（细胞生物学专业论文）aspp在猕猴胚胎干细胞诱导神经分化过程中的表达变化分析.pdf

摘要 摘要 a s p p 蛋白家族由a s p p l 、a s p p 2 和i a s p p 组成，该蛋白家族存进化卜保 守，其中最保守的是i a s p p ，作为p 5 3 的抑制因子它在线虫体细胞中也有同源物。 a s p p l 和a s p p 2 的功能与i a s p p 恰好相反，是p 5 3 的激活因子。a s p p 蛋白家 族主要通过调节p 5 3 来调节细胞凋亡，同时也调节p 5 3 蛋白家族另外两个成员， 即p 6 3 和p 7 3 。最近发现p 6 3 和p 7 3 在神经系统发育过程过程中发挥着重要作用， 且a s p p 2 缺失小鼠神经系统发育也存在异常。 为检测在灵长类神经系统发育过程中a s p p 家族是否有变化，本研究用体外 诱导猕猴胚胎干细胞( r h e s u se m b r y o n i cs t e mc e l l s ，r e s c s ) 向神经元分化的方法 模拟中枢神经系统早期发育的过程，在此基础上检测a s p p 家族i 个成员在神经 细胞分化过程中的表达变化情况。同时，为了更高效快速地诱导分化r e s t s 向 神经前体细胞分化，我们改良了单层贴壁诱导分化的方法。 研究结果表明改良后的单层贴壁诱导方法能够成功诱导出较高l i f t 0 的神经 前体细胞，满足模拟神经细胞分化过程的要求。在此基础上，检测到a s p p 蛋白 家族的成员在此过程中都有变化，a s p p l 和a s p p 2 在蛋白表达量上的变化和 i a s p p 在蛋白质翻译后修饰上变化尤为明显。这说明a s p p 蛋自家族随着神经细 胞分化而被诱导发生了改变，也表明a s p p 家族在中枢神经系统发育过程中扮演 着重要的角色，为进一步研究其在神经系统发育中的作用奠定了基础。 关键词：a s p p 蛋白家族a s p p la s p p 2i a s p p 猕猴h , h f if i 细胞神经d ，j 体细 胞分化 摘要 a b s t r ac t t h ea s p pp r o t e i n sa r ea ne v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e df a m i l yt h a tc o n s i s t so ft h r e e m e m b e r s ，a s p p1 ，a s p p 2a n di a s p et h em o s tc o n s e r v e do n ei si a s pp w h i c hi sa n i m p o r t a n ti n h i b i t o ro fp 5 3i ng e r mc e l l so fc e l e g a n s a s p pia n da s p p 2h a v e o p p o s i t ea c t i v i t i e st oi a s p pa n df u n c t i o na sa c t i v a t o r so fp 5 3 t h em o s tw e l ls t u d i e d f u n c t i o no ft h ea s p pf a m i l yi st h e i ra b i l i t yt or e g u l a t ea p o p t o s i st h r o u g hr e g u l a t i o no f p 5 3 ，a n dt h ep 5 3f a m i l ym e m b e r sp 6 3a n dp 7 3 r e c e n t l yp 6 3a n dp 7 3w e r er e p o r t e d t op l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h en e u r a ld e v e l o p m e n ts y s t e m m e a n w h i l e ，i tw a sr e p o r t e d t h a ta s p p 2d e f i c i e n tm i c es u f f e rf r o md e v e l o p m e n t a ld e f e c t si nc n s t ot e s tw h e t h e rt h ea s p pf a m i l yw o u l dc h a n g ed u r i n gt h ep r i m a t en e u r a l d i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n t ，t h i ss t u d yd e t e c t st h ee x p r e s s i o no fa s p pf a m i l yi n t h ep r o c e s so fn e u r a ld i f f e r e n t i a t i o nf r o mr h e s u se m b r y o n i cs t e mc e l l s w ei n d u c e d r h e s u se m b r y o n i cs t e mc e l l s ( r e s c s ) t od i f f e r e n t i a t ei n t on e u r o nt om i m i ct h ep a t t e r n o ft h ed e v e l o p m e n to fc n s i na d d i t i o n ，t h em e t h o do fi n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o nw i t h a d h e r e n tm o n o c u l t u r ei si m p r o v e dt ob ef a s t e ra n dm o r ee f f e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w nh e r ed e m o n s t r a t e dt h a tt h ei m p r o v e dm e t h o dc a nh a r v e s t e n o u g hn e u r a lp r o g e n i t o r sd i f f e r e n t i a t e df r o mt h er e s c st oe s t a b l i s hn e u r a l d i f f e r e n t i a t i o nm o d e l b a s e do nt h i sp l a t f o r m ，w ef i n d t h a tn e u r a ld i f f e r e n t i a t i o n i n d u c e c h a n g e si ne x p r e s s i o nl e v e l so fa s p p 1a n da s p p 2w h e r e a so n l yp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n so fi a s p et h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h em e m b e r so f a s p pf a m i l ya r ei n d u c e dt oc h a n g ed u r i n gt h ep r o c e s so fn e u r a ld i f f e r e n t i a t i o na n d t h e ym a yp l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e si nt h ep r i m a t en e u r a ld e v e l o p m e n ts y s t e m a l l t h e s ec o u l dp r o v i d eo p t i o n sf o rt h en e x ts t u d yo fa s p pi nn e u r a ld e v e l o p m e n t s y s t e m 摘爱 k e yw o r d s ：t h ea s p pf a m i l y ，a s p p l ，a s p p 2 ，i a s p p , r h e s u se m b r y o n i cs t e mc e l l s ， n e u r a lp r o g e n i t o r s ，d i f f e r e n t i a t i o n 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名： 签字同期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权捌有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开口保密( 年) 作者签名： 签字同期： 导师签名： 签字同期： 第一审绪论 1 1 引言 第一章绪论 近年来生物发育领域的研究发展迅速，尤其是几种哺乳动物的胚胎干细胞 体外建系的成功以及体外诱导分化为不同的功能细胞的实验方法的不断完善， 已经将该领域的很多探索引领到了体外实验体系中来，为发育生物学的发展提 供了更方便，更快捷的途径。 同时，生物发育领域的研究越来越多的和肿瘤发生交叉，很多最初在肿瘤 调控方面发现有重要作用的因子或者机制，后来发现在发育过程中也起者非常 重要的作用。加之前不久肿瘤干细胞存在的证实，为这两个领域关联性的探索 提供了更广阔的研究日仃景。 本论文f 是为进一步研究肿瘤调控蛋白a s p p 家族在胚胎神经发育过 程中的作用做前期准备工作。 1 2a s p p 肿瘤调控蛋白家族结构与功能的研究进展 细胞凋亡是生物体发育、维持生长和防止肿瘤发生过程中非常重要的机制。 目前的研究结果将细胞凋亡途径主要分为两种，即内途径和外途径。外途径主 要是指通过某些细胞外因子，如t n f c t ，c d 9 5 l 等，与相应的细胞表面受体结合， 直接或间接地激活c a s p a s e 8 或c a s p a s e l 0 ，从而丌启下游一系列的凋亡程序。而 内途径主要是指在某些外因或内因导致细胞内部发生一些不利于细胞生存的变 化时，比如d n a 损伤，核甘酸异常或者过氧化损伤等，细胞将通过一系列通路 开启内途径凋亡以防止细胞癌变的发生，参与其中的包括b a x 、b a k 、b c l 2 蛋白家族以及a r a f 和c a s p a s e 9 。 l 第一章绪论 作为最早也是最为深入被研究的肿瘤调控因子p 5 3 在以上两种细胞凋亡途 径中发挥着重要作用。目前研究发现，它可以通过调节c d 9 5 、b a x 、b c l 2 ( m i h a r a e ta 1 2 0 0 3 ) 等的转录从而调节细胞凋亡，防止受损细胞癌变损伤机体。相反，一 旦p 5 3 发生突变，其表达或者功能发生异常，细胞就很容易失去凋亡的自我调 节功能，走向癌变。然而，也并非所有的癌症都与p 5 3 的突变有关，而且随着 对细胞凋亡和肿瘤发生研究的深入，人们发现许多与p 5 3 协同调控细胞凋亡和 肿瘤发生的因子，在癌症发生和抑制过程也发挥着重要作用，a s p p 蛋白家族就 是其中一员。 a s p p 蛋白家族的成员和功能是英国牛津大学卢欣教授实验室在2 0 0 1 年发 现并证实的。该蛋白家族是p 5 3 、p 6 3 和p 7 3 在细胞凋亡途径中的特异的调节因 子( s a m u e l s l e ve ta 1 2 0 01 ；b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ；b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 4 ) ，成 员主要包括a s p p l 、a s p p 2 和i a s p p ，前两者是促进凋亡，而后者是抑制凋亡 的，三者通过这种相向的功能调节着细胞凋亡。已经证实在几种癌细胞中a s p p l 和a s p p 2 的表达量与讵常细胞的相比有显著下降，可见该家族成员在肿瘤发生 过程中的确发挥作用。 a s p p 蛋白家族的功能结构域在进化上是高度保守的，尤其是i a s p p ，线虫 中的i a s p p 同源物和人体中的i a s p p 在体内的功能都是抑制p 5 3 促凋亡的功能。 同时，在a s p p 家族的三个成员之间也存在高度保守区域，即三者的c 未端的 三个结构域a n k r y i nr e p e a t s ，s h 3 和p r o l i n e r i c hr e g i o n ，这三个结构域都是和各 自配体结合的保守区域，而氨基酸序列上的保守性只存在a s p p i 和a s p p 2 中。 1 2 1a s p p 蛋白家族的发现和证实 a s p p 蛋白家族的发现和证实经历了一段漫长的历史，其中最先被鉴定的是 a s p p 2 。1 9 9 4 年k u n i y o s h i1 w a b u c h i 用段截去n 术端的小鼠野生型p 5 3 片断 2 第一章绪论 作为“诱饵”通过酵母双杂交的方法在b 细胞c d n a 文库中筛出了两段p 5 3 结 合蛋白，并命名为5 3 b p l 和5 3 b p 2 ( p 5 3 b i n d i n gp r o t e i n1 a n d2 ) ( 1 w a b u c h ie ta 1 1 9 9 4 ) 。与其他p 5 3 的结合蛋白相比，这两个新的结合蛋白只与野生型p 5 3 的d n a 结合区域发生作用，一旦p 5 3 发生突变则不会与5 3 b p l 和5 3 b p 2 结合( j o e r g e r e t a 1 2 0 0 5 ) 。后来证明，其中5 3 b p 2 ( 5 2 8 个氨基酸残基) 就是a s p p 2 的c 术端， 而5 3 b p l 被证实与a s p p 家族没有关系，它只是在d n a 修复中发挥着重要的作 用。而后，用同样的方法证实5 3 b p 2 与b c l 2 也存在相互作用，而此时用b c l 2 的n 端1 8 8 个氨基酸作为“诱饵”筛出来的是比5 3 b p 2 在n 端多出一段的蛋白， 它被命名为b b p ( b c l 2 一b i n d i n gp r o t e i n ) ( 10 0 5 个氨基酸残基) ( n a u m o v s k ia n d c l e a r y1 9 9 6 ) 。同时，5 3 b p 2 被证明通过其a n k r y i nr e p e a t s 和s h 3 两个结构域与 p p l ( p r o t e i np h o s p h a t a s e1 ) 结合并相互作用，而且其作用比5 3 b p 2 与p 5 3 之问的 相互作用强( h e l p se ta 1 1 9 9 5 ) 。而后的研究又发现5 3 b p 2 b b p 的很多配体，包括 r e l a p 6 5 ( n f l ( b 的第三亚基) ( y a n g e ta 1 19 9 9 ) 、a p c l ( a d e n o m a t o u sp o l y p o s i s c o l i l i k e ) ( n a k a g a w ae ta 1 2 0 0 0 ) 、a p p b p1 ( a m y l o i d d p r e c u r s o rp r o t e i n b i n d i n g p r o t e i n1 ) ( c h e ne ta 1 2 0 0 3 ) 、y a p1 ( y e s a s s o c i a t e dp r o t e i n l ) ( e s p a n e la n ds u d o l 2 0 0 1 ) 和丙型肝炎核心抗原( c a oe ta 1 2 0 0 4 ) ，而且这些配体都是与5 3 b p 2 的 a n k r y i nr e p e a t s 和s h 3 两个结构域结合。直到人们发现该蛋门的伞长序列。即 a s p p 2 ，它由1 1 2 8 个氨基酸残基构成，c 端与5 3 b p 2 和b b p 相同，但在n 端 多出一段结构域，并且发现其增强p 5 3 促转录和促凋亡的能力比5 3 b p 2 和b b p 要强。 而第一次关于a s p p l 的报道要晚一些，1 9 9 8 年，一个a s p p l 的n 木端缺 失片断，被称为k i a a 0 7 7 1 ( 共9 4 8 个氨基酸残基) 被发现，其c 术端与5 3 b p 2 高度同源( n a g a s ee ta 1 1 9 9 8 ) 。而后进一步的研究获得了a s p p i 的全长蛋白，共 1 0 9 1 个氨基酸残基，其功能与a s p p 2 相近，同样是促进p 5 3 的凋亡功能，而且 3 第一章绪论 也比5 3 b p 2 的作用强。 至于i a s p p ，最初报道的是一段3 5 1 个氨基酸残基的蛋白i a s p p r a i ，它能 够抑制r e l a p 6 5 的转录活性( y a n ge ta 1 1 9 9 9 ) ，这是i a s p p 的c 米端片段，随 后研究得到了i a s p p 的全长蛋白( 8 2 8 个氨基酸残基) ，而且线虫中有一段i a s p p 的同源蛋白，由7 6 9 个氨基酸残基构成( b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) ，这也说明该蛋 白在进化上是保守的。i a s p p 的功能与a s p p l 和a s p p 2 相反，主要是抑制p 5 3 的促凋亡功能，从而促进细胞存活。 1 2 2a s p p 的表达及功能 人类的a s p p 家族成员是由分布在三条不同染色体上的基因所编码，它们分 别是a s p p l 在1 4 q 3 2 3 3 ，a s p p 2 在l q 4 2 i ，i a s p p 在1 9 q 1 3 3 2 。a s p p i 和a s p p 2 除了c 末端有很高的同源性，两者的n 末端也有很高的同源性，而i a s p p 与丽 两者却仅有c 未端是有同源性的( t r i g i a n t ea n dl u2 0 0 6 ) 。 a s p p 蛋白家族成员在人类的许多组织都有不同量的表达，比如骨骼肌是高 表达的，心脏和脑是低表达的( n a g a s e e ta 1 1 9 9 9 ) 。在进一步探究a s p p 家族体内 表达调控的实验中，人们发现转录因子e 2 f 调控a s p p l 和a s p p 2 的表达( c h e ne t a 1 2 0 0 3 ；f o g a le ta 1 2 0 0 5 ) ，而且e 2 f 家族不同成员结合a s p p 家族蛋白的特异性 也不一样。这一点又将a s p p l 和a s p p 2 、p 5 3 和e 2 f 1 介导的凋亡途径联系到了 一起。 在5 3 b p 2 发现后两年，也就是1 9 9 6 年，5 3 b p 2 和p 5 3 d n a 结合区的混合物 的晶体结构被公布出来，这样a s p p 2 与p 5 3 的结合区域也被揭示t ( g o r i n aa n d p a v l e t i c h1 9 9 6 ) 。s a m u e l s 等人在5 年后证明了a s p p 2 与p 5 3 之i 日j 的结合特异地 促进p 5 3 的促凋亡功能，但a s p p i 和a s p p 2 不影响p 5 3 的细胞周期停滞功能 ( s a m u e l s l e ve ta 1 2 0 0 1 ) 。后续的研究又证明a s p p l 和a s p p 2 也可以与p 5 3 家 第一章绪论 族另外两个成员，即p 6 3 和p 7 3 结合并且有促进功能。a s p p l 依i a a 0 7 7 l 和 a s p p 2 5 3 b p 2 的促p 5 3 凋亡功能不如相应的全长蛋白有效( s a m u e l s l e ve ta 1 2 0 0 1 ) ，说明其n 端的对蛋白功能的行使非常重要，但是a s p p l 和a s p p 2 的n 端具体功能如今还不是很清楚。 a s p p 2 不同的短片段可能会与它全长的生物学功能不同，而且某些特定的 组织中有5 3 b p 2 样片段表达，但体内检测到的绝大部分该蛋白的表达方式都是 全长韵a s p p l 和a s p p 2 ( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 4 ) 。不管体内何时何处表达a s p p 2 的不同片段，目前的研究结果表明仅仅和p 5 3 结合并不能充分地实现a s p p i 和 ； a s p p 2 促p 5 3 凋亡功能。 关于a s p p t 和a s p p 2 提高p 5 3 促凋亡功能的机制方面，有。种机制是 a s p p l 和a s p p 2 可以选择性地促进p 5 3 、p 6 3 和p 7 3 结合一一些蛋白特异启动子 区域，例如蛋白b a x ，p i g 3 ( t 9 5 3 i n d u c e dg e n e 3 ) $ dp u m a 。染色体沉淀( c h i p ) 分析奏明a s p p l 和a s p p 2 选择性地提高体内p 5 3 结合b a x 和p i g 3 启动子d n a 危列的能力，但没有提商结盒，c d k n l a 的能力。而县a s p p i 和a s p p 2 的共表 达可以选择性地促进p 邓结合b a x 和p i g 3 的启动子而不包括c d k n la 、m d m 2 。 和c c n g i 启动子，提高其异常表达的转录活i 生( s a m u e l s l e ve ta 1 2 0 0 1 ) 。有趣 的是，共表达a s p p l 和举p p 2 可以提高p 7 3 结合p u m a 启动子上从而促进其 转录活性，而不会影响p 5 3 ，在该处的活。 生( b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 4 ) 。选择件提高 该启动子活性的机制尚不清楚，但c h i p 结果表明在p 5 3 结合并促进日的皋园 r b a x ，的过程中，a s p p l 和a s p p 2 处在同一作用复合物中( s 锄u e l s l e ve ta 1 2 0 0 1 ) 。 由己知的目的基因确认的p 5 3 结合区域可以分为两类：低亲和性区域和高 亲和性区域。像b a x 的启动子就是低亲和性区域，它会与p 5 3 的非常规应答元 件结合，而c d k n l a 和m d m 2 的启动子是高亲和性区域，它与p 5 3 的常规应 气 第一章绪论 答元件结合。如果a s p p i 和a s p p 2 正是结合在b a x 启动子这样的p 5 3 的d n a 结合区域上( g o r i n aa n dp a v l e t i c h1 9 9 6 ) ，那么可以推断a s p p l 和a s p p 2 在某种 程度上提高了p 5 3 与低亲和性区域的结合能力? 当然，a s p p i 和a s p p 2 也可以 通过其他途径影响凋亡。 在线粒体中有p 5 3 表达，而且线粒体中p 5 3 与b c l 2 、b c l x l 和b a k 相 互作用( m i h a r ae ta 1 2 0 0 3 ；l e ue ta 1 2 0 0 4 ；p a r ke ta i 2 0 0 5 ) 也可以通过直接在线 + 粒体外与b a x 相互作用来调节其功能。而前不久o k a m o t o 小组报道a s p p 2 和 5 3 b p 2 在h e k 2 9 3 细胞中过表达时，蛋白都定位在线粒体上，同时他们可蛆在 不需要p 5 3 介导的情况下促进h e k 2 9 3 凋亡( k o b a y a s h ie ta 1 2 0 0 5 ) 。尽管内源 a s p p 2 是定位在细胞孱之内，但其毒位车线粒体上还没耷被证实。n n , - t ，j a s p p 2 和b c l 22 _ f 日j 相互作用是否影响芦5 3 的功能也很重要， - j 前推测b c l 2 通过与 a s p p 2 结合从而抑制a s p p 2 与p 5 3 结合而阻止其调节凋芒的功能。 与a s p p l 和a s p p 2 不同，i a s p p 在体内或体外是特异的凋亡抑制因子。人 类的1i a s p p 和i a s p p r a i 在抑制凋亡的效率上基本_ 致。有趣的是，i a s p p 的 。 ， 。 ： c 木端a n k y f i nr e p e a t 区域包含段细胞核定位序歹l j 。目自订为止检测到的a s p p ：v ， i “ 家族蛋白都是分命在细胞质q b ( s l e ee ta 1 2 0 0 4 ) ，而p 5 3 、p 6 3 和p 7 3 主要分布在 细胞核中，所以a s p p 中调节细胞定位的信号必定在a s p p 调节凋亡的功能中发 挥着重要作用。 。 i a s p p 的表达可以选择性地抑制p 5 3 结合b a x 和p i g 3 的启动子促进凋， 。 、 j 的功能，但不会抑制m d m 2 和c d k n l a 的相应功能( b e 唱a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) 。 这种选择性上的特异性与a s p p l 和a s p p 2 一致，这稀致性推断a s p p 家族蛋 白是通过同一相对方式来调节p 5 3 的功能。当人体细胞内i a s p p 高表达时，它 可以取代a s p p 2 而与p 5 3 结合( b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) ，从而抑制化学药物如 c i s p l a f i n 诱导的凋亡。但在线虫中只有i a s p p ，a s p p l 和a s p p 2 是不存在的， 6 第一帝绪论 如果将i a s p p 删除，便会诱发p 5 3 介导的凋亡，这说明i a s p p 是p 5 3 的主要抑 制因子，a s p p l 和a s p p 2 是通过删除i a s p p 来促进凋亡的。无论a s p p l 、a s p p 2 和i a s p p 是如何调节p 5 3 活性的，i a s p p 抗凋亡的功能是肯定的，而且这种功 能在进化是保守的。 1 2 3a s p p 蛋白家族的进化 因为p 5 3 的功能进化上保守，所以p 5 3 紧密相关的蛋白也很可能有相同进 化历史( s u t c l i f f ea n db r e h m2 0 0 4 ) 。通过同源性比较和检索，人们发现a s p p 样蛋 白存在于含有p 5 3 直系同源蛋白的所有组织中。 通过比较直系同源蛋白，人们发现这些a s p p 样蛋白在c 木端具有很强的 同源性，而且哺乳动物中有一群独特的a s p p 基因家族可能是哺乳动物独有的。 在低等有机体中，虽然有可能有多种剪接体，但只有单独个基刚，女l i 线虫中 只有i a s p p 同源蛋白。当线虫中的i a s p p 同源蛋白被删除，其体细胞凋亡的程 度和紫外线或y 射线诱导的凋亡是一样的( b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) 。有趣的是， 线虫中p 5 3 的直系同源蛋白只诱发d n a 损伤导致的细胞凋亡，而且在缺少p 5 3 的线虫中，i a s p p 的删除对体细胞没有影响。由此可见，线虫i a s p p 也是p 5 3 促凋亡功能的一种抑制因子。而通过r n a 抑制技术降低i a s p p 表达也可诱导 p 5 3 调节的两种野生型人体肿瘤细胞的凋亡，他们是天然表达p 5 3 的，个是乳 腺癌细胞系m c f 7 ，另一个是骨肉瘤细胞系u 2 0 s 。所以线虫的i a s p p 与人类的 i a s p p 在功能上是相似的( t r i g i a n t ea n dl u2 0 0 6 ) 。 尽管i a s p p 的保守性已被证实，但低等生物中只有i a s p p 的同源物，也就 是说，p 5 3 介导的凋亡途径的抑制因子起源比增强因子早。鉴于目静实验数据有 限，对此现象有两种假说，都与p 5 3 有关。 第一种假况是与p 5 3 的天然性质有关，p 5 3 的n 段在低等动物如线虫，果蝇 7 第一帝绪论 和哺乳动物之间有差异( m a i e re ta 1 2 0 0 4 ) ，低等动物中的p 5 3 只有促进细胞损伤 导致的凋亡，没有促进p 2 1 同源蛋白表达从而导致细胞周期停滞的功能，而哺 乳动物中的p 5 3 则同时调节着细胞凋亡和细胞周期停滞的功能。可以推测在进 化过程中，为了整合以上两个途径，从而通过细胞停滞和修复来减少可能恢复 的细胞的凋亡，a s p p l 和a s p p 2 逐渐产生来调节p 5 3 新增的功能，使凋亡达到 平衡。这种进化很可能发生在节肢动物向脊椎动物进化的过程中，因为脊椎动 物可以通过此途径保护细胞自我更新能力和延长寿命( t r i g i a n t ea n dl u2 0 0 6 ) 。 第二种假说是与p 5 3 的多样性有关。脊椎动物p 5 3 家族有三个成员：p 5 3 、 p 6 3 和p 7 3 。尽管它们有相同的d n a 结合区域，但三者有多种剪接片段而且行 使着不同的功能。而且p 5 3 主要是与细胞凋亡和癌症有关，p 6 3 和p 7 3 在发育过 程中发挥着重要作用。像a s p p 家族一样，p 5 3 家族在线虫和果蝇中也只有一个 成员。目自行的研究结果表明a s p p 和p 5 3 结合可以调节凋亡，所以推测a s p p 的 进化与p 5 3 的进化是平行的( t r i g i a n t ea n dl u2 0 0 6 ) 。 1 2 4a s p p 蛋白家族与癌症 a s p p l 和a s p p 2 促进凋亡，i a s p p 抑制凋亡，而且a s p p 蛋白家族在进化 上也是高度保守，可以推之其在肿瘤发生和癌症产生过程中发挥着非常重要的 作用。 ， 在人类癌细胞中，a s p p 是通过c 术端的a n l ( y r i n r e p e a t s 和s h 3 结构域与p 5 3 的d n a 结合区结合( g o r i n aa n dp a v l e t i c h1 9 9 6 ) ，而p 5 3 上1 7 8 h i s 、18 1 a r g 、2 4 3 m e t 和2 4 7 a r g 这几个和a s p p 结合至关重要的氨基酸都发生了突变。同时，p 5 3 中 还有两个非常重要的氨基酸2 4 8 a r g 和2 7 3 a r g 也发生了突变，这两个氨基酸是 p 5 3 结合d n a 和a s p p 2 的位点。 p 5 3 的1 8 1 a r g 的突变在人子宫颈癌和乳腺癌被检测出，更重要的是 r 第市绪论 a r 9 1 8 1 l y s 和a r g l 8 1 l e u 在p 5 3 突变系中是诱导细胞周期停滞的标志。当p 5 3 发 生突变，a s p p i 和a s p p 2 无法促进p 5 3 的凋亡功匕( s a m u e i s l e v e ta 1 2 0 0 1 ) ，可 见a s p p l 和a s p p 2 在肿瘤抑制中扮演着重要的角色。 一系列的实验进一步证明以上的观点。在大鼠胚胎纤维原细胞中，a s p p l 和a s p p 2 的表达可以抑制致癌基因r a s 和e 1 a 的转化。同时，肿瘤细胞系m c f 7 和u 2 0 s 中a s p p1 和a s p p 2 高表达( s a m u e l s l e ve ta 1 2 0 01 ) 。a s p p1 和a s p p 2 的表达可以诱导p 5 3 表达缺失细胞系s a o s 一2 和h 1 2 9 9n 1 2 ( b e r g a m a s c h ie t a 1 2 0 0 4 ) 。通过检测1 l 株不同类型来源的肿瘤细胞系，m o r i 等人发现a s p p 2 的 m r n a 水平完全与紫外线和x 射线导致的导致的细胞毒性对细胞敏感性影响商 接相关( m o r ie ta 1 2 0 0 0 ) 。当h e k 2 9 3 被阿霉素诱导凋亡时，其中a s p p 2 及其相 关的a s p p 2 不同剪接体都会高表达。与a s p p l 和a s p p 2 彳、= 同，i a s p p 可以提 高大鼠胚胎纤维原细胞中r a s 和e 1 a 的转化从而抑制p 5 3 的凋亡功能。所以， 从功能上看，i a s p p 可以算是一个致癌基因。在u 2 0 s 等肿瘤细胞系中，i a s p p 的高表达抑制了c i s p l a t i n 诱导的细胞凋亡( b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) 。如果通过 r n a 干扰束减少i a s p p 在肿瘤细胞中的表达，细胞的凋亡会增加。 分析人体肿瘤样本也得到相同的结果，即a s p p 蛋白家族在肿瘤发生过程中 发挥重要作用。比较乳腺癌细胞中相应的正常细胞和肿瘤细胞发现，在表达野 生型p 5 3 的样本中，有6 0 的样本中a s p p l 和a s p p 2 的表达下调，在突变型 p 5 3 的样本中，只有2 0 的样本a s p p l 和a s p p 2 的表达下调。在以上样本中 a s p p l 和a s p p 2 没有发生变化的个体中，i a s p p 的表达有所增力n ( s a m u e l s l e ve t a 1 2 0 01 ；b e r g a m a s c h ie ta 1 2 0 0 3 ) 。在人肺癌细胞系中a s p p 2 在m r n a 上有所 下降，在问皮瘤细胞中a s p p l 下调。同时，a s p p l 和a s p p 2 在几种白血病和急 性淋巴瘤中的表达都有下调 人们发现沉默a s p p i 和a s p p 2 的一种机制是甲基化( l i ue ta 1 2 0 0 5 ；a g i r r e o 第一章绪论 e ta 1 2 0 0 6 ) 。如a s p p l 的启动子甲基化与许多淋巴瘤的发生有关。 a s p p 与p 5 3 相互作用的知识已经被应用到医学治疗上了。人们发现一段源 自a s p p 2 的九肽段和被称为c b p 3 的蛋白在稳定p 5 3 和恢复突变p 5 3 d n a 结合 能力上有重要作用。同样，i s s a e v a 等人通过小分子r i t a 与i a s p p 相互作用从 而增强p 5 3 介导的细胞凋亡( t r i g i a n t ea n dl u2 0 0 6 ) 。如果能发现提高a s p p l 和 a s p p 2 的活性而抑制i a s p p 活性的分子，那么将对癌症治疗领域有很人帮助。 1 3 灵长类胚胎干细胞向神经前体细胞分化的研究进展 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e s c s ) 是来源于早期囊胚内细胞团，且具有 多潜能性的一种干细胞，这类细胞能够分化为组成身体的所有细胞类型。1 9 8 1 年e v a n s 和k a u f m a n 首次建立了小鼠e s 细胞后，猕猴( t h o m s o ne ta 1 1 9 9 5 ) 、绒 猴( t h o m s o ne ta 1 1 9 9 6 ) 幂d 人( t h o m s o ne ta 1 1 9 9 8 ) 的e s c s 也相继被t h o m s o n 等 人成功地分离且建立了细胞系。e s c s 具有巨大的潜在科研价值和应用的景，一 直是生物学家热衷的研究领域。如今体外长期培养e s c s 并保持其刁分化状念和 正常二倍体核型的技术已经很成熟，而且最近美国和同本的科学家相继成功的 将人类的皮肤细胞转化为千细胞，即多能性干细胞( i p s ) ( y ue ta 1 2 0 0 7 ) ，( h y u ne t a 1 2 0 0 7 ) ，可以说再一次掀起了干细胞研究的热潮。 目前，e s c s 研究的_ 个热点集中在通过体外诱导分化柬模拟生物体内个体 发育过程，从而进一步研究生物发育，衰老和疾病等不同状念下的细胞分子机 制和机理。其中，研究的比较多的则是体外定向诱导分化e s c s 为神经日，j 体细胞、 胶质细胞、神经元等，通过这方面的体外研究可以揭示神经系统发育的机制， 并为神经系统退行性疾病( 如帕会森氏病) 的细胞替代治疗提供大量的供体细 胞。非灵长类的e s c s 较之其它物种的e s c s 不管从细胞性质还是细胞结构都更 1 0 第一章绪论 与人类的接近，而且其来源比人类e s c s 更容易，所以使用非灵长类的e s c s 作 为模型去研究e s c s 的机制与功能是目前比较好的选择之一。 1 3 1e s c s 的基本定义及特征 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e s c s ) 指从早期胚胎囊胚内细胞 ( i n n e r c e l lm a s s ，i c m ) 分离出来的多能性干细胞。 e s c s 具有两个基本特征：自我更新( s e l f - r e n e w a l ) $ 1 ：l 多潜能性( p l u r i p o t e n c y ) 。 1 3 2e s c s 向神经细胞定向分化的诱导方法 目前，体外定向诱导e s c s 向神经细胞分化的方法大体上可以分为三种： 一是拟胚体( e m b r y o i db o d i e s ，e b ) 法。该方法主要是通过将e s c s 分离出维持 干细胞特性因子的环境，在悬浮或悬滴培养的条件下，由e s c s 自发形成包含互 个胚层细胞类型的e b ，然后将其接种到带有特定选择性因子培养液的环境中使 神经细胞增殖( c a r p e n t e re ta 1 2 0 0 1 ；z h a n ge ta 1 2 0 0 1 ；k u oe ta 1 2 0 0 3 ；l ie ta 1 2 0 0 5 a ) 。这种方法虽是使用比较广泛的一种，但它是建立在e s c s 自发分化的 基础上，由e s c s 形成的e b 包含有三个胚层的细胞类型，神经类细胞往往只是 其中的一部分，夹杂在许多其他细胞类型中，这样纯度不一，而且产生的神经 类细胞成熟程度也不一致。这些都不利于满足移植治疗的需要。 二是与具有特殊诱导能力的细胞共培养或者使用特殊的条件培养基诱导。 该方法是将e s c s 与具有特殊诱导能力的基质细胞( 如p a 6 ) 共培养( k a w a s a k ie t a 1 2 0 0 0 ；z e n ge ta 1 2 0 0 4 ) ，这些细胞不仅能诱导e s c s 分化，还能维持分化细胞 的存活。或者用肝细胞条件培养基诱导猕猴和人e s c s 分化为神经系统细胞 ( c a l h o u ne ta 1 2 0 0 3 ；s c h u l ze ta 1 2 0 0 3 ) ，但这种条件培养摹成分不确定。该类方 法虽然能够产生大量的成熟细胞，但由于诱导分化的基质细胞的机制不清楚， 第一章绪论 而分化产物很容易受到不明成分污染，这对进一步研究不利。 三是使用特定的因子诱导直接贴附在细胞外基质上的e s c s 促使其定向分 化，又称单层贴壁诱导分化法。这种方法采用非条件培养基，非血清培养基， 排除培养基中不明成分的影响和污染。比如使用含有n 2 ，b 2 7 的d m e m f 1 2 培 养基诱导单层的人类e s c s ( y i n ge ta 1 2 0 0 3 b ；g e r r a r de ta 1 2 0 0 5 ；s h i ne t a 1 2 0 0 6 ) 。这种方法分化出来的细胞没有收到外源成分的污染，细胞纯度比较高， 可以用作临床治疗和科学研究。 1 3 3 几种典型的神经分化细胞类型 神经前体细胞( n e u r a lp r o g e n i t o rc e l l s ) ：一般来说，使用相差显微镜观察在体 外条件下诱导的细胞集落，出现玫瑰花环说明该区域的细胞已经形成早期的神 经前体细胞( l ie ta 1 2 0 0 5 a ) 。早期神经6 订体细胞足神经上皮样细胞，具有自我更 新能力的细胞，并且有一定的多潜能。眭( x i ea n dc h i