（细胞生物学专业论文）通过兔单克隆抗体筛选胚胎干细胞特异性分子标志的研究.pdf

浙江大学硕士研究生毕业论文 致谢： 两年的研究生生活转眼即逝，在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从 开始的懵懵懂懂，到正式进入课题、论文的顺利完成，有多少可敬的学长、同学、 朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意! 感谢我的导师张铭教授，他严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习 中的榜样；他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。 感谢实验室里其他老师和师兄师姐对我的帮助和指点。没有他们的帮助和指 导，我无法迅速地进入实验室工作，无法顺利地学习各项必须的技术和具备独立 实验设计的能力。还要感谢我的师弟师妹们对我的帮助。尤其要感谢我的男友， 同时还是我师兄的苏中渊。在同一个实验室里，他给了我很大的帮助。在我实验 不如意的时候，能帮我耐心分析原因；在我工作量太大的时候，能帮我分担任务； 还会对我的实验，提出建议和指出错误，虽然有时还会为这些事吵起来，但这也 是促进我不断学习的动力吧。 最需要感谢的人就是我的父母。从小到大，他们对我的学习和生活给予了无 微不至的关怀，在外求学也已有六年了，他们对我还是那么得放不下心，或许在 父母心中，我永远也是小孩子吧。每次回学校，父母总是坚持要送我到车站，无 法忘记那天由于人多没买到早点回杭州的票，父母陪我在车站台阶上坐了整整一 下午。没有父母的支持，我无法坚持到这一步! 以后还有更多的考验在等着我，我即将踏上工作岗位，开始新的人生旅程。 两年的研究生生涯教给了我很多东西，它将成为我人生中的宝贵记忆，敦促我在 今后也要用踏实的求学态度和认真负责的工作精神，对待每一件事。 再次感谢帮助过我的每一个人，在这里我真诚地说：谢谢1 4 浙江大学硕士研究生毕业论文 中文摘要： 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e sc e l l s ) 是指从胚胎内细胞团分离获得 的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正 常二倍体细胞。e s 细胞是细胞治疗和组织工程的理想种子细胞来源，可应用于 药物筛选，还是很好的研究胚胎早期分化的模型系统。 胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要 特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化 机制的研究，有着十分重要的意义。尤其是细胞表面分子标志，与细胞外信号系 统和细胞间通讯联系密切相关，受到广泛关注。但是目前发现的e s 细胞分子标 志数量有限，而且与其他的成体干细胞或肿瘤细胞有共同的表达，因此更多更特 异的胚胎干细胞分子标志仍有待发现。胚胎干细胞特异性分子，尤其是膜表面特 异分子，具有丰度低、修饰复杂和变化快的特点；胚胎干细胞培养系统复杂，不 易大规模培养，加之它的群体异质性更增加了特异性分子标志的研究难度。 目前研究胚胎干细胞特异性分子标志的方法主要基于单克隆抗体技术、转录 组学技术和蛋白组学技术。我们实验室使用小鼠e s 细胞免疫兔，筛选e s 细胞 特异的兔单克隆抗体，通过免疫共沉淀和质谱技术结合的方法鉴定抗原来筛选胚 胎干细胞的特异性分子标志。目前常用的大部分胚胎干细胞分子标志s s e a 1 、 s s e a 3 、t r a 1 6 0 等并不是直接从胚胎干细胞获得的，而且所用的免疫动物大 多为小鼠。与鼠单抗相比，兔单抗具有更大的优势：首先，兔对外源抗原反应更 为敏感，可以对小鼠无免疫原性的抗原产生抗体；其次，兔单克隆抗体具有更高 的亲和力；第三，对同一种抗原，兔单抗会识别更多不同的表位；第四，兔的脾 脏更大，可以产生更多的脾细胞进行融合实验，有机会筛选到更多的单克隆抗体。 通过e s 细胞免疫兔的方法可以获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从而建 立胚胎干细胞的抗体库，并可能率选到新的胚胎干细胞分子标志。 在本次实验中，我们共筛选到了2 0 0 多株胚胎干细胞特异性的杂交瘤，并选 择了其中2 0 株进一步进行亚克隆，最后获得了1 4 株稳定分泌单克隆抗体的杂交 瘤细胞株。大部分抗体对胚胎干细胞有特异性结合，并且具有一定的组织表达特 异性。细胞免疫荧光和免疫组织化学得结果显示：多数抗体具有较高的特异性， 仅在少数成体组织或其它细胞系中有染色现象，并且多数抗体的染色在e s 细胞 浙江大学硕士研究生毕业论文 分化后会出现染色变弱或消失的现象，说明这些抗体所针对的抗原随着e s 的分 化表达降低，这些抗原很有可能会成为未分化胚胎细胞的分子标志。尤其是其中 一株杂交瘤5 9 # ，它所分泌的抗体只在e s 细胞中有阳性染色，其抗原在成体组 织中未发现表达，甚至在畸胎瘤细胞中也未发现表达，可能会成为一个很好的胚 胎于细胞的特异标志。对其中一株鲥杂交瘤分泌抗体的研究表明，该抗体所针 对的抗原是三磷酸肌醇受体( i n o s i t o l1 , 4 ，5 - t r i p h o s p h a t er e c e p t o r ) 。它位于细胞内 质网膜上，与内质网上的钙离子释放有关。其它抗体仍在进一步的鉴定过程中。 6 浙江大学硕士研究生毕业论文 英文摘要： a b s t r a c t ： e m b r y o n i cs t e mc e l l s ( e s c ) a r ec e l l sg e n e r a t e df r o mi n n e rc e l lm a s s ( i c m ) o f p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s t h e yc a l lb ep r o p a g a t e ds t a b l yi nv i t r of o ral o n gt i m e ，a n d p r e s e r v et h ec a p a c i t yo fd i f f e r e n t i a t i n gi n t oa l lc e l ll i n e a g e sd e r i v e df r o mt h et h r e e g e r ml a y e r s ，w h i c hs t i l lk e 印n o r m a ld i p l o i dk a r y o t y p e e s c sa r ee x c e l l e n ts o u r c ef o r c e l lt h e r a p y , t i s s u ee n g i n e e r i n ga n dd r u gs c r e e n i n g t h e ya r ea l s os u p e r i o rm o d e lf o r r e s e a r c hi ne m b r y od e v e l o p m e n ta tt h ee a r l yp e r i o d e s c sa r ed i f f e r e n tf r o mo t h e rc e l l sb e c a m eo ft h e i rc h a r a c t e r i z a t i o n so fh i g h l y s e l f - r e n e wa b i l i t ya n dd i f f e r e n t i a t i o np l u r i p o t e n c y e s cs p e c i f i cm a r k e r sp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nc h a r a c t e r i z a t i o no ri s o l a t i o no fe s cl i n e sa n de l u c i d a t i o nf o rt h e m e c h a n i s mo fs e l f - r e n e w a lo rd i f f e r e n t i a t i o ni ne s c e s p e c i a l l yc e l ls u r f a c em a r k e r s ， w h i c ha r ei n v o l v e di ne x t r a c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o no rc e l lc o m m u n i c a t i o n ，a r eo f g r e a ti n t e r e s t h o w e v e r , t h er e p o r t e de s cm a r k e r sa r es t i l ll i m i t e d , w h i c ha l e c o e x p r e s s e d 、析t l lt h eo t h e r a d u l ts t e mc e l l so rm a l i g n a n tc e l l s m o r ee s cm a r k e r sa r e s t i l lt ob ef o u n d y e ti ti sn o ta ne a s yw o r kf o ri d e n t i f i c a t i o no fe s cm a r k e r s ：e s c m a r k e r s ，e s p e c i a l l ys u r f a c em a r k e r s , a r eo fl o wa b u n d a n c e ，c o m p l i c a t e dm o d i f i c a t i o n a n dq u i c kv a r i a t i o n ；c o m p l i c a t e ds y s t e mo fe s ci sn o ts u i t a b l ef o rl a r g es c a l ec u l t u r e ； t h eh e t e r o g e n e o u sp o p u l a t i o ni ne s ca l s oi n c r e a s e st h ed i f f i c u l t y p r e s e n t l ya p p r o a c h e st os c r e e nf o re s cm a r k e r si n c l u d em o n o c l o n a la n t i b o d y ( m a b ) t e c h n i q u e ，t r a n s c r i p t o m i c st e c h n i q u ea n dp r o t e o m i e st e c h n i q u e i nt h i s r e s e a r c hw eu s em o u s ee s ct oi m m u n i z er a b b i t , a n ds c r e e nf o rm a b sw h i c hc a l l s p e c i f i c a l l yb i n dt oe s c b yc o m b i n i n gi m m u n o p r e c i p i t a t i o nw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y , i ti s p o s s i b l et oi d e n t i f yn o v e lm a r k e r sf o re s c s f r e q u e n t l yu s e de s cm a r k e r s ( s s e a - 1 ，s s e a 一3 ，t r a - 1 - 6 0 ，e t c ) w e r en o td e r i v e df r o me s cd i r e c t l ya n dt h e i rh o s t f o ri m m u n i z a t i o nw a sm o s t l ym o u s c c o m p a r i n g 谢t l lm o u s em a b s ，r a b b i tm a b s h a v em a n ya d v a n t a g e s ：f i r s t ，r a b b i ta r em o r es e n s i t i v et oe x o g e n o u si m m u n o g e n s ， p r o d u c i n ga n t i b o d i e st om o u s ei m m u n o g e n so rr e c o g n i z ed i f f e r e n te p i t o p e sf r o mm i c e ； s e c o n d , r a b b i ta n t i b o d i e sh a v eah i g h e ra f f i n i t y ；也i r d ，r a b b i th a v eal a r g e rs p l e e n , 7 浙江大学硕士研究生毕业论文 w h i c hc o u l dp r o d u c em o r es p l e e nc e l l sf o rg e n e r a t i n gh y b r i d o m a sa n ds e l e c t i n g d i f f e r e n ta n t i b o d i e s l a r g eq u a n t i t yo fr a b b i tm a b sc a nb ep r o d u c e de i t i c i e m l yu s i n g e sc e l l sa si m m u n o g e n h e n c e ，i ti sm o r el i k e l yt os c r e e nm a b sa g a i n s tn o v e l m a r k e r so fe sc e l l sf r o mt h o s er a b b i tm a b s i nt h i ss t u d y , w eg e n e r a t e dm o r et h a n2 0 0h y b r i d o m a ss e c r e t i n ge sc e l lb i n d i n g a n t i b o d i e s , 2 0h y b d d o m a sw e r ee l e c t e df o rs u b c l o n ea n d14s t a b l eh y b r i d o m a sw e r e o b t a i n e d c h a r a c t e r i z a t i o no ft h e s em a b ss h o w st h a tm o s t o ft h e yc o u l ds p e c i f i c a l l y b i n dt oe s c s , a n dt h ea n t i g e n so ft h e mw e i ep a r t l ye x p r e s s e di na d u l tt i s s u e s s t u d y f o ro n eh y b r i d o m a9 拌s h o w st h a t ：i ts e c r e t e sm a b a g a i n s ti n o s i t o l1 , 4 ，5 - t r i p h o s p h a t e r e c e p t o r , w h i c hi se x p r e s s e di ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，a n dr e g u l a t e st h er e l e a s eo f c a 寸f r o mt h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) mo t h e rm a b sa r es t i l li ns t u d yu n t i l n o 、 ， 8 浙江大学硕士研究生毕业论文 背景介绍： 胚胎干细胞是从植入前的胚胎内细胞团分离获得的一类细胞，它能在体外培 养过程中长期保持自我更新的能力和分化为所有三胚层细胞的潜能。因此，胚胎 干细胞是一种细胞移植治疗的优秀种子细胞来源。【l ，2 】随着不同胚胎干细胞株 的建立，胚胎干细胞的标志物也不断被发现，至今已报道的常用的胚胎干细胞特 异性标志包括转录因子o c t 4 、n a n o g 、r e x l 等；表面标志物s s e a - 1 、s s e a 3 、 t r a 1 6 0 、c d 9 等。这些标志对胚胎干细胞的鉴定、胚胎干细胞的分化过程中 基因和蛋白表达变化的研究起着非常重要的作用。尤其细胞膜表面标志，对细胞 因子参与胚胎干细胞的自我更新和分化的机制的研究、未分化胚胎干细胞的分离 纯化有着十分重大的意义。单克隆抗体具有高度的特异性，这些胚胎干细胞的特 异性标志的抗体的应用能很好地达到这些研究目的。 然而，目前研究资料表明：大部分的胚胎干细胞的特异性标志抗体并不是直 接从胚胎干细胞获得的：s s e a 1 、s s e a 4 、t ra 1 6 0 等抗体是由畸胎瘤细胞免 疫获得的；s s e a - 3 抗体是从小鼠胚胎免疫获得【3 5 】；o c t 4 、n a n o g 这些转录 因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。这些标志的特异性有 一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达 【6 1 0 1 ，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，发现更多、更灵 敏、更特异的胚胎干细胞标志十分必要。2 0 0 5 年，s o n 等通过人胚胎干细胞免疫 小鼠发现了人胚胎干细胞特异性标志h s p 7 0 异性i 蛋白，说明使用胚胎干细胞 直接作为免疫原有可能发现新的胚胎干细胞标志物【l1 1 。 我们通过用小鼠胚胎干细胞免疫兔制备胚胎干细胞特异性单克隆抗体。与鼠 来源的单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有更大的优势：首先，兔对外源抗原反 应更为敏感，可以对小鼠无免疫原性的抗原产生抗体；其次，兔单克隆抗体具有 更高的亲和力；第三，兔和小鼠来源的抗体对同一种抗原也会识别不同的表位； 第四，兔的脾脏更大，可以产生更多的脾细胞进行融合实验，有机会筛选到更多 的单克隆抗体【1 2 】。得到e s 特异性抗体后，结合免疫共沉淀技术和质谱分析技 术，可以分离鉴定抗体所特异结合的胚胎干细胞抗原，有可能筛选得到新的胚胎 干细胞特性标志，同时获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从而建立胚胎干 细胞的抗体库。 9 浙江大学硕士研究生毕业论文 在本次实验中，我们通过使用小鼠胚胎干细胞对新西兰大白兔进行了大量多 次的皮下注射免疫，并与宜康公司合作筛选兔杂交瘤细胞株，共获得了2 0 0 多株 胚胎干细胞特异性的杂交瘤，最后选择了其中2 0 株进一步进行亚克隆，最后获 得了1 4 株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。我们对这1 4 株杂交瘤细胞分泌 的抗体进行了不同细胞系和成体组织的免疫化学检测，从而初步鉴定了这些抗体 所针对抗原在细胞与组织中分布特异性。细胞免疫荧光和免疫组织化学得结果显 示：多数抗体具有较高的特异性，仅在少数成体组织或其它细胞系中有染色现象， 并且多数抗体的染色在e s 细胞分化后会出现染色变弱或消失的现象，说明这些 抗体所针对的抗原随着e s 的分化表达降低，这些抗原很有可能会成为未分化胚 胎细胞的分子标志。尤其是其中一株杂交瘤5 9 # ，它所分泌的抗体只在e s 细胞 中有阳性染色，其抗原在成体组织中未发现表达，甚至e c 细胞中也未发现表达， 可能会成为一个很好的胚胎干细胞的特异标志。我们已经通过免疫共沉淀的方法 成功分离纯化了部分抗体的抗原，并对其中9 群抗体的抗原进行了质谱的鉴定： 该抗体所针对的抗原是三磷酸肌醇受体( i n o s i t o l1 , 4 ，5 - t r i p h o s p h a t er e c e p t o r ) 。它 位于细胞内质网膜上，与内质网上的钙离子释放有关。其它抗体仍在进一步的鉴 定过程中。 1 0 浙江大学硕士研究生毕业论文 实验部分： 材料和方法： 材料： 细胞系及实验动物： 小鼠胚胎成纤维细胞：取自本实验室妊娠1 3 5 d 的i c r 小鼠 小鼠胚胎干细胞( j 2 细胞系) ：1 2 9 小鼠建系胚胎干细胞系( 实验室自建) i c r 小鼠：浙江省医学科学院 2 5 - 3 个月大的新西兰大白兔 主要试剂： h d m e m ( s i g m a ) 16 4 0 ( s i g m a ) 1 3 巯基乙醇( s i g m a ) 非必需氨基酸( o i l ) c o ) l 一谷氨酰胺( g i b c o ) 丝裂霉素c 胎牛血清( f b s ) ( 杭州四季青) 小牛血清( f c s ) ( 杭州四季青) d m s o e d t a 明胶( s i g m a ) m l i f ( c h c m i c o n ) 青霉素、链霉素 常规化学试剂：n a c l 、k c l 、n a h 2 p 0 4 、k 2 h p o 、苯酚、氯仿等为国产分析纯 多聚甲醛( s i g m a ) 山羊血清 牛血清白蛋白 浙江大学硕士研究生毕业论文 f i t c 荧光二抗 p o w e r v i s i o n 免疫组织化学二抗 d a b 试剂盒( 中杉金桥) 主要仪器 c 0 2 培养箱( h e r a e u sb b 6 2 2 0 0 2 ，德国) 实体显微镜( 0 1 y m p u sc h 2 ，日本) 普通倒置显微镜( o l y m p u sc k 3 0 ，日本) 荧光倒置显微镜( d i a p h o t ，n i k o n ，h b 0 1 0 0 w 2 ，o s r a m ) 激光共聚焦扫描显微镜( z e s sl s m 5 1 0 ) 8 0 0 型离心沉淀器( 上海手术器械厂) 冷冻高速离心机( s c r 2 0 b a ，日本日立) 恒温水浴锅( h h s 1 1 2 ，上海医疗器械三厂) 电子分析天平( p b 3 0 3 ，m e t e r ) 4 0 0 0 转台式离心机( 8 0 - 2 ，上海) 细胞培养瓶、吸管和载玻片( 苏州玻璃仪器厂) 超净工作台( y j 1 4 5 0b 型，苏州市金燕净化设备厂) 眼科手术器械( 浙江省华东医药公司) 普通冰箱( 海尔，青岛) - 7 0 * 2 低温冰箱( f o r m a7 2 5 ) 液氮罐( x k 0 2 ，亚西) 电热鼓风干燥箱( 江苏东台电器厂，1 0 1 1 型) 磁力搅拌器( 7 8 胂1 ，杭州仪表电机厂) 组织培养板、培养皿、锥形离心管 高压蒸汽灭菌锅( l d 2 x 一4 0 a i ，上海申安医疗机械厂) p h 计( 梅特勒，3 2 0 p hm e t e r ) 移液枪( e p p e n d o r f ) 隔水式恒温培养箱( 3 0 3 一a s 一2 型，上海锦屏仪器仪表公司) 制冰机( f 一1 2 0 b ，h o s h i z a k ie l e c t r i cc o ) 1 2 浙江大学硕士研究生毕业论文 p c r 仪( p t c 一1 0 0 ，m jr e s e a r c h ，i n c ，a m e r i c a ) 冰冻切片机 质谱仪( a p p l i e db i o s y s e t e m s ，a b 3 4 8 0 0 0 0 2 5 ) 主要试剂配制方法 细胞培养试剂 h d m e m ：根据说明将高糖d m e m 粉剂6 x1 3 4 9 充分溶于6 9 5 0 m lm i l l i p o r e 超纯水，加入6x3 7 9n a h c 0 3 ，调整p h 到7 2 ，定容至6 1 0 0 0 m l 。0 2 2 1 a m 孔 径一次性滤膜过虑，5 0 0 m l 盐水瓶分装，4 保存。 1 3 巯基乙醇( b m e ) ( 1 0 0 ) ：用0 0 5 m m e d t a 配制1 0 0 幸母液，浓度为1 0 m m 。 3 5ulb m e 溶于5 0 m l0 0 5 m me d t a 中，抽滤灭菌。 l 谷氨酰胺( 1 0 0 ) ：1 0 0 母液浓度为2 0 0 m m 。称取2 9 2 3 9 l g l u l 0 0 m l 溶于亚 沸水，超声波溶解，3 7 度保温，分装，抽滤灭菌。 l i t 分装：1 0 0 0 u n i t m l = 1 0 n g m l 。用移液器将l m l 装的l i f 液体分装成1 0 0 p l ， 一2 0 度保存。 b f g f 分装： 配制5 m mt r i s ( p h 7 6 ) ，溶解b f g f 。b f g f 储液浓度不得低于2 5pe c m l ，1 | i 管，1 0 0 使用即一管溶于1 0 0 m l 的培养液中，每管4 0ul ，2 0 度保存。 滋养层细胞( m e f ) 培养液：9 0 d m e m + 1 0 f c s 小鼠胚胎干细胞( m e s c ) 培养液： 1 非必须氨基酸( n e a a ) + o 1 m mb m e + 2 m m l - g l u + 1 0 n g m l + 8 5 d m e m + 15 f b s + 1 0 n g m ll i f 人胚胎干细胞( h e s c ) 培养液 8 0 k o d m e m + 2 0 s i h2m ml g l u + 0 1m mb m e + 1 n e a a + lo n # m l b f g f 2 e c 细胞株f 9 培养液 1 6 4 0 + 1 5 f b s 消化液( 0 0 5 胰蛋白酶+ 0 0 2 e d t a ) 1 3 称取胰蛋白酶0 5 9 、e d t a0 2 9 溶于无钙镁离子的p b s ，$ l j 成i 0 0 0 m l 的溶液，用 0 2 21 1m 孔径滤膜过滤，2 5 0 m l 盐水瓶分装，一2 0 保存。 e b 诱导培养液： 1 非必须氨基酸( n e a a ) + o 1 m mb m e + 2 m m l - g i u + 1 0 n g m l + 8 5 d m e m + l2 5 f b s p b s 工作液( 1 ) n a c l8 9 ， k c l 0 2 9 ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 8 9 9 ， k h 2 p 0 4 0 2 9 ， 溶于1 l 亚沸水中，分装后高压蒸汽灭菌2 0 - - - 3 0 m i n ，常温保存。 p b s 贮液( 5 x ) n a c l4 0 9 ， k c i i g ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 1 4 4 5 9 ， k h 2 p 0 4 l g ， 溶于l l 亚沸水中，分装后高压蒸汽灭菌2 0 - - - 3 0 m i n ，于4 c 保存。 抗生素贮液( 1 0 0 x ) 青链霉素溶液为医用注射粉剂，国产，青霉素8 0 万单位，链霉素0 8 9 溶于8 0 m l lx p b s 中，0 2 p a n 微孔滤膜过滤，l m l 分装，- 2 0 。c 保存，每l o o m l 培养液中 加l m l 储存液。 明胶溶液( o 1 ) 称取明胶0 5 9 ，溶于5 0 0 m lm i l l i p o r e 超纯水中，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 3 0 m i n ，于常温保存。 丝裂霉素( 1 僻) ( o 1 m g m 1 ) 取一个包装( 2 m g ) 的丝裂霉素c 在无菌条件下加入2 0 m ld m e m ，分装l m l 管， 于一2 0 保存，6 周内用完。 1 4 浙江大学硕士研究生毕业论文 免疫组织化学试剂： 多聚甲醛固定液( 4 ) 首先可配制8 多聚甲醛贮存液，将8 9 粉状的多聚甲醛溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，加热 并搅拌，当温度升至5 5 - - 6 0 c 时，加入1 - - - 2 m 的n a 0 h ，直至溶液变清澈透明为止。 凉至室温，用n a 0 h 溶液调节p h 值n 7 4 ，用p h 试纸测，千万不要用p h 计，4 1 2 保存， 临用前将1 0 m l8 多聚甲醛贮存液加入1 0 m l0 2 m o l l 的p b ( p h7 4 ) ，混匀， 配制成4 的多聚甲醛。 3 h ：0 。溶液：3 0 h 2 0 2 以p b s1 0 倍稀释，4 。c 密封避光存放不超过两周 封闭液：5 山羊血清，p b s 配制 0 5 t r i t o nx - 1 0 0 ：取t r i t o nx 1 0 00 5 m l 溶于9 9 5 m l 1x p b s ( p h 7 4 ) 中，混匀后 备用。 w e s t e r n b l o t 试剂 蛋白提取液( 细胞组织裂解液) ：5 0 m mt r i s h c ip h7 4 ，3 0 0 m mn a c i ，5 m m e d t a , 0 1 s d s ，l m mp m s f 浙江大学硕士研究生毕业论文 实验方法： 细胞培养 i c r 小鼠成纤维饲养层细胞的原代培养 下午5 点左右将雌雄i c r 小鼠合笼，次日早晨九点以前观察阴道栓，有阴道 栓者为受孕母鼠，记为0 5 天。 在怀孕1 3 5 天时，准备好蜡盘、剪刀，弯头镊子，培养皿等，引颈处死怀孕 母鼠，浸泡于7 0 的酒精中5 分钟左右，用于表面消毒。 剪开腹部皮毛，取出有胚胎的子宫，加入放有1 0 m l p b s 的培养皿中，清洗后 转移到另外一个培养皿中，换一把剪刀将子宫剪开，将胚胎逐个释放于培养 皿中，并去掉胚胎上的胎盘和胎膜。转移到另一个培养皿中，p b s 清洗。去 掉胚胎的头部及胎肝，p b s 清洗。 吸去p b s ，添加胰酶e d t a ，能润湿即可。逐个剪碎胚胎，越碎越好，成麇 状，再添加3 m l 左右的胰酶溶液。 3 7 。c 消化5 一1 5 分钟，后用枪头吹打之，让组织块尽量分散。 加入m e f 培养液终止消化，并将这些组织块平均接入细胞培养瓶内。一般 2 3 个胚胎可接入一个t 1 5 0 大瓶。放置于3 7 。c 的c 0 2 培养箱中继续培养。 i c r 小鼠成纤维饲养层细胞的传代及冻存 当m e f 生长至9 0 汇合时，即可进行传代或冻存。吸去培养瓶内的培养液， p b s 洗2 遍，然后每瓶加入适量0 0 5 胰酶一0 0 2 e d t a 消化液，培养箱中 孵育l - - - 2 m i n 左右。 镜下观察，一旦细胞变圆，用手拍瓶壁，敲脱细胞。 最后用m e f 培养液中止消化，轻柔吹打，分散成单个细胞。l ：2 或l ：3 传 代。 如果冻存细胞，则吸取细胞悬液，1 5 0 0 转m i n 离心5 r a i n ，倾去上清，加入 冻存液( 3 0 f c s + 1 0 d m s o + 6 0 d m e m ) ，吹散细胞沉淀。l m l 每冻存管 冻存，密度大约为2 3 1 0 7 个管。7 0 。c 过夜，次日转入液氮保存。 i c r 小鼠成纤维饲养层细胞的复苏 取出冻存细胞，3 7 。c 水浴快速融化 1 6 浙江大学硕士研究生毕业论文 吸出细胞悬液，逐滴加入m e f 培养液，边加边振荡，吹匀。1 5 0 0 转m i n ， 离心5 m i n 。 弃上清，加入适量m e f 培养液，以适宜密度接入细胞培养瓶。 饲养层细胞的处理 取1 0 丝裂霉素母液按比例加入m f f 培养液中，处理2 3 h 。 加入适量p b s 洗5 遍，彻底去除丝裂霉素。加入消化液，按传代方法消化细 胞。将细胞密度调整至2 1 0 5 - 4 1 0 5 个c m ? ，接入实现明胶包被的孔板中。 细胞贴壁后，5 天之内都可使用。 小鼠胚胎干细胞的培养 小鼠胚胎干细胞的复苏 取出冻存细胞，3 7 。c 水浴快速融化 吸出细胞悬液，逐滴加入m e f 培养液，边加边振荡，吹匀。1 5 0 0 转m i n ， 离心5 m i n 。 用胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，接入事先准备好的饲养层细胞的孔板中。 每天换液。 小鼠胚胎干细胞的传代 当生长至8 0 左右满时，即可传代。吸去培养液，p b s 洗两边。 加入适量消化液，3 7 孵育2 分钟。 吸管轻轻吹打细胞，并镜检观察细胞分散情况。至单个细胞时，加入胚胎干 细胞完全培养基终止消化。 以适当密度传代e s 细胞。5 c o ：培养箱培养，每天更换胚胎干细胞培养液。 小鼠胚胎干细胞的冻存 1 3 同传代方法。 1 5 0 0 转m i n 离心5 m i n ，弃上清。 加入冻存液( 5 0 f b s + 1 0 d m s o + 4 0 d m e m ) ，吹散细胞，按适宜密度冻 存。 1 7 浙江大学硕士研究生毕业论文 e s 细胞分化 悬浮分化：e s 细胞消化为单细胞后，通过差速帖璧去除m e f ，按5 1 0 5 m l 接 入细菌培养皿，同时撤去l i f 培养于e b 培养液中( 1 非必须氨基酸+ 0 1 m m b m e + 2 m m l - g l u + 8 5 d m e m + 1 2 5 f b s ) 。悬浮培养6 天后将形成的拟胚 体接入2 4 孔板继续培养6 天。 单层分化：将同样去m e f 的e s 细胞按1 * 1 0 4 c m 2 接入孔板，在加入l o pm r a 存在的诱导培养液下( 1 非必须氨基酸+ 0 1 m mb m e + 2 m m l g l u + 9 0 d m e m + 1 0 f b s ) 培养8 天，每天换液。 细胞免疫 e s 细胞的免疫 准备5 1 0 7 _ i * 1 0 8 m e s 细胞( 6 8 个1 0 e m 培养皿) ，p b s 洗涤后，0 i e d t a 消化5 1 0 m i n 。 用l m l 移液器将整个皿吹打一遍后收集细胞悬液，1 5 0 0 转m i n 离心5 m i n 。 弃上清后，p b s 重悬细胞，收集6 8 个皿的细胞悬液，p b s 离心洗涤2 次。 弃上清后，l m l p b s 重悬细胞( e s 细胞总量至少需要5 1 0 7 ) 。 将l m l e s 细胞悬液和l m l 福氏完全佐剂混合后，吸进2 m l 注射器中，用适当 的橡皮管连接到另外一个注射器上，来回推动3 0 m i n 以上混匀，同时使e s 失活。 选取2 5 3 个月大的新西兰大白兔，背部选取十个位点，0 2 m l 点皮内注射。 3 周后每隔两周以步骤2 3 同样方法免疫，由福氏不完全佐剂代替福氏完全佐 剂。 4 次免疫后，耳缘静脉取血l m l ，4 c 静置过夜后1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上 清，得多抗血清。i c c 检测( 方法与后面相同) ，设置不同血清稀释度：1 ： 1 0 0 ，1 ：2 0 0 ，l ：5 0 0 ，l ：2 0 0 0 。根据检测结果判断血清抗体滴度是否达到 融合要求，若达到要求进行加强免疫。 两周之后，取1 1 0 8 e s 细胞量，p b s 悬浮后静置3 0 m i n ，不时摇晃，防止沉 淀。然后直接腹腔注射加强免疫。 1 8 浙江大学硕士研究生毕业论文 单克隆抗体的制备 细胞融合 加强免疫4 天后，取脾，迅速将其放入含p b s 的离心管中，1 h 内用于融合。 在无菌环境下取出脾细胞，离心去上清。 加入5 m l 红细胞裂解液，混匀后静置5 m i n 。 离心去上清，加入5 m l 无血清培养液悬浮，计数。 加入与免疫脾细胞来源相同的永生化h r g t p 的b 细胞2 4 0 e w 2 ，免疫脾细 胞和2 0 4 e w 2 细胞比例为2 ：1 。混匀后，于5 0 m l 离心管中1 0 0 0 r p m 离心 5 m i n ，去上清，尽量将液体吸尽。 加入预热到3 7 的p e g 4 0 0 0l m l ，边加边用枪头轻轻混匀，i m i n 内加完，静 置9 0 s 。然后加入无血清培养液稀释，3 0 s 加l m l ，再3 0 s 加5 m l ，然后l m i n 内加入3 5 m l 培养液，盖好离心管盖子，缓慢上下颠倒混匀一次后，静置l m i n 。 1 5 0 0 r p m5 m i n 离心，去上清，加入1 5 f c s 培养液，混匀。 以1 1 0 4 c m 2 接种到9 6 孔板中，共铺6 0 板块。 7 2 h 后换成h a t 培养液。 5 - 6 天换液一次，1 5 天后，观察克隆生长情况。 杂交瘤的亚克隆 每个亚克隆孔计数。 每个亚克隆孔吹打混匀后，取2 0 0 微升细胞悬液经过3 次稀释后，将细胞密 度调整到3 0 个m 1 ，然后以1 0 0 微升孔铺一块9 6 孔板。 每孔补加t 0 0 微升1 1 0 4 c m 2 的2 4 0 e w 2 细胞作为饲养层细胞。 前期5 - 6 天换液1 次，第2 次换液后3 天换液1 次。 杂交瘤阳性孔筛选( i c c ) 抗原e s 的准备：以每瓶t 7 5m e f 铺2 块9 6 孔板的细胞量铺6 0 块9 6 孔板， 分批接种e s ，接种细胞量在4 , 1 0 6 c m 2 左右，接种后2 天半量换液一次，第3 1 9 浙江大学硕士研究生毕业论文 天待e s 克隆长到适当大小即可取出固定。 固定：用8 道排枪吸出9 6 孔中培养液后，1 5 0 微升孔p b s 洗涤2 次，然后 加入5 0 微升孔多聚甲醛固定，4 c 保存，可在2 3 周内用于i c c 检测。 i c e 检测当天取出固定好e s 的9 6 孔板，吸去p b s ，以5 0 微升孔加入 0 5 t r i t o nx - 1 0 0 ，3 7 孵育3 0 r a i n 。 封闭：吸去t r i t o nx - 1 0 0 后，p b s 洗涤2 次，以5 0 微升孔加入i b s a ，3 7 孵育3 0 r a i n 。 封闭完成后，吸去液体，p b s 洗涤2 次，按孔板顺序对应的加入上清液7 0 - 1 0 0 微升，3 7 孵育l h 。 吸去上清液后，p b s 洗涤2 次，加入荧光标记的山羊抗兔的二抗( 1 ：i 0 0 0 稀释) ，5 0 微升孔，3 7 孵育l h 。 吸去二抗，p b s 洗涤2 次，荧光显微镜下观察克隆阳性情况。 杂交瘤分泌抗体特异性的初步鉴定 细胞免疫荧光细胞株的交叉反应 选用几种不同的细胞系进行i c c 检测，方法同阳性孔检测( i c c ) 选用了j 3 、d 3 、s 8 三株小鼠胚胎干细胞；实验室自建人胚胎干细胞系一株； s n l 、m e f 两种常用于支持e s 细胞生长的成纤维细胞。 e s 分化为e b 后的i c c 鉴定 e s 常规消化后，接入o 1 5 明胶包被过的细胞培养瓶，经过1 5 h 后，轻轻摇 晃后吸取培养液，按5 1 0 5 个m l 密度接入细菌培养皿，悬浮培养6 天，隔天 换液。第7 天时，将拟胚体接入9 6 孔板，一孔一个，贴壁生长4 天后固定检 测。 组织免疫化学成体组织的交叉反应 组织的冰冻切片 将小鼠引颈处死后，立即取其肾、脑、肝、心、小肠和肺这些器官。 浙江大学硕士研究生毕业论文 解剖获得组织后置于3o 蔗糖脱水3 天以上至组织块下沉。 载玻片处理：载玻片先在洗洁液( 或洗衣粉溶液) 中煮沸3 0 r a i n ，清水洗净 后放入清洁液中浸泡1 2 - 2 4 h ，漂洗，用蒸馏水清洗后烘干，然后涂以切片黏 合剂。 取出组织用包埋剂包埋后，- 8 0 c 冷冻5 m i n 以上，然后迅速将其取出置于已 添加包埋剂的固定架上，- 2 0 中平衡2 0 r a i n 以上。 以6 - 8 微米的厚度切片。 切完后，- 8 0 保存，或干燥过夜后，4 c 保存。 切片的免疫组织化学( i h c ) 取出冰冻切片，室温放置3 0 分钟后，入4 c 多聚甲醛中固定1 5 分钟，p b s 洗，5 分钟3 。 用3 过氧化氢孵育5 1 0 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。p b s 洗，5 分钟2 。 5 1 0 正常山羊血清( p b s 稀释) 封闭，室温孵育1 0 分钟。 倾去血清，p b s 洗3 分钟，滴加含不同抗体的杂交瘤上清，3 7 c 孵育1 小 时或4 过夜。p b s 冲洗，5 分钟x3 次。 滴加适当1 ：1 稀释的二抗( i b s a p b s 稀释) ，3 7 c 孵育3 0 分钟。p b s 冲 洗，5 分钟3 次。 加入显色剂显色( d a b ) ，避光，1 0 2 0 m i n ，显色完全即可终止。 自来水充分冲洗。 苏木精复染3 m i n ，盐酸酒精分色2 0 s ，自来水冲洗后封片。 w e s t e r n b l o t 蛋白样本的提取： 细胞蛋白提取： 准备1 1 0 7 的m e s 细胞。 加入细胞裂解液，吹打或用刮板将细胞刮下，冰上静置3 0 m i n 。 离心1 2 ，