（细胞生物学专业论文）马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究.pdf

致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：兰邋 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 ， 学位论文作者签名： 互设 指导教师签名：谚蔹杈涉 签名e t 期：莎j o 年f 月3 日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 是我国重要的粮食及经济作物，在农业生产和人民生 活中占有非常重要的地位，盐渍土壤严重影响了马铃薯的生长和产量。因此，选育耐盐 的马铃薯品种，具有重要的经济价值。 本研究以马铃薯中1 、中2 、中3 、中4 为实验材料，通过茎尖脱毒作用，用分化培 养基( m s + b a2 m g l + n a a0 1 m g l + g a 3 0 1m g l + 3 蔗糖+ 6 琼脂) ，建立了四个马 铃薯品种的组织培养再生体系。 实验以马铃薯脱毒试管苗茎段为材料，1 0 n a c l 为筛选压力，通过仅) c 0 y 射线辐照、 e m s 浸泡及6 0 c o y 射线和e m s 复合的方法诱导马铃薯耐盐突变株，并获得了耐 1 0 n a c i 的马铃薯突变株w l l 。同时本实验研究了6 0 c 0 3 , 射线、e m s 处理对马铃薯茎 段生长及突变率的影响。研究结果表明：小剂量( 1 0 g y ) 的印c o y 射线能促进马铃薯茎 段的生长，随着辐照剂量的增大，对马铃薯试管苗的抑制作用逐渐增强。顶芽的辐射敏 感性低于侧芽；c o y 射线辐照马铃薯茎段的半致死剂量和突变高峰为2 0 c , y ，致死剂量 为4 0 g y ；小剂量( o 1 ) 的e m s 对茎段损伤极小，而高剂量长时间的e m s 处理会导 致茎尖或茎段白化，失去生长能力，e m s 处理马铃薯茎段的半致死剂量为0 7 + 4 h ，致 死剂量为1 0 咐3 h 。 通过试管苗外部指标分析、生化分析及盆栽盐胁迫的方法对耐盐突变株w l - 1 进行 了分析，结果表明：当n a c i 浓度高于0 6 时，突变株w l - 1 的株高、脯氨酸含量、叶 绿素含量显著高于对照，而丙二醛含量较低。通过分析w l - 1 和对照的s d s - p a g e 图谱 显示：w l - 1 的一条蛋白表达量明显高于对照。盆栽盐胁迫中，当盐浓度为0 4 时对照 株开始出现叶色变黄萎蔫，两者长势差别不大，而当盐浓度大于0 8 时耐盐突变株长 势明显好于对照。 用r a p d 分子标记方法进一步对突变株w l - 1 进行d n a 水平鉴定，得出了突变株 w l - 1 与中3 马铃薯的遗传相似系数为0 7 0 3 ，因此从基因的水平上证明了该株系为突变 株。 关键词：马铃薯；组织培养；诱交育种；耐盐突变体；分子鉴定 + n a a0 1 i n g l + g a 3 0 1m g l + 3 + 6 s u c r o s ea g a r w eu s et h ep o t a t o e ss t e m sa st h em a t e r i a l ，1 0 n a c la st h es e l e c t i o np r e s s u r e ，t h r o u g h 6 0 c o t - r a yr a d i a t i o n 、e m st r e a t m e n ta n dc o m p o s i t em e t h o d t oi n d u c es a l tt o l e r a n tm u t a n t , a n d o b t a i n e dt h es a l tt o l e r a n tm u t a n to f1 o n a c ln a m e dw l - 1 a tt h e 戳h l l et i m e ，w es t u d i e d t h ee f f e c t i o no f c 0 丫r a yr a d i a t i o n 、e m st ot h eg r o w t ho f p o t a t os t e m sa n dt h em u t a t i o nr a t e l o w d o s e ( 10 g y ) o f 叫c o t - m yr a d i a t i o nc o u l dp r o m o t et h es t e m s g r o w t h ，谢mt h ei n c r e a s e o ft h er a d i a t i o nd o s e ；t h ei n h i b i t i o nt ot h ep l a n t l e ti sa l s oi n c r e a s e d s e n s i t i v i t yo ft e r m i n a l b u di sl o w e rt h a nl a t e r a lb u d , t h es u i t a b l ed o s e sf o rp o t a t os t e m sw e r e2 0 g y , a n dl e t h a ld o s e w e t e4 0g y t h ed a m a g eo fl o wd o s e ( o 1 ) e m st r e a t m e n ti sm i n i m a la n dt h eh i g hd o s e0 1 l o n gt i m ee m s t r e a t m e n tc o u l dc a u s es t e mt i pa n ds t e m sw h i t e n i n g ，l o s et h ea b i l i t yo fg r o w t h , t h es u i t a b l ed o s e sa n dt r e a t m e n tt i m ef o rp o t a t os t e m sw e r eo 7 惝，a n dl e t h a ld o s ew c r e 1 0 + 3 k t h r o u g ho u t s i d ei n d e x e sa n a l y s i s 、b i o c h e m i c a li n d e x e sa n a l y s i sa n ds a l ts t r e s so fp o t c u l t i v a t i o n , e v a l u a t e dt h es a l tt o l e r a n c eo f 札1 - n 坞r e s u l t ss h o w e dt h a t ：a s t h en a c l c o n c e n t r a t i o nh i g h e rt h a n0 6 ，t h ep l a n th e i g h t 、p r o l i n ec o n t e n t 、c h l o r o p h y l lc o n t e n to fs a l t t o l e r a n tm u t a n tw l - 1i ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ，m d ac o n t e n ti sl o w e r r e s u l t so fs d s - p a g es h o w e dt h a t ：o n eo fw l - 1e x p r e s s i o nc o n t e n ti sh i g h e rt h a nc o n t r o l g r o u p t h er a p dt e x tr e v e a l e dt h a tt h eg e n t i cs i m i l a r i t yb e t w e e nw l la n dz h o n g3w a s0 7 0 7 ； s oa l lt h ee v i d e n c em e n t i o n e da b o v ep r o v e dt h a tw l - 1i ss a l tt o l e r a n tm u t a n t k e yw o r d s ：s o l a n u mm b e r o s u ml ；t i s s u ec u l t u r e ；m u t a t i o nb r e e d i n g ；s a l tt o l e r a n c em u t a n t ； m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n i i 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 绪论1 1 1 马铃薯茎尖脱毒组织培养技术的研究进展。l 1 2 耐盐诱变育种的重要性1 1 3 耐盐诱变育种的主要方法及国内外研究进展2 1 3 1 物理诱变方法获得耐盐突变体2 1 3 2 化学诱变方法获得耐盐突变体2 1 3 3 理化复合诱变育种的研究进展一3 1 3 4 直接诱变耐盐突变体4 1 3 5 海水诱变耐盐突变体4 1 3 6 其他诱变方法4 1 4 诱变育种材料与最佳诱变剂量的选择。5 1 5 耐盐突变体筛选方法5 1 6 突变体耐盐性的鉴定。6 1 6 1 耐盐性直接鉴定。6 1 6 2 耐盐性间接鉴定7 1 6 3s d s p a g e 鉴定7 1 6 4 分子标记辅助筛选。8 1 7 马铃薯耐盐研究进展：。8 1 8 本实验的目的和意义1 0 1 9 技术路线。：l l 2 马铃薯茎尖脱毒培养技术1 2 2 1 实验材料与仪器1 2 2 1 1 实验材料1 2 2 1 2 实验仪器1 2 2 2 实验方法：1 2 2 2 1 打破种薯休眠1 2 2 2 2 外植体材料处理1 2 2 3 实验结果1 3 2 4 讨论1 3 马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究 2 4 1 影响成苗率的因素1 3 2 4 2 马铃薯茎尖离体培养中的壮苗研究1 4 2 5 小结1 4 3 耐盐诱变及突变体的筛选1 5 3 1 实验材料与仪器15 3 1 1 实验材料1 5 3 1 2 实验仪器。15 3 2 实验方法1 5 3 2 1n a c l 诱变耐盐筛选临界浓度及材料的确定1 5 3 2 2 c o - q 射线辐射对马铃薯试管苗的影响及最佳辐射剂量的选择。1 6 3 2 3e m s 药物诱导对马铃薯试管苗的影响及最佳诱变剂量的选择1 6 3 2 4 耐盐品系筛选1 6 3 2 5 耐盐再生株的盆栽盐胁迫鉴定1 7 3 2 6 数据统计17 3 3 实验结果1 7 3 3 1n a c i 诱变耐盐筛选临界浓度及材料1 7 3 3 2 c o - q 射线辐射对马铃薯试管苗的影响及最佳辐射剂量1 9 3 3 3e m s 药物诱导对马铃薯试管苗的影响及最佳诱变剂量3 0 3 3 4 耐盐筛选结果3 2 3 3 5 耐盐再生株的盆栽盐胁迫鉴定结果3 2 3 z l 讨论：1 3 3 4 1 诱变材料的确定。3 3 3 4 2 诱变剂的选择。j 3 3 3 4 3 诱变剂处理适宜浓度和时间的选择3 4 3 5 小结：。3 4 4 突变体鉴定及生化分析3 5 4 1 实验材料与仪器3 5 4 1 1 实验材料3 5 4 1 2 实验仪器。3 6 4 2 实验方法3 6 4 2 1 突变株外部指标鉴定3 6 4 2 2 叶绿素含量的测定3 6 辽宁师范大学硕士学位论文 4 2 3 脯氨酸含量测定。3 6 4 2 4 丙二醛含量测定3 7 4 2 5 突变株s d s p a g e 变异分析3 7 4 2 6 数据统计3 8 4 3 实验结果3 8 4 3 1 外部指标与生理生化指标鉴定结果3 8 4 3 2 突变株s d s p a g e 变异分析结果4 0 4 4 寸论4 0 4 5 小结4 1 5r a p d 基因指纹图谱分析4 2 5 1 实验材料与仪器4 2 5 1 1 实验材料4 2 5 1 2 实验仪器4 2 5 2 实验方法4 3 5 2 1 实验样品总d n a 的提取c n 姬法一4 3 5 2 2d n a 纯度及浓度的检测4 3 5 2 3r a p d 反应体系。4 3 5 2 4r a p d 随机引物筛选4 4 5 2 5 遗传相似系数的计算4 4 5 3 实验结果4 4 5 3 1 马铃薯基因组d n a 的纯度和浓度4 4 5 3 2 随机引物的选择4 5 5 3 3w l 广1 、中3 的r a p d 图谱分析4 5 5 3 4 遗传相似系数分析4 7 5 4 讨论1 7 5 5 小结4 8 参考文献4 9 攻读硕士学位期间发表学术论文情况5 3 1 改谢! ；4 一v 一 1 1 马铃薯茎尖脱毒组织培养技术的研究进展 马铃薯是双子叶种子植物，属茄科( s o l a n c e a e ) 茄属( s o l a r i u m ) 的一年生草本植 物。栽培分布广泛，世界上共1 4 8 个国家栽培，主要分布在亚洲和欧洲。据联合国粮农 组织资料统计，全世界现有的马铃薯栽培面积为1 8 3 8 1 万h m 2 ，总产量为2 9 5 1 1 8 万吨， 平均单产为1 6 t h m 2 t _ 【1 2 3 。我国是世界上马铃薯最大的生产副3 ，种植面积达6 0 0 万h m 2 。 但在连年栽培过程中，由于病毒或类病毒的侵染和积累，造成质量退化和产量下降。 经研究，获得无病毒植株的途径有自然选择、化学药剂处理、物理学方法、生物学方法 等，其中最简便有效的方法便是茎尖脱毒。 p rw h i t e 在1 9 4 3 年将感染奥古巴花叶病毒的番茄根等分成1 2 段，分别接种到心 叶烟上，发现接种在生长点的2 段在心叶烟未出现病斑，而离生长点越远的病斑越多。 b k a s s a n i s ( 1 9 5 7 ) 等进一步证明在活跃的茎尖分生组织中，病毒粒子因植物核蛋白的合成 而得不到复制的营养【5 】。我国在2 0 世纪7 0 年代开始了对茎尖组织培养的摸索，并于1 9 7 6 年建立了我国第1 个马铃薯脱毒原种场，从此开始了我国无病毒种薯的时代【6 7 1 。 在脱毒过程中，影响茎尖存活、成苗及脱毒效率的因素很多，尤其是在对茎尖培养 过程中培养基里所加的植物生长调节剂的浓度存在着较大分歧。韩宏义等采用 m s + 6 b a2 m g l + n a a0 1 i n g l + 蔗糖3 + 琼脂0 6 培养基，以m s + g a 3 0 5 m g l + 蔗糖 3 卅琼脂0 6 为分化培养基，获得了大白、尤金品种的脱毒试管苗阎。王桂荣采用正交 实验筛选茎尖脱毒培养基配方，结果得到m s + l m g lb a + i m g li r a , + 琼脂5 5 9 l 为成 苗率最高的培养基，成苗率达4 5 3 【9 】。王付欣研究了温度、培养基、活性炭、茎尖大 小对茎尖脱毒培养的影响，以m s + b a 2 m g l + n a a0 1 m g l + g a 3 0 1 i n g l + 0 0 5 a c + 3 蔗糖+ 6 琼脂为培养基，愈伤组织分化出芽率在6 5 左右【l 川。 1 2 耐盐诱变育种的重要性 土壤盐渍化是一个世界性问题，据联合国教科文组织和粮农组织的不完全统计，世 界盐渍土的面积约为1 0 9 h m 2 ，亚洲约为3 9 9 x 1 0 8 h m 2 。而我国的盐渍土面积约为 3 5 x 1 0 7 h m 2 ，相当于耕地的1 3 ，其中盐土1 6 x 1 0 7h m 2 ，碱土8 5 x 1 0 5 h m 2 ，各类盐碱化 土壤达1 8 1 0 7h m 2 t l l 】。目前，由于施用过量化肥，造成土壤次生盐渍化严重，预计到 2 0 5 0 年，将会有超过5 0 的耕地发生盐渍化现象【1 2 1 。 在这些高盐分的盐渍土地区，植物的生长受到很大限制，栽培作物的产量和品质也 随之下降。因而提高盐胁迫下作物的产量，改良土壤和提高植物抗盐性有着很重要的意 马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究 义。目前对于土壤的改良方法主要有淡水压盐、挖沟排盐、引黄放淤等工程措施，但这 些措施费用昂贵，而且不能从根本上解决盐渍化问题。因此解决土壤盐渍化最经济、最 根本、最重要的方法是培育抗盐植物。 1 3 耐盐诱变育种的主要方法及国内外研究进展 1 3 1 物理诱变方法获得耐盐突变体 物理诱变主要是指利用射线的诱变作用。x 射线多应用在诱变育种的早期过程中， 而丫射线易于控制辐照条件，其育种成效显著，是目前应用最为广泛的诱变剂，其中6 0 c o 发射的丫射线应用最多。近年来还出现了如激光、电子束和离子束等新的物理诱变因素。 s h a o z h e nh e 等用8 0 a y 印c ot 射线照射甘薯悬浮细胞，用含3 4 2m mn a c l 的m s 培养基定向筛选耐盐细胞系，经愈伤组织分化，共获得18 株再生耐盐突变植株，对其 耐盐性的鉴定结果表明，这1 8 株突变株都有较强的耐盐性，s o d 活性和脯氨酸含量均 比对照植株高，在2 5 7 m mn a c l 下长势良好，但在3 4 2m mn a c l 的培养基中不能正常 生根，并逐渐死亡，其可能原因是愈伤组织分化苗的耐盐性比愈伤组织低【1 3 】。王长泉等 用y 射线处理杜鹃不定芽，获得了耐受1 0 的n a c l 的变异株系【1 4 】。毛桂莲用不同剂量 的c o t 射线对枸杞的愈伤组织进行辐射处理，采用逐步提高盐浓度的方法，筛选出耐 1 0 n a c l 的愈伤组织变异体【1 5 】。w a n g c h a n g q u a n 利用丫射线处理香石竹不定芽，筛选 出耐n a c i 浓度为0 5 ，o 7 和1 0 的变异株系【1 6 1 。 随着对耐盐诱变育种的深入研究，发现植物体自身内具有d n a 损伤修复系统，能 够修复物理诱变剂诱发的d n a 损伤，减少变异频率。因此，常在物理诱变前后添加修 复抑制剂，干扰这一修复过程，增加染色体变异，进而提高物理诱变频率。 1 3 2 化学诱变方法获得耐盐突变体 化学诱变育种是人工利用化学诱变剂诱发植物发生突变，再通过多世代对突变体进 行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上能利用的农作物品种。化学诱变具有时间短， 方法简便，后代稳定快，容易推广应用等特点，因此常常用于诱变育种工作。化学诱变 剂种类很多，常用的有叠氮化钠、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、硫酸- - g _ , 酯( d e s ) 等。 l u a n 等以甘薯叶片愈伤组织为试材，用0 5 的e m s 处理，在2 0 0m mn a c l 培养 基中筛选，经愈伤组织再生，获得3 株耐盐突变株m l l ，m l 2 ，m l 3 ，鉴定结果表明其 耐盐性比对照组高【1 7 1 。李波等用n a n 3 对苜蓿愈伤组织进行诱变处理，获得了耐1 2 n a c i 的愈伤组织【墙】。陈丽用4 ( v v ) 浓度的e m s 处理杨树胚性愈伤组织3 6 h ，经逐 级耐盐定向筛选，得到在含o 5 ( m v ) 的培养基上生根的杨树组培苗4 0 株【1 9 】。刘艳 一2 一 辽宁师范大学硕士学位论文 萌，葛会波等以草莓继代苗为试材，用e m s 处理其叶片，获得可耐o 8 n a c l 的再生 植株【2 0 】。周立名，王飞用e m s 诱变处理海沃德与红阳猕猴桃叶片，在1 0 9 ln a c l 的培 养基上通过胚性愈伤组织诱导出海沃德1 1 株，红阳组培苗1 0 株，经继代后突变株的耐 盐性与对照相比明显提耐2 1 1 。薛建平以安徽药菊为材料，用0 2 和0 5 e m s 分别经浸 渍法和滴加法处理，筛选出在1 5 的n a c l 培养基中稳定遗传的耐盐愈伤组织突变体，大 多数分化出了再生植株，但是不同品种间的分化率差异很大，高者可达7 0 ，低者5 0 e 2 2 。 与物理诱变剂相比，化学诱变剂对生物损伤较大，常引起植物生活力和生育力的下 降【2 3 1 。因此，选择合适的诱变剂量至关重要。 1 3 3 理化复合诱变育种的研究进展 物理诱变方法和化学诱变方法对生物体的作用都有一定的局限性，诱变机理各不相 同。因此，将两种诱变剂特异性复合使用，可以产生累加效果，提高变异频率，扩大变 异谱。 目前国内外研究使用的理化复合诱变研究大致可分为三类：第一类是物理诱变剂+ 化学诱变剂。其可能的机制是辐射处理改变了细胞膜的完整性，促进了化学诱变剂的吸 收；第二类是物理诱变剂+ 修复抑制剂。植物接受辐射后，添加修复抑制剂，可抑制植 物自身d n a 损伤修复系统对诱变剂诱发的d n a 损伤的修复，目前常用的修复抑制剂 主要有e d t a 、咖啡因、溴化乙锭( e b ) 等等；第三类是辐射诱变剂+ 辐射防护剂：辐射 处理后，添加辐射防护剂可清除生物体内辐射产生的自由基，并进行能量选择性转换， 减轻辐射损伤，在辐射频率不降低的情况下，增加突变体数量。辐射防护剂主要有无线 电微波、半胱氨酸、赤霉素、吲哚乙酸和十字花科植物中的芥子碱等。随着此诱变方法 的日益完善，在国内外耐盐诱变育种中的应用也有很大的发展 2 4 - 2 0 3 。 王彩莲【2 7 1 、梁劬嗍、李社荣【冽、张再剥3 0 】等分别在水稻、小麦、珍汕9 7 a 上系统 的研究了y 射线与e m s ，丫射线与n a , n 3 的处理方法、最佳诱变剂量的组合及诱变效果， 结果显示出协和效应和累加作用。郭房庆等用修复抑制剂咖啡因预处理后用x 射线辐照 诱变冬小麦种子，或在辐照后热处理诱变冬小麦萌发种子，用不同浓度的n a c l 筛选耐 盐突变株，结果显示复合处理能明显的提高小麦的耐盐性，并获得了耐1 9 n a c l 的耐 盐突变株p 。 虽然对理化复合诱变的研究早在4 0 年代就开始了，但仍有一些问题尚未解决，如 处理剂量组合少，难于分析复合处理的剂量效应与互作效应；直观分析多，数理统计方 法的运用少：研究指标少，且不系统，缺乏在细胞学水平的研究，忽视对数量性状微突 马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究 变的诱变效应的研究；诱变材料较侧重于二倍体植物等。因此，对理化复合诱变的研究 有待于进一步深入。 1 3 4 直接诱变耐盐突变体 直接诱变耐盐突变体是指不使用其他诱变剂，只使用不同浓度的n a c l 直接进行筛 选。常见的直接诱变方法有两种，一种是利用n a c l 梯度逐级进行筛选，另一种是以特 定浓度的n a c l 进行筛选。 杨爱芳以鲁梅克斯k - 1 杂交酸模的幼嫩花序切段为外植体，诱导出丛生芽，此芽可 通过1 7 1 m m o l l 氯化钠筛选，其后代在含盐o 7 的滨海盐碱地上种植，长势良好【3 2 】。 晁相蓉等获得了耐1 5 n a c l 的鸭茅组培芽，培育成生根苗后，移栽大田，获得了耐盐 性提高的鸭茅新种质【3 3 1 。张焱如等获得了耐1 2 n a c l 的燕麦愈伤组织跚，郑霞等获得 了耐2 0 n a c l 的玉米品系，而且能稳定遗传【3 5 1 。米海莉获得了耐0 5 n a c l 的小麦品 系，在含盐量0 3 o 4 的大田盐地种植中耐盐性很好闭。程智慧等以四种马铃薯品 种茎段为外植体，在不同盐浓度培养基上直接诱导愈伤组织，获得耐盐浓度为0 8 的“东 农3 0 3 ”和“鄂l 号”突变苗，o 6 的“费乌瑞它”突变苗，o 4 的“夏波帝”突变苗【了丌。 利用直接诱变方法筛选出的抗性苗，可能是短期适应的，而不是基因突变的结果， 不具有遗传性。因此，对后代必须进行严格的耐盐性检测【3 8 】。 1 3 5 海水诱变耐盐突变体 海水诱变耐盐突变体方法是指用海水替代n a c l 进行耐盐突变体的选择。 刘兆普以库拉索芦荟( a l o ey e r a ) 组培苗为材料，在培养基中添加不同浓度海水对芦 荟进行盐胁迫驯化培养，以化学渐进递增的方法诱导芦荟的盐应答系统表达逐渐增强， 经过2 年的反复驯化培养，获得可耐5 0 海水浓度的耐盐突变株系“南盐1 号”【3 9 1 。姜 健以紫花苜蓿试管苗下胚轴为外植体，诱导获得愈伤组织，经e m s 处理，通过进一步 筛选获得了耐半海水w 0 呵a c l = 1 5 ，1 2 海水) 的耐盐细胞系，在s d s - p a g e 蛋白图谱中， 出现两条新多肽条带口l = 5 8 k d ，p 2 = 2 6 k d ) ，这两条多肽条带可能与耐盐性有关。 1 3 6 其他诱变方法 随着科学技术的发展，新型的诱变技术不断出现。“空间诱变育种”是利用高空气球、 返回式卫星、高空模拟实验塔搭载植物种质材料，在近地空间化学和物理因素的影响下， 使植物后代发生变异，再经过地面选育，从而获得新品种的方法。1 9 8 7 年我国开始利用 卫星搭载蔬菜种子，至今已搭载处理过番茄、辣椒、黄瓜、斑豆、甜瓜、菜豆、莲子、 百合、食用菌等多种蔬菜，经过种植选育，获得了一批突变类型【4 。 辽宁师范大学硕士学位论文 石刁柏种子经8 天的空间飞行后在地面发芽，呼吸强度高出地面对照6 1 ，幼苗中 脯氨酸的含量高于对照3 3 ，在盐胁迫下，该幼苗质膜透性明显低于对照，说明空间处 理有助于提高幼苗抗逆性【4 2 】。 1 4 诱变育种材料与最佳诱变剂量的选择 诱变育种材料的选择是诱变育种的重要环节之一，而诱变材料的基因型对诱变效果 有重要的影响。基因型的差异可以影响突变率和突变谱。 随着植物诱变育种技术的提高和完善，育种材料也由单一发展到多元化。诱变育种 初期，多采用干种子为材料，后又增加了多种诱变材料，以组织培养物作为诱变筛选的 材料已逐渐趋于主流，包括愈伤组织【1 8 捌、簇生芽【1 44 3 1 、离体叶片刚、花粉等m 。 诱变育种成败的关键是采用适当的诱变剂量，即获得较多的变异，同时又不致过大 的损伤植株。经长期的实验研究，一般多采取半致死剂量或临界剂量。 诱变剂量直接影响到突变频率。研究表明，随着诱变剂量的增大，植株的成活率下 降，同时突变频率上升。一些学者认为，将植物的成活率为6 0 - 7 0 时的诱变剂量作为 最适诱变剂量。一般的说，诱变育种是一个随机复合事件，诱变成功率由植物的成活率 和突变率的乘积决定，对应概率积的剂量才是诱变最适剂量。 1 5 耐盐突变体筛选方法 长期研究表明，对耐盐突变体的筛选，应直接在盐环境下进行。能否诱导出耐盐突 变体，关键在于盐的浓度和筛选的时间。 扎 首先，要确定适宜的盐浓度作为筛选压力。一般认为，选择较低的压力有利于形成 生理适应性的植株，而不利于突变体的产生【4 5 】。因此，n a b o r s 认为，选择的压力必须足 以抑制绝大多数细胞的生长和分裂，在含盐压力培养基中正常细胞几乎不能生长分裂的 情况下，才可能筛选出耐盐突变细胞。 其次，长时间的筛选才能获得稳定的耐盐株系，并获得同质的突变体，以减少产生 嵌合再生植株的可能性。 目前，通常利用n a c i 和海水作为筛选耐盐突变体的选择剂，而c h a l e 行认为也可以 利用羟脯氨酸( h y l p ) 、聚乙二醇( p e g ) 、l 氮杂环丁烷2 羧酸( l - a z e t i d i n e 2 c a r b o x y l i c a c i d ) 等作为选择剂，通过选择渗透的调节能力来提高抗盐性 4 6 1 。d i x 等分理出抗h y p 的烟草细胞系，经测定，这些抗h y p 的细胞系再生植株脯氨酸含量提高，并且具有耐 盐性m 。 马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究 1 6 突变体耐盐性的鉴定 为了确定筛选出的耐盐性突变体是否具有稳定遗传性，还需要对突变体进行进一步 的耐盐性鉴定。目前鉴定方法主要包括直接鉴定方法、间接鉴定方法及分子标记辅助鉴 定。 1 6 1 耐盐性直接鉴定 直接鉴定法是通过评定盐环境下，种子的发芽情况、形态指标、产量等表现性状来 判定突变体的耐盐性。一般来说，种子萌发期和幼苗期是植物对盐胁迫最敏感的时期， 因此，目前耐盐性直接鉴定主要是研究在种子萌发期和幼苗期进行盐胁迫后，筛选出耐 盐性鉴定标准，建立直接鉴定法耐盐性筛选技术体系。 无论是种子萌发期还是幼苗期鉴定，首要的就是确定耐盐性鉴定的n a c i 浓度。不 同的植物、不同的植物器官对盐的敏感性和耐受性都各不相同，过高或过低都达不到鉴 定的目的。因此，筛选出适合的耐盐性鉴定n a c i 浓度是耐盐性鉴定的首要问题。 目前，主要采用的方法就是设定不同的盐梯度，将与不同品种间或是同一品种对照 间耐盐筛选指标差异显著的n a c i 浓度作为该植物耐盐性鉴定的n a c i 浓度。 ( 1 ) 种子萌发期耐盐性鉴定 种子萌发期作为植物生长发育期中对盐胁迫最敏感时期之一，通常可以反映出该品 系其他时期的耐盐性。而且由于其鉴定简单、周期短等优点，成为当前植物耐盐性鉴定 的主要时期。 目前，种子萌发期耐盐性鉴定指标主要有发芽率、相对发芽率、发芽势、发芽指数、 相对发芽指数、萌发活力指数、相对萌发活力指数，同时，也有用芽长、根长、芽鲜重、 芽干重、根鲜重、根干重和发芽盐害指数作为萌发期耐盐性鉴定指标。 发芽盐害指数( ) = 对照发芽率不同盐浓度下发芽率 对照发芽率 l o o ( 2 ) 幼苗期耐盐性鉴定 盐害指数是目前耐盐鉴定中较为常用的方法之一，可以准确的评价鉴定材料的耐盐 性。 ( 代表极值株数) 盐害指数( ) = 最高极值总株数 x 1 0 0 辽宁师范大学硕士学位论文 由于不同植物在盐胁迫后的表现不同，可以根据待评定植物在盐胁迫下的表型自行 划分盐害等级。李卫欣和刘翔分别根据南瓜幼苗和番茄幼苗对盐胁迫的反应，将盐害症 状划分等级，研究表明，耐盐突变体与对照植株的盐害指数差异十分显著，能明显看出 其品系耐盐性的大小，可以作为植物耐盐性比较鉴定的指标郴、4 9 】。 幼苗期其他耐盐性直接鉴定指标还有株高、茎粗、生根数、根长、茎叶鲜重和干重、 根鲜重和干重、根体积、比叶重、叶片数等。程智慧等对0 8 n a c l 浓度下马铃薯的生 根数、生根率、茎尖鲜重、茎尖干重等进行多元统计分析，初步确定了突变株的耐盐性 【3 刀。李晓芬等采用多元统计分析方法，比较了不同品种间辣椒的相对发芽势、相对发芽 指数、盐害指数、相对胚根长、相对株高、相对比叶重、相对展开叶数等1 2 个性状指 标，评价了1 0 个辣椒品种的耐盐性刚。 ( 3 ) 其他耐盐性鉴定 在盐胁迫下，株形、产量、果实质量等都是易受盐害影响的性状，所以可以作为耐 盐性鉴定指标。叶片的表皮蜡质、气孔大小、叶肉质化、叶面茸毛、叶面积大小等都与 植株的水分蒸腾有关，可以使植株内盐浓度相对降低。所以，盐环境下，叶肉质化程度、 叶干重增长量、气孔密度和大小、蜡质的厚度等也是常用的耐盐性鉴定指标。总而言之， 在盐胁迫下，易受盐害的且品系间差异显著的有关植株形态的性状，都可以作为直接的 耐盐性鉴定指标。 1 6 2 耐盐性间接鉴定 间接鉴定法是指用一些与植物耐盐性相关的生理生化指标的变化来评价突变株的 耐盐性。目前，用于植物耐盐性鉴定生理生化指标主要有细胞膜透性、渗透调节物质( 脯 氨酸、多胺、可溶性糖、甜菜碱等) 含量、各种保护酶系统( s o d 、p o d 、c a t 等) 活 性、光合作用、呼吸作用、丙二醛( m d a ) 含量以及激素等。 毛桂莲等通过对耐1 o n a c l 的枸杞耐盐突变体进行生理生化分析表明，突变体的 m d a 含量、质膜透性、h 2 0 2 、0 2 含量均低于对照；抗氧化酶s o d 、c a t 、p o d 活性 明显高于对照【1 5 1 。l u a n 等测定了筛选出的耐盐突变甘薯试管苗的脯氨酸和质膜透性， 突变体中脯氨酸含量升高，质膜透性降, t r o t l 7 1 。吴能表通过研究n a c l 胁迫对豌豆幼苗生 理生化指标的动态影响，也认为脯氨酸可以作为逆境伤害的指标【5 1 1 。 1 6 3s d s p a ( 迅鉴定 s d s p a g e 可以从蛋白质水平来检测耐盐突变株是否发生了遗传变异。能用 s d s p a g e 方法进行品种鉴定的蛋白质主要包括贮藏蛋白和同工酶，这些蛋白的组成由 遗传决定，不受环境的影响，因此，当基因不同时，可表现出蛋白组分的差异，又称为 马铃薯的组织培养及耐盐诱变育种研究 品种的“生化指纹”。相对于d n a 多态性检测，蛋白质的检测具有时间短、材料用量小、 结果稳定性好、技术简单、重复性高、费用低等优点，因此，已经被广泛用于品种鉴定。 闰炯等用s d s p a g e 对由e m s 诱导的河农8 2 2 获得的小麦变异株进行鉴定，在g l u - i b 和g l u - i d 位点呈现出缺失和新增亚基2 种情况，提供了分子生物学证据【5 2 1 。毛桂莲获 得耐盐突变体有2 2 个蛋白条带，而对照组有2 1 个蛋白条带，而且突变体和对照株都有 其特有的蛋白条带，从图谱上还可以看出蛋白的表达量不同【l 引。 1 6 4 分子标记辅助筛选 随着分子遗传学及相关学科的迅速发展，利用分子标记技术对耐盐突变体进行鉴 定，可以从分子水平上准确的分析个体的遗传组成，从而实现对突变株基因型的直接选 择【5 3 】。分子标记是以d n a 多态性为基础的遗传标记，目前应用的主要有r a p d 、r f l p 、 a f l p 等。它可用来定位基因、筛选耐盐分子标记，进而进行耐盐品系的选育；它还克 服了传统诱变育种的随机性、盲目性，不受环境条件和植物生长发育阶段的影响，且检 测快速简便l 5 4 】。 到目前为止，在分子水平上已成功鉴定的耐盐突变体有芦苇【5 5 1 、大豆、小麦 铜、豆 瓣菜【5 7 1 、和苜蓿、小黑麦【4 引。 1 7 马铃薯耐盐研究进展 马铃薯是一种弱耐盐性作物【5 9 】，我国马铃薯耐盐性研究起步较晚，从2 0 世纪9 0 年 代开始出现较多研究报道。早期，多倾向于研究盐胁迫对马铃薯生长的影响。主要的研 究结果有盐胁迫可推迟出苗时间、抑制地上部分的生长、出苗迟缓、成活率低、植株矮 小、随着盐浓度的增加，存活率、株高和生长势均与浓度呈显著负相关 6 0 - 6 3 1 。 随后，对马铃薯的耐盐性研究深入到生理变化上。主要研究结果有盐胁迫下，脯氨 酸、n a + 、丙二醛增加，叶绿素含量、气孔导度、光合速率下降，质膜透性增大，s o d 活性先升高后降低，p o d 活性升高等f f , 4 - 6 6 】。崔炎森等认为，叶绿素含量的下降、膜透性 增大和n a + 是盐抑制马铃薯试管苗生长的主要原斟6 5 1 。 马铃薯耐盐性的筛选和鉴定工作是马铃薯耐盐研究的关键，大量学者通过不同的鉴 定环境和鉴定措施对不同马铃薯品系的材料进行耐盐性鉴定，并通过不同的方法，诱发 突变，获得耐盐性品系。1 9 9 6 年，龚家栋在低盐分( e c 4 0 d s m ) 和中盐分( e c 8 0 d s m ) 胁迫下，根据生物量和产量，6 个马铃薯品种的耐盐性顺序为 v - 3 m a r i v a p i r a t i n l c f c 6 9 1 m t m i m n z a r a t 6 7 1 。尹江等( 2 0 0 5 ) 用n a c l 浓度梯度法鉴定和 筛选了3 5 份不同马铃薯材料的耐盐性，筛选结果为：1 级耐盐( a p0 8 盐浓度下仍然存 活) 材料3 份，2 级耐盐( e p0 6 盐浓度下仍然存活) 材料2 份，3 级耐盐( e p0 4 盐浓度 下仍然存活) 材料3 份 智慧等对马铃薯茎段外植体直接盐胁迫，筛选出耐盐突变体：“东农3 0 3 和“鄂l 号 愈伤组织最大耐盐浓度为0 8 ，“费乌瑞它一为0 6 ，“夏波帝 为0 4 ，并提出愈 伤组织继代次数不宜超过8 1 0 次【，7 1 。 随着转基因技术的逐步完善，利用转基因方法获得耐盐品系也得到了尝试。李东魁 等将从菠菜中合成的甜菜碱醛脱氢酶( 劭m h ) 基因转入“甘农薯2