（神经生物学专业论文）snapin蛋白在神经系统及内体溶酶体系统的功能研究.pdf

上海交通大学博士学位论文 中文摘要 s n a p i n 蛋白在神经系统及内体溶酶体 系统的功能研究 摘要 神经递质释放是神经元进行信息传递的基础活动，受到机体复杂而又精确的调 节。目前发现s n a r e 复合物是所有膜融合过程所需的核心蛋白复合物，在神经系 统中介导神经递质囊泡在突触前膜的搭靠与融合过程，s n a r e 复合物本身的调节 一直都是突触传递研究中的热点。s n a p i n 蛋自是由酵母双杂筛选出的t - s n a r e 之 一的s n a p 2 5 结合蛋白，它被发现通过与s n a p 2 5 的直接作用调节s n a r e 复合 物和突触囊泡上的钙离子感受器s y n a p t o t a g m i ni 结合，从而影响突触传递的过程。 在以前工作的基础上，我们进一步用磁珠免疫分离和蛋白质相互作用的生化方法鉴 定出：s n a p i n 与s y n a p t o t a g m i n 起位于神经递质囊泡上；它可以和脑内s n a p 一2 5 直接结合，并同s y n a p t o t a g m i ni 共存于同一蛋白复合物中。这些结果更加肯定了 s n a p i n 通过与s y n a p t o t a g m i n 和s n a p 2 5 的直接作用对神经递质释放过程进行调 控。 除神经系统外，s n a p i n 同时在全身各组织中均有表达，提示它具有广泛的生物 学功能。近来s n a p i n 被发现是溶酶体相关颗粒复合物之一，该复合物在溶酶体及 溶酶体相关颗粒的起源生成中起作用。我们利用s n a p i n 基因敲除鼠模型研究了该 蛋白对溶酶体生成和功能上的影响。磁珠免疫分离技术发现s n a p i n 在非神经组织 内位于细胞的内体、溶酶体系统；激光共聚焦显微镜和电镜观察发现，s n a p i n 基因 3 上海交通大学博士学位论文 中文捅要 敲除引起胞内次级内体堆积，且这些次级内体包含着大量未消化的内吞物，这一 现象在外源性表达s n a p i n 基因后得以恢复；荧光生长因子降解检测显示s n a p i n 基 因敲除后，溶酶体不能有效降解内吞的生长因子及其受体；同时蛋白电泳和免疫组 化染色显示在s n a p i n 敲除细胞中，从高尔基体运输的酸性水解酶无法顺利转运到 溶酶体形成有功能的成熟形式。溶酶体必须和内体、高尔基体相互作用以获得维持 生成和功能所需的各种物质，我们的结果显示，s n a p i n 作用在细胞内向溶酶体物质 运输通路，它的缺失使溶酶体不能有效获得各种成分，造成溶酶体生成和功能缺 陷。到目前为止，溶酶体相关颗粒复合物的成员只被报道在黑色素颗粒、血小板凝 集颗粒等溶酶体相关颗粒的形成中发挥作用，s n a p i n 是该复合物中第一个发现能同 时影响溶酶体和溶酶体相关颗粒生成的亚基，证明这两种细胞器在起源上具有相似 性。 关键词：突触传递，神经递质释放，s n a p 2 5 ，s y n a p t o t a g m i n ，溶酶体起 源，内体，高尔基体，溶酶体酸性水解酶 4 上海交通大学博士学位论文 f u n c t i o n a lr o l eo fs n a p i ni n m o d u l a t i n gn e u r o s e c r e t i o na n d l y s o s o m eb i o g e n e s i s a b s t r a c t 英文摘要 s y n a p t i cv e s i c l ed o c k i n ga n df u s i o n a r em e d i a t e db yt h ea s s e m b l yo fas t a b l e s n a r ec o r e c o m p l e x ，w h i c h i n c l u d et h e s y n a p t i c v e s i c l em e m b r a n ep r o t e i n v a m p s y n a p t o b r e i na n dt h ep l a s m am e m b r a n es y n t a x i na n ds n a p - 2 5 s n a p i nw a s s c r e e n e da sas n a p 一2 5b i n d i n gp r o t e i nb yy e a s tt w oh y b r i de x p e r i m e n t i ta s s o c i a t e d w i t ht h es n a r ec o m p l e xt h r o u g hd i r e c ti n t e r a c t i o nw i t hs n a p 一2 5 b i n d i n go f r e c o m b i n a n ts n a p i n c tt os n a p 2 5b l o c k e dt h ea s s o c i a t i o no ft h es n a r ec o m p l e x w i t hs y n a p t o t a g m i ni r e c o m b i n a n ts n a p i n c tr e v e r s i b l yi n h i b i t e dt h i sp r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n ，a n dp a r t i a l l yb l o c ks y n a p t i ct r a n s m i s s i o nw h e ni n t r o d u c e di n t os u p e r i o r c e r v i c a lg a n g l i o nn e u r o n s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h ep o s s i b i l i t yt h a ts n a p i ns e r v e sa sa l i n kb e t w e e nt h e s n a r e sa n d s y n a p t o t a g m i n d u r i n gc a l c i u m d e p e n d e n t n e u r o t r a n s m i t t e rr e l e a s e h e r ew ed e m o n s t r a t e db yt h em a g n e t i cb e a d si m m u n o i s o l a t i o n m e t h o dt h a ts n a p i nw a sl o c a l i z e dw i t hs y a n a p t o t a g m i na n ds y n a p t o p h y s i no ns y n a p t i c v e s i c l e s ；g s t - s n a p i nc a np u l ld o w ns n a p - 2 5f r o mm o u s eb r a i nh o m o g e n a t es u g g e s t i n g t h e i rd i r e c ti n t e r a c t i o ni nv i v o ；a n dc o - - i m m u n o p e r c i p i t a t i o nc a r r i e db ya n t i - - s n a p i n a n t i b o d yr e v e a l e ds n a p i na c t u a l l yc o l o a l i z e dw i t hs y n a p t o t a g m i nii nt h es a m ep r o t e i n c o m p l e x t h e s er e s u l t sf u r t h e ri n d i c a t et h em o d u l a t i o nr o l eo fs n a p i ni ns y n a p t i c t r a n s m i s s i o nb yd i r e c ti n t e r a c t i o nw i t hs y n a p t o t a g m i na n ds n a p 一2 5 u b i q u i t o u se x p r e s s i o no fs n a p i ni n d i c a t e si t sg e n e r a lc e l lb i o l o g yr o l eb e s i d e s r e g u l a t i n gn e u r o t r a n s m i s s i o n r e c e n t l ys n a p i nw a sr e p o r t e da sas u b u n i to fl y s o s o m e - r e l a t e d o r g a n e l l eb i o g e n e s i sc o m p l e x 一1 ( b l o c 1 ) w h i c h a s s o c i a t e s n a p i n w i t l l 5 上海交通大学博士学位论文 英文摘要 e n d o s o m e 1 y s o s o m es y s t e m w ei n v e s t i g a t e di fs n a p i nt a r g e t e dg e n em u t a t i o nh a da n y e f f e c to nl y s o s o m eb i o g e n e s i s w ef o u n ds n a p i nw a se n r i c h e di ne n d o s o m e l y s o s o m e f i a c t i o n a t i o ni m m u n o i s o l a t e db ym a g n e t i cb e a d s ；s n a p i nm u t a t i o n c a u s e dl a t e e n d o s o m e 1 ) r s o s o m ea c c u m u l a t e dw i t hi n n e ri n d i g e s t i v em a t e r i a l ，w h i c hc a n b er e s c u e d b y r e i n t r o d u c t i o no fs n a p i ng e n ei n t om u t a n tc e l l s ；e n d o c y t o s e de g f e g f rc o m p l e xc a n n o tb ee f f i c i e n t l yd e g r a d e di ns n a p i nm u t a n tl y s o s o m e s ，i n s t e a dt h e yw e r er e t a i n e da tl a t e e n d o s o m e l y s o s o m e ；a tt h es a m et i m e ，t r a n s p o r to fp r o t e a s ec a t h e p s i nd f r o mg o l g it o l y s o s o m ew a si m p a i r e dr e s u l t i n gi ni m m a t u r ee n z y m ei np r e e n d o s o m ec o m p a r t m e n t t a k e nt o g e t h e r ，w ep r o p o s es n a p i nf u n c t i o n si ni n t r a c e l l u l a rt r a n s p o r tp r o c e s st a r g e t e dt o l y s o s o m e ，w h i c hi s e s s e n t i a lf o rl y s o s o m eb i o g e n e s i sa n dn o r m a lf u n c t i o n s of a ra l l o t h e rb l o cp r o t e i n sw e r eo n l yr e p o r t e dt or e g u l a t eb i o g e n e s i so fs p e c i f i cl y s o s o m e 。 r e l a t e do r g a n e l l e ss u c ha sm e l a n o s o m e sa n dp l a t e l e t d e n s eg r a n u l e s ，t h ed i s c o v e r yt h a t s n a p i nm u t a t i o nh a sap h e n o t y p ei nl y s o s o m eb i o g e n e s i ss u g g e s t st h e s et w oo r g a n e l l e s s h a r es i m i l a rm o l e c u l a rm e c h a n i s mf o rb i o g e n e s i s k e yw o r d s ：s y n a p t i ct r a n s m i s s i o n ；n e u r o t r a n s m i t t e rr e l e a s e ；s n a p - 2 5 ；s y n a p t o t a g m i n ； l y s o s o m eb i o g e n e s i s ；e n d o s o m e ；g o l g ia p p a r a t u s ；l y s o s o m a lp r o t e a s e 6 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：岳乞 日期：矿7 月p 日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 1 保密团，在互年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：j 转 指导教师签名： 盛祖杭 日期：叼年钐月“日 日期：叼年午月a 弓日 l 。 上海交通大学博士学位论文 第一部分s n a p i n 蛋白对神经递质释放的调节作用 前言 第一部分 神经系统的基本功能是对体内、外各种环境变化作出迅速而完善的适应性调 节，从而维持体内各器官、系统功能的正常进行。体内各系统在神经系统的直接或 间接调节和控制下，相互配合，共同完成统一的整体生理功能。神经元是组成神经 系统的基本单位，神经元间的信息传递是实现神经系统功能的基础。 突触神经元间相互接触的部位，是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是 信息传递的关键部位。当神经冲动通过轴突传导到突触部位时，突触前膜对钙离 子的通透性增加，促使突触小泡与突触前膜紧密融合，使小泡内的递质释放到突 触间隙中，并且经过弥散到达突触后膜，立即与突触后膜上的蛋白质受体结合，并 且改变突触后膜对离子的通透性，引起突触后膜发生兴奋性或抑制性的变化，神经 元就是这样通过突触传递来交流信息。机体运用复杂而精确的机制对突触传递频率 和强度的进行调节，实现如学习、记忆等脑的高级认知活动，以适应和调整体内、 外环境的变化。 神经递质囊泡和突触前膜融合的过程受到精确调控，囊泡被招募( r e c r u i t e d ) 、 搭靠在突触前的活性区后，并不能立即释放，还需有s n a r e 复合物形成和钙离子 升高的信号。s n a r e ( s o l u b l en e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v ea t t a c h m e n tp r o t e i nr e c e p t o r ) 蛋白是一类高度保守的蛋白家族，它们是具有s n a r e 结构域的膜相关蛋白，调控 包括神经递质释放在内细胞内几乎所有膜融合过程。根据分布不同，可分为位于靶 膜上的t s n a r e ，包括s y n t a x i n 和s n a p 2 5 家族，和囊泡膜上的v s n a r e 蛋白 s y n a p t o b r e v i n v a m p s ( v e s i c l ea s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n ) 。它们三者通过l ：1 ：1 的 比例形成具有4 个螺旋的s n a r e 复合物，拉近突触小泡和突触前膜的距离，促使两 者融合释放神经递质( s u t t o nr be ta 1 。1 9 9 8 ) 。 在体外组装的s n a r e 复合物虽可以催化膜融合，但时程却长达几分钟( w e b e r 7 上海交通大学博士学位论文第一部分 te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。而在体内，胞c a 2 + 浓度升高可触发神经递质释放在数毫秒内完 成。这说明，钙离子感受器及其它调节蛋白一起和s n a r e 复合物协同作用，才能 使神经递质迅速释放。s y n a p t o t a g m i ni 是位于突触囊泡上的钙离子结合蛋白，它的 含量约占囊泡蛋白总量的7 0 。由于同时具有和s n a r e 复合物及膜脂质层结合的 特性，s y n a p t o t a g m i ni 被认为是介导突触囊泡和突触前膜融合的钙离子感受器。 s y n a p t o b r e v i n 基因敲除后，神经囊泡自发性和刺激诱发的胞吐都减少( s c h o c h se ta 1 ，2 0 0 1 ) ，推测在基因敲除后，v a m p 2 的功能会部分被同源体蛋白c e l l u b r e v i n 代偿；s n a p 一2 5 基因敲除后则几乎不能观察到钙触发的快速囊泡释放( w a s h b o u m e pe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在突触前神经元注射s y n a p t o t a g m i ni r 断，可使突触后兴奋性电压 显著下降( b o m m e r tk e ta 1 ，1 9 9 3 ) ；s y n a p t o t a g m i ni 点突变使刺激诱发的突触囊泡胞 吐下降两倍，重新转入正常的s y n a p t o t a g m i ni 片断则可恢复这一缺陷( f e r n a n d e z - c h a c o nre ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这些实验证据显示，s y n a p t o t a g m i ni 和s n a r e 复合物对介导 神经递质释放有着至关重要的作用；但另一方面，s y n a p t o t a g m i ni 如何把钙信号和 s n a r e 复合物的形成联系起来在很长时间内都不太清楚。 s n a p i n 蛋白是由盛祖杭博士实验室用酵母双杂交的方法鉴定出的s n a p 2 5 结合 蛋白， 体外蛋白结合实验表明s n a p i n 可以通过和s n a p 2 5 直接结合而与脑内 s n a r e 复合物作用，外源加入重组s n a p i n 蛋白可以增力i s y n a p t o t a g m i ni 和s n a r e 复 合物的结合，且这一作用在s n a p i n 经p k a 磷酸化后得以加强( i l a r d ie ta 1 ，1 9 9 9 ； c h h e d ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。s n a p i n 的c 末端经结构预测可形成蛋白相互作用的c o i l c o i l 结构 域，外源性s n a p i n c t 可以抑制它与s n a p 2 5 间的结合，把该片断注射到颈上神经 元可部分阻断突触传递。这些结果都表明，s n a p i n 可能作为s n a r e 复合物与 s y n a p t o t a g i n1 2 _ 间联系的桥梁，在神经递质释放过程中起调节作用。 近来，s n a p i n 被报道和细胞内钙通道r y a n o d i n er e c e p t o r ( r y r ) 相互作用，并调 节s n a p i n 与s n a p 一2 5 间结合。r y r 是广泛分布在神经元和骨骼肌、心肌细胞内质 网上的选择性钙离子通道，它在骨骼肌和心肌细胞兴奋时释放储存在内质网( 肌浆 网) 内的钙库，以供肌肉收缩需要。同时它在大脑皮质，海马，小脑，下丘脑和脊 髓等神经元内表达。在多种神经突触前末梢内，由钙引发的经r y r 通道的钙内流 ( c a 2 + _ i n d u c e dc a 2 + r e l e a s e ，c i c r ) 造成细胞内约一半程度的钙离子浓度升高( n a r i t ak 8 上海交通大学博士学位论文第一部分 e ta 1 ，1 9 9 8 & 2 0 0 1 ) ；在小脑篮状细胞里，由r y r 介导的胞内钙流( c a 2 + s p a r k s ) 和 由动作电位开启的突触前钙离子通道引发的钙内流强度相似，被认为可诱发不依赖 电活动的神经递质自发性释放( c o n t ire ta 1 ，2 0 0 4 ) 。而使r y r 开启的钙信号则源 自多种突触前受体偶联的钙通道，如尼古丁受体和代谢型谷氨酸受体( b r a i nk e ta 1 ， 2 0 01 ；s h a r m aa n dv i j a y a r a g h a v a i l ，2 0 0 3 ) 。 以r y rc 末端为饵的酵母双杂交筛选出s n a p i n 是r y r 通道的结合蛋白，免疫 共沉淀和p u l ld o w n 实验证明r y r 位于胞内c 末端疏水区可以和s n a p i nc 末端相 结合，这一区域同时也是s n a p i n 与s n a p 2 5 的结合位点；竞争结合实验表明 s n a p 2 5 和r y r 通道可以竞争性结合s n a p i n ，这是新发现的一个调节s n a p i n 与 s n a r e 蛋白相互作用的分子。z i s s i m o p o u l o se ta l 提出，在静息状态下，s n a p i n 与 r y r 通道的相互作用可影响神经元内c a 2 + s p a r k s 的幅度和频率，调节递质自发释 放；在电刺激下，经突触前钙通道进入的钙信号可激活r y e 通道，引发内质网释 放胞内钙库，更加促进神经递质释放( z i s s i m o p o u l o sse ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 为了进一步了解s n a p i n 调节神经递质释放的具体机制，我们试图回答：s n a p i n 在神经元内是否位于突触囊泡上；s n a p i n 是否可以直接和脑内s n a p 2 5 结合，是否 可以和s y n a p t o t a g m i ni 直接作用? 我们运用磁珠免疫分离法在小鼠脑匀浆内纯化了 神经递质囊泡，发现s n a p i n 是位于囊泡膜上的膜相关蛋白之一；同时蛋白质相互作 用的生化实验显示g s t s n a p i n 可以直接和脑内的s n a p 2 5 结合，s n a p i n 乘l s y n a p t o t a g m i ni 共存在同一蛋白复合物中。这些结果更加肯定s n a p i n 在神经系统内 对s n a r e 复合物和s y n a p t o t a m i ni 的结合状态的调节作用。 材料和方法 一利用免疫磁珠分离神经递质囊泡 材料： 免疫磁珠d y n a b e a d sm 5 0 0s u b c e l l u l a r ( d y n a l # 15 0 1 ) 9 上海交通大学博士学位论文 第一部分 联接二抗羊抗兔免疫球蛋白、羊抗大鼠免疫球蛋白 ( j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c hl a b o r a t o r i e s ) 特异性一抗 a n t i e e a1 抗体( a b c a m # a b 2 9 0 0 1o o ) a n t i c a l n e x i n 抗体( s t r e s s g e n 群s p a 一8 6 0 ) a n t i c y t o c h r o m ec ( b dp h a r m a c y # 5 5 6 4 3 2 ) a n t i s y n a p o p h y s i n 单抗( c h e m i c o n # m a b5 2 58 ) a n t i s y n a p o t a g m i n 单抗( g i f tf r o mj a p a n e s eg r o u p # 1 d 1 2 ) a n t i - p115 ( b dt r a n s d u c t i o nl a b612 2 6 0 ) a n t i v a m p 2 ( g i f tf r o mj a p a n e s eg r o u p ) 蛋白电泳胶( n u p a g e n o v e x4 1 2 b i s t r i sg e l si n v i t r o g e n ) 蛋白分子量标准( s e eb l u ep r e s t a i n e di n v i t r o g e n l c5 6 2 5 ) 蛋白抗氧化剂( n u p a g ea n t i o x i d a n ti n v i t r o g e n # n p 0 0 0 5 ) 蛋白上样缓冲液( n u p a g el d ss a m p l eb u f f e ri n v i t r o g e n 胡q p 0 0 0 7 ) b c a 蛋白定量反应试剂盒( p i e r c e # 2 3 2 2 8 ) 硝化纤维膜( s c h l e i c h e r & s c h u e l l p r o t r a nn i t r o c e l l u l o s et r a n s f e ra n d i m m o b i l i z a t i o nm e m b r a n e 徉n b a0 8 3g p o r es i z e0 2 u m ) 显影胶片( h y p e r f i l me c l a m e r s h a m 群r p n2 1 0 3 k ) 显影剂( e c ld e t e c t i o nk i ta m e r s h a m 群r p n2 1 0 6v 1 ) 溶液配方： o 1 mb o r a t eb u f f e rp h9 5 粉状b o r a t ea c i d ( m w6 1 8 3 ) 0 6 2 9 溶于8 0 m l 水里，用n a o h 调至p h9 5 ， 定容至1 0 0 m l 。 b u f f e r a p b sp h7 4 、2 m me d t a 、5 胎牛血清。 脑匀浆液 0 3 2 ms u c r o s e 、1 0 m m h e p e s 、l m me d t a ，p h 7 4 上海交通大学博士学位论文 第一部分 蛋白质电泳m e s r u n n i n gb u f f e r ( 2 0 x ) 5 0 m mm e s 、5 0 m mt r i sb a s e 、0 1 s d s 、l m me d t a ，p h7 3a 蛋白质电泳t r a n s f e r b u f f e r ( 2 0 x ) 2 5 m mb i c i n e 、2 5 m mb i s t r i s ( f r e eb a s e ) 、l m me d t a ，p h 7 2 用水和甲醇稀释成1 xb u f f e r ，甲醇终浓度2 0 。 步骤： 免疫磁珠分离的基本原理是将磁珠偶联上特异的抗体，这些抗体能识别某 些细胞器上特意的标志性蛋白，通过把包被好抗体的磁珠和组织匀浆或细胞裂 解液孵育，即可将特定的细胞器分离出来。由于这种分离技术是利用特异性的 抗原抗体反应，而且是通过磁场吸附回收磁珠，避免了传统的离心步骤。因 此，免疫磁珠分离技术具有特异，灵敏且组织损失少的优势。 一) 包被抗体： 1 ) 磁珠和二抗偶联 将成品磁珠置于v o r t e x 上彻底打散； 吸取一定量磁珠( 1 m l 一4 x 1 08 m 1 ) ，置于磁场内两分钟，待磁珠吸附好后，吸 去原有的缓冲液； 重悬在l m lp b s ，打散，置磁场内两分钟后吸去p b s ； 重悬在l m lo 1 mb o r a t eb u f f e rp h9 5 ，并加入1 3 0 u l 二抗i g g ( 8 u g 1 07b e a d s ) ， 置于3 7 。c 温箱旋转过夜； 和二抗孵育结束后，置于磁场中，吸去多余的缓冲液，重悬于0 1 ( w v ) b s a 的p b s ，4 0 c 旋转5 分钟，洗两次； 重悬在l m l 有0 1 ( w v ) b s a 的0 2m t r i sp h8 5 ，室温旋转过夜； 上海交通大学博士学位论文 第一部分 再在0 1 ( w v ) b s a 的p b s 里洗一次。此时二抗已和磁珠偶联好，且t r i s 、 b s a 可封闭磁珠表面剩余的活性基团，减少非特异性的吸附。偶联好的磁珠可 放置在0 1 ( w v ) b s a 的p b s 里存放一到两周。 1 磁珠和特异性的一抗偶联 吸取一定量偶联好二抗的磁珠( 5 0 u l 每个反应) ，在o 1 ( w v ) b s a 的p b s 里洗 两次。加入适量一抗0 u g 每个反应) ，重悬于0 1 ( w v ) b s a 的p b s 至终体积 2 5 0 u l ，4 0 c 旋转过夜； 置磁场两分钟后吸去多余液体，在0 1 ( w v ) b s a 的p b s 里4 。c 旋转5 分 钟，重复洗四次。此时磁珠已包被好一抗，可以用于分离细胞器。 二) 脑组织匀浆 取野生型c 5 6 b l 6 成年雄性小鼠一只，经c 0 2 麻醉后断头，尽快取双侧大脑皮 质，浸在脑匀浆液里； 尽快匀浆，避免产热匀浆管需一直置冰上。待脑组织彻底碾碎后，上下缓慢移 动匀浆管十次既可； 4 。c 离心，1 0 0 0 9 ，1 0 分钟，取上清即为去核后上清( p o s tn u c l e a rs u p e m a t a n t p n s ) ； b c a 方法蛋白定量： 制定已知浓度的蛋白标准曲线，如：0 、2 、5 、7 5 、l o 、1 5 、2 0 ( m g r r d ) ， 取未知浓度的脑匀浆液样品l u l 。把每个标准品和样品同时稀释到l m la + b 反 应液中( a ：b = l ：5 0 ) ，放3 7 0 c 水浴箱1 5 分钟。在分光光度计5 6 2 n m 波长读取吸 光值，根据标准曲线计算样品浓度。 三) 磁珠和脑匀浆孵育 1 2 上海交通大学博士学位论文 第一部分 将包被好一抗的磁珠中用l m lb u f f e ra 重悬，并加入已知浓度的脑匀浆( 5 0 u g 每 个反应) ，置4 0 c 旋转过夜或至少- - + 时； 孵育后的磁珠置于磁场内两分钟，吸去多余液体，重悬在i m lb u f f e ra 中，4 0 c 旋转1 5 分钟，重复洗5 至8 次； 最后在0 1 ( w v ) b s a 的p b s 里洗一次； 置磁场内两分钟后吸净多余液体，加入聚丙烯酰胺凝胶电泳l o a d i n gb u f f e r ， 3 0 u l 每个反应； 四) 聚丙烯酰胺凝胶电泳、w e a t e mb l o t 分析分离的神经囊泡 将加入电泳l o a d i n gb u f f e r 的磁珠样品置7 0 。c 热变性蛋白，1 0 分钟；此时和磁 珠免疫结合的神经囊泡在l o a d i n gb u f f e r 中的蛋白变性剂作用和加热条件下与磁 珠分离开来； 离心1 3 ，0 0 0 r p m ，1 分钟； 取上清上样电泳，约3 0 u l 每孔，注意避免吸入管底的磁珠；上样结束后，往电 泳槽内注满r u n n i n gb u f f e r ，并在内槽加入5 0 0 u l 蛋白抗氧化剂以维持蛋白样品的 解聚状态： 室温1 5 0 v 电泳约一个小时； 转膜 撬开塑料夹层取出跑好的电泳胶，切掉上下两端没有蛋白条带多余的胶( 以可 见的蛋白分子量m a r k e r 为界；在托盘内注满t r a n s f e rb u f f e r ，摊开转膜专用的塑 料支架浸在b u f f e r 里，依次在支架的黑色端上放置海绵、滤纸。小心在滤纸上 摊平切好的胶，覆盖上等大小的硝化纤维膜，赶气泡，再加盖滤纸和海绵。所 有操作均在液面下进行，以避免气泡夹杂在胶和滤纸之间阻碍蛋白转移。合上 支架，固定好后按正负极对应放入电转槽； 5 7 v4 0 c 转移两小时或4 5 v4 0 c 转移过夜； 转膜结束后，打开支架取出硝化纤维膜，可见转到膜上蓝色的分子量m a r k e r 说 明转膜成功； 13 上海交通大学博士学位论文 第一部分 把膜浸在t b s t 中洗一遍，t b s t 溶解1 0 干奶粉封闭室温- - d , 时，并置于摇床 上； t b s t 稀释适量一抗室温杂交一小时( 按每个抗体的推荐工作浓度) ； 在t b s t 洗三次，每次十分钟； 根据一抗的种属来源用t b s t 稀释相应的二抗室温杂交一小时； 在t b s t 洗三次，每次十分钟； e c l 显影试剂显影 等量混合显影试剂1 和2 ，混匀后加到膜上，室温放置一分钟。注意显影液量要 足够盖住整张膜，不要让膜干在空气中干以免增加背景。把显影液沥干，用透 明塑料保鲜膜包裹； 暗室内曝光显影。 = g s t 融合蛋白p u l l d o w n 实验 材料： g s t 融合蛋白表达载体p g e x 4 t 一2 ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e ) g s tb e a d s ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e ) 野生型c 5 6 b l 6 成年雄性小鼠 电动匀浆器 溶液配方： t b s t p i s ( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r s ) 1 xt b s 、0 1 t r i t o nx 一1 0 0 、p m s f 、a p r o t i n i n 、l e u p e p t i n 为避免蛋白水解酶的活性，溶液应一直置冰上。 步骤： 取适量g s tb e a d s ( 3 0 u l 每反应) 在t b s t p i s 里洗三遍； 1 4 上海交通大学博士学位论文第一部分 用t b s t p i s 重悬至终体积3 0 0 u l ，并加入约2 u g 的g s t s n a p i n 融 合蛋白或g s t 对照，4 0 c 旋转三小时； 此时g s t 蛋白已和b e a d s 结合。吸去多余的液体，在t b s t p i s 里 洗三遍： 脑匀浆并经b c a 蛋白定量( 详见前述) ； 用t b s t p i s 重悬至终体积5 0 0 u l ，加入脑匀浆蛋白4 0 0 u g ，4 。c 旋 转过夜或至少三小时； 将反映结束的b e a d s 在t b s t p i s 里洗三遍，和b e a d s 结合的蛋白 溶解在蛋白电泳缓冲液里经电泳、w e s t e mb l o t 分析。 三交联加强的免疫共沉淀反应 材料： 步骤： 交联剂d t p ，d t s s p ( p i e r c e ) 终止剂0 2mt r i s p r o t e i na b e a d s ( g eh e a t t h c a r e ) 脑匀浆 新鲜制备成年小鼠脑匀浆； 在匀浆内加入交联剂d s p 、d t s s p 至终浓度2 0 0 u m ，4 0 c 旋转1 5 分 钟； 在匀浆内加入终浓度为4 0 m m 的t r i s 缓冲液以终止交联反应，4 。c 旋 转1 5 分钟； 加入终浓度为l 的t r i t o nx - 1 0 0 ，4 0 c 旋转3 0 分钟； 离心1 3 ，0 0 0 r p m ，3 0 分钟，4 。c ； 取上清即为交联好的脑匀浆，经b c a 蛋白定量即可用于免疫共沉淀 反应； 1 5 上海交通大学博士学位论文第一部分 取3 0 u l 每反应的p r o t e i nab e a d s ，在t b s t p i s 里洗三遍； 用t b s t p i s 重悬至终体积5 0 0 u l ，并加入2 u g 的a n t i s n a p i n 抗体或兔 i g g 对照，4 。c 旋转三小时；此时抗体即与b e a d s 相结合。 将b e a d s 在t b s t p i s 里洗三遍；用t b s t p i s 重悬至终体积5 0 0 u l ， 加入交联好的脑匀浆蛋白总量约4 0 0 u g ，4 。c 旋转过夜； 将b e a d s 在t b s t p i s 里洗三遍； 加入上样缓冲液每管约3 0 u l ，经蛋白电泳、w e s t e r nb l o t 分析被抗体 沉淀的蛋白复合物； 上海交通大学博士学位论文 结果 第一部分 一s n a p i n 位于神经递质囊泡上 由于现有的抗体无法用于免疫组化染色，s n a p i n 亚细胞定位的不能直接依靠 免疫荧光观测；而外源性过表达( o v e r e x p r e s s i o n ) 常导致蛋白质分类、运输的细胞 器过于饱和，致使转染g f p s n a p i n 也不能完全准确反映细胞内的状况。把富含 有神经递质囊泡的突触小体( s y n a p t o s o m e ) 结构经高速离心分离出胞浆和囊泡膜组 分，s n a p i n 只在囊泡膜组分中检测出，而不存在于胞浆里，提示s n a p i n 应该是囊 泡膜相关蛋白之一( i l a r d ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在这里，我们用偶联了神经递质囊泡标志 性蛋白s y n a p t o p h y s i n 、s y n a p t o t a g m i ni 抗体的磁珠，在小鼠脑匀浆里根据免疫结 合分离纯化神经递质囊泡，检测s n a p i n 是否存在于被纯化的囊泡组分中。磁珠分 离的结果显示：s n a p i n 和s y n a p t o p h y s i n 、v a m p 2 这些递质囊泡标志性蛋白一起 可在被磁珠分离的组分中检测出；同时其他细胞器的标志性蛋白，如：线粒体 蛋白c y t o c h r o m ec ，高尔基体蛋白p 1 1 5 均不能在该组分中检测出。说明被磁珠 分离的的确是成分较纯的神经递质囊泡，而没有其他细胞器的污染，s n a p i n 的确 是位于神经递质囊泡上的膜相关蛋白( m e m b r a n e a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 。 二s n a p i n 和脑内s n a p 2 5 蛋白间的直接作用 s n a p i n 最初是以神经突触前膜上t s n a r e 的之一的s n a p 2 5 为饵，用酵母双 杂交的方法筛选出的s n a p 2 5 结合蛋白。之后运用体外蛋白结合实验( i nv i t r o b i n d i n g ) h 正明了体外重组的s n a p i n c 末端和g s t s n a p 2 5 可以相互结合( i l a r d ij m e ta l 1 9 9 9 ) ，且这一结合在s n a p i n 经蛋白激酶p k a 磷酸化后加强。但体内的情况 尚待研究。在这里我们运用g s t s n a p i n 和小鼠脑匀浆蛋白孵育的p u l ld o w n 实验 显示s n a p i n 可以和脑组织中的s n a p 2 5 相互结合。s n a p i n