（细胞生物学专业论文）pml蛋白调控细胞核体可塑性的分子机制研究.pdf

摘要 摘要 p m 是支配p m l n b s 组装及功能的主要成分。尽管以前的研究已经证明了 p m l - n b s 是s u m o 化蛋白聚集的地方，但关于p m l 蛋白调节其过程仍然不是清楚。 本研究显示了p m l 3 与t i p 6 0 相互作用并募集其上p m l - n b s 。我们的生化证据表明 p m l 3 与t i p 6 0 的n 端3 6 4 个氨基酸相互作用。重要的是，这3 6 4 个氨基酸也是t i p 6 0 定位到p m l _ n b s 上所必需的，说明了p m l 3 t i p 6 0 相互作用是介导了t i p 6 0 的 p m l - n b s 定位。p m l 3 与t l p 6 0 之间的相互作用是特异的，因为t i p 6 0 是与p m l 3 蛋白 的c 端相互作用的。p m l 3 以及t i p 6 0 之间的相互作用可以稳定t i p 6 0 ，使之免于由 m 锄2 介导的降解，表明p m l 3 与m d m 2 竞争与t i p 6 0 结合。荧光漂白恢复实验说明 p m l 3 t i p 6 0 的相互作用调节了t i p 6 0 的核体定位以及移动。相反，在p m l 3 缺失的细 胞中，t i p 6 0 的分布和移动受到了阻碍，同时导致了d n a 损伤修复应答的异常。因 此，p 地3 控制了t i p 6 0 的分布动力学以及功能。我们的发现提示了一种新颖调节机 制。我们认为p m l 3 和t i p 6 0 肿瘤抑制蛋白相互协作，确保了基因组的稳定性。 p m l 小m 是一种动态的结构，它的数目、大小和位置在正常情况下，特别是细 胞压力应答的情况下，会进行显著的改变。例如，热休克及重金属会导致p m l - n b 变为无数的核内小点。类似的，d n a 损伤试剂，如c i s p l a t i n 和a l k y l a t i n 试剂将导致 p m l - n b 散布为更小的小体甚至呈现一种弥散的状态。虽然先前的研究试图解释这 些表型，压力下p m 微结构的作用仍然未知。在我们最近的研究中，我们揭示c d c l 2 和t n f 可以诱导两种不同表型的产生，并且介导两种不同的细胞命运。h e l a 细胞用 c d c l 2 处理后，p m l - n b 在核中被破坏，大部分p m l 蛋白迁徙到胞浆之中。有趣的是， p m l 和泛素蛋白在胞浆共定位，并且受其调控而降解。最终c d c l 2 诱导细胞凋亡。然 而，t n f 可以通过提高p m l 的s u m o 化而增加p m l n b 的数目及大小，而且，在 t n f a 的压力下，检测不到凋亡细胞。我们的观察为进一步理解p m l 和p m l - n b 的 功能提供了证据，也将对化学治疗药物的筛选有所帮助。 关键词：核体p m lt i p 6 0s u m o 化m d m 2 介导的降解应急凋亡 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r o m y e l o c ”i cl e u k a e m i a ( p m l ) p r o t e i ni sam 旬o rc o m p o n e n tt og o v e mt h e p m ln u c l e a rb o d y ( n b ) a s s e m b l ya n df h n c t i o n a l t h o u g hi ti sw e l ld e f i n e dt h a tp m ln b i sas i t er e c m i t i n gs u m o y l a t e dp r o t e i n s ，t h em e c h a n i s mb yw h i c hp m lp r o t e i nr e g u l a t e s t h ep r o c e s sr e m a i n su n c l e a r h e r ew es h o wt h a tp m l 3 ，as p e c m cp m li s o f o 肿，i n t e 胁c t s w i t ha n dr e c r u i t st i p 6 0t op m ln b s o u rb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o nd e m o n s t r a t e st h a t p m l 3p h y s i c a l l yi n t e r a c t sw i t ht i p 6 0v i ai t sn t e n n i n a l3 6 4a m i n oa c i d s i m p o n a n t l y ， t h i sp o r t i o no ft i p 6 0i ss u 伍c i e n tt ot a r g e tt ot h ep m l n b s ，s u g g e s t i n gt h a tp m l 3 - t i p 6 0 i n t e r a c t i o ni ss u f n c i e n tf o rt a r g e t i n gt i p 6 0t ot h en b s t h ep m l 3 - t i p 6 0i n t e r a c t i o ni s s p e c i f i ca st h er e g i o no ft i p 6 0 - b i n d i n gi sn o tc o n s e n ，e di no t h e rp m li s o f o r m s n e p h y s i c a li n t e r a c t i o nb e t w e e np m l 3a 1 1 dt i p 6 0p r o t e c t st i p 6 0 行o mm d m 2 m e d i a t e d d e g r a d a t i o n ，s u g g e s t i n gt h a tp m l 3c o m p e t e s w i t hm d m 2f ；d r b i n d i n g t 0t i p 6 0 f l u o r e s c e n c er e c o v e wa r e rp h o t o b l e a c h i n ga 1 1 a l y s i si n d i c a t e st l a tt h ep m l 3 一t i p 6 0 i i l t e r a c t i o nm o d u l a t e st h en u c l e a rb o d yd i s 仃i b u t i o na 1 1 dm o b i l i t yo ft i p 6 0 c o n v e r s e l y ， t h ed i s t r i b u t i o na n dm o b i l i t ) ，o ft i p 6 0a r ep e r t u r b e di np m l 3 一d e f i c i e n tc e l l s ， a c c o m p a n i e db y a b e r r a t i o n si nd n ad a m a g er 印a i r i n gr e s p o n s e t h u s ，p m l 3 o r c h e s t r a t e st h ed i s t r i b u t i o n ，d y n a m i c sa n dm n c t i o no ft i p 6 0 o u rf i n d i n g ss u g g e s ta n o v e l r e g u l a t o r ) ，m e c h a n i s mb yw h i c ht h ep m l 3a i l dt i p 6 0t u m o rs u p p r e s s o r sc o o p e r a t e t oe n s u r eg e n o m i cs t a b i l i 够 p m l - n b sa r ed y n a m i cs 仃u c t u r e st h a tu n d e 唱os i g n i 行c a n tc h a n g e si nn u m b e r ，s i z e 觚dp o s i t i o nb o t hu n d e rn o m l a lc i r c u m s t a n c e sa n dp a r t i c u l a r l yi nr e s p o n s et oc e l l u l a r s t r e s s ，f o ri n s t a n c e ，h e a ts h o c ka n dh e a v ym e t a l sc a u s et h er e d i s t r i b u t i o no fp m l - n b s i n t on u m e r o u ss m a l ln u c l e a rd o t s s i m i l a r l y ，d n a d a m a g i n ga g e n t ss u c ha sc i s p l a t i na n d a l k y l a t i n ga g e n t sc a u s et h ed i s p e r s a lo fp m l - n b si n t 0s m a l l e rb o d i e so re v e ni n t o a d i a h s ep a 仕e m a l t h o u 曲p r e v i o u ss t u d i e st r yt 0r e s e a r c ht h o s ep h e n o t y p e s ，t h ef u n c t i o n o fp m lm i c r o s t r u c t u r e su n d e rs t r e s si ss t i l lu n k n o w n i n0 u rr e c e n ts t u d y ，w es h o wt h a t c d c l 2a n dt n f ac o u l di n d u c et 、v od i 虢r e n tp h e n o m e n o n sa n dm e d i a t e dt w od i 日e r e n t c e l lf a t e s 、m 1 e nh e l ac e i l sw e r et r e a t e dw i t hc d c l 2 ，p m l - n b sw a sd i s r u p t e di nt h e n u c l e a r ，a n dm o s to fm ep m lp r o t e i n s t r 孤s f e l l r e dm t 0c y t o p l a l s m i i l t e r e s t i n g i y ， c y t o p l a s m i cl o c a l i z a t i o n o fp m l 、a sc o l o c a l i z e dw i t hu b q u i t i n 锄dd e g r a d e d t h e u l t i m a t ee f f e c to fc d c l 2o nh e l ac e l l sw a st oi n d u c ea p o p t o s i s h o w e v e r ，t n f ac o u i d i n c e a s et h en u m b e ra n ds i z eo fp m l n b st h r o u g hp r o m o t i n gt h es u m o y l a t i o no fp m l ， a n dm e r ew a sn oa p o p t o s i sc e l l sd e t e c t e du n d e rs t r e s so f7 r n f a o u ro b s e r v a t i o n so f f e r s o m ee v i d e n c e st of u r t h e ru n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no fp m la n dp m l - n b s ，a n dw i l lb e h e l p 如1f o rs c r e e n n i n gd r u g sf o ra p lc h e m o t h e r a p y k e yw o r d s ：n u c l e a rb o d y ，p m l ，t i p 6 0 ，s u m o y la t i o n ，m d m 2 - m e d i a t e dd e 掣a d a t i o n ， s t r e s s ，a p o p t o s l s 缩略词表 a r a t m a 豫 c d c l 2 c 1 1 l ( 1 c h l ( 2 c h x d a p i h 认p g f p g s t h a h a t h d a c m b p n l s p b s p m 吐n b s p m 吐 r f p s d s p a g e s i r n a s u m o t b s t i p 6 0 t n f a u b u b l u v 缩略词表 a n d r o g e nr e c 印t o r a t a ) 【i at e l a n 西e c t a s i am u t a t e d a t ma n dr a d 3 一r e l a t e d c a d m i u mc h l o r i d e c h e c k p o i n t 虹n a s e1 c h e c k d o i ml ( i n a s e2 c y c l o h e x i m i d e 4 ，6 - d i 姗i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l e f l o r r e s c e n c er e c 0 v e d ，疆e rp h o t o b l e a c h i i 唱 g r c e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i l l g l 蝴i o n es - t 阳n s f 旨e r 笛e h 铋1 a g g l u t j 畸n h i s t o n ea c e l y l1 豫n s f c m s e h i s t o n ed e a c e i y l 雏e m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i l l n u c l e a rl 0 c a l i z a t i o ns i 印a l p h o s p h a l eb u 位r 甜s a l i n e p m 儿n u c l e a rb o d i 鹳 p r o m y e l o c ”i cl e u k e m i a r e df l u o r e s c e n c ep r o t e i n s d sp o l y a c r y l 锄i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s m a l l i m e r f 蕊n gr n a s m a l lu b i q u i t i n - r e l a t e dm o d i f i e r t n sb u j f f e r e ds a l i n e t a t - i m e r a 硝v ep r o t e i i l ，6 0 k d f u m o rn e c r o s i sf a c t o r u b i q u i t i n u 聊q u i t i n - l i k ep r o t e i n u l t r a v i o l e t 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。 除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研 究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：签字日期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有 学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文 的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电 子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开 口保蛮( 年) 作者签名： 监作者签名：j 里径 签字日期：主墨菩三! 匠签字日期! 匣型 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 早幼粒细胞白血病蛋白p m l ( 又称m y l 、r n f 7 l 、p p 8 6 7 5 或者t r i m l 9 ) 是一个 肿瘤抑制子，其特异地散布在染色质的点状核结构。以前称这些结构为核结构域1 0 、 k r e m e r 体和p m l 癌基因结构域，由于p m l 蛋白对这种结构域的形成至关重要， 现在都统称为p m l 核体( p m l - n b s ；s a l o m o n ia n dp a n d o l f i ，2 0 0 2 ) ，p m l 舶s 是一种 不连续的核聚集，尺寸约为o 2 0 3 “m 宽，这些聚集点出现在大部分哺乳动物细胞 核中，依据细胞类型、细胞周期的不同及不同阶段，每个核中p m l 小b s 的数量约 为l 3 0 个。最近的研究表明，尽管这些结构显得整齐规一，但p m l - n b s 在结构 上和功能上具有异质性，而且也是是一种动态的结构。 许多p m l - n b s 上的蛋白是构成性的，但大部分蛋白在p m l 柚s 是动态变化的， 因此，p m l 小旧s 能够调节各种细胞功能，如参与细胞凋亡和细胞衰老、抑制细胞增 殖、维持基因组稳定性和抗病毒功能。尽管p m l 和p 池加s 的生理功能仍然存在 争论，其在肿瘤抑制中的功能是被证实了的( b e m a r d ie ta 1 ，2 0 0 6 ；t r o t m a i le ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。本篇综述将集中讨论p 池小i b s 的结构、成核机制以及其细胞学功能。 t i p 6 0 最早是作为h i v - lt a t 相互作用蛋白而分离出来的( k 锄i n ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。编 码t i p 6 0 的h t a t 口基因定位于染色体上1 1 q 1 3 1 ，由十四个外显子组成。细胞内n l 】刚a 的选择性剪接产生至少三个剪接体，t i p 6 0 异构体l 、t i p 6 0 异构体2 ( t i p 6 0 a ) 和t i p 6 0 剪接体3 ( t i p 6 0 p ，p l a 2 相互作用蛋白，p l i p ) ，目前被研究最多是剪接异构体2 。异 构体1 是由外显子l 的翻译产生的，编码了具有潜在的不同功能的新蛋白( l e g u b ea n d 1 r o u c h e ，2 0 0 3 ) ，异构体3 ( t i p 6 0 p ) 是由丢失了编码富有脯氨酸区域的外显子5 产生的 限a na n dp e r e i r a s m i t h ，2 0 0 0 ) ，并且与t i p 6 0 a 具有相似的特性( s h e r i d a l le ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 在发现t i p 6 0 不久就证明了其具有乙酰转移酶的活性。重组的t i p 6 0 在体外可以 乙酰化核心组蛋白h 2 a ( l y s 5 ) 、h 3 ( l y s l 4 ) 和h 4 ( l y s 5 ，l y s 8 ，l y s l 2 和l y s l 6 ) ( k i m u r a 觚dh 撕k o s h i ，1 9 9 8 ；y a m 踟o t o 锄dh o r i k o s h i ，1 9 9 7 ) 。当t i p 6 0 在一个稳定的多蛋白复 合物中时，能在体外修饰可以组装成核糖体的组蛋白在这种情况下，t i p 6 0 选择性的 乙酰化h 2 a 和h 4 ( i k u r ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。最近从果蝇( d m e l a n o g a s t e r ) 发现的证据表明 t i p 6 0 也能乙酰化被修饰的组蛋白，如磷酸化的h 2 a v 的l y s 5 ( k u s c he ta 1 ，2 0 0 4 ) 。除 了组蛋白外，细胞内的t i p 6 0 能乙酰化转录因子，如男性激素受体( a r ) ，结合转录 因子的上游区域( 切3 f ) 、骨髓组织增生癌基因一c ( c m y c ；g a u 曲a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 以及 第一章文献综述 删( s u ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 t i p 6 0 参与了广泛的生物学过程，比如基因调节，剂量补偿，d n a 损伤修复和肿 瘤发生t l e ye ta 1 ，2 0 0 3 ) 本篇综述将对t i p 6 0 的结构和功能做详细介绍。 1 1p m l 和p m l 核体 由于与急性早幼粒细胞白血病( a p l ) 有关，在十多年中p m l 一直都是一个研 究热点。p m l 最初被发现是因为它位于t ( 1 5 ：1 7 ) 转移的分支点上，而t 转移是大多 数a p l 的特点。这一转移彼此相关互惠，将位于第1 5 号染色体的p m l 基因和位于 1 7 号染色体的r a r 0 【基因相融合( m e l n i c ke ta 1 ，1 9 9 9 ) ，从而产生两个编码融合蛋白 的融合基因p m l r a r a 和r a r n p m l ( m e l n i c ke ta 1 ，1 9 9 9 ；l ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 p m l 。r a 胁包含了这两个基因绝大多数的编码区域，是a p l 中的主要致癌因子。 而r a r 晓p m l 在a p l 转化过程中只是起辅助作用( b r o w ne ta 1 ，1 9 9 7 ；p 0 1 1 0 c ke ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。融状0 【属于核激素受体亚家族，在其配体维甲酸存在时促进转录，诱导分化 过程中许多基因的表达( c h e ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。普遍认为p m l r a r c 【起着p m l 和r a r a 的显性抑制突变的作用，因此分别导致了成熟阻滞和异常存活( m e l n i c ke ta 1 ，1 9 9 9 ； s a l o m o n ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。然而，最近的数据表明，实际的情况可能更为复杂，p m l r a r a 还可以起到功能获得性突变的作用( s t e m s d o r f e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。用药学剂量的全反式维甲 酸a t r a 对白血病成纤维细胞进行治疗可以导致终端分化，从而使病人恢复。正因 为此，a p l 已成了分化疗法的范例。然而，许多a p l 病人都会因为出现a 姗认抗 性而产生病情的反弹( s 1 a c ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 尽管对p m l 的许多方面还知之甚少，最近几年对p 池的研究已经有了很大进 展。越来越多的证据表明，除a p l 外，p m l 在非造血肿瘤中也有着肿瘤抑制的功 能。 1 1 1p m l 的结构 人类p 池基因至少在1 2 条选择性剪切的m 砌妊中表达，每一条都编码一个独 立的蛋白质( j e n s e ne ta 1 ，2 0 0 l ；n i s o l ee ta i ，2 0 0 5 ) 。它们共享一段标志性的n 端区域， 由5 7 0 个氨基酸组成，由外显子1 6 编码。所有核p m l 异构体都在第六个外显子中 有一段n l s ( 核定位信号) ，从而使它们定位于核浆和p m l 小i b s ( p m l 核体) 。p m l j n b s 是由高度有序的p m l 多聚体构架的大蛋白复合体，有各种不同的名称，如 p m l _ b o d v 、p m l 小i b s 、p o d 、n d l 0 。目前，已经有越来越多的蛋白质被报导与p m l 第章文献综述 共定位于n b 上而且其中的一部分蛋白质被发现可以与p m l 之间发生直接的相互 作用这些蛋白质包括：p 5 3 、r b 、d a x x 、c b p 以及e i f 4 e ( 圈l lx j e n s 朗h 甜，2 0 0 1 ) 。 根据细胞类型以及细胞大小的不同，细胞核内定位的核体往往呈现十分不一致的形 态和数量。一般来说，核体形态以及数目上的差异与当时细胞的蛋白质合成速度成 正相关而与细胞的分化程度成负相关( m e h i c k 孤dl i c m1 9 9 9 ) 。利用电子显微镜对 n b 的观察发现细胞核中一般含有l o 一3 0 个不等的核体并且呈现类似于血红细胞形 态的凹陷环状结构，大小一般为：仉2 1o 微米。 圈1 lp m l 棱件的已知组成成分爰其细臆棱内定位模j “h o 缸叫w 峨2 在细胞中也存在缺少外显了6 的胞浆p m l 异构体因而缺少有功能的核定位 信号( s a i o r n ida l ，2 0 0 7 ) 。另外一种p m l 异拘体p m l i ，除了表达n l s 外还表 达一种核输出信号，因而能够在核内及胞质中穿梭。 由于p m l 的n 端包含有r 酬l y h t e 腊t i l l g n e w g 蛐“r 肼g ) 、b b o x 、i l c d 啪i 1 ( r b c c ) 结构域( j 蚰s 帅就a 1 ，2 0 0 1 ) 因此它被定义为三重模体( 刑m ) 蛋白质家族的 一员y m o n dna 1 ，2 0 0 1 ) 。在人类基因组编码的6 0 余种1 砌m 家族蛋白种，至少 l 晤具有抗病毒作用( 包括p m l ，也称删1 9 ) ，但其他约4 巧的该家族蛋白功能仍 然未知( n i s 0 i e 吐蛆，2 0 0 5 ) 。有趣的是r i n g 结构域已被证实有e 3 连接酶的活性 口o a 让i i odm ，2 0 0 0 ) ，而且这种活性似乎也存在f 其他的t r i m 家族成员f m e r o n in 第一章文献综述 a 1 ，2 0 0 5 ) ，尽管是否所有的t 对m 家族蛋白质都有e 3 连接酶活性还有待证实。螺旋 结构( c o i l e d - c o i l s ) 也已被证实在聚合过程中起作用( b u r l ( h a r de ta 1 ，2 0 0 1 ) ，但对b - b o x 的功能目前还知之甚少。最近解出的第一个人类b - b o x 结构域表明，它与r 烈g 结 构域有j 晾人的相似性，说明这一结构域可能有e 4 连接酶的潜在功能( m a s s i a he ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。然而，与r b c c 模体相联系，人们已经知道b - b o x 可以辅助由c o i l e d c o i l 区 域介导的寡聚化( c a oe ta 1 ，1 9 9 7 ) ，因此b - b o x 的精确功能还仍然是未解之谜。不过 目前知道的是r b c c 作为一个整体对寡聚化非常重要，例如k a p 1 蛋白的r b c c 模体已被发现在体外也以三聚体的形式存在( p e n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此外，r b c c 模式与 组成型结构域之间的间隔彼此相关，并且在整个t 刚m 家族中高度保守，暗示其在 维持整体结构以及在协调寡聚过程中起着很重要的作用。事实上，每一个这样的结 构域对p m l n b s 的形成都是不可或缺的( b o r d e ne ta 1 ，1 9 9 6 ；f a 西o l ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。然 而，除了这些信息之外，对p m l 的结构分析还仅限于了解i 也c c 的单个结构域， 并且目前已经被解析出来的还只有单一n g 结构域的三维结构( b o r d e n 或a 1 ， 1 9 9 5 ) 。而对于完整的r b c c 模体，或者对t 对m 蛋白自身结合的机制( 这两者都对 侧m 蛋白各自的功能至关重要) 却还没有获得任何结构信息。 p 池的s 切o 化涉及到p 池功能的各个方面，也使得p m l 的结构与功能显 得更加错综复杂。p m l 的s u m o 化在三个赖氨酸残基限玳g 结构域的k 6 5 、k 1 6 0 、 以及n l s 的k 4 9 0 ) 上发生( k a m i t a n ie ta 1 ，1 9 9 8 ) ，对p m l 二n b s 的形成至关重要，因 为p m l 通过其r b c c 以及s u m o 作用模体形成同寡聚体( s h e nc ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而且 s u m o 化对p m l 与许多p m l - n b s 架构蛋白( 包括转录抑制蛋白d a x x ) 的相互作用 也很重要( i s h o ve ta 1 ，1 9 9 9 ；l i ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。实际上，r b c c 1 刚m 蛋白家族的一些 成员作为s u m o ( 而不是泛素) 的e 3 连接酶在起作用。有证据表明，p m l 可能也以 相同的方式起作用( q u i m b ye ta 1 ，2 0 0 6 ) ，可能由其与s u m o 化e 2 酶u b c 9 的相互 作用介导( d u p r e z e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。s u m o 化是一个高度动态的过程，由类泛素蛋白特异 性的蛋白水解酶家族调节( m u l ( 1 1 0 p a d h y a ye ta 1 ，2 0 0 6 ) 。有趣的是，p m l 可以被s u m o 蛋白水解酶s u p r l 去s u m o 化，而s u m o 蛋白水解酶普遍可以影响p m l 的亚细 胞分布( b e s tc ta 1 ，2 0 0 2 ；m u l ( l o p a d h y a ye ta 1 ，2 0 0 6 ) 。这一发现说明p m l 的s u m o 化也是一个非常动态的过程， s 切0 化在细胞中功能多样，仍然不完全为人们所知( h a ye ta 1 ，2 0 0 5 ) ，但这一 修饰对于调节亚细胞定位、蛋白质复合物形成都很重要，而这两者都是p m l 功能 的体现( h e u ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。p m l 的复杂性和动态性可以通过对其s u m o 化过程的观 察得到很好的体现。p m l 可以被任意一种s u m o 异构体( s u m 0 1 ，s l m 0 2 ，s u m 0 3 ) 4 第一章文献综述 修饰( f ue ta 1 ，2 0 0 5 ；v e n e g a a le ta 1 ，2 0 0 6 ) 。s u m 0 1 倾向于以单体形式修饰，而最近 的证据表明s u m 0 2 3 以多聚体形式与p m l 共价结合( f ue ta 1 ，2 0 0 5 ) ，并且这些多 聚s u m o 链对p m l - n b s 的形成是必须的( m u k h o p a d h y a ye ta 1 ，2 0 0 6 ；1 a t h a me ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。另外，人们也发现，当大多数s u m o 1 组成性地和其底物相连接时，细胞 中存在着一个游离s u m 0 2 3 库，在细胞受到不同的环境压力时，这些s u m 0 2 3 将 与底物相连接( s a i t o he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这一现象使人们对p m l 的生物功能又有了更进一 步的了解。 1 1 2p m l 的异构体 p m l 的功能依赖于其与不同细胞成分的相互作用、架构乃至直接修饰的能力。 大家都知道这一具有多重功能性的蛋白可以与其他的核蛋白作用，但它也可以和 s s 聊、a ( b o ee ta 1 ，2 0 0 6 ；l u c i a l l ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 、特定染色体位点( a o t oe ta 1 ，2 0 0 6 ；k u m a r e ta 1 ，2 0 0 7 ；l u c i a n ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 、病毒d n a ( b i s h o pe ta 1 ，2 0 0 6 ) 以及质粒d n a ( b l o c k e ta 1 ，2 0 0 6 ) 形成复合物。p m l 加s 被发现与许多核结构或核内区域( 如核仁、端粒、 d n a 损伤时的聚点及c 萄a l 体) 结合，并且常常被描述为“与核基质相连”。这种多样 的结合能力反过来又可以将p m l 与许多生物学过程如凋亡、衰老、蛋白更新 以及基因表达调控联系在一起。 那么一种蛋白质可能具有如此广泛的功能吗? 这一问题的部分答案是人类p 池 实际上并不仅仅是一种蛋白，它是一个不同蛋白质异构体的集合，每一种异构体都 有其独特的功能。如上所述，n 端区域介导了p 池的同源多聚化，但不同的c 端 可能决定了p m l 与其他蛋白的相互作用。在不同的人类p m l 异构体之间，c 端区 域有高度的多样性；由于鼠细胞只表达两种几乎相同的异构体，这很可能反映了进 化的多样化。在鼠中，只表达有限的p m l 剪切形式，而在更高等的脊椎动物中， 却有不同的变化形式，这很可能反映了p m l 在压力胁迫下的细胞通路调控中的特 化功能( c o n d e m i n ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 。由此产生的一个问题是：是否有一种驱动力克服了 鼠细胞中很常见的自然转化事件，推动着p m l 功能的进化( r a n g a r 句a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ? 图1 2 中举出了人类p 眦异构体的标准命名法，显示了每个蛋白都是怎样从人类 p m l 基因中的1 3 个外显子中剪切下来的。p m l 异构体i 有最长的c 端区域，含有 超过3 0 0 个氨基酸，包括一个核酸外切酶( e x o i i i ) 结构域，是在i 氇c c 结构域外的 一个球状结构域的异构形式。p m l i 也是表达量最高( c o n d e m i n ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 、最古 老的一种异构形式，与鼠中的异构体有最高的同源性。因此，p m l i 很可能在 p m l - n b s 的形成中起到关键的结构作用，但e x o i i i 结构域的存在说明这一异构体 第一章文献综述 可能对染色质束缚、重塑、以及与核酸的相互作用都很重要i b 姒na i ，2 0 0 6 ；l i 绷i n 训，2 0 0 6 ) ，事实也确实如此。p 。的一个特异性作用正是通过与特定的基因座， 如c 基因座相互作用来实现对基因表达的直接调控( k 哪盯d m ，2 0 0 7 ；s h e le t 柏2 0 0 1 ) 除了e x o i i i 结构域，p m l i 的c 端被预测是无特定结构的，在其他p ， 异构件中亦然( 图l3 ) 。这种无特定结构区域的存在与p m l 蛋白能与许多其他蛋白 相互作用的特性相一致。在涉及蛋白蛋白相瓦作用和蛋白d n a 相互作用的蛋白之 中，天然的无序结构或无序区域是普遍存在的。据估计，大约4 0 由人类基因组编 码的蛋白质都包含这样的区域，这一比例在涉及转录调控和胞内信号传导的蛋白质 中还要更高u n 蛔da 1 ，2 0 0 5 ) 。结构的多样性为蛋白相互作用提供了许多便利所 有这些便利都可以极好地对应于p m l 功能的复杂性。例如与结构固定的球形蛋白 质结构域相比西妇n 甜，2 5 ) ，无序的多肚有更高的动力学常数，有更多的结合 蛋白，这些特性显然是对p 。的功能有利的。 廿忙卜俨仁 口! 珂! 三 二玉 一一m 挑m 工二二丁二二 二二二 二二二二 二卫立3 = = = = = = p m 二口二正二 二 二二二二工二卫 卫雹 p m l w 二口二正二 二 二二二二工二卫日= 翔幸 p m l - v 工二 工二正二工二二工二二二二二 二圃+ p m m 二 二 二二 二二二 回 n t j - p m l l 9 a f o r m 州i n ca m l b o d i e ， 瞎t 】人类细矗中表选的全部的p m l 异柏体( b h - 川i - “h o h l 2 0 忉p m l 蛋白包括i 十由单基因通过选择性剪接而编码校异构体。其模式图如上所示，显示r 啦结构域、b 出 盘1 和2 、c o n e 她却陋c c 结拇域) 和出桉结构域一其n 端的r b c c 结构域都是相同的，而不 同的p h 董l 异构体的c 端结构域各不相同。 第一章文献综述 壁 8 叱 o z o 正 p m li s o f b n t ld 拓帕f d e rp f e d i c t i 、一觚八门 从八、 ： ? ： ， - f f ： ? ： ： j ：? ： ： f i f v 。 ? 心 r 尸 图1 3 聊m 。异构体c 端结构域表现出不同的结构特性( 融l o m 蛐i 曩n df e r 驴鲫n 瑚8 ) 。 与不同的p 眦异构体具有不同独立功能的观点相一致，越来越多的证据表明蛋 白蛋白相互作用是异构体特异性的。例如，p m l i i 可以和腺病毒子e 4 0 r f 3 特异性 地相互作用( h o p p c e ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而p m l i v 可特异性地与p 5 3 相互作用( f o g a l 既a 1 ， 2 0 0 0 ；g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。p m l i v 也可以和磷酸化不足的视网膜蛋白p r b ( a l c a l a ye ta 1 ， 1 9 9 8 ) 以及组蛋白去乙酰酶) a c ( w he ta 1 ，2 0 0 1 ) 相互作用，正是通过这样的作用， p m l i v 也涉及介导特定的胞内过程如诱导衰老( b i s c h o f 瓯a 1 ，2 0 0 2 ) 。最近发现 p m l i 的c 端和核仁有相互作用( c o n d 咖i e ta i ，2 0 0 7 ) ，虽然关于这一作用的特异 性和功能还仍然未知。胞浆p m l 异构体则通过与s m a d 2 以及s a r a 的直接作用 介导t g 邛信号传导( l 如e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 这些发现构成了p m l 生物学中重要而未知的问题的基础。要正确地理解这一系 统，这些问题必须得到解答。尽管如今已经知道不同的p m l 异构体必须聚集以形 成单一的、有功能的p m l 加( c o n d 锄i 鹏e ta 1 ，2 0 0 6 ) ，但人们还不知道p m l 的活 性是否与其出现于核膜或核结构域有关。例如，是否有可能p m l 二n b 只是仅仅作为 一个无活性的架构蛋白( 如d a x x ) 的储存位点( 在需要的时候，d a x x 可以在核结构 域穿梭，可能由特定的p m l 异构体介导( l ie ta 1 ，2 0 0 0 ；w he ta i ，2 0 0 1 ) ) ? 这一模型 ( 即：p 的活性与其出现于核膜或核结构域有关) 或许可以解释为什么总是发现 p m l 小体与其他的核结构域相关，如与d n a 损伤聚集相邻，在那里，信号蛋白， 7 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ， o 0 0 o 0 0 0 0 0 第一章文献综述 如c h k 2 ( 可以被a t m 在双链断裂位点修饰，随后又可以在p m l 小旧s 被进一步修饰 ( y a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) ) 可能在断裂产生的两个位点被有效地共享。然而，p m l 与d n a 以及染色质相互作用的功能中心位于核结构域本身的内部，因为正是在那里发现了 休眠的病毒基因组，s s d n a 以及端粒。这种现象构建了一种可能的模型：p m l 小旧s 提供一种微环境，使与其结合的蛋白具有特定的活性。 另一个显著的现象就是在不同的细胞株中，甚至在同一细胞群体的不同时期， p m l 的功能也不同。例如，在a l t 细胞中，p m l 与端粒聚点相结合( y e a g e re ta 1 ， 1 9 9 9 ) ，而在休眠期的细胞中它常常环绕于核仁( c o n d e m i n ee ta 1 ，2 0 0 7 ) 。对不同的 组织，肿瘤和细胞株中对p m l i 的i 埘a 转录水平进行检测可以发现这一异构体的 表达量是十分多样的( c o n d e m i n ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 。p