（细胞生物学专业论文）sox7参与aspirin抑制结肠癌细胞增殖的分子机制研究.pdf

ia o l 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作 所取得的成果。据我所知，除了特另l l d l ：i 以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：迎垒：墨：2 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东：l k n i 范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段 保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：l 姊 指导教师签名： 日 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 日期： 电话： 邮编： 摘要 流行病学研究表明阿司匹林可以减少大肠癌的发病。动物实验和体外细胞培养也提 示阿司匹林能够抑制结肠癌细胞株的生长增殖，并普遍认为是通过抑制环氧合酶 2 ( c o x 2 ) 活性而发挥抗肿瘤作用。然而并非所有结肠肿瘤均表达c o x 2 ，阿司匹林对 缺乏c o x 一2 表达的肿瘤细胞的作用机制如何目前研究较少。有研究显示，在c o x 2 阴 性的结肠癌细胞中，阿司匹林可能通过激活p 3 8 m a p k 信号通路来抑制结肠癌增嫡。s o x 基因家族是近些年来在动物中发现的一类编码转录因子的基因家族，其产物具有一个 h m g d o m a i n 保守区，参与诸如性别决定、骨组织发育、血细胞生成、神经系统发育、 晶状体发育、肺发育、心脏发育等多种早期胚胎发育过程，许多s o x 基因与人类的疾 病相关。s o x 7 是s o x 转录因子家族s o xf 亚族的一个成员。鼠基因芯片的结果表明， 鼠s o x 7 基因可能是p 3 8 m a p k 通路的靶基因。我们的实验表明，阿司匹林能够上调结 肠癌s w 4 8 0 细胞中s o x 7 的表达，干涉s o x 7 能够回复阿司匹林对结肠癌的抑制作用， 应用p 3 8 m a p k 信号通路特异性的阻断剂s b 2 0 3 5 8 0 处理2 9 3 t 细胞，能够抑制阿司匹林 对s o x 7 基因表达的上调；荧光素酶报告基因结果显示，p 3 8 m a p k 信号通路下游转录 因子a p 1 能够显著上调s o x 7 启动子活性。本论文的研究揭示了s o x 7 参与了阿司匹 林对结肠癌的抑制作用，阿司匹林可能通过激活p 3 8 m a p k 通路调控s o x 7 的表达。我 们的研究为进一步研究阿司匹林及s o x 7 在结肠癌抑癌中的作用及机制奠定了基础。 关键词：阿司匹林；s o x 7 ；p 3 8 m a p k ：s w 4 8 0 a b s t r a c t t h er e s e a r c ho fe p i d e m i o l o g yr e v e a l st h a ta s p i r i nc a nr e d u c et h ei n c i d e n c eo fc o l o n c a n c e r i ti sk n o w nt h a ta s p i r i ni n h i b i t st h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no ft h ec e l ll i n e so fc o l o n c a n c e rt h r o u g ht h ei n a c t i v a t i o no fc o x 一2a c t i v i t y h o w e v e r i ti sa l s ok n o w nt h a tn o ta l lt h e c o l o nc a n c e rc e l l se x p r e s sc o x 一2 s of a r , t h e r eh a v e b e e no n l yl i m i t e dn u m b e r so fs t u d i e so n t h ef u n c t i o no fa s p i r i ni nt h ec o x 2d e f i c i e n c yt u m o rc e l l s s o m es t u d i e sr e v e a lt h a ta s p i r i n a c t i v a t e st h ep 38 m a p kt oi n h i b i tt h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no fc o x 2n e g a t i v ec o l o n c a n c e rc e l l s t h es o x f a m i l yo ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r si sf o u n di na n i m a l si nr e c e n ty e a r s t h e p r o d u c to fs o xh a sah m gd o m a i nc o n s e r v a t i o n ，w h i c hp l a y sar o l ei ns e xd e t e r m i n a t i o n ， h e m a t o p o i e s i s ，a n dd e v e l o p m e n to fb o n et i s s u e ，n e r v o u ss y s t e m ，c r y s t a l l i n el e n s ，l u n ga n d h e a r t ，a sw e l la si nm u l t i p l ep r o c e s so fe a r l ye m b r y o g e n e s i s s o m es o xg e n e sa r er e l a t e d w i t hh u m a nd i s e a s e s s o x 7i sam e m b e ro ft h es o xfs u b f a m i l y t h ea n a l y s i so f m o u s e g e n ec h i p si n d i c a t e st h a tt h em o u s es o x 7m a yb et h et a r g e tg e n eo fp 38 m a p ks i g n a l p a t h w a y e x p e r i m e n t si nt h i st h e s i si n d i c a t et h a ta s p i r i nc a nu p r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no f s o x 7i ns w 4 8 0c e l l s ，a n di n t e r f e r e n c eo fs o x 7e x p r e s s i o nc a na b o l i s ht h ei n h i b i t o r ye f f e c t o f a s p i r i ni ns w 4 8 0c e l l s b l o c k a g eo fp 38 m a p ks i g n a lp a t h w a yb yt r e a t i n g2 9 3 tc e l l sw i t h s p e c i f i ci n h i b i t o rs b 2 0 3 5 8 0s u p p r e s s e st h e e x p r e s s i o n o fs o x 7a tm r n al e v e l ， d e m o n s t r a t i n gt h a th u m a ns o x 7m a yb et h ed o w n s t r e a mt a r g e tg e n eo fp 38 m a p k s i g n a l p a t h w a y t h er e s u l t sf r o mt h el u c i f e r a s er e p o r tg e n ea s s a y si n d i c a t et h a ta p 1 ，w h i c hi sa d o w n s t r e a mt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro fp 38 m a p k s i g n a lp a t h w a y , c a nu p r e g u l a t et h ea c t i v i t yo f s o x 7p r o m o t e r o u rs t u d yr e v e a l st h a ts o x 7i si n v o l v e di nt h ei n h i b i t i o no fa s p i r i nt o s w 4 8 0c e l lg r o w t h ，a n da s p i r i nm a yu p r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fs o x 7b ya c t i v a t i n gt h e p 38 m a p k t h i ss t u d yl a y sd o w nt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d i e so ft h em e c h a n i s m so f f u n c t i o n so f a s p i r i na n ds o x 7 i ni n h i b i t i o no fc o l o nc a n c e r k e yw o r d s ：a s p i r i n ；s o x 7 ；p 38 m a p k ；s w 4 8 0 1 1 目录 中文摘要i 英文摘要。i i 目 录i i i 引 言1 一、s o x 7 基因及其生物学功能1 ( 一) s o x 基因家族简介一1 ( 二) s o x 蛋白的分类2 ( 三) s o x 蛋白的功能3 ( 四) s o x 7 基因及其转录调控4 二、阿司匹林一4 ( 一) 阿司匹林及作用机制4 ( 二) 阿司匹林与结肠癌5 三、p 3 8 m a p k 信号通路6 ( 一) p 3 8 m a p k 简介6 ( 二) p 3 8 m a p k 抑制剂7 ( 三) 阿司匹林和p 3 8 m a p k 7 实验材料与方法l o 一、实验材料。l o ( 一) 质粒lo ( 二) 蛋白质和抗体1 0 ( 三) 哺乳动物细胞系1 0 ( 四) 试剂l o 二、实验方法l o i 分子生物学试验方法1 0 ( 一) 分子克隆1 0 ( 二) d n a 的琼脂糖电泳1 0 ( 三) 质粒大量制备的方法1 0 ( 四) 哺乳动物细胞总r n a 的提取1 2 ( 五) 逆转录( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n 。r t ) 一1 3 ( ；i ) p c r 1 3 i i 细胞生物学实验方法1 4 ( 一) 哺乳动物细胞系的培养1 4 ( 二) 真核生物细胞的转染和荧光素酶报告基因检测1 5 l i i ( 三) 蛋白质的w e s t e r nb l o t 分析1 6 ( 四) m t t 细胞活性检测实验1 8 实验结果与分析1 9 一、s o x 7 报告基因质粒的构建及鉴定1 9 二、阿司匹林对结肠癌s w 4 8 0 细胞生长增殖的影响2 0 三、阿司匹林对s o x 7 基因表达的影响一2 0 四、阿司匹林抑制s w 4 8 0 细胞增殖的机制2 l 五、阿司匹林上调s o x 7 基因表达的分子机制一2 2 ( 一) p 3 8 m a p k 信号通路对s o x 7 的调控2 2 ( 二) p 3 8 m a p k 参与阿司匹林对s o x 7 的调控2 3 ( 三) 转录因子a p 一1 参与人s o x 7 启动子活性的调控2 4 讨论2 6 结 论2 8 参考文献2 9 致谢3 6 在学期间公开发表论文及著作情况3 7 i v 东北师范大学硕士学位论文 己i 吉 丁i 口 一、s o x 7 基因及其生物学功能 ( 一) s o x 基因家族简介 s o x 家族转录因子因它与性别决定因子s r y 的h m gd o m a i n 的同源性首先在哺乳 动物中被发现。1 9 9 0 年，在人类和小鼠中克隆了睾丸决定因子s r y s r y 基因，人们发现 s r y s r y 基因产物含有一个与染色体蛋白h m g 1 和h m g 2 中的d n a 结合基序非常相似 的保守区。根据该h m gd o m a i n 的保守性，发现了编码一类新的转录因子的s o x 基因家 族【lj 。h m gd o m a i n 是约7 9 个氨基酸残基的d n a 结合基序，h m gd o m a i n 与d n a 螺旋的 小沟结合，具有序列特异性，从而使d n a 弯曲【2 】。s o x 转录因子选择性的结合至m j d n a 的5 w w c a a w g 3 ( w 为a 或t ) 区域【3 4 】。编码h m gd o m a i n 的基因形成一个超家族， 有两个主要的亚族：h m g u b f 亚族和t c f m a t a s o x 亚族。其中h m g u b f 包括h m g l 和h m g 2 ，它们含有多个h m gd o m a i n ，与d n a 结合是非特异性的，参与染色质组装。 t c f m 删s o x 包括转录因子t c f 、l e f l 、酵母成熟蛋白m a t a 与s o x 蛋白家族，具有 单个的h m gd o m a i n ，h m gd o m a i n 具有d n a 结合部分以及蛋白蛋白结合部分，能够特 异性与d n a 结厶【5 6 7 1 。 s r y 型的h m gd o m a i n 与d n a 结合和游离时的结构在都已经被阐吲8 9 1 。和其他的 h m g d o m a i n 一样，它含有三个h e l i c s ( i i i i ) ，形成一个l 型转角，其中反向平行的 螺旋i 与i i 形成l 型的长臂，而i i i 及其所含的n 末端形成l 型的短臂，整个结构由疏 水核心维持。s o x 蛋白中，组成疏水核心的氨基酸残基高度保守，以提供特异性的d n a 结合序列。由于h m gd o m a i n 的整个结构与d n a 结合时仍未改变，导致靶d n a 的结 构有很大的改变，如靶d n a 的小沟随着凹精确的结合到h m gd o m a i n 的表面。结果与 经典的b d n a 相比，d n a 与s r y 或其他s o x 蛋白结合有大约7 0 8 5 。的弯曲，使小 沟变变宽，并成螺旋形的展开【1 0 , 1 1 - 1 4 。 s o x 蛋白与d n a 小沟结合的特性与大多数转录因子不同，因为大多数转录因子与 d n a 的大沟结合，但s o x 蛋白与d n a 结合同其他转录因子与d n a 的结合方式却高度 相似，都是空间上可行的。这与之前提到的弯曲d n a 的能力产生了一个假说：s o x 蛋 白可能作为结构蛋白执行部分功能，通过构成局部的染色质结构并招募其他d n a 结合 转录因子形成具有活性的，空间上固定的多蛋白复合物【1 s , 1 6 。s o x 蛋白也可以招募蛋白 到这些复合物中而s o x 蛋白并不与d n a 结合，但它们之间通过信号通路相联系。这个 机制通过t c f l e f 蛋白类比而被阐明。t c f l e f 蛋白与1 3 c a t e n i n 结合，因而将胞外信 号翻译成基因表达的改变【1 7 , 1 8 】。w n t 信号通路的参与，只特异的对于t c f l e f 蛋白， 因为1 3 c a t e n i n 相互作用的结构域在t c f l e f 蛋白和s o x 蛋白中并不是保守的。 s o x 蛋白的h m gd o m a i n 与s r y 的h m gd o m a i n 至少有5 0 的相似性。但在非 东北师范大学硕士学位论文 h m gd o m a i n 区域，s o x 序列确是多变的，尽管在大量s o x 蛋白中，共同的n o n b o x d o m a i n 被鉴定，表明具有最近的共同的祖先。在脊椎动物中，同源基因在h m gb o x 同 源性和n o n b o xd o m a i n 保守性上彼此都非常相似。 ( 二) s o x 蛋白的分类 目前s o x 家族中至少有3 0 个的成员被鉴定。在动物界中，s o x 蛋白在多种的细胞 类型和组织发育的多个阶段表达【| 7 ，1 9 1 ，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼 类、昆虫类和线虫。在脊椎动物中，不同种属的同源物都高度类似。在无脊椎动物模型 生物黑腹果蝇和漂亮新小杆线虫中都有这些家族中单个基因的代表，表明在脊椎动物进 化中，发生了单个基因延伸成多个相关的基斟2 0 1 。是否这种延伸是脊椎动物进化过程中 大量的多相的独立的基因复制或是两相或三相的基因复制结果仍不清楚【2 1 1 。为了更好的 了解s o x 基因家族的分子进化，需要进一步的脊椎动物基因组分析。 s o x 转录因子在早期发育中的表达具有组织特异性，在各种发育过程中的细胞命运 决定中都涉及s o x 转录因子【1 9 , 2 2 j 。根据s o x 基因h m gb o x 同源性和h m gb o x 外的保 守基序，s o x 家族可分为九个亚族( a i ) 【2 0 】。根据s o x 家族成员其内含子数目可以分 为两组：无内含子和多外显子。b 亚族和c 亚族是不含内含子的，至少在编码区是不含 内含子的，虽然在线虫中这个亚族的s o x 蛋白的h m gd o m a i n 具有内含子。在d g 亚 族中，哺乳动物中s o x 家族成员有外显子内含子的结构【1 9 j 。在e 亚族中s o x 基因开 放阅读框中内含子的位置是保守的【2 3 。2 5 1 。在d 亚族中的s o x 5 基因【2 6 1 ，e 亚族中的s o x 9 和s o x l 0 基因，f 亚族中的s o x l 7 基因【27 1 ，h m gd o m a i n 被内含子打断。在d 和f 亚 族中h m gb o x 内含子序列的保守性表明他们具有共同的祖先。尽管如此，进一步的系 统进化分析法并不支持这一关系。h 和i 亚族的内含子的位置彼此不同，且和其他的亚 族也不相同，支持它们被分为不同的亚族【2 0 】。 同一亚族的成员在h m gd o m a i n 至少有8 0 的氨基酸是相同的，而且脊椎动物中 同一亚族的成员在非h m gd o m a i n 也具有很大的同源性。在一些亚族中，h m gd o m a i n 侧面的区域高度保守，如b ，c ，e 亚族。b 亚族中的保守区域位于h m gd o m a i n 的c 端， 它包括一个短的氨基酸序列基序，c 和e 亚族中的保守氨基酸位于h m gd o m a i n 的n 端。在少数亚族中的其他保守区域包含转录激活结构域，在c 和e 亚族中，这个区域位 于c 的术端【2 8 。列。 d 亚族中的成员除含有h m gd o m a i n 外，还含有一个亮氨酸拉链基序。h m gd o m a i n 和亮氨酸拉链的距离约2 5 0 个氨基酸。在s o x 6 ，r t s o x 2 3 ，l s o x 5 中亮氨酸拉链可以 调控同型二聚化作用【3 5 。37 1 。在s o x 6 和l - s o x 5 中还存在异源二聚化作用。与经典的b z i p 转录因子的亮氨酸拉链不同，d 亚族中s o x 蛋白的亮氨酸拉链在基本区域内并不是邻 近的，紧随亮氨酸拉链后通常是富含谷氨酰胺区域并形成c o l i e x t - c o i ld o m a i n ，因此，二 聚化作用并不导致新的d n a 结合界面的产生，而b z i p 蛋白会产生新的d n a 结合界面。 亮氨酸拉链对d n a 结合的影响是间接的，因为亮氨酸拉链调控的二聚化作用极大的减 少了二聚体与s o x 共有序列结合位点的亲和力【3 5 州，同时增加了识别两个相邻s o x 结 2 上 东北师范大学硕士学位论文 合位点的能力【3 7 】。尽管如此，亮氨酸拉链在d 亚族中的s o x 蛋白中不仅仅是提供同型 或异型二聚化作用，它也调控与其他蛋白的相互作用【3 5 】。因此推测并不是d 亚族中的 亮氨酸拉链，其他亚族中的s o x 蛋白的保守的类似区域也通过调控与其他蛋白的相互 作用来发挥作用。 ( 三) s o x 蛋白的功能 s o x 蛋白在多种的细胞类型和组织发育的多个阶段表达，在胚胎早期发育中有重要 的作用。由于e 、f 亚族在结构和功能上的相似性，尤其是在分化与形态建成及功能中共 同发挥作用，因此对s o x 家族e 、f 亚族成员的功能做重点介绍。 s o xe 亚族包括s o x 8 、s o x 9 、s o x l 0 三种，s o x 8 、s o x l 0 在神经系统发育中起 到重要调控作用，s o x 9 在调控软骨分化、性别决定中起重要作用，s o x l 0 在神经系统发 育中起重要作用，s o x l 0 在神经嵴细胞中最初表达很广泛，在形成周围神经系统的神经 嵴细胞中持续表达，在感觉的，交感神经的和肠神经节中都可以检测到s o x l 0 的表达【3 8 】， 在胚胎发育的后期，s o x l 0 只在神经胶质细胞中表达【3 9 】。在中枢神经系统中，s o x l 0 的 表达相对较晚，但逐步表达，在成年期达到最大水平，也主要在少突胶质细胞中的神经胶 质中表达【3 8 , 4 0 a 1 1 ，s o x l 0 是周围神经胶质发育的重要调节因子【3 9 1 ，髓磷脂形成的少突神 经胶质细胞的终末分化也依赖s o x l 0 转录因子【4 2 1 。在神经分裂症病人中，检测到s o x l 0 c p g 岛高甲基化水平，s o x l 0 的甲基化也与其他少突胶质细胞基因的表达相关。因此 s o x l 0c p g 岛甲基化水平可能是精神分裂症中少突胶质细胞功能紊乱的表观标志【4 3 1 。早 在胚胎1 2 5 天时，s o x 9 就大量失活，出生后肺的形态发生和功能都没有改变。虽然s o x 9 在肺形态发生中高表达，但呼吸上皮细胞中s o x 9 的失活并不改变肺的结构，出生后的生 存率和氧损伤的修复能力。s o x 9 失活并不改变肺形态建成以及出生后肺功能【删。s o x 9 基因杂合突变与可导致人类c d 病发生，c d 病是一种骨发育畸形，产期致死和其他畸形 的综合症【4 副。虽然没有直接的证据说明s o x 9 在睾丸决定中的本质作用，但有实验证据 证明s o x 9 在调控卵巢通路向睾丸通路的转化中的本质作用【4 6 1 。s o x l 0 基因突变与 w a a r d e n b u r g 综合症发生相判川。 s o xf 亚族包括s o x7 、s o x l 7 和s o x l8 三个成员。在斑马鱼血管生成过程中的 研究表明，s o x 7 与s o x l 8 在维持动脉血管平衡过程中存在功能冗余性，共敲除s o x 7 和s o x l8 造成血管生成缺陷【47 1 。在非洲爪蟾心脏发育过程中的研究表明，s o x 7 与 s o x l 8 对于非洲爪蟾心脏发育是必须的，s o x 7 能抑制 3 - c a t e n i n 诱导的s i a m o i s ，并且 s o x 7 的c 末端在这一作用中是必须的，s o x 7 、s o x l 7 、s o x l 8 在爪蟾心脏发育过程 中能激活n o d a l 编码相关蛋白x n r s ，存在功能冗余性【4 引，s o x 7 和s o x l 7 能增强鼠 l a m i n i na l p h a l 的表达而调节鼠内胚层分化【4 】。 在脊椎动物原肠胚形成过程中，s o x l 7 对于内胚层的形成是必须的，s o x l 7 不仅 在胚胎的内胚层中高表达，在成熟组织中如肺中也表达。在胚胎1 8 天时，在胚胎的肺 中的呼吸上皮细胞中首次检测到s o x l 7 的表达，此后，s o x l 7 的表达只主要局限于纤 毛细胞中，表明了s o x l 7 在气管细胞分化中的潜在作用。在小鼠肺分化过程中，鼠胚 3 东f l l - o $ 范大学硕士学位论文 肺上皮细胞异位表达s o x l 7 促进胚胎发育与细胞分化，并限定向呼吸上皮细胞分化，说 明，s o x l 7 诱导呼吸上皮细胞的可塑性，促进多种呼吸细胞类型的分化形成【4 9 1 。s o x l 8 基因突变可能导致心血管疾病。s o x l 8 在发育中的血管内皮细胞及间充质细胞向毛发、 毛囊发育中高表达，s o x l 8m r n a 在成人肺、胃、空肠、心室中高表达，在一些胃癌、 胰腺癌、畸胎瘤中高表达【5 0 。 ( 四) s o x 7 基因及其转录调控 s o x 7 是含h m gd o m a i n 的s o x 转录因子家族s o xf 亚族的一个成员，人类s o x 7 位于8 p 2 2 ，其蛋白质由3 8 8 个氨基酸残基组成。人s o x 7m r n a 在成人肺、气管、前 列腺、淋巴结、胎盘、心脏中高表达，在胃癌、胰腺癌、食道癌中高表达，在肺癌、结 肠癌、乳腺癌、前列腺癌中低表达，在癌细胞系h l 一6 0 、h e l as 3 、k 5 6 2 、m o l t - 4 、 r a j i 、s w 4 8 0 、a 5 4 9 、g 3 6 1 中不表达或低表达【5 ，推测s o x 7 可能是癌症相关基因， s o x 7 在癌症中的具体作用未见报道。 s o x 7 首先在非洲爪蟾和小鼠中被鉴定【5 2 , 5 3 】。s o x 7 的c 端存在转录激活结构域， 并能极大的降低w n t 1 3 c a t e n i n 刺激的转录，表明s o x 7 可抑制w n t 信掣蚓。有研究表 明，s o x 7 蛋白的表达在4 7 的前列腺癌中被下调，在结肠癌细胞系h c t l l 6 中也有 s o x 7 的失活。因此推测s o x 7 是肿瘤抑制因子，可能通过作为1 3 - c a t e n i n 转录活性的独 立检测点来发挥作用【5 5 1 。s o x 7 在f 9 胚性瘤细胞中的顶骨分化中具有重要作用，并通过 调控g a t a - 4 和g a t a 6 的表达来实现【5 6 】。在结肠癌细胞中，s o x 7 的表达下调，诱导 结肠癌细胞凋亡和抑制结肠癌细胞增殖【5 丌。在胚胎肝细胞分化的过程中，利用全基因表 达谱的方法鉴定了s o x 7 作为潜在的候选基因，参与了中胚层形成血液谱系的调控。以 前的研究表明，s o x 7 在中胚层前体中瞬时表达，体外敲除s o x 7 大大减少了原始红细 胞造血祖细胞，最终的造血祖细胞和内皮祖细胞的形成，s o x 7 在最初定型的血液前体 中的分子调控中作为一个新的重要的调节子。s o x 7 的持续表达完全改变了血细胞生成 中增殖和分化的平衡【5 8 1 。s o x 7 至少可通过两种不同的机制发挥作用：一是参与靶基因 活性，二是通过与t c f l e f 活性竞争来调控w n t 信号通科州。 s o x 转录因子家族成员在胚胎发育过程中起着重要作用，目前的研究表明，某些 s o x 转录因子在疾病及癌症发生过程中发挥不同作用，在发育调控过程中，s o x 与其 他调控基因的相互作用构成一个多环节、多层次的网络调控系统，但对于很多s o x 家 族成员的研究还不够深入，相信随着研究的进展，对于s o x 转录因子研究的深入，必 将对于人们更好的认识胚胎发育与癌症发生提供一系列的线索。 二、阿司匹林 ( 一) 阿司匹林及作用机制 阿司匹林是世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药，也是作为比较和评价其他药 物的标准制剂。阿司匹林的学名叫乙酰水杨酸，化学名称为2 一( 乙酰氧基) 苯甲酸( 2 4 东北师范大学硕士学位论文 e t h a n o y l h y d my b e n z o i ca c i d ) ，分子式为c 9 h 8 0 4 ，分子量为1 8 0 1 6 。复方阿司匹林由阿司 匹林、非那西汀和咖啡因三种药物组成。因为这三种药的拉丁文字头分别为a 、p 、c ， 所以又叫a p c 。 阿司匹林的抗癌分子机制目前并未完全阐明，其可能通过一些途径发挥保护作用， 如细胞周期停滞，诱导凋亡和抑制血管生成。目前普遍接受的一个抗癌机制是阿司匹林 通过抑制前列腺素合成过程中两种环氧合酶c o x 1 和c o x 2 来抑制前列腺素的产生。 c o x 1 在正常组织中是组成型表达的，c o x 2 在正常组织中低表达，在很多结肠癌中 是诱导型表达并大幅上调。非类固醇类抗炎药对不表达c o x 1 或c o x 2 结肠癌细胞系 具有生长抑制作用1 5 9 1 ，并对不表达c o x 1 和c o x 2 小鼠胚胎成纤维细胞也有生长抑制 作用【6 0 1 。这些研究并不支持非类固醇类抗炎药主要或唯一的通过抑制前列腺素的合成的 观点。除了抑制c o x ，非类固醇类抗炎药还可通过其他的机制发挥抗癌作用，因为非 类固醇类抗炎药可与细胞内各种通路相互作用【5 9 , 6 1 , 6 2 】。通过与n f k b 激酶1 3 的抑制剂结 合，阿司匹林可抑制其活性，从而抑制n f k b 的d n a 结合活性【6 3 , 6 4 】。在正常人成纤维 细胞中，阿司匹林可激活p 3 8 激酶从而诱导凋亡【6 5 1 。非类固醇类抗炎药是核受体过氧化 物酶体增生物激活受体y 的激活子，表明了其直接影响转录的潜力脚】。在缺失d n a 错 配修复活性的结直肠癌细胞中用阿司匹林或舒林酸处理可减少微卫星稳定性表明了非 类固醇类抗炎药活性的另一个靶标【6 7 | 。 ( - - ) 阿司匹林与结肠癌 结肠癌是一种很常见的恶性肿瘤，在西方发达国家位居肿瘤相关死亡原因的前列， 在发展中国家其发病呈上升趋势，且呈年轻化发展，严重威胁人类健康。阿司匹林作为一 种非类固醇类抗炎药，已成功应用于结肠癌治疗上，阿司匹林能够抑制结肠癌细胞生长 与增殖，促进癌细胞凋亡，具体机制不十分明确。1 9 8 2 年d o u b i l e 等的研究首次报道了 长期服用阿司匹林的人群其结肠癌发病率比普通人群明显降低【6 8 1 ，流行病学的研究显示， 阿司匹林可减少大肠癌的发病【6 9 , 7 0 ，体外细胞培养和动物实验也表明阿司匹林能抑制结 肠癌细胞株生长增殖【_ 7 1 】，但其作用机制仍不明确。临床发现阿司匹林对腺瘤性结肠息肉 也具有消退作用1 7 2 1 。环氧合酶2 是非类固醇类抗炎药的靶分子，c o x 2 在大部分结肠 肿瘤组织中高表达，与肿瘤发生、血管形成等关系密切【7 3 1 。目前多数研究都是以c o x 2 阳性结肠癌细胞为研究对象来进行的，以往的研究普遍认为非类固醇类抗炎药是通过抑 制c o x 2 而发挥抗肿瘤作用。b r o w n 等通过研究提出c o x 2 将成为结肠癌预防的一个 分子靶位【_ 7 4 】。b e r t a g n o l l i 等的研究认为非类固醇类抗炎药对发散的结肠腺瘤具有预防作 用【7 5 1 。然而并非所有的肿瘤细胞均表达c o x 2 ，阿司匹林对c o x 2 阴性的肿瘤细胞的 作用机制研究目前还较少。s u b b e g o w d a 等研究发现，阿司匹林对c o x 2 阴性的结肠癌 s w 4 8 0 细胞株有抑制作用，随浓度增加其抑制作用增强【7 6 1 。 虽然关于结肠癌与阿司匹林和非类固醇类抗炎药的研究很少有报道，然而有很多关 于这些药物与结肠癌预后特征的报道【7 7 , 7 8 , 7 9 】。对结肠癌的研究为阿司匹林在减少结肠癌 复发的保护性效果方面提供了进一步的支持【8 0 , 8 1 】。h i d e k i 等又通过j - c a p p 项目研究， 5 一 东北师范大学硕士学位论文 针对性地在日本人群中做了试验，发现用非固醇类的抗炎药物( n s a i d s ) 作为结直肠 癌的化学预防药物时，低剂量的阿司匹林处理在长时程的临床应用中也是安全可行的 【8 2 】。阿司匹林能抑制环氧合酶，环氧合酶催化从花生四烯酸到前列腺素转换中的限速步 骤，c o x 2 是一种形式的环氧合酶，能促进炎症反应和细胞增殖，结直肠癌中经常过表 达c o x 2 1 8 3 , 8 4 , 8 5 , 8 6 1 。随机实验表明c o x 2 的选择性抑制剂降低了高风险试验者的腺癌的 复发【7 5 , 8 7 , 8 8 , 8 9 。尽管如此，阿司匹林和非类固醇类抗炎药物降低结肠癌细胞的增殖和增 加其凋亡，并没有检测到环氧合酶的活性【则。 阿司匹林有其他与环氧合酶无关的作用，包括抑制n f k b 6 3 】，激活p 3 8 激酶来诱导 凋亡【6 5 】和多胺的分解代谢【9 1 1 。如果阿司匹林通过抑制c o x 一2 或它下游的效应子来发挥 在腺瘤和癌形成中的作用，那么服用阿司匹林应该只减少生长依赖c o x 2 功能的肿瘤 的风险。有实验表明常规服用阿司匹林能减少过表达c o x 一2 的结直肠癌的发生，但对 弱表达或不表达的结直肠癌并没有明显的效梨9 2 】。 三、p 3 8 m a p k 信号通路 ( 一) p 3 8 m a p k 简介 细胞信号转导通路的异常与肿瘤发生、发展密切相关。在此系统中，癌基因的激活 和抑癌基因的失活刺激细胞加速增殖与无限生长或凋亡抑制，从而导致肿瘤发生。丝裂 原活化蛋白激酶( m a p k ) 是离散信号级联中的成员，对各种细胞外刺激起焦点作用。丝 裂原活化蛋白激酶介导了细胞的生长，发育、分裂、死亡、以及细胞间的功能同步等多 种细胞生理过程【9 3 1 。到目前为止，m a p k 家族中四个不同的亚族已被发现：细胞外信号 调节蛋白激酶( e r k s ) ，e - j u n 氨基末端激酶( 州心) ，b m k l 和p 3 8 m a p k l 9 4 。哺乳动物 的e r k s 可被生长因子和促有丝分裂刺激激活【9 5 , 9 6 ，而p 3 8 和j n k 可被压力诱导的信号 ( 如紫外线辐射，渗透冲击) 和促炎细胞因子( i l 1 ) 和肿瘤坏死因子a ( t n f a ) 调控 【9 丌。所有的m a p k 通路都有三级核心信号模型，包括以下蛋白激酶家族：m k k k s ， m k k s ，m a p k s 。在生物进化过程中，m a p k 信号转导的三级激酶级联反应高度保守， 即m a p k k k ( m a pl ( i n a s ek i n a s el ( i n a s e ) _ m a p k k ( m a pl 【i n a s el 【i n 嬲e ) m a p k 。 m a p k s 由酪氨酸和苏氨酸在保守的t h r - x a a - t y r 基序中的双重磷酸化而被激活，这发生 在激酶的激活环的亚结构域。m a p k 磷酸酶类逆转了磷酸化作用并使m a p k 处于失 活状态。m a p k s 的磷酸化被双重特异性激酶m k k s 所催化，m k k s 反过来激活s e r 和 t h r 残基的磷酸化，m k k s 磷酸化特异的m a p k s 是具有高度选择性。m k k s 激活个别 m a p k 亚型的部分机制是由于m k kn 末端区域与m a p k 上出现的不同的停泊位点间 的相互作用，也是由于包括t h r - x a a - t y r 双磷酸化基序的m a p k 激活环的结构【9 8 1 0 3 1 。 其中，激活p 3 8 的磷酸化级联反应是m e l 厂r a k m k k 6 m l o o - p 3 8 m a p k 。细胞在 外界各种因素的刺激下，通过一系列细胞内信号传导途径使p 3 8 m a p k 的t l l r l 8 0 和t y r l 8 2 同时被磷酸化而激活，活化后的p 3 8 m a p k ( p - p 3 8 ) 进入细胞核内通过磷酸化作用激活多 种转录因子，从而导致相应炎性细胞因子基因表达的增加，最终导致各种炎性细胞因子 6 东北师范大学硕士学位论文 的大量产生，引起炎症产型1 0 4 】。 p 3 8 a 是最先被发现的对l p s 刺激快速酪氨酸磷酸化的分子量为3 8 k d a 的蛋白质 1 0 5 , 1 0 6 】。目f j ，已鉴定p 3 8 家族的四个剪切异构体：p 3 8 a ，p 3 8 1 b 1 0 7 】，p 3 8 7 t 1 0 8 , 1 0 9 和 p 3 8 8 1 1 0 】，其中p 3 8 a ，p 3 8 1 b 在各种组织中遍在表达，而p 3 8 7 和p 3 8 8 的表达具有组 织特异性，p 3 8 7 主要存在于肌肉组织，p 3 8 8 主要存在于肾和肺组织。所有的p 3 8 激酶 都可以根据“t - g y 双位点磷酸化基序而分类2 1 。序列对比揭示每个p 3 8 亚型有约 6 0 的同源性，但p 3 8 亚族和其他三个m a p k 激酶家族成员只有4 0 5 0 的同源性。 p 3 8 m a p k 亚家族可进一步分成两个不同的亚类，一个亚类是p 3 8 a 和p 3 8 d ，另一个亚 类是p 3 8 3 , 和p 3 8 6 。首先从氨基酸序列相似性上很明显：p 3 8 a 和p 3 8 b 有7 5 的相似， 但p 3 8 2 , 和p 3 8 8 与p 3 8 a 分别只有6 2 和6 1 的相似性，而p 3 8 7 和p 3 8 8 之间的有7 0 的相似。第二，它们对低浓度s b 2 0 3 5 8 0 ，s b 2 0 2 1 9 0 复合物的易感性不同。体内和体外 实验表明，只有p 3 8 a 和p 3 8 p 被复合物抑制，而p 3 8 t 和p 3 8 8 几乎对这些药物没有影响 1 1 3 ，i i4 1 1 5 。 ( 二) p 3 8 m a p k 抑制剂 p 3 8 m a p k 抑制剂包括非特异性和特异性抑制剂，非特异性除抑制剂不但可抑制 p 3 8 m a p k 的活性，还可抑制州k 或e r k 的活性，如c n i 1 4 9 3 。而特异性抑制剂只特异性 抑s u p 3 8 m a p k 的活性，对j n k 和或e r k 几乎没有抑制作用，或需很大剂量