y , d e f i n e db yt h ep r e s e n c eo fa ni n t i a c e l l u l a r t o l l i l - 1 r ( t i r ) d o m a i n , a r ci m p o r t a n ti nm e d i a t i n gi m m u n er e s p o n s e s b a s e do n e x t r a c e l l u l a rd o m a i n s , t h i ss u p e f f a m i l yc a nb ed e i v e d e di n t ot h r e es u b g r o u p s t h e f i r s tc o n t a i n se x t r a c e l h i l a ri m m u n o g l o b u l i n0 9 ) d o m a i n sn a m e di l - 1 rs u b f a m i l y t h e s e c o n di st l r s , w h i c hl a c kl gd o m a i n s , b u th a v ee x t r a c e l l u l a rl e u c i n e - r i c hr e p e a t s t h et h i r d s u b g r o u pc o n s i s t s o fu p s t r e a m a d a p t e rm o l e c u l e s , i n c l u d i n gm y d 8 8 ， m y d 8 8a d a p t e r - l i k e ( m a l ，a l s ok n o w n a st m a p ) a n dt i r d o m a i n - c o n t a i n i n ga d a p t o r t l r la n ds i g i r ra r eb o t hm e m b e r so ft i rs u p e r f a m i l y ，b e l o n g i n gt ot h et l r s u b f a m i l ya n di d i rs u b f a m i l yr e s p e c t i v e l y a sa ni m p o r t a n tm e m b e ro ft l r s , t l r li sk n o w na sp a m pr e c o g n i t i o nr e c e p t o r , i n v o l v i n gi nt h er e c o g n i t i o no f n - i a c y l a t e dl i p o p r o t e i ma n dm y c o b a c t e r i a lp r o d u c t sb yb i n d i n gt ot l r 2t of o r ma h e t e r o d i m e r a no r p h a nr e c e p t o r , s i g l r r ，h a sb e e ni d e n t i f i e da san o v e lm e m b e ro f t h et i rs u p e r f a m i l y , i n v o l v i n gi nt h en e g a t i v er e g u l a t i o no ft h et i rs i g n a l i n g p a t h w a y s d i g i r ri sah o m o l o g yo fm a m m a l i a ns i g i r r a n de x i s t so n l yi nf i s h h e r ew er e p o r t e dt w on o v e lg e n e st l r la n dd i g i r ri nt e r r a o d o nn i g r o v i r i d i t h ec l o n e dt n t l r lc d n ae x h i b i t e d2 5 8 7b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n sa1 2 2 b p5 u n t r a n s l a t e dr e g i ( 1 j t r ) ，a2 3 9 1 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) a n da7 4b p3 u t r t n t l r lj sc o n s t i t u t i v e l yd e t e c t a b l ei nv a r i o u st i s s u e sa n do r g a n ss e l e c t e d , a n dt h e l e v e l so ft h et r a n s c r i p t si n c r e a s e di ns p l e e na n dh e a r ta f t e rl p ss t i m u l a t i o n s g e n e o r g a n i z a t i o no ft n t l r li ss i m i l a rt om a m m a l i a na n da v i a n , a n dah i g hd e g r e eo f c o n s e r v a t i o no fc h r o m o s o m es y n t e n ye x i s t sb e t w e e nt h e m t h ep r o t e i ns e q u e n c e s h a r e s3 3 7 - 7 7 3 i d e n t i t yw i t hk n o w nt l r lm e m b e r s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s g r o u p e dt n t l r lw i t ho t h e rf i s ht l r so nas e p a r a t e db r a n c h , e x c l u d e df r o m m a l n m a l j a na n da v i a nt u t l s t n t l r lw i t h7 9 6a m i n oa c i d sh a sac a l c u l a t e d m o l e c u l a rm a s so f9 0 6 9k d aa n dat h e o r e t i c a lp ，o f8 4 3 s t r u c t u r a l l y ，t n t l r lh a sa 浙扛大学硬士学位论文 t o 砌i n t c r l e u k i n - ir e c e p t o rc r i r ) d o m a i n , at r a n s m c m b r a n cd o m a i na n dl e n c i n o - f i c h r e p e a t d o m a i nw h i c ha l et h eh a m 咖恼o ft l r 缸n i l y 1 h y l o g e n e t i ca n a l y s i s p r o v i d e da ne v i d e n c et h a tt h et n t l r lw a sv e r yc l o s et om a m m a l i a nt l r l ，6a n d1 0 a n ds e e m e dt ob et h e i rc o m m o na n c e s t o r t n d i g i r re d n ae x h i b i t e d1 9 1 6b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n sa1 1 2b p5 u n t r a n s l a t e dr e g i o nc o r g ) , a1 5 7 5 b po p e nr e a d i n gf l a m e ( o r f ) a n da2 2 9b p3 町r r t n d i g i r rw i t h7 9 6a m i n oa c i d sh a sac a l c u l a t e dm o l e c u l a rm 磷o f9 0 6 9k d aa n da t h e o r e t i c a lp ro f8 4 3 s t r u c t u r a l l y , t n d i g i r rh a sa 1 1 喂d o m a i n , at r a n s m e m b r a n e d o m a i na n dt w o i gd o m a i n sw h i c h a l et h eh a l l m a r k so ft b es e c o n d 翔0s u b g r o u p 珏e p r o t e i ns e q u e n c es h a r e s3 1 9 住o i d e n t i t y 奶t hk n o w ns i g i r rm e m b e r s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sg r o u p e dt n d i g i r rw 训ho t h e rf i s hd i g i r ro nas e p a r a t e d b r a n c h , e x c l u d e df i o mm a m m a l i a na n da v i a ns i g i r r 删g 诹i sh i g h l y 颤芦骼s c d i nt h eh e a r t ，b r a i n s k i na n dl i v e r ；, m o d e r a t e l ye x p r e s s e di nt h e 班a n di n t e s t i n e ；a n d n o te x p r e s s e di nm u s l e g e n eo r g a n i z a t i o n , m u l t i p l ea l i g n m e n ta n ds i g n a lp e p t i d e p r e d i c t i o ns h o w st h a tt n d i g i r rp r o t e i nh a sap u t a t i v es i g n a ls e c r e t i o np e p f i d e1 2 3 a ai ni t sn - t e r m i n a li e g i o l lw h i l et h e r ei sn op r e d i c t a b l es i g n a lp e p f i d ei nm a m m a l i a n a n da v i a n ；t n d i g i r rp r o t e i nh a sad r a m a t i c a l l yl o n ge x t x a c e l l u l a rr e g i o no f2 6 0a a w h i c h c o r r e s p o n d st w oi gd o m a i n si n s t e a do fs i n g l eo u ci nh i g hv e r t e b r a t ej u s ta si t s u m eg o e s ；n cs p e c i f i ca m i n oa c i ds e r , w h i c hw c r cc h a r a c t e r i z e dt ob ee s s e n t i a lf o r t h es i g n a l l i n go ft h em - l r i ，i sc o n s e r v e di na l lt h r e ef i s hd i g i r rb u ta l lc h a n g e dt o c y si nh i g hv e r t e b r a t e ( i n c l u d i n g d a n o ) 1 1 l cd r a m a t i cf e a t u r e so f s t r u c t u r ei n d i c a t e d t n d i g i r rm a y p o s s e s s e dt h ea b i l i t yo fr e c o g n i z i n gc y t o k i n ea n db ea b l et os i g n a la s i d i r - i 浓ec o m p o n e n t s i nc o n c l u s i o n , t h eo v e r a l lc h a r a c t e r i z a t i o n so ft n t l r la n dt n d i g i r r , i n c l u d i n g s e q u e n c e ，s t r u c t u r e ，s y n t e n y , l o c a t i o n , f u n c t i o n a ld o m a i n sa n de x p r e s s i o np a t t e r n w e r ea n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec l o n e dt n t l r la n dt n s i g i r ra g eb o t h o r t h o l o g n eo fm a m m a l i a na n da v i a nt l r la n dd 1 g i r rr e s p e c t i v e l y 佻w o r kw i l l c o n t r i b u t et oo u rf u r t h e ru n d e r s t a n d i n go ft h ef l m c t i o ua n de v o l u t i o no ft h i st i r s u p e r f a m i l y k e y w o r d ：t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i ，t n t l r l ，t n d i g i r r , s e q u e n c e sr e t r i e v a l ，c d n a c l o n i n g , t i s s u ee x p r e s s i o na n a l y s i s , e v o l u t i o n a r ya n a l y s i s s 渐扛大学硬士学位论文 第_ 部分实验研究 第一章河豚t i a t l 基因( t n n 脚) 的克隆及表达研究 一引言 天然免疫是机体免疫重要的组成部分，但是长期以来被认为是免疫应答的一 种低等形式，但是随着对免疫系统的深入认识，发现天然免疫并不是简单地发挥 非特异吞噬、清除作用，而是涉及复杂地抗原识别机制，与获得性免疫一样能够 正确区分“自己”和“非己”，并且进一步调控获得性免疫。它存在于所有的生物体 中，可以应对多秭病原体的感染，如病毒，细菌，真菌或者原虫，对病原体的识 别过程和对病原体的防御机制非常保守，从无脊椎动物到人类，甚至在一些植物 中都存在天然免疫天然免疫的识别系统是由能够识别病原相关的分子模式 ( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a n e r n ，p a m p ) 的模式识别受体( p a t t e r n r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s , p r r s ) 介导的 j a n e w a yc aj r ，1 9 8 9 ，这些受体信号转导所 激活的通路控制着各种免疫应答所要表达的基因。 t o l l 样受体( t o l l 1 i k er e c e p t o r , t l r s ) 就是一种模式识别受体，可以识别病 原微生物进化中保守分子，如脂多糖( u 珞) 、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生 物的核酸等等。t l r s 是首次在果蝇中发现的一类细胞膜蛋白，果蝇中称为t o l l 蛋白，参与果蝇胚胎发育时背腹极性的建、- 6 - h a s h i m o t o , ce ta l ，1 9 8 8 ；a n d e r s o n k ve ta 1 ，1 9 8 5 。随后1 9 9 7 年m e d z h i t o v 等 m c d z h i t orc ia 1 ，1 9 9 7 用图位克隆方 法克隆到了入类的第一种t o l l 同源变体( t o h 1 i k et c c e p t o r4 ，t l r 4 ) ，后又发现 了至少1 0 种人的t l r 家族蛋白，分别被命名为t l r l 1 1 。其中t l r l 6 f f l r 2 可以 形成异源二聚体，对细菌的脂蛋白或肽聚糖产生反应；t l r 3 - 5 ，t l r 7 和t l r 9 可以分别识别双链r n a 、l p s 、细菌鞭毛和非甲基化的c p gd n a 基序 m u s h e g i a n ， aa n dr m e a z h i t o v , 2 0 0 1 ；觚s ，a n ds s a t o , 2 0 0 3 ，t l r 家族成员的具体配体 情况可见第二部分文献综述。 t l r 家族成员均属i 型跨膜受体蛋白，结构分为胞外区、跨膜区和胞质区。 胞外区由1 8 - - 3 1 个富含亮氨酸的重复序列( 1 e u c i n c - r i c hr e p e a t ，l r r ) 和半胱氮酸 结构( 半胱氨酸残基形成链内二硫键) 所组成，该区为序列多变的1 9 样结构域， 与病原体及其产物的特异性识别有关，其空间结构的细微变化就会影响t l r s 对 病原相关分子模式( p a m p ) 的识别。t l r s 家族成员的胞外区之间存在较大的差异 性，如t l r l 和t l r 4 的胞外区仅有2 4 同源，这可能是不同配体激活不同受体的 结构基础。胞质区大约为2 0 0 个氨基酸，与i l - i 受体的胞质区相似，因而被称为 t o l i i l - 1 受体同源区( t o l i i l - 1r e c e p t o rh o m o l o g o u sr e g i o n , t i r ) ，是t l r s 向下游 传递信号的核心元件 m a r t i nm u a n dw e s c h eh ，2 0 0 2 1 ( 图1 ) 。1 f l 受到配体刺激 后，t i r 结构域可以吸引接头蛋 刍m y d 8 8 、t 1 r a p 或t r i f i a k i r a ，s a n ds s a t o , 6 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 3 ；b a r t o n , g m a n dr m e d t h i t o v , 2 0 0 3 ；o n c i 址l 九e ta 1 ，2 0 0 3 1 。这些接头蛋 白和1 1 r s 类似，均含有t i r 结构域，在激活n f - w b 转移的过程中发挥重要的作用， 继而激活前炎症因子的转录，i l - 1 r 和t l r s 的结构及其介导的信号通路见图 2 s h l z u o a k i r ae ta 1 ，2 0 0 4 t l r s 不仅在天然免疫系统中发挥重要的作用，而且还调节获得性免疫。目 前在果蝇中，t o l l 受体在先天性免疫中的作用研究已经十分深入 h o f f m a n a , j a a n dj m r e i c h h a r t , 2 0 0 2 ，脊椎动物中t l r s 的研究主要集中在人和小鼠中，而在 鱼类中对t l r s 的研究还十分有限，仅有红鳟鱼t l r 3 和t l r 5 ，牙鲆t l r 2 和 t l r 2 2 ，金头鲷t l r 9 全长c d n a 的克隆，而斑马鱼和f u g u 中只预测了t l r s 的部 分序列，包括t l r l - 9 , 5 s ，1 8 - 2 2 ，这些研究为t l r 家族在鱼类中的存在提供了证 据【m er o d r i g u e ze ta 1 ，2 0 0 5 ；t s u j i t a , te ta 1 ，2 0 0 4 ；i k u oh i r o n oe ta 1 ，2 0 0 4 ； r a f a e l l af r a n c he ta 1 ，2 0 0 6 ；h i r o y u k io s h i u m ie ta 1 ，2 0 0 3 ；a n n e m a r i eh m e i j e re t a 1 ，2 0 0 4 ；o l r i lj a u l t le ta 1 ，2 0 0 4 ，对鱼类t l r s 功能的研究尚在深入当中近来， 随着河豚( t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i ) 基因组计划的完成，人们发现该基因组是已知 全基因组序列的脊椎动物中最小的，只有大约3 5 0 m b j a i l l o n , 0 e ta 1 ，2 0 0 4 】。与 人类和斑马鱼庞大的基因组( 3 2 和1 6b i l l i o nb p ) 相比， 河豚的基因组仅相当于 人和斑马鱼基因组的1 8 和1 4 c r o l l i u s , h r e ta 1 ，2 0 0 4 l ，而其中含有的基因数目 约2 7 9 1 8 + ，与人类基因组中包含的基因数目大体相当。因此，河豚是一个非常 好的模式生物，可以用来研究人类基因组、比较基因组学和分子免疫的系统进化 等相关问题。我们利用河豚基因数据库及生物信息学方法，成功鉴定了t l r l 基 因( 砌r 1 ) ，并对其进行了序列分析、基因结构分析和组织分布研究。研究结 果为今后进一步研究鱼类1 1 且1 及t l r 家族基因功能奠定了基础。 图1t o l l - f i k e 受律( t l r s ) 和i u t e r l e u l d n 1 受体( i l - i r s ) 结构域 1 1 j 黜和i i ，l 凡都存在一个较保守的胞质区域一1 r i r 结构域t i r 结构域中存在三个同源类 似区：b o x l 。2 和3 这些分子的胞质区相似，但是其胞外区却明显不同：t l 嫦l r r 正向 重复区，i l - i l t s 有三个i g 样结构域 7 浙江大学硬士学位论文 二实验材料和方法 1 实验材料 1 1 实验鱼：i 龄河豚( t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i ) ，体重4 6 克，长4 5 厘米，购 自杭州水产市场，实验前置水族箱饲养l 2 周，确认健康后使用。 1 2 菌株和质粒：e c o i ld h s a 菌株、t o p l 0 菌株由本实验室保存。 1 3 引物：所有引物均由h i 缸o g 公司上海分公司合成。 1 4 试剂和试剂盒 r n a 酶、l p s 购s i g m a ；琼脂糖购i 刍s a n l a n d - c h c mi n t e r n a t i o n a ll n c ：i p t g 、 x - g a l 购i 刍b b i ：d n am a r k e ri i 、d n am a r k e r 购自天为时代；d n at a q 酶、 d n t p 和p c rb u f f e r 购自北京鼎国生物技术有限责任公司；总r n a 纯化试剂盒 t r i z o l 购i 刍i n v i t r o g c n ；反转录试剂盒r n ap c rk i t ( a m v ) v c r 3 0 、t r a c e 试剂 盒3 f u hr a c ec o r es e t 、5 r a c e 试剂盒5 - f u l lr a c ec o r es e t 以及p c r 产物纯化 试剂盒a g a r o s eg e ld n af r a g m e n tr e c o v e r yk i tv e t 2 0 、t 4 伪q a 连接酶、e xt a q 酶购自t a k a r a ；氨苄青霉素、卡那霉素、l b 液体培养基粉剂，l b 固体培养基粉 剂以及t a 克隆试剂盒t - v c c t o rp c rp z o d u c tc l o n i n gl ( i t ，购自上海生工；其它试 剂均为国产分析纯。 1 5 仪器设备 商速冷冻离心机( s i g m al a b o r a t o r yc c n t i i f i l g 娼) ；离心机( c e n t r i f u g e5 4 1 5d e p p c n d o f f ) ：p c r 仪( e r c - l o op c l t i c rt h e r m a lc y c l e ) ：凝胶成像分析系统( g e ll o g i c 2 0 0i m a g i n es y s t e m ) b 浙江大学硬士学位论文 1 6 主要数据库和软件 美国国立生物技术信息中心i q c b i g c n b a n k 数据库；h p ：w w w n c b i n l m n l h g o v m a pv i e w e r ：h t t p ：w w w n c b i n l m 】a i h g o v m a p v i e w e n s e m b l ：h t t p ：w w w e n s e m b l o r g u c s c ：h t t f , w w , v ，g e n o m e u c s c c d u t i g rg e n ei n d i c e s ：h t t p ：w w w t i g r o r g t d b t g i 黑青斑河豚基因组数据库：h t t p ：w w w g e n o s c o p c c 1 1 s f x e x t c m e t c t r a n c w 斑马鱼( d a n i or e r i o ) 序列数据库：h t t p ：w w w s a n g c r a c u k e r o j 删o f u g u 基因组数据库；h t t p ：g e n o m c j g i - p s f o r g f u g u 6 f u g u 6 h o m e h t m l s t c j r e b a 吐基因组数据库：h t t p ：w w w e n s e m b l , o r g g a s t e r o s t e u s _ a c u l e a t u s s w i s s p r o t 蛋白质数据库：h t t p ：w w w e x p a s y o r g s p r o t 核酸序列同源性分析软件：b l a s tq t l p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 基因预测软件：g e n s c a n ( h t t p ：g e n c s m i t c d u g e n s c a n h t m l ) 功能位点分析：p r o s i t e ( h t t p ：w w w e x p a s y c h p r o s i t e ) 信号肽预测软件：s i g n a l pv c r 3 0a th t t p ：w w w c b s d t u d k s c r v i c e s 序列匹配分析软件；c l u s t a lw 1 8 进化树预测软件：m e g a ( v e r s i o n3 ) 引物设计软件：p r i m e rp r e m i e r5 0 2 实验方法 2 1t l r l 基因的序列预测 利用生物信息学方法，以人类t l r l 基因的蛋白质序列( g e n b a n ka c c e s s i o n n u m b e r ：n p0 0 3 2 5 4 ) 为查询序列，在s w i s s p o r t 数据库中进行b l a s t ，得到黑青 斑河豚1 号染色体上的一个s c a f f o l d ：s c a f l 4 9 4 4 ，在黑青斑河豚基因组数据库中 找出s c a f l 4 9 4 4 的序列，用g 日临c a n 分析，得到的所有预测蛋白质用s w i s s p o r t 数据库进行b l a s t ，其中一个与哺乳动物的t l r l 有很高的同源性利用基因共线 性原理，将人和黑青斑河豚的基因连锁关系对应起来，找到t l r 的具体位置和序 列( 图3 ) 。 2 2 总砌蛆提取及质量检测 2 2 1m 峨提取 取河豚组织剪碎转移到匀浆器中，组织样品按5 0 - 1 0 0 r a g n , 1t r i z o l 加入1 血o l 研磨；1 5 - 3 0 c 放置5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；4 c ，l o , o o o x g 离心1 0 分钟，取上清；每使用l m l1 h z o l 加0 2 m l 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡1 5 秒，室温 放置3 分钟；4 1 0 , 0 0 0 x g 离心1 5 分钟，取上层水相转移到新管中，每使用l m l t r i z o l 加入0 5 m l 异丙醇，混匀，室温放置l o 分钟；4 c 1 0 ，0 0 0 x gr p m 离心l 吩钟， 9 浙江大学硬士学位论文 去上清，加l m l7 5 7 醇洗涤，每使用l m lt r i z o l 至少加1m l t 醇；4 c 不超过 7 , 5 0 0 x g 离心5 分钟，弃上清；室温放置5 - 1 吩钟晾干，加2 0 f l l 水5 5 - - 6 0 ( ? 放置1 0 分钟溶解r n a ，一舳保存 。 觜訾 图3 黑青斑河豚与a 类t l r l 基因共线性关系 2 2 2r n a 质量检测 测o d 值定量r n a 浓度：外分光光度计测定提取的总r n a 的提取量， o 】b 胡d d 瑚= 1 8 以0 ，提取的总鼢渔较纯。r n a 电泳：取l u l 总r n a ，加2 u l 溴酚 兰指示剂，在1 2 琼脂糖凝胶中稳压1 0 0 伏电泳2 0 分钟，电泳缓冲液为0 5 x t a e 。 电泳完毕后，用凝胶成像分析系统拍照并分析一般来讲，若2 k s 和1 8 s 条带明 亮、清晰、条带锐利，且2 8 s 的亮度在1 8 s 条带的两倍以上，r n a 的质量较好， 可用于后续实验 2 3 第一链c d n a 的合成 真核细胞的m r n a 毛e 3 端存在叫y a 尾巴，o l i g od t 能够与m r n a 的p o l y a 互幸b 结合用l 腭前面提取的总r n a 作为模板，按照3 f u l lr a c e c o r es e 斌剂盒合成 第一链c d n a ，按下列组成配制反转录反应液： 1 0 x r n ap c rb u f f e rh l m902(25mm)2in d n t pm i x t u r e ( 名- 1 0 m m ) m l a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 5 u 芦i ) 一 0 5 脚 r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u 4 1 ) 0 2 5 d o l i g od t - 3 s i t e sa d a p t o rp r i m e r ( 2 5 m m ) o 5 , l r n a l p g r n a s cf r e 宅d h 2 0 补足到1 似l 按以下条件进行r t 反应：4 2 ，4 0 分钟；9 9 ，5 分钟：5 c ，5 分钟。r e v e r s e 1 0 m l l 一n 浙江大学硕士学位论文 t r a n s c r i p t a s e 能与c d n a 结合，对p c r 反应有阻碍作用因此，进行p c r 反应前， 必须进行9 9 加热5 分钟使r e v e r s et r a n s c r l p t a s e 失活 根据生物信息学预测的t n t l r l 基因序列设计特异性引物进行p c r 扩增基因 片段，实验中所用的特异性引物及通用弓l 物见表1 表1 p c r 克隆t u t l r ! 所用引物 2 4t n t l r l 全基因序列的克隆 2 4 1t n t l r l 基因序列的中间片断的扩增 以前面合成的第一链c d n a 为模板，分别用引物t l r l f 2 、t l r l - f 3 、 t l r l 一f 4 、t l r l f 6 、t l r l - r 1 、t l r l - r 2 和t l r l - r 3 扩增t n t l r l 基因序列的中 同片断。p c r 反应均采用5 0 “l 标准体系： 1 0 x p c rb u f f e r ( 含m 矿+ ) 驯 d n t p ( 各1 m m )1 血l t a q 酶( 5 u 一1 )埘 模板-1 正d 上游引物( 1 0 m m ) 2 f l 下游引物( 1 0 m m )知l 灭菌蒸馏水补足到5 0 “l 按照下列参数进行p c r 反应：首先9 4 c 预变性4 分钟，随后9 4 c 变性3 0 秒， 1 l 浙征大学硬士学位论文 5 6 退火3 0 秒，7 2 延伸3 0 秒，共4 0 个循环，最后7 2 延伸1 0 分钟 2 4 2t u t l r l 基因序列3 端和5 端的扩增 t n t l r l 基因3 端序列的扩增采用3 r a c e 与半套式p c r 相结合的方法，首先 以前面合成的第一链c d n a 为模板，以3 s i t e sa d a p t o rp r i m e r 和t l r l - f 2 为引物进 行第一轮p c r 反应，接着以第- - 轮p c r 的产物为模板，以3 s i t e sa d a p t o rr r i m e 和 k f 2 - f 3 为引物进行第二轮p c r 扩增目的片段t n t l r l 基因5 端序列利用生物信 息学的方法预测得到，根据序列设计了特异性引物t l r l - f 7 和t l r l - r 4 进行扩 增，也可以利用5 r a c e 的方法扩增。p c r 反应体系及参数都同上 图43 r a c e 和s ，r a c e 原理 2 4 3p c r 产物的检测 取5 u lp c i t 产物，加2 u l 溴酚兰指示剂，在1 2 琼脂糖凝胶中稳压1 0 0 伏电泳 3 0 分钟，电泳缓冲液为0 s x t a e ，凝胶成像分析系统拍照分析。 2 4 4p c r 产物的纯化 按照p 僳产物纯化试剂盒a g a f o 辩g e ld n af r a g m e n tr e c o v e r yk i tv e r 2 o 说 明进行纯化。 2 4 5t _ a 克隆 使用t a qd n a 聚合酶扩增的p c r 产