（细胞生物学专业论文）鲤鱼tlr22基因的分子克隆及功能研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 鲤鱼t l r 2 2 基因的分子克隆及功能研究 中文摘要 t o l l 受体首先在果蝇中报道，研究发现其在果蝇的胚胎发育和天然免疫中发挥作用。 后来，在脊椎动物中发现与果蝇t o l l 受体结构相似的蛋白，命名为t o l l 样受体( t l r s ) 。 t l r s 在天然免疫中起着重要作用，并且能够激活适应性免疫，是联系天然免疫和适应性 免疫的桥梁。髓样分化因子8 8 ( m y d 8 8 ) 作为白介素i 受体t o l l 样受体超家族信号通路 中的一员，是t l r s 信号通路中的一类重要接头分子。 本研究以鲤鱼为研究对象，采用分子克隆和s m a r tr a c e 技术获得鲤鱼t l r 2 2 c d n a 全长，并分析了其在有关组织中的分布情况；通过鳗弧菌刺激实验，r e a l t i m ep c r 技术检测t l r 2 2 基因和m y d 8 8 基因( 本实验室已经克隆) m r n a 表达水平的变化；在 体外将t l r 2 2 的部分编码序列连接到p e t - 2 8 a ( + ) 表达载体上，而后转化大肠杆菌 b l 2 1 ( d e 3 ) ，利用表达的外源蛋白制备抗原，免疫新西兰雄兔，得到抗血清，蛋白质印迹 显示所得到的抗血清能够与抗原发生特异性结合。获得结果如下： ( 1 ) t l i 也2c d n a 序列全长3 3 2 5 b p ，其中5 - u t r 为5 6 b p ，3 - u t r 为4 3l b p ，o r f 长2 8 3 8 b p 。t l r 2 2 基因编码的蛋白质由9 4 5 个氨基酸组成，其分子量为1 0 8 2 4 k d a 、p i 为8 7 3 3 。t l r 2 2 具有l r r 结构域受体亚家族的共同特征，胞外区含7 4 0 个氨基酸残基， 包括1 6 个l r r 结构域；胞内区含1 7 2 个氨基酸残基，具有典型的t i r 结构域；此外， 还具有2 3 个氨基酸的跨膜区和2 2 个氨基酸的信号肽序列。 ( 2 ) t l r 2 2 和m y d 8 8 基因m r n a 在健康鲤鱼所选组织中为非组成性表达，在后肠、 脾脏、肾脏、鳃和口腔上皮中表达量较高，在前肠和皮肤中表达量较低，而在肌肉中未检 测到其表达。氨基酸结构分析、多序列比对和进化树分析都表明，t l r 2 2 与其他物种t l r s 之间有较高的氨基酸相似性，其中，与金鱼t l r 2 2 的同源性最高( 达8 8 6 ) 。采用鳗弧 菌刺激鲤鱼0 、0 5 、1 、3 、5 、7 天，r e a l t i m ep c r 检测表明t l r 2 2 基因和m y d 8 8 基因 m r n a 在前肠、后肠、鳃和皮肤中的表达均有不同程度的上调，揭示t l r 2 2 和m y d 8 8 在鲤鱼粘膜免疫中发挥着重要的作用。 ( 3 ) 以鲤鱼鳃c d n a 为模板，利用r t - p c r 扩增得到t l r 2 2 的部分编码序列，经 e c o ri 、h i n d 1 双酶切后连接入p e t - 2 8 a ( + ) 原核表达载体中。将重组质粒转化大肠杆菌 表达菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用l m m 的i p t g 诱导目的蛋白表达。s d s p a g e 结果显示，重组菌 山东师范大学硕士学位论文 经i p t g 诱导后表达融合蛋白，其分子量为3 8 17 k d a 。进一步实验分析表明，在3 7 。c 条 件下经l m mi p t g 诱导6 h 时蛋白表达量最大，表达的蛋白大部分是以包涵体的形式存在 的。对包涵体蛋白进行初步纯化后，制备抗原免疫动物，收获抗血清，并利用得到的抗血 清进行琼脂双向扩散以及蛋白质印迹。经琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1 ：4 ，蛋白 质印迹显示所得到的抗血清能够与抗原发生特异性结合。 关键词：鲤鱼；t o l l 样受体；基因克隆；r e a l t i m ep c r ；原核表达 中图分类号：$ 9 1 i l 山东师范大学硕士学位论文 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft o l l - - l i k er e c e p t o r2 2i n c o m m o nc a r p ，c y p r i n u sc a r p i ol a b s t r a c t t o l lr e c e p t o r sw e r ef i r s tc h a r a c t e r i z e di nd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e ra n dh a v ear o l ei nb o t h e m b r y o n i cp a t t e r n i n ga n di n n a t ei r n m u n i t y m o r er e c e n t l y , ar e l a t e df a m i l yo ft o l l l i k e r e c e p t o r s ( t l r s ) w a sd i s c o v e r e de n c o d e di nv e r t e b r a t eg e n o m e s t l r sh a v eac e n t r a lr o l ei n i n n a t ei m m u n i t ya n da r ea l s or e q u i r e df o rt h ed e v e l o p m e n to fa na d a p t i v ei m m u n er e s p o n s e ， b r i d g i n gi n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n i t y a n dt h ei n t e r l e u k i n 一1r e c e p t o r t o l l - l i k er e c e p t o r ( i l 1r t l r ) s u p e r f a m i l ys i g n a l i n gi n v o l v e sm y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 8 ( m y d 8 8 ) t h a t a c t sa sa ni m p o r t a n ta d a p t e rp r o t e i ni nt l r ss i n g a l i n gp a t h w a y i nt h i s p a p e r , w eh a v ei s o l a t e d ，s e q u e n c e da n dc h a r a c t e r i z e dt h ef u l l l e n g t he d n ao f t l r 2 2f r o mc o m m o nc a r pb yt h em e t h o do fm o l e c u l a rc l o n i n ga n dr a p i d - a m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ( r a c e ) a sw e l la ss t u d i e dt h e i re x p r e s s i o np a r e mi nt i s s u e si nr e l a t i v e l yh e a l t h c o m m o nc a r pb yr t - p c r ；t l r 2 2 g e n ea n dm y d 8 8g e n e ( c l o n e db yo u rl a b ) e x p r e s s i o nl e v e l w e r ed e t e c t e db yr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c ri nc o m m o n c a r pw h i c hw e r es t i m u l a t e db yv i b r i o a n g u i l l a r u m ；t l r 2 2g e n e ，w h i c he n c o d e sp a r t i a lt l r 2 2p r o t e i no fc o m m o nc a r p ，w a sc l o n e d b yt h em e t h o do fr e c o m b i n a n tt e c h n i c s t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) t l r 2 2 w a sc o n s t r u c t e da n de c o l ib l 21 ( d e 3 ) w a st r a n s f o r m e dt oe x p r e s st h et l r 2 2 p r o t e i n t h e p r o t e i nw a sp u r i f i e da n du s e da sa na n t i g e nt oi m m u n ea n i m a l st og a i nt h ea n t i s e r u m t h e r e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ec l o n e dt l r 2 2e d n ae x h i b i t e d3 3 2 5 b p i n l e n g t h a n dc o n t a i n sa5 6 b p 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) ，a2 8 3 8 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) a n da4 3 1 b p3 - u t r t l r 2 2 w i t h9 4 5a m i n oa c i d sh a sac a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f10 8 2 4 k d aa n dat h e o r e t i c a lp io f 8 7 3 3 h a sap u t a t i v es i g n a ls e c r e t i o np e p t i d e2 2 a ai ni t sn t e r m i n a lr e g i o n s t r u c t u r a l l y , t l r 2 2 h a sat o l l i n t e r l e u k i n r e c e p t o r ( t i r ) d o m a i n ，at r a n s m e m b r a n ed o m a i na n dl e u c i n e - r i c hr e p e a t ( l r r ) d o m a i nw h i c ha r et h eh a l l n a r k so ft l rf a m i l y t l r 2 2a n dm y d 8 8n o n - c o n s t i t u t i v e l y d e t e c t a b l ei nv a r i o u st i s s u e sa n do r g a n ss e l e c t e d ，b o t ha r eh i g h l ye x p r e s s e di nt h eh i n d g u t ， s p l e e n ，k i d n e y , g i l la n ds m o u t he p i t h e l i u m ；m o d e r a t e l ye x p r e s s e di nt h ef o r e g u ta n ds k i n ；a n d i i i 山东师范大学硕士学位论文 n o te x p r e s s e di nm u s l e p r o t e i no r g a n i z a t i o n ，m u l t i p l ea l i g n m e n ta n ds i g n a lp e p t i d ep r e d i c t i o n s h o w st h a tt l r 2 2s h a r e sh i g h l yi d e n t i t yw i t hk n o w nt l r 2 2m e m b e r s ，w h i c ha c h i e v e st o 8 8 6 w i t hg o l d f i s ht l r 2 2 ( 2 ) e x p r e s s i o no ft l r 2 2a n dm y d 8 8w e r em e a s u r e di np r e v i o u s l yn o n e x p o s e df i s h ，0 5 ， 1 ，3 ，5 ，a n d7d a y sa f t e re x p e r i m e n t a lv i b r i oa n g u i l l a r u mc h a l l e n g et od e t e r m i n ei ft h e ya r e a s s o c i a t e dw i t hh o s tr e s p o n s et o 矿a n g u i l l a r u mi n f e c t i o nb yr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r t h e m r n a c o p yn u m b e r so fc a r pt l r 2 2a n dm y d 8 8w e r ei n c r e a s e di ns o m eo r g a n si n c l u d i n g i n t e s t i n e ，g i l la n ds k i n t h e s er e s u l t si m p l yt h a tt l r 2 2a n dm y d 8 8h a v ea ni m p o r t a n tr o l ei n t h em u c o s a li m m u n i t yi nc o m m o nc a r p ( 3 ) t h ef i r s ts t r a n do fe d n aw a ss e r v e da st h et e m p l a t et oa m p l i f yp a r to f t h eg e n et l r 2 2 t h ep r o d u c to fa m p l i f i c a t i o nw a st r e a t e db yd o u b l ee n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n ( e c o ria n dh i n d i i i ) a n dl i n k e d t o p e t - 2 8 a ( + ) e x p r e s s i o n v e c t o r t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) t l r 2 2w a st h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) s d s - p a g er e s u l t ss h o w e d t h a tap r o t e i nw i t ham o l o c u l a rw e i g h to f38 17 k d aw a se x p r e s s e dw i t h i nt h eh o s ts t r a i n t h e e x p r e s s e dt l r 2 2p r o t e i nw a sp u r i f i e dp r i m a r i l ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft l r 2 2 w a sa d j u s t e d f o rl a t e ru s ea sa na n t i g e n a n t i s e r u mw a sg a i n e df r o ma n i m a li m m u n i z a t i o n ，t h e nd o u b l ea g a r d i f f u s i o ne x p e r i m e n t sa n dw e s t e r nb l o t t i n gw e r ec o n d u c t e da f t e r w a r d s a n dt h et i t e ro ft h e a n t i s e r u mw a sm e a s u r e da s1 ：4a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fd o u b l ea g a rd i f f u s i o ne x p e r i m e n t s k e yw o r d s ：c o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i o ) ，t o l l l i k er e c e p t o r s ，g e n ec l o n i n g ，r e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep c r ，g e n ee x p r e s s i o n c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：$ 91 山东师范人学硕士学位论文 缩写词 t l r s ：t o l l 1 i k er e c e p t o r st o l l 样受体 l r r ：l e u c i n e r i c hr e p e a t s 富含亮氨酸的重复序列 t h d ：t o l lh o m o l o g yd o m a i nt o l l 同源结构域 t i r ：t o l l 1 i k er e c e p t o r i n t e r l e u k i n 1r e c e p t o rt o l l 样受体白介素1 受体 p r r ：p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r 模式识别受体 p a m p s p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s 病原相关分子模式 l p s ：l i p o p e p t i d e s 脂多糖 p g n ：p e p t i d o g l y c a n 肽聚糖 u a ：l i p o t e i c h o i ca c i d 脂质磷壁酸 l a m ：l i p o a r a b i n o m a n n a n 脂阿拉伯甘露聚糖 c p g o d n c p gc o n t a i n i n go l i g o d e o x y n u c l e o t i d e 含c p g 的寡聚脱氧核苷酸基序 m y d 8 8 ：m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o np r i m a r yr e s p o n s ep r o t e i n8 8 髓样分化因子8 8 t i r a p ：t i r - d o m a i nc o n t a i n i n ga d a p t o rp r o t e i n 包含t i r 结构域的接头蛋白 m a l - m y d 8 8 一a d a p t o rl i k ep r o t e i n 类m y d 8 8 接头分子 t r i f ：t i r d o m a i nc o n t a i n i n ga d a p t o rp r o t e i ni n d u c i n gi f n p 诱导i f n p 的包含t i r 结构域的接头分子 t i c a m - 1 ：t i rd o m a i nc o n t a i n i n gm o l e c u l e1包含t i r 结构域的接头分子1 t r a m ：t r i f r e l a t e da d a p t o rm o l e c u l et r i f 相关接头分子 t i c a m 一2 ：t i rd o m a i nc o n t a i n i n gm o l e c u l e2 包含t i r 结构域的接头分子2 s a r m ：t i r d o m a i n - c o n t a i n i n gm o l e c u l e 包含t i r 结构域的分子 d d ：d e a t hd o m a i n 死亡结构域 d c ：d e n d r i t i cc e l l s 树突状细胞 i r a k ：i n t e r l e u k i n1r e c e p t o r - a s s o c i a t e dk i n a s ei l 1 受体相关激酶 t r a f 6 ：t n fr e c e p t o r - a s s o c i a t e df a c t o r6t n f 受体相关因子6 i k k ：i r d 3k i n a s ei r b 激酶 i r a k ：i n t e r l e u k i n 1r e c e p t o ra s s o c i a t e dk i n a s ei l 1 受体相关激酶 i r f - 3 ：i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r3 干扰素调节因子3 h i v ：h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s 人免疫缺陷病毒 v 山东师范大学硕士学位论文 n f - v d 3 ：n u c l e a rf a c t o r - k a p p ab 核转录因子1 ( b g n b p l ：g r a m - n e g a t i v eb i n d i n gp r o t e i n1 革兰氏阴性结合蛋白1 p g r p ：p e p t i d o g l y c a nr e c o g n i t i o np r o t e i np g n 识别蛋白 d i f d o r s a lr e l a t e di m m n i t y 白c t o r 果蝇相关免疫因子 o r f - o p e nr e a d i n gf l a m e 开放阅读框 5 - u t r 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n5 非翻译区 3 - u t r ：3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n3 非翻译区 r e a l t i m ep c r - r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 实时荧光定量p c r r a c e ：r a p i d - a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n dc d n a 末端快速扩增技术 p o l y ( i ：c ) ：p o l y i n o s i n i c ：p o l y c y t i d y l i ca c i d 多聚次黄苷酸- 胞苷酸 e s t ：e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g 表达序列标签 p b l s ：s p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e s 外周血白细胞 s p e s p i i t z l ep r o c e s s i n ge n z y m es p i i t z l e 递呈酶 m a f - m a c r o p h a g ea c t i v a t i n gf a c t o r 巨噬细胞激活因子 g s p ：g e n es p e c i f i cp r i m e r 基因特异引物 s m a r t ：s w i t c h i n gm e c h a n i s m a t5 e n do ft h er n a t r a n s c r i p t 反转录5 末端交换机制 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本 栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：乌稚 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：召确弓 导师签字： 签字日期：2 0 0 ? 年占月7 日 扣叼 签字吼2 。哆年匆日 山东师范大学硕士学位论文 综述 lt o l l 样受体研究进展 1 1t l r 的发现、结构及分布 t o l l 一词最早是在研究果蝇胚胎的背腹极性分化中提出的【啦】，t o l l 德文的意思为“疯 狂的 或“极好的、令人兴奋的 ，因为作者发现该基因突变后果蝇的“背腹 发育不正 常，由此以德文“t o l l 命名。后来发现，t 0 1 l 蛋白是一类跨膜蛋白【3 】，在果蝇的抗真菌 和抗细菌感染中起重要作用【4 1 。研究证实t o l l 参与昆虫的抗真菌免疫。真菌感染时果蝇 t o l l 通路被激活，诱导大量的抗真菌肽表达，t o l l 基因的突变导致果蝇极易受到真菌的感 染【5 1 。在果蝇，t o l l 受体并不直接识别或结合病原，而与针对病原的各种免疫应答过程中 信号的转导密切相关。1 9 9 7 年，m e d z h i t o r 等【6 】首次鉴定出与果蝇同源的第一个人类细胞 表面的t o l l 样蛋白，发现其在免疫应答发生之前已定位于人的第4 对染色体，并命名为 t o l l 样受体4 ( t o l l 1 i k er e c e p t o r s ，t l r 4 ) 。后来从低等到高等动物体内都发现t o l l 样受体 ( t o l l 1 i k er e c e p t o r s ，t l r s ) 的存在，现已在人和小鼠体内发现1 3 种t l r s ，分别命名为 t l r l - - t l r l 3 ，是宿主细胞识别各种微生物病原体的受体。 t o l l 和t l r s 家族成员具有相似的结构特征【刀，均为非特异性的i 型跨膜糖蛋白受体， 由胞外区、跨膜区和胞内区3 个功能区组成【8 】。胞外区序列差异较大，是与配体结合的特 异性部位，由1 9 2 5 个富含亮氨酸的重复序列( l e u c i n e r i c hr e p e a t s ，l r r s ) 组成，其 间有非l r r 序列分隔，不同t l r 之间的胞外区同源性较差，提示各个t l r 分子的配体 可能具有不同结构。l r r 结构存在于许多蛋白质中，行使多种功能：r n a 递呈、转录调 节以及信号转导等。其中，t o l l 由两个不连续的l r r s 模块组成，而t l r s 由单一l r r s 模块组成( 图1 ) 。l r r 区的氨基端和羧基端分别称为l r r n t 和l r r c t ，两者是非常 重要的帽状结构【9 】。研究表明，l r r n t 帽状结构可以形成b 发夹结构，而l r r c t 采用a 螺旋与p 折叠结构，l r r 结构域形成的马蹄形结构被认为其凹面与病原体的模式识别直 接相关【1 0 】。l r r 基序主要是有利于促进蛋白质间的相互黏附，因而认为可用来识别病原 体或其产物【1 1 1 ，研究显示，存在于不同物种的多种含l r r 的蛋白都参与宿主对病原体的 防御反应【12 1 。跨膜区是富含半胱氨酸的结构域，通过a 螺旋将胞外区与胞内区相连。t l r s 的胞内区由t o l l 同源结构域( t o l lh o m o l o g yd o m a i nt o l l ，t h d ) 和分子羧基端长短不同 m 东师范 学颤十学位论文 的短尾肽组成。t h d 至少包括1 2 8 个氨基酸分为1 0 个区段，形成螺线相间的二级结 构。序列分析发现，t l r s 的t h d 结构域与i l 1 r 胞浆结构域有高度同源性，由此推导 它们的分子构象也很类似，于是叉将t h d 结构区称为t o l l 样受体伯介素1 受体结构域【1 w ( t o l l l i k er e = c e p t o r i n t e r l e u l d n 1r e c e p t o r d o m a i n ，t i r 结构域) 。t i r 区域【1 ”包古b b l o o p 结构( 图i ) ，与受体= 聚化及信号转导有关，是向下游传导信号的核心元件，这一区域 关键位点的突变或序列缺失将阻断信号向下传递【】”。t l r s 通过其高度保守的t i r 结构招 募下游具有t i p , 结构的接头分子，启动特异的信号通路，檄活核转录因子r , b ( n u c l e o r f a c t o r - k a p p a b ，n f - r , b ) 等转录因子，控制各种效应基因的表达”q 。t l r 家族成员的胞内 区结构差别不大，而胞外区之间存在较大差异这有助于不同配体激活相应的受体。 t l r s 在淋巴组织和非淋巴组织中均有表达，主要分布于淋巴细胞。尽管t l r s 在1 i 同的组织和细胞表达量有所不同【4 - l ”，但t l r 主要表达于参与机体免疫反应的细胞中，如 单核巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、粒细胞以及各种内皮细胞和上皮细胞等，其中 t l r 在树突状细胞中的表达最为丰富。目前有关t l r s 的研究主要集中在以下几种类型： t l r 2 、t l r 4 、t l r 5 及t l r 9 ，而针对其他t l r s 的研究相对较少。t l r l 分布【l q 广泛， 存在于多种细胞表面：多核细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、n k 细胞、 成纤维细胞及树突状细胞等。t l p - 2 选择性的高表达于外周血白细胞、c d l 4 阳性单核巨 噬细胞及内皮细胞。t l r 3 特异分布，只存在于树突状细胞表面。t l r 4 主要存在于心肌 细胞、外周血白细胞、内皮细胞、上皮细胞及脾脏中。t l r 5 表达于外周血自细胞及卵巢 中。t l r 6 具有组织特异性主要分布于脾、胸腺、卵巢及肺的细胞中。t l r 9 可表达在 树突状细胞和b 细胞，另外研究表明其在细胞质的小囊泡l i ”中也有表达。t l r l 0 多分布 2 罴轻 一 b 鍪辩矾爨 m 东师范a 学顿十学位论文 于淋巴样组织，在b 细胞表面检测到其大量表达。t l r l l 功能不详，主要表达于巨噬细 胞、肝脏、肾脏及膀胱上皮细胞表面。t l r s 通过与其配体结合激活树突状细胞( d e n d r i t i c c e l l s ，d c ) 实现天然免疫向适应性免疫的转变2 “。t l r s 在亚细胞水平上的定位主要与其 识别的配体有关 7 1 ( 图2 ) 。t l r l 、t l r 2 、t l r 4 和t l r 6 定位在细胞膜表面，主要识别 病原微生物脂糖、脂蛋白等成分；而t l r 3 、t l r 7 、t l r 8 和t l r 9 则定位于细胞内室质 膜( 如胞内体) 上，与识别核酸有关。但是，t l r 的定位1 2 1 - 2 1 并不完全受表达模式的限 制。 匝互圊匾 图2 t l r s 在旺细胞水平上的定位l 憎】 1 2t u t 的家族成员及配体 目1 i i ，哺乳动物已报道的t l r 有1 3 种。其巾，人类存在1 0 种，分别命名为t l r i t l r l 0 。小鼠存在1 2 种，具有人类除t l r l 0 之外的其他9 个同源基因，另外，小鼠还存 在三种不同于人类的t l r s ：t l r l l 、t l r l 2 和t l r l 3 ；并且存在一个退化的假基因 ( d e g e n e r a t ep s e u d o g e n e ) ，分析表明其与人类t l r l 0 基因同源。人类基因组也存在小鼠 t l r l l 的同源序列，但不能表达完整的t l r l l l 2 4 l 。n i s h i m u r a 等采用实时荧光定量p c r 技术( r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ，r e a l t i m ep c r ) 发现人类1 0 种t l r 基因的m r n a 在许 多组织中都有不同程度的表达。 t l r 作为一类非特异性免疫受体，广泛存在于从昆虫到哺乳动物，甚至植物中。依 据g e n b a n k 中部分脊椎动物t l r 序列，作出分子进化树【“i ，分析表明所有t l r 起源于共 同的祖先基因，识g 相同或相似配体的t l r 具有更近的亲缘关系和更高的同源性。但由 。 眨9 。q 一 山东师范大学硕士学位论文 于不同物种面临的选择压力和生存环境的不同，导致有些基因在物种中出现退化，形成进 化上的差异。 t l r s 作为先天性免疫模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r ，p r r ) 之一，是通 过识别病原微生物及其细胞壁产物均具有的特殊结构即病原相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p s ) 来迅速激活天然免疫系统的。p a m p s 包括g 一菌的 脂多糖( 1 i p o p e p t i d e s ，l p s ) 、类脂a ，g + 菌的肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ，p g n ) 、脂质磷壁 酸( l i p o t e i c h o i ca c i d ，l t a ) 、脂阿拉伯甘露聚糖( l i p o a r a b i n o m a n n a n ，l a m ) 、分枝杆 菌和疏密螺旋体的脂蛋白与脂肽、酵母多糖、细菌d n a 以及病毒r n a 等( 表1 ) 。由于 p a m p s 仅由微生物产生，不存在于高等哺乳动物中，因此哺乳动物中参与天然免疫的细 胞可以区分出“自我”和“非我”成分。不同t l r 家族成员识别的配体具有特异性，针 对t l r s 信号通路的配体的研究，主要是通过化学合成物来实现的。研究表明，激活t l r s 信号转导的配体主要有三种类型2 7 1 。 蛋白类：s p i i t z l e 是果蝇t o l l 信号通路的胞内配体，尽管信号转导时配体受体复合物 的结构研究的不甚清楚，但其理化性质已十分明确 2 8 , 2 9 】。s p 犯l e 与t o l l 胞外区相互作用， 覆盖疏水表面，从而使两者亲和力增加，复合物更加稳定。在脊椎动物，尽管不存在如同 s p i i t z l e 的胞内细胞因子激活t l r 信号通路，但外源性的鞭毛蛋白和呼吸道合胞病毒融合 蛋白分别激活t l r 5 和t l r 4 。鞭毛蛋白是一种具有毒性的因子，可以引起组织感染，t l r 5 由鞭毛蛋白的保守序列激活，此保守序列对其发挥功能是必须的。单体鞭毛蛋白在浓度小 于1 0 0 f m 时就可以激活t l r 5 ，说明两者具有较高的亲和力。研究表明，t l r 5 通过胞外 单个l r r 区直接与鞭毛蛋白相互作用。 脂类和脂肽：激活t l r s 的第二种配体类型是脂类和脂肽。l p s 是g 一菌细胞壁的主 要成分，激活t l r 4 。l p s 通过类脂a 与辅助蛋白m d 2 相互作用引起下游信号转导。 m d 2 是一种分泌型的糖蛋白，由1 6 0 个氨基酸残基组成，与l p s 直接结合。m d 2 是 m d 2 相关的酯识别家族成员，该家族所有成员与脂类结合，具有单一的结构特征，呈现 免疫球蛋白样1 3 - s a n d w i c h 结构【3 0 1 。脂肽和脂蛋白主要来自g + 菌和寄生虫，激活t l r 2 。 同时，t l r 2 也可以与来自g 一菌的非典型的l p s 相互作用，如l e p t o s p i r ai n t e r r o g a n s 。t l r 2 的配体结构比l p s 简单，通过与t l r i 或t l r 6 形成异源二聚体发挥作用。识别来源于支 原体的三肽基脂蛋白需要t l r 2 和t l r l 相结合，而识别来源于支原体的二肽基脂蛋白则 需要t l r 2 和t l r 6 相结合。有关体外实验表明，t l r 可以单独识别其配体 3 1 , 3 2 3 3 】。 核苷酸类：核苷酸及其人工合成的具有核苷酸结构的小分子药物是激活t l r s 的第三 4 山东师范大学硕士学位论文 类配体。t l r 3 、t l r 7 、和t l r 9 与这类配体相互作用，并且各受体间联系紧密。t l r 3 识别的配体是病毒在复制过程中形成的双链r n a ( d o u b l es t r a n d ，d s r n a ) 及聚合物多聚 次黄苷酸一胞苷酸( p o l y i n o s i n i c ：p o l y c y t i d y l i ca c i d ，p o l y ( i ：c ) ) 。t u t 7 和t l r 8 识别来自病 毒的富含鸟苷或尿苷的单链r n a ( s i g n a ls t r a n d ，s s r n a ) ，t l r 7 亦能识别咪唑喹啉【3 4 】， 眯唑喹啉是一种非核苷类异环咪唑喹啉胺类药物，在人和动物体内、外的实验中均显示出 强的抗病毒、抗肿瘤活性。d n a 中非甲基化的c p g 寡脱氧核苷酸( c p gc o n t a i n i n go l i g o d e - o x y n u c l e o t i d e ，c p g o d n ) 基序是t l r 9 的配体【3 5 】，在哺乳动物中，此序列有七处半胱 氨酸残基位点发生甲基化，而病毒和细菌d n a 无此修饰，从而区别自我和非我成分。 表it l r s 识别配体类型f 2 7 】 5 山东师范大学硕上学位论文 1 3t l r 信号通路 与其他i 型跨膜受体一致，t l r s 信号的转导是通过配体引起的受体二聚化或寡聚化 实现的( 图3 ) 。s p i i t z l e ，作为一种对称的二聚体，与t o l l 胞外区相互作用使其形成二聚 6 m 东师范大学硕学位论文 体引起下游信号传递【圳。脊椎动物t l r s 可能具有相似的配体诱导的二聚化信号转导途 径，二聚化引起受体胞外结构的改变，从而使蛋白蛋白间相互作用的稳定性增强。 誉一棠望蓥瓣落 m l 9叫dd d 蕊裂， 型 图3 t o l l 蚩白和t l r s 与配体相互作用示意图” 从昆虫到哺乳动物，t o l l 和t l r 信号通路组成成员在进化上是保守的，但是两者在 配体识别和调节方面存在差异，借以调控不同的信号转导( 图4 ) 。 懈二c e 一簟裟 j i 。5 口 t u b e 蟹器“ _ 警 “。 ：一 姐1 一7 一l - i t x t l 遮 i 警l ，墨 备。一圣 = 冬_ ，? 。 ，。一匕。三。土。 圈4 t o l l 蛋白和t l r s 信号通路9 1 哺乳动物t l r 信号通路包含5 种具有t i r 结构的接头分子【5 9 1 ：髓样分化因子8 8 ( m y d o i dd i f f e r e n t i a t i o n p r i m a r yr e s p o n s e p r o t e i n8 8 ，m y d 8 8 ) ；包含t i p , 结构域的接头 蛋白( t i r - d o m a i nc o n t a i n i n ga d