（细胞生物学专业论文）基于bac同源重组技术构建小鼠胚胎干细胞nanog基因报告体系及其鉴定.pdf

四川大学硕士学位论文 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特，l l j j j r l 以标注和致谢的地方外，论文中不包括 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所作的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 导师签字： 学生签字： 四川大学硕士学位论文 基于b a c 同源重组技术构建小鼠胚胎干细胞 n a n o g 基因报告体系及其鉴定 细胞生物学专业 研究生：范彦指导老师；邹方东 摘要 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e s 细胞) 具有的自我更新( s e l f - r e n e w ) 及多向分化潜能( m u l f i p o t e n t i a l ) 两大特性，是细胞移植治疗手段的首选来源， 也成为近年研究的热门领域。自e s 细胞建系至今，对于e s 细胞的研究不仅局限 于定向分化条件的摸索，将体细胞去分化( d e d i f f e r e n t i a t i o n , 重塑其多能性的研 究也逐渐成为了热点，因此阐述e s 细胞多能性维持的分子机制是对其深入研究 的基础。目前研究得知与维持e s 细胞多能性相关的因子有l i f g p l 3 0 s t a t 3 ， w n t b m p s s m a d s ，p 1 3 k 等多条信号通路及o c t 4 ，s o x 2 ，n a n o g 等多种外源因 子。其中同源异型蛋n a n o g 是最新发现的一个在维持e s 细胞多能性的机制中 有重要作用的转录因子。n a n o g 独立于l i f s t a t 3 途径及b m p s s m a d s 途径维持e s 细胞的多能性，主要在早期胚胎细胞和e s 细胞中表达，并且与o c t 4 、s 0 x 2 的 表达存在一定的时序关系。n a n o g 的表达能非常灵敏的随着e s 细胞的分化而下 调，成为指示细胞多能性的最理想的标志基因之一。 另一方面，基于细菌人工染色体( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o m e ，b a c ) 的 同源重组技术是近来广泛应用且稳定的基因打靶载体构建方法。此方法通过同 源重组技术从包含有目的基因的b a c 上直接套取目的基因，不仅避免了传统构 4 四川大学硕士学位论文 建过程中通过p c r 扩增的方法获得目的基因可能带来突变及p c r 片段大小的限 制，还不受限制酶切位点的局限。 本研究旨在运用基于b a c 的同源重组技术构建小鼠胚胎干细胞( m e s 细胞) n a n o g 基n 报告体系。首先挑选包含n a n o g 基因启动子的b a c ，通过同源重组， 直接从b a c 上套取n a n o g 启动子。再次同源重组，将报告基因插入n a n o g e g f p 插入n a n o g 基因启动子之后，高效构建t n a o n g e g f p 打靶载体。通过电穿孔的 方法，将打靶载体导入r u e s 细胞系r 1 中，筛选后获得基因打靶的阳性细胞1 1 5 。 经鉴定，r 5 与r 1 分化前具有相似的基因表达情况；r 5 与r 1 具有形成e l i ( e m b r y o n i c b o d y ) 的能力。用r t - p c r 分析此两种e l i ，结果表明，r 5 及r 1 所形 成的e b 均表达内、中、外三个胚层的标志基因s o x l 7 、n k x 2 5 及n e s t i n 。由此 说明，打靶后的a r i e s 细胞r 5 具有与r u e s 细胞r 1 相似的特性。同时，用免疫细胞 化学的方法对自发分化前后的r 5 细胞进行o c t 4 的标染，观察到未分化的1 1 5 细 胞团e g f p 与o c t 4 共染，而分化后e g f p 不表达的部分细胞不被o c r 4 标染。结 果证明此报告体系能稳定的偶联表达n a n o g 和e g f p ，且符合n a n o g 基因的表达 模式。 由于此报告体系能通过e g f p 有效报告n a n o g 基因的表达水平，对r u e s 细胞 分化或未分化状态作出明显指示，因此为m e s 细胞自我更新和诱导分化的研究提 供了一个理想的实验体系。本实验所构建的r u e s 细胞系不仅能用于优化m e s 细胞 的培养体系，还可以用于研究n a n o g 的表达调控、n a n o g 与其他维持m e s 细胞多能 性的因子和途径之间的关系。另外，p 1 2 5 3 一n a n o g - e g f p 载体可以作为良好的报 告载体用于小鼠体细胞重编程因子的研究。 关键词小鼠胚胎干细胞，自我更新，n a n o g ，e g f p ，细菌人工染色体，同源重 组 四j i i 大学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn a n o g r e p o r t e rs y s t e mi nm o u s ee m b r y o n i c s t e mc e l l s b a s e do nt h eh i g he f f i c i e n tb a c h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n m a j o r ：c e l lb i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t ：y a hf a n t u t o r ：f a n g d o n gz o u a b s t r a c t o w n i n gt o t h e i rs e l f - r e n e w a la n dm u l t i p o t e n t i a ld i f f e r e n t i a t i o na b i l i t i e s , e m b r y o m cs t e m ( e s ) c e l l sh a v eb e e nb e c a m et h ef i r s tc a n d i d a t ef o rc e l l b a s e d t r a n s p l a n t a t i o n i na d d i t i o nt ot h es t u d yo i lc o n d i t i o n a l l yd i f f e r e n t i a t i o no ft h ee s c e l l s ，t h ed e d i f f e r e n t i a t i o no fb o d yc e l l st or e p l a s t i ci t sm u l t i p o t e n c ea l s ob e c o m ea h o tt o p i c t h e r e f o r e ，t h ee l u c i d a t i o no fe sc e l l s m o l e c u l a rm e c h a n i s mt om a i n t a i ni t s m u l t i p o t e n t i a la b i l t yi st h ef o u n d a t i o no ft h ew h o l es t u d y p r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h e r ew c r es e v e r a ls i g n a lp a t h w a y si n c l u d i n g l i f g p l 3 0 s t a t 3 ，w n t , b m p s s m a d s ，p 1 3 ke t c , a n ds e v e r a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s s u c ha so c t 4 、s o x 2 、n a n o gi n v o l v e di nt h em a i n t a i n a c eo fm u l t i p o t e n c eo fe s c e l l s n a n o gi sa n o v e lt r a n s c r i p t i o nf a c t o rs p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di ne a r l ye m b r y o n i c c e l l sa n de m b r y o n i cs t e mc e l l s i th a sb e e ns h o w nt op l a ye s s e n t i a lr o l ei nt h e m a i n t e n a n c eo fp l u r i p o t e n c yi ne sc e l l sa n di n n e rc e l lm a s so c m ) i n d e p e n d e n to f l 1 f s t a t 3a n db m p s s m a d sp a t h w a y s t h e r ee x i s t sas c h e d u l i n gr e l a t i o na m o n g 6 四川大学硕士学位论文 o c t 4 , s o x 2a n dn a n o gi ne a r l ye m b w o m cc e l l sa n de sc e l l s t h ee x p r e s s i o no f n a n o gw a sv e r ys e n s i t i v et oe sc e l l sd i f f e r e n t i a t i o n ，s u g g e s t i n gn a n o gt ob eo n eo f t h eb e s tm a r k e r st oi n d i c a t et h es t a t u so fe sc e l i s o nt h eo t h e rh a n d , h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nt e c h n i q u eb a s e do nb a c t e r i a l a r t i f i c i a lc h f o m o s o n c ( b a c ) i so n eo ft h eu s e f u lt e c h n i q u e st oc o n s t r u c tg e n e t a r g e t i n gv e , c t o r s t h i st e c h n i q u ea v o i d st h ed n a m u t a t i o na n ds i z el i m i t a t i o nf r o m p c r w ed k e c t l yr e t r i e v et h et a r g e tg e n ef r o mb a cw i t ht w oh o m o - s e q u e n c e s w i t h o u tc o n s i d e r i n ge n z y m es i t e s i nt h i ss t u d y , b a s e do nb a ch o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n t e c h n i q u e ，a n e f f i c i e n tm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e dt oc o n s t r u c te g f pr e p r o t o rs y s t e mw h i c hh a s b e e nd i z e nb yn a n o gp r o m o t e r n a n o gp r o m o t e rw a sr e t r i e v e dd i r e c t l yf r o mt h e b a c , a n dt h e nt h er e p o r t e rg e n ew a sk n o c k e d i na f t e ri t t h ep o s i t i v ec e l ll i n er 5 w a sp i c k e do u ta f t e rt h ef i n a lp l 2 5 3 - n a n o g e g f pc o d s t m c tw e r ei n d u c e di n t om e s c e l l sb ye l e c t r o p o m t i o n t h en e wm e sc e l ll i n er 5c o u l dp r o l i f e r a t ei nv i t r of o rn l o n gt i m e t h en e wm e s c e l ll i n eh a sb e e nd e t e c t e dt os h o wf e a t u r e ss i m i l a rt ot h e i r p a r e n t a lm e s c e l l su s i n gt h ee bf o r ma n dr t - p c r t h ee x p r e s s i o no fe g f pc a nb e d e t e c t e di nt h er e p o r t e rs y s t e mi n d i c a t i n gt h er i g h te x p r e s s i o np a t t e mo f n a n o g t h i sr e p o r t e rs y s t e mc o u l de f f e c t i v e l yd e t e c tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fn a n o g t h r o u g he g f pi n d i c t i n gt h ed i f f e r e n t i a t i o ns t a t u so fr u e sc e l l s o u rs t u d ym a y s e r v e a sn g o o de x p e r i m e n t a ls y s t e mt os t u d ym e s c e l l ss e l f - r e n e w a la n dd i f f e r e n t i a t i o n , f a c i l i t a t i n gt h es t u d yo nc u l t u r es y s t e mo fm e sc e l l s w ea l s op r o v i d e da ne sc e l l l i n et oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fn a n o ga n do t h e rf a c t o rr e l a t e di n m e sc e l l s ,a n dt h e p 1 2 5 3 n a n o g - e g f pc o n s t r u c t i su s e f u li nt h e s t u d y o f r e p r o g r a m m i n g k e yw o r d s ：m o u s ee m b r y o m cs t e mc e l l s ，s e l f - r e n e w a l ，n a n o g , e g f p ，b a c t e r i a l a r t i f i c i a lc l l r o m o s o m e ，h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n 7 四川大学硕士学位论文 研究部分 前言 胚胎干细胞来源于哺乳动物囊胚的内细胞团( i n n e rc e l lm a s s , i c m ) 。经体外 培养，具有无限增殖并保持未分化状态的特性【1 1 ，e s 细胞具有多能性，在体内、 体外正常分化时，可产生内、中、9 1 , 3 个胚层的所有细胞类型，因此e s 细胞成为 通过细胞移植进行疾病治疗的潜在细胞来源。e s 细胞在体外特定培养条件下可 进行对称性细胞分裂，产生2 个具有多能性的子代细胞，此特性称为e s 细胞的自 我更新( s e l f - r e n e w a l ) 。而在这种e s 细胞扩增过程中必定伴随着细胞分化的抑制 或多能性的维持嘲。目前对e s 细胞多能性维持及定向分化机制的研究尚不十分 透彻，对于内源和外源生长因子的作用、多条信号通路之间的相互影响，以及 相关基因的调控都不是很清楚。小鼠作为一种哺乳动物的模式生物，对其胚胎 干细胞的研究也将对人类胚胎干细胞的研究起到启示作用。 2 0 0 3 年c h a m b e r s 等【3 】和m i t s u i 等【4 】分别报道了新的转录因子n a n o g 在维持 r u e s 细胞多能性中有非常重要的作用。n a n o g 仅在具有分化多能性的内细胞团 ( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 、e s 细胞和胚胎生殖细胞( e m b r y o n i cg e r m c e l l s ，e g ) 中表达， 在己分化的细胞和成体组织中不表达1 5 l 。自从n a n o g 被报道为维持e s 细胞多能性 的关键因子后，围绕n a n o g 基因的一系列研究被迅速开展。在m e s 细胞中强表达 n a n o g ，可使m e s 细胞在不含u 一6 】或无饲养层细胞 7 1 的培养条件下维持其自我更 新的能力；而通过r n a i 干涉下调n a n o g 的表达，则会使得r u e s 细胞向胚外内胚 层分化i s , 9 。而在人的e s 细胞中的相关研究也得到了类似的结果【7 9 】。可见，n a n o g 在维持e s 细胞的干性和正常的自我更新中都起到了关键的作用，深入研究 n a n o g 的作用机理，详细阐述其功能途径对进一步了解e s 的自我更新与分化机 制具有深远的意义。 目前对n a n o g 在e s 细胞多能性的调控网络中的作用已有了逐渐深入的了 解。n a g 在e s 细胞多能性维持中处于相对独立却又不完全独立的独特地位【1 0 l ， 和其它重要的维持自我更新重要因子也有着密切的联系。它与l i f s t a t 3 b m p s s m a d s ，w n t 以及o c t 4 、s o x 2 等与e s 细胞多能性维持相关的信号通路和 基因之间有着错综复杂联系。l o h 等 1 2 】阐述了n 柚o g 和另外一个重要的细胞多 四川大学硕士学位论文 能性标志基因0 c i 4 在维持m e s 细胞多能性中的重要性和协同作用。b o i a n i ”j 和 r o d d a 等 6 1 论述了o c t 4 、s o x 2 和n a n o g 之间的密切联系。f r i e l 等1 1 4 1 研究发现 n a n o g 和s t a r 3 信号没有直接联系，但b o y e r ”】的研究表明n 锄o g 、o c t 4 和s o x 2 协同调节着s t a r 3 ，并且揭示这三个转录因子位于细胞多能性调控网络顶端。2 0 0 3 年y i n g 等1 1 6 】发现b m p s m a d s 信号通路是与u f s t a t 3 协同作用对e s 细胞的多能 性进行维持，但n a n o g 与b m p 信号通路没有确切联系，后来s u z u k i 等i t 7 1 认为 n a n o g 与s t a t 3 绑定后能上调其表达，通过和s m a d l 的互作抑制b m p 诱导的e s 向 中胚层的分化。2 0 0 6 年1 钛l 墙譬又通过w n t 信号通路的组成成份b e t a - c a t e n i n ， 将此信号作用与n a n o g 联系起来。通过n a n o g 还使以往认为和e s 细胞多能性无关 的p 1 3 k 【1 9 1 ，p 5 3 1 2 0 , 2 1 1 等信号通路与e s 细胞多能性的维持关联起来。尽管如此， n a n o g 的表达调控网络还远远没有研究清楚。 目前常规构建打靶载体的方法主要基于酶切反应和p c r 扩增技术。本研究 利用基于b a c 的同源重组技术【笠，2 3 1 ，进而改进了报告基因敲入目的基因内部的 方案，高效构建了m e s 细胞的n a n o g e g f p 报告体系。经过验证，基因打靶后的 r u e s 细胞具有如同其源m e s 相同的形态学特征、长期传代培养的能力和多向分 化潜能，并维持了相似的e s 多能性相关基因的表达。通过免疫细胞化学的方法 鉴定，当m e s 细胞处于未分化状态时，e g f p 表达并能用o c t 4 标染；m e s 细胞 分化后，e g f p 不表达，不能用o c r 4 标染，符合n a n o g 基因表达模式。 9 四川大学硕士学位论文 第一章基于b a c 同源重组技术构建打靶载体 摘要：打靶载体的构建是进行基因打靶的基础。挑选包含n a n o g 基因启动子的 b a c ，在n a n o g 基因启动子的两端用p c r 的方法分别扩增5 0 0 b p 的同源臂a b 、 y z 。a b 、y z 与骨架质粒p l 2 5 3 相连后，在已经重组入b a c i 拘d y 3 8 0 菌株中通过 同源重组，直接从b a c j z 套取n a n o g 启动子。此实验改进了将报告基因敲入 n a n o g 基因启动子之后的重组方案，直接从p e g 什n 1 中e g f p k a n 两端分别设计 7 0 b p 的引物，其中6 0 b p 为插入目的位点所需要的同源臂。再次通过同源重组的 方法，将报告基因插n a n o g 基因启动子之后，高效构建了打靶载体 p l 2 5 3 - n a 彻g e g f p 经过多种酶切检验，构建的载体结构正确无误。 关键词：n a n o ge g f p 细菌人工染色体同源重组 1 引言 基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项重要的分子生物 学技术。打靶载体的构建是进行基因打靶的基础，传统基因打靶载体构建的构 建方法存在效率低，目的基因表达不稳定等问题。1 9 9 9 年i j up e n g t a o 利用基于 b a c 的同源重组技术高效构建基因敲除小鼠的打靶载体【2 2 j ，改写了基因打靶载 体构建的历史，以此方法构建的打靶载体具有构造简单易行、高效和稳定表达 目标基因等优点。 增强型绿色荧光蛋白( e n h a n c eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 是对绿色 荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 进行了一定的改造，从而使其能更敏 感的吸收紫外激发光源，显现绿色荧光。为从而对活细胞内生物大分子的状态 进行实时可视化研究提供了更有效的手段 2 4 - 2 7 1 ，e g f p 作为报告基因已经在r u e s 细胞及活体标记中被广泛应用。e g f p 能在特异的基因启动子控制下特异表达， 将n a n o g 基因与e g f p 绑定，实现了流式细胞分析、荧光显微镜、激光共聚焦 显微镜等多种方法对生活细胞中n a n o g 基因的表达进行监测。 同源异型蛋白n a n o g 是2 0 0 3 年由c h a m b e r s 等【3 】和m i t s u i 等1 4 】发现的一个 在维持e s 细胞多能性的机制中有重要作用的转录因子。n a n o g 主要在早期胚胎 细胞和e s 细胞中表达，n a n o g 的表达能非常灵敏的随着e s 细胞的分化而下调， 使之成为指示细胞多能性的最理想的标志基因之一。 1 0 四川大学硕士学位论文 在此研究中，利用基于b a c 的同源重组技术 z 2 2 9 l ，进而改进了报告基因敲 入目的基因内部的方案，高效构建了打靶载体p l 2 5 3 - n a o n g - e g f p 。此打靶载体 将n a n o g 基因启动子于e g f p 的表达偶联起来，达到通过对e g f p 表达情况的 描述实时反应n a n o g 基因的表达情况。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 质粒和菌株 含有n a n o g 的b a c 购买于i n v i t r o g e n 公司，b a c 号为r p 2 3 1 8 0 n 2 2 ， 质粒p l - 2 5 3 及菌株d y 3 8 0 均由l i up e n t a o 惠赠， p e g f p - n 1 购于c l o n t e c h 公司。 e c o l i 感受态购自t i a n g c n 公司。 2 1 2 酶及主要试剂 l a r g e c o n s t r u c tk i t 购自q i a g c n ， 琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒g e n e c l e a nh i 购自q b i og e n e ， d n a 纯化试剂盒c l e a n u p 购自p r o m c g a 公司， 各种限制酶购自n e b 公司， p c r 相关试剂购自t a k a r a ， 酵母浸出物、水解酪蛋白购自( ) x i o d ， 其他化学常规试剂购自s i g m a 及上海化学试剂公司， 引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供合成服务。 2 2 方法 2 2 1 打靶载体构建流程 首先通过p c r 扩增的方法以b a cd n a 为模板，在n a n o g 基因启动子两 侧设计同源臂a b 、y z ，分别以a 、b ，y 、z 为引物扩增同源臂a b 、y z ，并 将此两端同源臂连接到骨架质粒p l 2 5 3 中。b a cd n a 与p 1 2 5 3 - a b y z 上两对同 源臂a b 、y z 在菌株d y 3 8 0 中发生同源重组，使p l 2 5 3 从b a c 中套取得到n a n o g 启动子序列，构成p 1 2 5 3 - - n a n o g 重组质粒( 图1 a ) 。从p e g f p n 1 中通过p c r 四川大学硕士学位论文 扩增的方法扩增到带由e 、f 同源臂的e g f p k a n 片断，此片断与p 1 2 5 3 - - n a n o g 的两对同源臂e 、f 在菌株d y 3 8 0 中发生第二次同源重组，将e g f p k a n 接于 n a n o g 基因启动子之后，构成最终的打靶载体p l 2 5 3 - - n a n o g - e g f p ( i 墨i1 b ) 。 册l h m * g h 2 诌- l - 图h 打靶载体构建流程( a ：p l 2 5 3 - a b y z 从b a cd n a 上套取n a n o g 启动子，b ：e g f p 插入p l 2 5 3 - n a n o g 中n a n o g 启动子片段上指定位点) 2 2 2 引物设计与合成 选取n a n o g b a cd n a 上n a n o g 启动子两端约5 0 0 b p 的片断分别设计p c r 引物，在p c r 引物末端分别设计需要的酶切位点 a ：d f ih o m o5 叫姒a g cg g cc g cc t t a a gc t gg g t 1 a ga g tg c - 3 b ：砌枷i h o m 0 5 g t c a a g c r r g c g t 兀c 兀g c r t g c t c r t c 3 y ：月z 蒯i i ih o m o5 g t ca a g ( 】tg t cc a g tg g gg t ca a t a l ：ac 3 z ：s b e lh o m ot c t5 a c t a g t1 a g ( 1 t a g gg g gt i a 1 g ct c 3 选取p e g f p n l 上e g f p k a n 片段，设计7 0 b p 的p c r 引物，其中6 0 b p 是 e g f p 靶向重组的同源臂。 e ：5 g c ct c t c c tc g cc c t t c c1 tg a ag a c ( 1 gc c t ( x tc a a g g c a g cc c t g a tt c t t c ta c ca t g g t ga g ca a g g g cg a gg 3 f ：5 c c a ( 1 gg t tt i tc i gc c ac c gc i tg c a ( 1 tc a t c c tt r g g t t t t ga a ac c a g g tc t ta a c c a a a c g a c cc a a c a c c g tg 一3 1 2 四川大学硕士学位论文 引物设计借助p r i m e rp r e m i e r 5 0 软件，引物合成由上海生工生物工程技术服务 有限公司提供合成服务。 2 2 3 同源臂的扩增 同源臂a b 、y z 的扩增 用q i a g e nl a r g e c o n s t r u c t 瞄t 提取n a n o g - b a cd n a ，以b a cd n a 作为模 板扩增约5 0 0 b p 的a b ，y z 同源臂，反应体系：5 蛳lp c r 体系中加入耻lb a c d n a ，5 “l1 0 xp y r o b e s tb u f f e r ，2 5 p m o l au pp r i m e r ( ao ry ) ，2 5 p m o f m l 血 p r i m e r ( bo r 刁，2 0 m md n t p ，2 up y r o b e s t ，3 和lh 2 0 ，设置对照中不加d n a 模 板，反应程序：9 4 1 24 m i n 9 4 * c3 0 s ，5 5 c3 0 s ，7 2 ci m i n 2 5 7 2 c7 m i n , 4 c8 。 设置对照中不加e d n a 模板。 以同样的方法扩增e g f p k a n 片段： 提取p e g f p - n 1d n a ，p e g f p n 1d n a 作为模板，用此7 0 b p 的引物直接 从p e g f p n 1 上扩增出约3 5 k b 带有同源臂的e g f p k a n 片段，反应体系： 5 0 a i p c r 反应体系中加入毕lp e g f p - n 1 质粒d n a ，驯1 0 xp y r o b e s tb u f f e r ， 2 5 p m o l m lp r i m e r e ，2 5 p m o l ：i lp r i m e r f ，2 0 r a md n t p ，2 up y r o b e s t ，3 钆lh 2 0 ， 设置对照中不加d n a 模板，反应程序；9 4 2 m i n 9 4 3 0 s ，5 6 3 0 s e e ，7 2 l m i n 2 57 2 7 m i n , 4 c8 。设置对照中不加e d n a 模板 2 2 4 重组质粒及e g f p k a n 靶向插入片段的构建 重组质粒的构建 取5 0 j u l p c r 产物在1 - - 2 的琼脂糖凝胶上电泳，在长波紫外线照射仪上 分别从琼脂糖凝胶上切取a b 、y z 两条约5 0 0 b p 的目标条带，用q b i og e n e 的胶回收试剂盒g e n e c l e a ni i i 回收p c r 得到的两段同源臂a b 、y z 。 质粒p l 2 5 3 用n o t l 和印e i 酶切：3 毗l 的酶切体系中包含1 t g p l 2 5 3 ，1 u d f ， 1 u 印吐却1 1 0 b u 虢r ，2 和lh 2 0 ，于3 7 反应6 h 。酶切反应后可通过在1 一2 的琼脂糖凝胶上电泳检测酶切效果。用0 b i og e n e 的胶回收试剂盒 g e n e c l e a ni i i 胶回收5 k b 的p l 2 5 3 片段，用t a k a r a 的s o l u t i o n ei 连接a b 、 y z 及酶切后的p l 2 5 3 片段：在2 0 p l 的连接体系中加入2 0 n g p l 2 5 3 片段，1 0 n g a b 片段，l o n gy z 片断及5 u s o l u 打o n ei ，1 8 反应1 - - 2 h ，将感受态e c o i l 从 四川大学硕士学位论文 一8 0 冰箱中取出，于冰上解冻后，将l o , 1 连接产物加入感受态e c o i l ，混匀 后，冰上静置3 0 r a i n ，4 2 热激9 0 s ，转入冰上静置2 - - 5 r a i n 3 7 于摇床上以3 0 0 转摇培1 h 后将菌液涂布于氨苄青霉素抗性的平板上挑取单克隆克隆，通过菌落 p c r 筛选鉴定阳性克隆将阳性克隆于氨苄青霉素抗性的l b 培养基中扩大培养 用碱裂解法【冽小提质粒，于2 0 冰箱内保存。 e g f p k a n 靶向插入片段的构建 同上，用胶回收试剂盒回收p c r 得到的约3 5 k b 的e g f p k a n 片段，用 p r o m e g a 的d i q j 蜕化试剂盒c l e a n u p 将e g f p k a n 片段纯化后备用。 2 2 5 转化n a n o g b a c 至d y 3 8 0 中 挑b a c 单隆在5 m l 含有氯霉素抗性的l b 中3 7 摇培过夜，次日收集菌液， 同上，用碱裂解法提质粒d n a 备用，但要注意因为b a c 序列很长，在提取质 粒的过程中应该尽量避免用力振荡，以免将b a cd n a 弄断。 制备d y 3 8 0 感受态1 2 2 1 ：挑单d y 3 8 0 单克隆至5 m l l b 中，3 2 c 摇至o d 6 0 0 = 1 2 ， 转至2 0 m l l b 中，3 2 摇至o d 6 0 0 = 0 5 ，取1 0 m l 于4 2 摇1 5 m i n ，冰上晃动5 m i n ， 静置5 m i n ，于0 c ，4 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，收集沉淀用8 8 趴l 洗三次，再用5 0 , l 冰水重悬。 取b a cd n a m l 加至5 叩l 制备好的d y 3 8 0 感受态中，在电转杯中混匀， 电转条件为：1 7 5 k v , 4 m s ，电转后向电转产物中加l m l l b ，3 2 摇1 h ，涂在氯 霉素抗性的平扳上。3 2 培养过夜，次日挑取d y 3 8 0 b a c 的阳性克隆，扩大培 养。 2 2 6 套取n a n o g 启动子片段 取d y ，跏b a c 的阳性克隆制备感受态，方法同上。 将备好的p l 2 5 3 - a b y z 质粒在3 0 , l 的酶切体系中用2 0 u 的h i n d i i i 切1 2 h 。 用常规方法纯化线性化片断：将3 0 1 d 的酶切体系用无菌水定容于5 0 0 z l ，使之 充分混匀，溶解，加入等体积酚：氯仿( 1 ：1 ) ，颠倒振荡混匀5 - - 1 0 r a i n ，室 温1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，小心将水相吸出，转入另一1 5 m le p p e n d o r f 管，加入等 体积酚：氯仿( 1 ： 1 ) ，颠倒振荡混匀5 1 0 m i n ，室温1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，小 心将水相吸出，转入另一1 5 m le p p e n d o r f 管，加入两倍体积无水乙醇，颠倒混 四川大学硕士学位论文 匀，于一2 0 冰箱放置2 0 m i n 以上室温1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，此时可见底侧壁上 有小块乳白色d n a 沉淀，小心吸去上清，倒扣于吸水纸上，用真空泵小心吸干 可见的液体，加入5 0 ( 0 17 0 乙醇洗涤d n a 沉淀，洗去盐离子，吸去上清，用 真空泵小心吸干可见的液体，室温放置1 0 m i n - - 2 h ，待完全干燥后，加入适量 t e ，3 7 温育1 h ，放于4 1 2 冰箱保存( 若要长期保存，则放在2 0 冰箱内保 存) 。在1 一2 的琼脂糖凝胶上电泳，根据与m a k e r 带形亮度对比，初步定量。 在电转杯中加入制备好的d y 3 8 0 - b a c 电转感受态及5 0 1 0 0 n g 线性化的 p l 2 5 3 - a b y z 质粒d n a ，电转条件为：1 7 5 k v 、2 5 # f 、2 0 0 0 。电转后向电转产 物中加l m l l b ，3 2 摇1 h ，涂在氨苄青霉素抗性的平板上，3 2 1 2 培养过夜 2 2 7e g n ，k 柚片段的靶向插入 挑取单克隆于氨苄青霉素抗性的l b 中，3 2 摇培3 5 h ，提取质粒，直接 用酶切的方法鉴定套取质粒：以未套取n a n o g 启动子的质粒做为对照，用n o t i 酶切两种质粒，通过电泳观察条带大小，套取成功的质粒比套取前的质粒长8 k b 。 鉴定正确的质粒进一步进行e g f p k a n 的重组。取d y 3 8 0 - p l 2 5 3 n a n o g 的 阳性克隆制备感受态，方法同上，将回收并经纯化的e g f i k a n 片段5 0 1 0 0 n g 及制备好的d y 3 8 0 - p l 2 5 3 n a n o g 感受态加入电转杯中，混匀，电转条件为： 1 7 5 k v 、2 5 9 f 、2 0 0 0 ，电转后向电转产物中加l m l l b ，3 2 摇1 h ，涂在氨苄青 霉素卡那霉素双抗性的l b 平板上。3 2 培养过夜，次日挑取单克隆，扩大培 养，采用同上所述的碱裂解法提取质粒，分别用h i n d i i i 、n o t l 、4 厅、b a m h i 、 s p e l 进行单酶切，对打靶载体进行鉴定。 3 结果 3 1 重组质粒的鉴定 构建的p l 2 5 3 - a b y z ( 图2 a ) 上重组所需的同源臂长度都在5 0 0 b p 左右， 以p l 2 5 3 - a b y z 为模板，用a 、z 分别作为上、下游引物进行p c r 扩增，能扩 增出l k 的片段，是两条小同源臂连接的长度( 图3 a ) 四川大学硕士学位论文 - _ _ _ _ _ _ _ _ 一p l 2 5 3 图2 ：构建过程中各载体的结构图( a ：p l 2 5 3 - a b y z 结构图，b ：p l 2 5 3 - n a n o g 结构图，c ： p l 2 5 3 - n a n o g - e g f p 结构图，根据图示，黑色区域为p l 2 5 3 骨架，浅灰及深灰色区域为包含 于白色区域中的a b ，y z 同源臂，白色区域为从b a c 上套取的包含n a n o g 启动子的片断，斜 线区域为插在n a n o g 启动子后的e g f p 片断) 图3 ：p 傀及酶切检测打靶载体的构建( a ：d n am a r k e rd l 2 0 0 0 ，从上至下条带大小分别为： 2 k b ，i k b ，7 5 0 b p ，5 0 0 b p ，2 5 0 b p ，l o o b p ；b ：d n am a r k e rd l l 5 0 0 0 从上至下条带大小分 别为：1 5 k b ，1 0 k b ，7 5 k b ，5 k b ，2 5 k b ，l k b ，2 5 0 b p 。a 1 以p l 2 5 3 - a b y z 为模板，a 、z 分别作为上、下游引物p 僳扩增，得到i k b 的a b y z 片段；b ： i p l 2 5 3 - a b y z 用n o t l 酶切， 2 p l 2 5 3 一n a n o g 用n o t i 酶切；c ：用la f l i i 、2 删、3 h i n d i i i 、4 n o t i 、5 勋e i 对打靶载体p l 2 5 3 - n a n o g - e g f p 进行单酶切鉴定) 1 6 四川大学硕士学位论文 3 2 套取n a n o g 启动子的鉴定 在氨苄青霉素