（分析化学专业论文）量子点光漂白及光谱蓝移的抑制研究.pdf

硕l j 学位论文 摘要 量子点作为一种新型荧光探针，与传统荧光染料相比，具有许多优良的光学 性质，已在分子生物学、细胞生物学、医学等研究领域获得广泛应用。本文主要 研究了商品化核壳结构量子点的光漂白与光谱蓝移现象及其抑制方法，具体开展 了以下两个方面的工作： l 、量子点的光漂白及光谱蓝移现象。在连续光照条件下，溶液中吸附到基底 上的量子点会发生光漂白及光谱蓝移现象。实验分别研究了连续激发状态下溶液 中在玻片表面非特异性吸附的量子点、空气中的量子点及溶液中以共价键固定到 玻片基底上的量子点的光漂白状况。结果表明，溶液中的量子点均会发生光漂白 现象，而空气中的量子点的耐光漂白性能良好。通过在电子倍增耦合器件 ( e m c c d ) 前插入透射光栅，观察到了溶液中量子点的光谱蓝移现象及巯基乙醇 对量子点光谱蓝移的抑制现象。探讨了光谱蓝移、光漂白与溶液中量子点消失现 象间的关系，证明了光漂白导致了溶液中量子点的消失。实验研究了不同实验条 件下量子点的光漂白状况，观察到了量子点的光谱蓝移，发现了巯基乙醇对量子 点光谱蓝移现象的抑制，进一步认识了量子点的光学性质。 2 、巯基乙胺对量子点光漂白及光谱蓝移的抑制。实验以巯基乙胺为抑制剂， 证实了巯基乙胺对溶液中量子点的光漂白、光谱蓝移及眨眼现象的有效抑制。通 过试验不同巯基化合物对不同种类量子点光学性质的影响，阐述了巯基乙胺的可 能作用机理：巯基乙胺是一种供电子化合物，能够向量子点提供电子，防止量子 点的氧化，同时也是一种三重态熄灭剂，能够消除量子点的激发三重态，从而抑 制了量子点的光谱蓝移及光漂白现象。实验改善了量子点的光学性质，为扩大量 子点作为荧光探针的应用范围打下了基础。 关键词：量子点；光漂白；光谱蓝移；透射光栅；巯基乙胺 量了点光漂白及光鹳蓝移的抑制研究 a b s t r a c t a san e wc l a s so ff l u o r e s c e n c ep r o b e s ，q u a n t u md o t sh a v em a n ye x c e l l e n to p t i c a l p r o p e r t i e s ，c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lf l u o r e s c e n c ed y e s ，a n dp l a y e dm o r ea n dm o r e i m p o r t a n tr o l e si nt h ef i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g y ，c e l lb i o l o g y ，m e d i c i n e ，e ta 1 t h i s t h e s i ss t u d i e dt h ep h o t o b l e a c h i n g ，b l u es h i f ta n dt h e i ri n h i b i t i o ni nc o m m e r c i a l c o r e s h e l lq u a n t u md o t s b r i e f l y ，t h em a i nw o r k sw e r ea sf o ll o w s ： 1 t h ep h e n o m e n o no fp h o t o b l e a c h i n ga n db l u es h i f ti nq u a n t u md o t s u n d e r c o n t i n u o u si l l u m i n a t i o n ，t h ep h o t o b l e a c h i n ga n db l u es h i f to fq u a n t u md o t sa d s o r b e d o n t os u b s t r a t ei nt h ef i e l do fv i e ww o u l da r i s e t h ep h o t o b l e a c h i n go fq u a n t u md o t s a d s o r b e do rf i x e dt h r o u g hc o v a l e n tb o n da tg l a s ss l i d e ，a n de x p o s e di na i r ，w a s i n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h er e s u l t so fe x p e r i m e n tp r o v e dt h a tt h ep h o t o b l e a c h i n g o f q u a n t u md o t sw o u l da r i s ei ns o l u t i o n ，w h e nt h eq u a n t u md o t si na i rs h o w e dh i g h r e s i s t a n c et op h o t o b l e a c h i n g w i t ht h eh e l po fat r a n s m i s s i o ng r a t i n gp l a c e di nf r o n to f t h ee l e c t r o nm u l t i p l y i n gc h a r g e c o u p l ed e v i c e ，t h eb l u es h i f to fq u a n t u md o t sw a s o b s e r v e di ns o l u t i o n ；a f t e rt h ea d d i t i o no fp - m e r c a p t o e t h a n o li n t ot h es a m p l e ，t h eb l u e s h i f tw a ss u p p r e s s e d r e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h e p h o t o b l e a c h i n g l e dt ot h e d i s a p p e a r a n c eo fq u a n t u md o t si nt h ef i e l do fv i e wa f t e rt h ea r g u m e n t a t i o no fr e l a t i o n b e t w e e nb l u es h i f t ，p h o t o b l e a c h i n ga n dd i s a p p e a r a n c eo fq u a n t u md o t si ns o l u t i o n w e h a v ei n v e s t i g a t e dt h ep h o t o b l e a c h i n go fq u a n t u md o t si nd i f f e r e n te x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s o b s e r v e dt h ec o u r s eo fb l u es h i ri nq u a n t u md o t sa n df o u n dt h ei n h i b i t i o n o fb l u es h i f tb y1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l ，w h i c hw i l lf u r t h e rt h eu n d e r s t a n d i n go fo p t i c a l p r o p e r t i e si nq u a n t u m d o t s 2 i n h i b i t i o no fp h o t o b l e a c h i n g a n db l u es h i f ti n q u a n t u m d o t s b y m e r c a p t o e t h y l a m i n e e x p e r i m e n t a lr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep h o t o b l e a c h i n g ，b l u e s h i f ta n db l i n k i n gi nq u a n t u md o t sw e r ee f f e c t i v e l ys u p p r e s s e db ya na p p r o p r i a t ed o s e o fm e r c a p t o e t h y l a m i n e ，a n de l u c i d a t e dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m b e h i n dt h i s p h e n o m e n o na f t e rt r y i n gd i f f e r e n tr e a g e n t sa n dq u a n t u md o t s t h em e r c a p t o e t h y l a m i n e i sa ne l e c t r o nd o n o ra n dt r i p l e tq u e n c h e r ，i tc a ns u p p r e s s e st h eo x i d a t i o no fq u a n t u m d o t sc o r e sb yd o n a t i n ge l e c t r o n st ob l o c kt h eb l u es h i f t i n ga n de l i m i n a t et h e a c c u m u l a t i o no ft h et r i p l e te x c i t e ds t a t e so fq u a n t u md o t st oi m p e d et h ep r o g r e s so f p h o t o b l e a c h i n g t h eo p t i c a lp r o p e r t i e s o fq u a n t u md o t sw e r e i m p r o v e db y m e r c a p t o e t h y l a m i n e ，w h i c hw o u l de x p a n dt h ea p p l i c a t i o ns c o p eo fq u a n t u md o t sa s f l u o r e s c e n tp r o b e s k e yw o r d s ：q u a n t u md o t s ；p h o t o b l e a c h i n g ；b l u e s h i f t ；t r a n s m i s s i o ng r a t i n g ； m e r c a p t o e t h y l a m i n e 1 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者答名：予系华字醐：加7 “月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密彤 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名：根华牢日期：汾7 年6 月5 日 刷磁翌一r 阳 硕l 学位论文 第1 章绪论 随着生命科学的飞速发展，对生物体内及生命过程中核苷酸、蛋白质、多肽 等生物大分子的高灵敏检测提出了新的要求。单分子检测作为迄今为止检测灵敏 度最高的检测方法，与传统方法仅提供体系平均参数值相比，它立足于个体分子， 研究宏观体系，能探测到物理量的分布和时间轨迹信息，可以监测平衡态下体系 的涨落及非平衡态下的反应途径，已发展成为传统系综研究手段的有力补充，在 分析化学、生物化学及医学等领域得到广泛应用。 单分子荧光成像是单分子检测技术的一种，以其高通量、实时追踪的特点逐 渐成为单分子检测的主流技术。1 9 7 6 年，h i r s c h f e l d 2 j 首次实现了多染料标记的单 分子荧光检测；1 9 9 0 年，s h e r a 等人【3 】第一次实现了室温下流体中的单荧光团分子 的荧光检测。一般而言，除了部分可以自发荧光的分子外，大部分生物分子的检 测需要荧光标记物，应用较多的是有机荧光染料，但其存在着诸多限制因素，如 荧光强度低，易于光漂白，激发光谱窄，发射光谱容易拖尾等。随着纳米技术的 不断发展，特别是功能纳米材料的出现，如发光纳米线、纳米带以及量子点等， 极大地推动了化学生物分析等研究领域的进展。 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 是近年来发展起来的一种半导体荧光纳米晶体， 其半径小于或接近激子波尔半径；与传统荧光染料相比，具有许多优良的光学性 质。作为一种新型荧光探针，它已引起科学工作者广泛的研究兴趣，并被应用到 活体、细胞、单分子等多种体系。 本章对量子点荧光纳米晶体进行了简要的综述，主要介绍了量子点的基本性 质、制备方法及其在单分子检测中的应用。 1 1 量子点的概述 1 1 1 量子点的基本性质 量子点是一种球形无机半导体纳米晶体，直径2 8n m l 4 - 6 】，一般由i i b 和a 族( 如c d s e 、c d t e 、c d s 、z n s e 等) 或i i i a 和v a 族( 如i n p 、i n a s 等) 元素组成0 1 。 因其特有的量子尺寸效应【1 1 i 、表面效应及优良的可见光区荧光发射性质，已成为 一类新型的荧光探针标记物，并应用于单分子检测领域，目前研究较多的是c d s e 、 c d t e l 4 j 量子点。 与常规的有机荧光染料相比，量子点作为荧光标记物有如下优势7 ，9 ，1 2 】： ( 1 ) 吸收光谱宽，在短波长处有较大的吸收系数【5 ，6 1 ，激发波长小于其发射波长均可激 发量子点，因此可用同一束激发光源激发多种量子点：( 2 ) 发射光谱窄而对称， 量了点光漂白及光讲蓝移的抑制研究 荧光强度高【7 1 ，发射光谱可调；通过改变量子点的粒径大小，可使相同组成的量子 点发射出不同波长的荧光；( 3 ) 斯托克( s t o k e s ) 位移大，可达3 0 0 4 0 0n m 5 1 3 】， 吸收光谱与发射光谱容易分开【1 0 ，1 4 1 ；( 4 ) 量子产率高，在室温下一般可达9 0 【6 】； ( 5 ) 光稳定性好，不易光漂白【5 ，7 1 ，可长时间追踪监测7 ，1 5 】；( 6 ) 生物兼容性好， 经过化学修饰或聚合物包裹后，对生物体的毒性小，可用于生物活体的标记检测。 1 1 2 量子点的发展简史 从2 0 世纪7 0 年代末起，量子点就引起了物理学家、化学家以及电子学家们 广泛的研究兴趣，其早期研究主要集中在光学物理性质、纳米结构以及在微电子 学和光电子学中的应用【7 】。近年来，量子点在生物化学、分子生物学及细胞生物学 等领域获得广泛应用。量子点在生物学中的应用，最早见于1 9 9 6 年m a h t a b 等人【1 6 l 对蛋白质的检测，自2 0 0 0 年后以指数形式迅速增加【6 j 。1 9 9 8 年，两个研究小组同 时报道了量子点作为荧光标记试剂应用于活细胞或固定细胞i l7 1 8 】；随后，以量子 点标记目标分子的研究在免疫细胞化学和免疫组织化学领域迅速增加【4 ，1 9 】。量子 点的高稳定性和高亮度，是理想的活体标记成像试剂，己应用到对淋巴节点、血 液成像【5 】。在单分子领域，已应用到核苷酸、蛋白质、病毒、小分子等物质的检测。 1 2 量子点的制备与标记 1 2 1 量子点的制备 1 9 8 2 年，e f r o s 和e k i m o v 等人【2 0 ，2 l 】首次描述了量子点的合成。1 9 9 3 年，b a w e n d i 小组【2 2 l 在合成单分散性量子点方面取得了巨大进步。c d s e 是量子点合成中最常见 的化学成分，其合成技术一直都是当前纳米科学与技术研究的热点。最近，c d s e 量子点的合成取得了新的进展，d e n g 等人【2 3 】以液体石蜡和油酸取代常用反应试剂 正三辛基膦( t o p ，t r i o c t y l p h o s p h i n e ) 及正三辛基氧化膦( t o p o ，t r i o c t y i p h o s p h i n e o x i d e ) ，在长烷基链烷烃溶剂中合成了高品质的c d s e 量子点。 常见量子点的制备过程一般分为四步【4 7 ，1 2 】：( 1 ) 高温有机溶剂中合成量子 点的核，以c d s e 较为常见；( 2 ) 核外生长无机层，保护量子点的光学性质，增 强核的稳定性和改善其生物亲和力，以z n s 较为常用；( 3 ) 将量子点从有机相转 移到水溶液中；有机相中合成的量子点不具有水溶性，而要应用于生物体系中， 必须进行相转移；( 4 ) 量子点的表面修饰，使其功能化。 以c d s e 为例，一般的合成过程如下：将c d ( c h 3 ) 2 与s e 溶解于t o p 中，迅速加 入至1 j 2 9 0 3 5 0 的t o p o 溶液内，形成量子点晶体核。量子点晶核的表面积比较大， 存在空原子轨道或分子轨道，可与有机配位体接合【6 】。t o p o 和t o p 中含有大量可 与晶体核表面接合的功能团和烷基链，与量子点晶核接合后，钝化了量子点的表 面，可以阻止聚积，使量子点晶体核在非极性溶液中以胶体状态相对稳定存在。 硕i j 学位论文 但这种连接不稳定，易于解吸。 在量子点晶核表面覆盖一层晶体结构相似、带隙更大的半导体材料，得到核 壳结构的产物，可使晶核表面无辐射重组位置被钝化、减少激发缺陷而使量子点 的荧光性能得到改善，提高量子产率，同时增强核的稳定性，改善其生物亲和力【2 4 1 。 壳的形成与核的合成类似：将核c d s e 重新悬浮在t o p 与t o p o 的溶液中，缓慢加入 壳前体( 如二乙基锌) ，同时升高温度至l6 0 2 2 0 。 上述方法合成的量子点表面富含烷基链，可溶于非极性有机溶剂；而要作为 生物探针，应用于生物医学分析等研究领域，量子点必须具有水溶性，因此需要 对量子点进行相转移。尽管近来有报道在水相中合成了量子点，但其单分散性差， 荧光效率也不及在有机相中合成的量子点【4 ，7 ，1 5 】，现在研究用高质量的量子点几乎 都是在非极性有机相中制备得到的。相转移方法一般有两种【l 5 】： ( 1 ) 配体交换， 即用两性分子置换出t o p o 配体，这种分子的一端与量子点的核壳表面直接接合， 另一端具有亲水性。1 9 9 8 年，n i e 等人【i8 j 首次利用金属巯基的结合作用，成功地 以巯基乙酸分子取代了油溶性量子点表面的t o p o 配体，从而将纳米粒子的末端 修饰上羧基，使其具有良好的水溶性。随后文献中报道了以巯基乙胺、半胱氨酸、 巯基十一酸等其他巯基小分子实现了油溶性量子点的水溶性方法。这种相转移方 法可使量子点的直径较小，但会降低荧光效率，且在生物缓冲溶液中易于聚集、 沉淀；( 2 ) 两性聚合体覆盖，即保留t o p o 配体，而在其表面覆盖一层两性分子。 2 0 0 3 年，w u 等人【2 5 】以两性高分子作为修饰试剂，成功地实现了量子点的水溶性 化。这种方法保持了量子点的荧光效率，但增大了量子点的尺寸1 6 j ，可能影响其在 生物医学中的应用范围。其它增加量子点水溶性的方法有：磷脂胶束或聚异戊二 烯包裹【2 6 ，27 1 、树形高分子修饰【2 8 1 、硅烷化【2 9 l 等，且量子点表面所修饰官能团的种 类和数量的不同会影响到量子点的光学性能和物理性质【3 0 刁引。 由于传统q d s 的合成过程较复杂，核前体( p r e c u r s o r ) 的毒性较大，新的合 成原料和路线不断出现。q u 等人【3 4 】以不同的核前体在不同的有机溶剂中合成了高 品质的量子点，发现分别以c d ( c h 3 ) 2 和脂肪酸作为核前体及溶剂的效果最好。p e n g 等人【3 5 以核前体c d o 合成了不同形状的c d s e ，c d t e 及c d s 量子点。z l a t e v a 等 人【3 6 】通过逐步升温的方法在同一反应中合成了六种不同颜色的c d s e 量子点。 1 2 2 量子点的标记 对于以检测荧光信号为主要手段的单分子检测技术来说，荧光标记是十分关 键的因素。除部分可以自发荧光的分子外，大部分生物分子需要标记荧光团，荧 光团分子的标记应具有特异性、专一性及无毒性等特点。 鉴于大多数相转移后的量子点表面覆盖羧基官能团，在中性或碱性缓冲溶液 中带负电的特点，量子点标记目标分子的方法一般有四种【4 ，9 ，1 0 j ： ( 1 ) 直接接合， 量了点光漂白及光谱蓝移的抑制研究 若目标分子含有能直接在量子点的核壳表面上接合的官能团，可直接与量子点连 接。m i t c h e l l 等人【3 7 】利用量子点表面的z n 原子与巯基之间的配位作用，以末端带 有巯基的d n a 分子取代修饰在量子点表面的巯基丙酸，从而将d n a 分子连接到 量子点上。g a o 等人 3 8 1 通过使牛血清白蛋白b s a 变性，使其带上巯基后连接到量 子点的核壳表面；( 2 ) 共价键接合，即目标分子可与量子点表面的羧基官能团以 共价键接合：( 3 ) 间接接合，若通过前两种方法未能使量子点标记到目标分子上， 可将目标分子修饰，使其带上可与量子点结合的官能团。目前应用较多的是抗生 蛋白链菌素( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素( b i o t i n ) 间的特异性结合：将量子点与抗生 蛋白链菌素连接，而将目标分子生物素化；( 4 ) 静电引力，由于修饰后的量子点 带负电，若目标分子带正电，通过静电引力作用，可将两者连接起来。g o l d m a n 等人【3 9 】通过静电引力将带正电的抗生物素蛋白( a v i d i n ) 修饰到带负电荷的量子 点表面，再与生物素化的抗体特异性结合，从而成功地检测了蛋白毒素。 在目前大多数的研究中，多以间接接合的方式将量子点标记到目标分子上。 其中尤以羧基与氨基、生物素与抗生蛋白链菌素、蛋白质与抗体之间的结合应用 较多【4 ，5 ，8 ，4 0 ，4 1 1 。 1 3 量子点标记单分子的检测方法 目前文献报道基于量子点的单分子检测方法主要包括：荧光成像法【4 2 ，4 3 1 、荧 光共振能量转移法【4 4 - 4 6 1 ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 、双色 荧光相合检测法【1 3 ，4 0 ，4 7 1 ( d u a l c o l o rf l u o r e s c e n c ec o i n c i d e n c ed e t e c t i o n ) 。 1 3 1 荧光成像法 直接以荧光显微镜对目标分子成像，可以进行相对较高通量的检测和分子示 踪。但这种方法必须在成像前进行分离纯化，使未标记和已标记的量子点分开或 通过某种识别参数对二者加以区分。c r u t 等人【4 8 】根据以量子点标记的d n a 分子 在盖玻片上的伸展方向和偏转角度来辨别区分；c o u r t y 等人【4 9 】以量子点标记驱动 蛋白马达分子，依据己标记的量子点将做定向运动与做布朗运动的未标记量子点 相区分。 1 3 2 荧光共振能量转移法 荧光共振能量转移法需要一个供体与一个受体，且两者间的空间距离要在 1 1 0n m 5 0 1 内；供体的发射光谱要与受体的吸收光谱部分相重叠，但与受体的发射 光谱要分开。传统有机荧光染料的发射光谱常有拖尾现象，吸收光谱较窄，在激 发供体时，受体也可能受到激发产生假的f r e t 信号。而以量子点作为f r e t 的供 体【4 4 ，5 1 1 ，激发光谱宽，避免受体被激发；发射光谱窄、对称，不会与受体的发射 硕 ：学位论文 光谱重叠；不同量子点可用同一束激发光源激发。c l a p p 等人1 52 j 以量子点为供体， 有机荧光染料为受体，研究了两种结构下的荧光共振能量转移现象：单个量子点 供体与多个不同受体之间的相互作用；多个不同量子点供体与单一受体的相互作 用。在两种模式下，都观察到了供体与受体问的荧光共振能量转移现象，且论证 了在后一模式下，数据分析更为简便，实用性更强。s a r k a r 等人【53 l 将量子点连接到 人血清白蛋白上，通过观察量子点与人血清白蛋白t r p 2 1 4 基团间的f r e t 现象来研 究蛋白结构的变化。s h i 等人【”】通过缩氨酸连接了量子点供体与若丹明受体，以供 体与受体间荧光强度的变化来检测胰岛素酶及胰岛素抑制酶的活性。 1 3 3 双色荧光相合检测法 基于目标分子无需放大，标记后的产物无需分离纯化，发展出了一种双色荧 光相合检测法【47 】：将两种荧光团同时标记到同一目标分子上，当目标分子通过检 测体积时，两种荧光团同时受到激发而发出荧光；如果发出的荧光在同一时间分 别在不同的通道中被检测到，则认为有目标分子通过检测体积。以量子点作为荧 光团，可使用单一激发光源，减小了检测体积，提高了信噪比。 s t a v i s 等人1 1 4 】利用双色荧光相合检测法研究了微通道与量子点结合的单分子 检测技术，并以抗生蛋白链菌素修饰的q d 6 5 5 和有机荧光染料a l e x af l u o r 4 8 8 双 色荧光团进行了验证，证明了微通道与以量子点作为标记物的结合，使单分子检 测分析更为快捷、高效。微通道使两个目标分子或两个自由荧光团同时出现在检 测体积的概率几乎为零，极大的消除了假信号的影响，提高了检测灵敏度。 1 4 量子点在单分子检测中的应用 目前量子点在单分子检测中主要应用到高灵敏检测及单分子示踪等领域，涉 及了包括核酸、蛋白质、病毒在内的多种生物对象。 1 4 1 高灵敏检测 对物质进行定量、定性及结构分析，一直都是分析化学的主要任务，而在单 分子水平对物质进行高灵敏检测，使检测水平上升到一个新的高度。 z h a n g 等人【4 0 j 报道了一种快速、灵敏，基于单分子相合检测法，利用双色量 子点检测核酸的均相检测方法。通过杂交反应，两个生物素化的核酸探针被用来 识别目标d n a 单链：杂交后的d n a 首先与抗生蛋白链菌素修饰的q d 6 0 5 结合， 抗生蛋白链菌素修饰的q d 5 2 5 再与杂交体的另一端结合。当q d 6 0 5 、q d 5 2 5 、d n a 杂交体形成一个整体时，相合信号才会被检测到。由于高的杂交效率，检测目标 d n a 分子所需时间较短，检测效率较高，检测限可达1 0 。5 m 。 量了点光漂白及光讲蓝移的抑制研究 a g r a w a l 等人【55 1 利用量子点所发出的荧光强度测定了病毒表面的蛋白数量。 将量子点与抗体相结合，当病毒表面有相应表面蛋白时，抗体与表面蛋白特异性 结合；表面蛋白越多，结合的量子点将越多，量子点发出的荧光强度越强。根据 荧光强度，判断出病毒表面蛋白的数量，并测定了四种病毒的表面f 蛋白数量。 c h e n 等人【56 j 以量子点为荧光探针，选择性的检测了溶液中的金属阳离子。实 验研究了分别以聚磷酸盐、半胱氨酸以及巯基甘油修饰的量子点对不同种类金属 阳离子的响应情况。实验发现，聚磷酸盐修饰的量子点对几乎所有的一价、二价 阳离子均有响应，没有选择性；半胱氨酸修饰的量子点仅对z n 2 + 有响应，对其它 离子则不敏感：而巯基甘油修饰的量子点对c u 2 + 和f e 3 十有特殊响应。 n i k i f o r o v 等人1 5 7j 以量子点为供体，有机荧光染料a l e x a f l u o r 荧光团为受体， 利用均相竞争免疫结合法对生物胞素的含量进行了测定。在实验过程中，生物素 化的q d 6 0 5 与抗生蛋白链菌素修饰的a l e x af l u o r 6 4 7 荧光团特异性结合，两种荧 光团之间发生荧光共振能量转移。当加入自由的生物胞素时，生物胞素、生物素 相互竞争，部分与a l e x af l u o r 6 4 7 上抗生蛋白链菌素结合的生物素游离出来，使 供体减少，f r e t 效率降低。根据f r e t 效率的降低，测定了所加入生物胞素的浓 度。运用此方法还对荧光素、皮质醇进行了测定。 c r u t 等人【48 j 利用量子点代替传统的d n a 染色剂，研究了d n a 分子新的标记 方法，并测定了d n a 分子在盖玻片上的伸展方向与偏转角度。通过特殊顺序的杂 交，生物素和异羟基洋地黄毒苷元( d i g o x i g e n i n ) 修饰的d n a 片段以共价键连接 到目标d n a 分子的两端。由于杂交后的d n a 分子与抗生蛋白链菌素修饰的 q d 5 6 5 、抗体修饰的q d 6 5 5 键合，当目标d n a 分子在盖玻片表面伸展后，两个 末端可在荧光显微镜下观察到。根据d n a 分子在盖玻片上的伸展方向和长度，挑 选出在这一方向和距离范围内的量子点对，因此可识别出与量子点对连接的目标 d n a 分子。实验表明，在距离为1 5 4 0 “m 、垂直方向偏转角度为1 0 1 0 。范围 内所挑选出的量子点对，均可认为连接在d n a 分子上。 y e h 等人i l3 】利用量子点以双色荧光相合检测法对点变异进行检测。在完全匹配 的目标模板存在下，利用d n a 连接酶将生物素化的辨别探针( d i s c r i m i n a t i o np r o b e ) 和荧光团o g 4 8 8 标记的报道探针( r e p o r t e rp r o b e ) 连接起来；通过加热使d n a 双 链解旋，形成的探针结合体与匹配的目标模板分离开。抗生蛋白链菌素修饰的量 子点通过与生物素的特异性结合捕获多个探针结合体，利用荧光相合检测法对特 异性结合后的纳米结构进行检测。在不匹配的目标模板存在下，辨别探针和报道 探针未能连接在一起，荧光团o g 4 8 8 与量子点间不存在相合荧光信号。因此，依 靠相合信号，将匹配的目标分子与不匹配的目标分子辨别出。 l i u 等人【5 8 】分别将发射波长在5 2 5a m 和5 8 5n m 的量子点连接到对腺苷或可卡 因敏感的a p t a m e r 修饰的金纳米颗粒上。由于金颗粒可熄灭量子点的荧光，当溶液 硕e 学位论文 中存在腺苷或可卡因分子时，量子点与金颗粒分开，其荧光强度增加，从而检测 到目标物的存在。 1 4 2 单分子示踪 在研究单分子运动的过程中，存在两大问题 5 9 j ：荧光探针的尺寸较大或易于 光漂白。而量子点的尺寸适宜，荧光强度高，不易光漂白，可长时间追踪监测， 具有广泛的应用前景。以量子点作为追踪探针，不仅可以获得单个生物分子的动 力学性质，而且可以获得常规成像方法所不能获得的信息。 s e i t z 等人【6 0 】利用量子点观察了单个驱动蛋白分子在拥挤微管中的前进运动。 在细胞内，多个马达分子和与微管相联系的蛋白质分子竞相与微管键合；通过抗 生蛋白链菌素与生物素的特异性结合，将量子点连接到驱动蛋白上，观察了微管 的拥挤状态对驱动蛋白分子运动的影响，并测定了在稳定状态下微管的拥挤度。 实验表明，驱动蛋白分子的运动几乎不受微管中高密度驱动蛋白分子的影响；但 当存在大量变异驱动蛋白时，会减小驱动蛋白的运动速率，而不改变其持续运动 能力。这一现象说明，当驱动蛋白分子遇到变异驱动蛋白分子时，会停止运动， 直到变异分子离开驱动蛋白分子所要结合的位置。 w a r s h a w 等人【6 l j 以不同量子点标记肌浆球蛋白v 的头部，并观察到肌浆球蛋白 v 的手拉手运输模式。将抗生蛋白链菌素修饰的q d 5 6 5 、q d 6 5 5 标记到生物素化的 肌浆球蛋白v 的两个头部，在全内反射荧光显微镜下成像；观察到肌浆球蛋白v 在 肌动蛋白丝上每步前进7 2n m ，两个静止头部间的距离为3 6a m ，且肌浆球蛋白v 的两个头部在肌动蛋白的位置上头尾互换，证实了这一手拉手运输模式。 c o u r t y 等人【4 9 】利用单个量子点在海拉细胞中追踪驱动蛋白马达分子，测定了 其速率、持续运动时间。将抗生蛋白链菌素修饰的量子点标记到生物素化的驱动 蛋白上，经过纯化冷冻后，有1 4 的驱动蛋白保留了活性。驱动蛋白分子在细 胞中的运动有两种状态：活性蛋白分子的定向运动，失活蛋白分子的布朗运动； 并测定了驱动蛋白马达分子的运动速率、持续运动时间以及扩散系数。 d a h a n 等人【59 】以单个量子点为标记物，研究了氨基乙酸受体分子的动力学扩 散过程。将抗生蛋白链菌素修饰的量子点标记到氨基乙酸受体后，追踪其运动轨 迹，分析其在活细胞神经膜内的侧向动力学过程，并观察到氨基乙酸受体分子依 靠扩散作用而进入神经细胞突触内的过程。 g r u n w a l d 等人【6 2 】利用量子点观察了单个蛋白质分子在磷酸盐缓冲液中的运 动。通过对实验所获得的均方位移数据进行分析，得到的扩散常数与通过荧光相 关光谱所获得的常数相同。 n a r a y a n a n 等人【6 3j 将量子点与胰凝乳蛋白酶连接，并证明了酶的结构和功能的 完整性。 量子点光漂白及光辨篇侈的抑制研究 1 5 前景展望 量子点作为一种新型荧光标记试剂，以其优良的光学性质引起了众多科研工 作者的兴趣，关于量子点在单分子检测中的应用研究也日渐兴起。然而，这仍需 要进行大量的基础研究：( 1 ) 量子点的合成与组装仍需完善。以期制备出具有良 好、稳定光学性质的量子点，并将其发射波长范围从可见光区扩展到红外区域， 便于在生物体系中的应用；( 2 ) 量子点的毒性有待于确认；( 3 ) 量子点的优良 光学性质仍需在实际应用体系中加以验证，以便确认量子点是否可以取代传统有 机荧光染料或荧光蛋白。 1 6 本文主要研究内容 与传统荧光染料相比，量子点具有许多优良的光学性质，己在分子生物学、 细胞生物学、蛋白质组学、医学等研究领域获得广泛应用。但量子点是否可以取 代传统有机荧光染料或荧光蛋白的地位，成为最具有应用价值的荧光探针，还需 要在实际应用体系中加以验证。基于以上构想，本文主要开展了以下两个方面的 工作： ( 1 ) 研究量子点的光漂白与光谱蓝移现象。实验发现，在连续激发状态下， 溶液中视场范围内的量子点会发生光漂白和光谱蓝移现象。本文详细研究了量子 点在不同实验条件下的光漂白状况：通过调节激发光源强度、改变连续激发方式、 变换激发光源波长以及向量子点溶液中添加巯基化合物来改变实验条件，详细考 察了溶液中在玻片表面非特异性吸附的量子点的光漂白状况；并研究了空气中的 量子点及溶液中以共价键固定到玻片基底上的量子点在连续激发状态下的光漂白 状况。通过在电子倍增耦合器件e m c c d 前插入透射光栅，以简单、明了的方法 观察了溶液中量子点的光谱蓝移状况，以及巯基乙醇对溶液中量子点光谱蓝移状 况的影响。论证了量子点的光漂白、光谱蓝移与溶液中量子点消失现象间的关系。 ( 2 ) 巯基乙胺对量子点光漂白与光谱蓝移的抑制。溶液中量子点的光漂白与 光谱蓝移现象限制了其作为荧光标记探针的应用范围，如何改善量子点的光学性 质成为一个亟待解决的问题。实验以巯基乙胺为抑制剂，研究了巯基乙胺对溶液 中量子点的光漂白、光谱蓝移以及眨眼现象的抑制状况；通过试验不同巯基化合 物对不同种类量子点光学性质的影响，阐述了巯基乙胺抑制溶液中量子点光漂白、 光谱蓝移以及眨眼现象的机理。实验还论证了量子点的光漂白与光谱蓝移、光谱 蓝移与眨眼现象间的关系，研究了聚乙烯乙二醇p e g 包裹对量子点光学性质的影 响。 在大多数的文献报道中，量子点的荧光强度高，耐光漂白性能良好，而本文 则以实验结果为依据，详细研究了量子点的光漂白现象。量子点的光谱蓝移现象 硕f j 学位论文 已见报道，而本文在简单、实用的成像系统下，通过统计分析单个量子点的光谱 蓝移数据，研究了量子点的光谱蓝移程度及蓝移速率。在文献中，抑制量子点眨 眼现象的方法已见报道，但还未找到能够有效抑制量子点光漂白与光谱蓝移现象 的方法，本文则成功地解决了这一问题。 量7 点光漂白及光谱荒移的抑制研究 2 1 引言 第2 章量子点的光漂白及光谱蓝移现象 量子点作为一种新型荧光探针，与传统有机荧光染料相比，它具有更高的荧 光强度和更好的耐光漂白性能【6 引，有着广泛的应用前景。在大多数的文献报道中， 量子点的耐光漂白性能良好。但在实验过程中发现，当连续光照溶液中的量子点 时，视场范围内所观察到的量子点个数会先增加，后减少，最后消失。2 0 0 7 年， l e e 等人【65 j 报道了溶液中量子点在连续激发状态下的消失现象，认为这是由于量 子点中的暗产物发光及量子点的光漂白所致。 量子点的荧光波长与其直径大小相关，直径越小，发射的荧光波长越短。在 连续激发状态下，溶液中量子点的核会被氧化，使核的有效尺寸减小，从而导致 了量子点的荧光光谱发生蓝移【6 6 】。2 0 0 1 年，v a ns a r k 等人【7 】对比了量子点在空气 和氮气中的光谱蓝移状况，但所用仪器较复杂。 巯基乙醇是一种供电子化合物，具有较强的还原能力，能够很好的溶解于水 溶液中。2 0 0 4 年，h o h n g 等人【6 8 j 报道了巯基乙醇有效抑制量子点的眨眼现象，认 为该化合物中的巯基作为电子供体，能够向量子点表面的电子缺陷位置提供电子， 导致其不能捕获量子点所发出的光子，从而抑制了量子点的眨眼现象。 本文详细研究了不同实验条件下量子点的光漂白状况，并通过在e m c c d 前 插入透射光栅，以及向量子点溶液中添加巯基化合物，考察了溶液中量子点的光 谱蓝移状况，论证了量子点的光漂白、光谱蓝移与溶液中量子点消失现象间的关 系。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与仪器 2 2 1 1 试剂 羧基修饰的量子点( q d 5 2 5 ，8 “m ，i t k t m ，i n v i t r o g e n m o l e c u l a rp r o b e s ，e u g e n e ， o r ，u s a ) ：巯基乙醇( 3 - m e ，3 - m e r c a p t o e t h a n o l ，分子量为7 8 1 3 ，a l f aa e s a r ) ； 1 乙基( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( c 8 h 1 7 n 3 h c l ，分子量为19 1 7 0 ，e d c ， n e t h y l n - ( 3 d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ，b b i ) ；3 - 氨丙基三 乙氧基硅烷( h 2 n ( c h 2 ) 3 s i ( o c 2 h 5 ) 3 ，分子量为2 21 3 7 ，a p s ，3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ，f l u k a ) ；硼酸盐缓冲溶液( 5 0m m ，p h 9 0 ) ；硼酸盐缓冲溶液( 1 0 m m ，p h 7 4 ) ；p i r a n h a 洗液( 体积比，h 2 s 0 4 ：h 2 0 2 = 7 ：3 ) ；其它试剂均为国产分 硕l ：学位论文 析纯，实验用水为m i l l qw a t e r ( m i l l i p o r e ) ：所配溶液均用0 2 2 “m 孔径的滤膜过 滤。 2 2 1 2 仪器 正置荧光显微镜( o l y m p u sb x 51 ，j a p a n ) ；1 0 0 x 油镜( u p l s a p o ，o l y m p u s ， j a p a n ) ；汞灯；电子倍增耦合器件( e m c c d ，d v 8 8 7 ，a n d o rt e c h n o l o g y ，n o r t h i r e l a n d ) ；透射光栅( 7 0l i n e s m m ，e d m u n ds c i e n t i f i c ，b a r r i n g t o n ，n j ，u s a ) ：中 性密度滤光片( n d 2 5 ，o l y m p u s ，j a p a n ) ；超声波清洗机( 宁波新芝生物科技股份 有限公司，中国) ；载玻片( s h i t a ie x p e r i m e n te q u i p m e n tc o l t d ，c h i n a ) ；盖玻 片( e l e c t r o nm i c r o s c o p ys c i e n c e s ，p a ，u s a ) 。 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 量子点光漂白过程的观察 用5 0m m ，p h 9 0 的硼酸盐缓冲溶液将q d 5