（细胞生物学专业论文）过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输.pdf

兰大硕士论文 过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 摘要 过氧化氢作为一种信号分子在植物体内许多过程中发挥着重要的作用。在多种 逆境胁迫下，植物体内都会有积累过氧化氢的现象，但对于过氧化氢介导的抗逆境 胁迫分子机制还不是很清楚。近几年研究发现，细胞内存在胞问连丝介导的转运大 分子物质的通路，许多胞内转录因子能通过胞间连丝进入邻近细胞发挥作用，植物病 毒也能利用或挟持这种通道进行传播。但胞间连丝介导的细胞非自主性运输通路的 精细机制还是不甚明了。而且越来越多的证据表明细胞内存在多种运输通路，每种 细胞非自主性因子可以通过一种或多种通路来完成自己的转运，阐明这些运输通路 的机制任重道远。 本实验通过对p s u c 2 - g f p 转基因拟南芥幼苗进行过氧化氢胁迫处理，发现其根 中荧光分布范围有了明显的变化，并且r t p c r 的实验表明许多与胞内运输有关的基 因和定位于胞间连丝的蛋白表达量发生了显著性地变化。现己发现许多内源因子能 够帮助植物病毒进行胞内运输和胞间运输，以烟草花叶病毒的运动蛋白肝做为诱 饵，已经鉴定出几种内源性因子，如p m e 、m p b 2 c 等。利用b i f c 技术对内源因子p m e 、 m p b 2 c 等与细胞非自主性转运因子之间相互作用进行研究，结果显示m p 与p m e 和 e b l a 之间存在相互作用，而且k n a t 与e b l a 之间也有相互作用。从而证明e b l a 和p m e 是细胞非自主性运输通路的组分，e b l a 能调节k n a t 的运输，并且m p 能 够利用本己存在的运输通路进行细胞间的移动。 关键词：胞间连丝 过氧化氢胁迫细胞非自主性运输双色荧光补偿 4 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞问连丝介导的物质运输 a b s t r a c t h y d r o g e np e r o x i d ei so n eo fk e yp l a y e r si nt h er e g u l a t i o no fp l a n td e v e l o p m e n t ， s t r e s sr e p o n s e s ，a n dp r o g r a m m e dc e l ld e a t h r e c e n t l y ，i ti ss e e na sas e c o n dm e s s e n g e ri n t h ep r o g r e s so fp l a n tf g h t i n ga g a i n s ta b i o t i ca n db i o t i cs t r e s s ，b u tt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fh y d r o g e np e r o x i d em e d i a t e ds t r e s sr e s i t e n c ei su n c l e a r i nr e c e n ty e a r so f s t u d y ，t h e r ei s e v d i e n c e s h o w i n gt h a t ap l a s m o d e s m a t am e d i a t e dm a c r o m o l e c u l a r t r a n s p o r tp a t h w a ye x s i t si nt h ep l a n tc e l l s o m et r a n s c r i p t i o nf a c t o r sc a l lm o v et h r o u g h t h i sw a yt o 删a c e n tc e l la n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n t i na d d i t i o n , m a n y p l a n tv i r u e sc a nt a k ea d v a n t a g eo ft h i sp a t h w a yt oa c h i e v et h eg o a lo fi n f e c t i n gt h ep l a n t u n f o r t u n a t e l y , t h ep e c i s em e c h s i mo ft h i sp a t h w a yi ss t i l lu n k n o w n m o r e o v e r ，m o r ea n d m o r ee x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tt h e r ei sn o to n l yo n ep a t h w a yb u ts v e r a lo n e se x s i t i n gi n t h ep l a n tc e l l a l lt h e s ea b o v es u g g e s tt h a tw ea r ef a rw a yf r o me l u c i d a t i n gt h i sp r e c i s e m a c r o m o l e c u l a rt r a n s p o r tp a t h w a y i no u re x p e r i m e n t s ，w eu s et h ep s u c 2 - g f pt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i st h a l i a n aa sa t o o lt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fh y d r o g e np e r o x i d es t r e s so nt h er a n g eo ft h eg f pd i f f u s i o n i nt h er o o t a st h er e s u l ts h o w i n g ，h y d r o g e np e r o x i d es t r e s sc a nc o n s t r i c tt h ed i f f u s i o no f g f pc o m p a r e dv v i 廿lt h ec o n t r o lo fp s u c 2 一g f ps i b l i n g s t h er e s u l to fr t - p c ra l s o d e m o n s t r a t e st h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fg e n e si n v o l v e di nt h ei n t r a c e l l u l a la n d i n t e r c e l l u l a rm o v e m e n th a v ec h a n g e dr e m a r k a b l y t ：m vm pi st h eb e s tc h a r a c t e r i z e d n o n - c e l l a u t o n o m o u sp r o t e i na n dt h e r ea l em a n ye x p e r i m e n t ss h o w i n gt h a ts o m eh o s t f a c t o r sc a ni n t e r a c tw i t ht h em pt of a c i l i t a t et h ei n t r a c e l l u l a ra n di n t e r c e l l u l a rm o v e m e n t w h e t h e rt h eh o s tf a c t o ra r es t i l lh e l p f u li nt h ee n d o g e n o u sp r o t e i n sn o nc e l la u t o n o m o u s t r a n s p o r ti su n k n o w n w eu s eb i f ct e c h n o l o g yi nt h ea g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s i e n t e x p r e s s i o ns y s t e mt ot e s tt h ep o s s i b i l i t yo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s a n dt h e s eh o s tf a c t o r s s o m eu s e f u lr e s u l t sh a v e b e e no b t a i n e df r o mt h eb i f c e x p e r i m e n t sa n dt h en o n c e l l a u t o n o m o u st r a n s c r i p f i o nf a c t o r s c a l la l s oi n t e r a c t 、) l ，i t | l s o m eh o s tf a c t o r st h a th a sb e e ni d e n t i f i e dt oa s s o c i a t e dw i t ht m vm p k e y w o r d s ：p l a s m o d e s m a t ah y d r o g e np e r o x i d es t r e s s n o n c e l l - a u t o n o m o u sm o v e m e n t b i f c 5 t m v r c n m v c m v c a l c u v 旷 t g p 口b 2 c n c a p p l p m 匣 e b l a c r t p f 愀 p d l p r g p 2 p d c b c n 匹p 1 6 p p l 2 g f p k n l k n a t s t m s h r l f y c p c d e f g l 0 ab b r e v l 气t i o n s t o b a c c om o s a i cv i r u sm o v e m e n tp r o t e i n 烟草花叶病毒 r e dc l o v e rn e c r o t i cm o s a i cv i r u s红叶坏死花叶病毒 c u c u m b e rm o s a i cv i r u s黄瓜花叶病毒 c a b b a g el e a f c u r lv i r u s 甘蓝叶卷曲病毒 m o v e m e n tp r o t e i n 运动蛋白 t r i p l eg e n eb l o c kp r o t e i n 三基因框蛋白 m _ m o v e m e n tp r o t e i nb i n d i n g2 c 运动蛋白结合2 c n o n - c e l l a u t o n o m o u sp r o t e i nl 细胞非自主性蛋白 p e c t i nm e t h y l e s t e r a s e s果胶甲基酯酶 ( m i c r o t u b l e ) e n db i n g i i l gl a 微管末端结合l a c a l r e t i c u l i n钙网蛋白 p l a s m o d e s m a l - a s s o c i a t e dp r o t e i nk i n a s e胞间连丝相关的蛋白激酶 p l a s m o d e s m a t a - l o c a t e dp r o t e i n胞间连丝定位蛋白 r e v e r s i b l yg l y c o s y l a t e dp o l y p e p t i d e s2 蛋白可逆糖基化多肽2 p l a m a o d e s m a t ac a l l o s eb i n d i n gp r o t e i n 胞问连丝胼胝质结合蛋白 c u c u r b i t am o s c h a t ap h l o e mp r o t e i n l 6 南瓜韧皮部蛋白1 6 p h l o e mp r o t e i n1 2 韧皮部蛋白1 2 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 k n o t t e d l k n o t r e d1 1 i k eh o m e o b o xp r o t e i n s h o o t 哐r i s t e 几e s s s h o r t r o o t l e a f y c a p r i c e d e f i c i e n s g i ，o b o s a 3 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进 行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成 果、数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外， 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盘边碴 日期： 也：皇：丕z 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权 归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的 规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和 电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复 制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或 与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州 大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：盔咝导师签名：期：i 峭 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 1 胞间连丝的结构 第一部分前言 1 8 0 5 年，b e r n h a r d i 提出一个非常超前的假说，他认为在植物细胞之间应该存在一 些通道来行使胞间的通讯联络，这个假说为后来发现细胞间通讯通道一胞间连丝提供 了理论依据。然而在这个假说之后，由于当时的实验条件和人们认识水平的限制， 有关细胞间通讯的描述和研究一直停滞不前，作为胞间信息分子运输通道的胞间连 丝的发现和研究更无从谈起。直到时隔6 4 年后的1 8 7 9 年，人们才第一次发现这种运输 通道，植物生理学家e t a n g ! 在利用碘对植物组织切片进行染色的方法时，发现柿子 胚乳细胞的细胞壁上有很多细的细胞质丝，以后实验证明这些质丝就是后来称为的 胞间连丝。1 9 0 1 年，s t r a s b u r g e r 将这种细胞质丝命名为胞间连丝。经过长达一个世纪 的研究分析，越来越多的实验证明作为植物超细胞结构的胞间连丝通过连接相邻的 细胞的内膜系统，把一个个独立的细胞转变成相互连接的共质体，为植物体的物质运 输和信息传递提供了一个直接的从细胞到细胞的细胞质通道( g u n n i n ga n dr o b a r d s 1 9 7 6 ，r o b a r d sa n dl u c a s1 9 9 0 ，l u c a se ta 1 1 9 9 3 ，v a nb e la n dv a nk e s t e r e n1 9 9 9 ) 。 不仅水分、养分、小的信号物质能通过胞间连丝运输，大分子物质如植物病毒，细 胞内源的转录因子和非蛋白信号分子如m r n a ，d 、r n a 等也能通过胞间连丝行使和 完成其功能( o p a r k ，1 9 9 3 ；e p e l ，1 9 9 4 ；l u c a s1 9 9 5 ，1 9 9 9 ；m e z i t ta n dl u c a s ，1 9 9 6 ； g h o s h r o ye t a l ，1 9 9 7 ；j a c k s o na n dh a k e ，1 9 9 7 ；m c l e a ne l a l ，1 9 9 7 ；d i n g ，1 9 9 8 ；k r a g l e r e ta l ，19 9 8 a ；c r a w f o r da n dz a m b r y s k i ，19 9 9 ；d i n ge ta l ，19 9 9 ；e h l e r sa n dv a nb e l ，19 9 9 ； p i c k a r da n db e a c h y ，19 9 9 ；v a nd e rs c h o o ta n dr i n n e ，19 9 2 ；a n g e l ls m ，19 9 6 ) 。 一直以来，胞间连丝被认为是没有选择性的，被动运输的孔道，相邻细胞的物 质和信号分子能通过胞间连丝进行自由的双向扩散。随着研究的不断深入，这种胞 间连丝的静态定义受到越来越多的挑战，许多研究表明胞间连丝是一种门控细胞器 ( s c h u l ze la l ，1 9 9 9 ) ，它能动态的调节物质和信号的运输。并且有证据表明胞间连 丝的组分和调控在不同的组织和细胞中有所不同。 许多学者通过对不同高等植物胞间连丝的研究，已经积累了大量的关于胞间连 丝结构方面的信息，提出了诸多胞间连丝结构模型。d i n g ( d i n ge la l ，1 9 9 2 ) 利用冰 6 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 冻蚀刻技术和加强的电脑处理图片技术研究了双子叶植物烟草的胞间连丝结构，并 提出了相关模型，该模型认为胞间连丝的连丝微管和细胞膜之间存在大量的蛋白颗 粒，这些蛋白分别镶嵌在细胞质膜的内小叶和连丝微管的外小叶，在这些小叶上的 球状蛋白之间有丝状辐条状蛋白连接。位于细胞膜和连丝微管上的电子致密物质呈 螺旋排列，此种结构在物质运输的过程中起到了分子筛的作用，限制了胞间连丝运 输孔径的大小。 b o t h a ( b o t h ae ta l ，1 9 9 3 ) 通过相似的技术手段研究了k r a n z 叶肉维管束鞘细 胞的胞间连丝结构，基于电镜照片结果提出了相应的胞间连丝结构模式图。该模式 图与d i n g 的结构模式图大体相同，但仍有一些显著地不同之处。最大的差别在于连 丝微管有空腔，空腔的的直径距离与2 5 n m ，而且在连丝微管的中央棒状颗粒蛋白 区与连丝微管的膜之间存在着线性连接。以前认为连丝微管是一种压缩的内质网， 中间不存在腔室。如今某些植物的连丝微管有空腔的结构形式的存在对这种共识提 出了质疑，连丝微管很有可能在物质的运输过程中单独的发挥作用，具体机制还需 要进一步的研究阐明。 另外一些工作者( b a d e l te ta l ，1 9 9 4 ；o v e r a l la n db l a c k m a n ，1 9 9 6 ) 研究发现在 胞间连丝颈环的外周或者内部存在着类似括约肌的结构，据称这种结构能对胞间连 丝的通透性产生影响。然而这种推论仅仅是从结构上推测其功能，并且括约肌并不 是普遍存在于胞间连丝的一种结构，所以对于它是否参与到胞间连丝通透性的调节 还需要进一步的评估。 细胞质融合通道又称为细胞质通道或原生质体通道。g a t e s ( g a t e s ，1 9 0 8 ) 发 现月见草小孢子母细胞之间有些精细的细胞质丝，随后他( g a t e s ，1 9 1 1 ) 提出这种细 胞质的连接本质上可能代表着细胞间物质交换的通道，并把通过这种通道发生的核 物质胞间转移的现象称作细胞质融合。1 9 7 5 年郑国铝在电子显微镜下观察到百合花 粉母细胞间不仅有染色质而且还有细胞质通过胞间通道转移到相邻细胞( 郑国铝等， 1 9 7 5 ) ，在烟草和菠菜共培养和百合小孢子母细胞减数第一次分裂早期都有胞质通道 的形成。胞质通道是在相邻两细胞壁上贯穿的通道，它们的直径宽度很大，大约 2 0 0 n m - 1 5 0 0 n m ，是一类很宽的胞间通道，比胞间连丝的直径大十几倍。 7 兰大硕士论文 过氧化氢胁迫下胞闻连丝介导的物质运输 2 胞间连丝的分类 尽管胞问连丝将植物连成一个统一的共质体，这无疑对细胞信号的传导和植物 体协调发育具有重大意义，但是从同一个胚细胞发育和分化而来的植物体需要共质 体分区来完成不同细胞和组织的生长( m c l e a ne t a l ，1 9 9 7 ) 。因此并不是所有的植 物组织的的细胞都由相同的胞间连丝来连接，在不同的细胞或组织的接触面胞间连 丝的的结构和功能是有区别的。从另一个角度讲，胞间连丝的发育是被精确调控并 且处于高度动态变化中，胞间连丝在植物的发育过程中不断地发生修饰，以改变不 同组织和细胞之间的连接程度，如信号物质的传导等，进而影响细胞或组织的发育， 由此可见胞间连丝的结构在植物的发育过程中发挥着重要的作用。 2 1 初生胞间连丝 传统划分胞间连丝类型的方法是根据胞间连丝的起源，在植物细胞分裂时形成 的胞间连丝为初生胞间连丝：不是在分裂时形成，而是在原有的细胞壁上形成的胞间 连丝称为次生胞间连丝( e h l e r sk e ta l ，2 0 0 1 ) 。初生胞间连丝的形成过程大概是这样： 高尔基体小泡围绕着内质网融合，并且贯穿细胞板，把相邻细胞的质膜相连，形成 胞间连丝的初始形状，又称为原生质体桥。当细胞分裂时内质网穿越细胞板并被严 格定位。这种定位决定了胞间连丝存在的位置。伴随着细胞壁的进一步发育形成， 在细胞壁的挤压和周围细胞质膜的约束下，内质网在正在形成的胞间连丝中发生了 转变，被压缩成一种圆柱状的压缩内质网。这种压缩的内质网也被成为连丝微管。 连丝微管和包被的细胞质膜，以及两者形成的胞质孔道构成了初生胞间连丝。相邻 细胞的原生质体和内膜系统通过胞间连丝连成一个整体。 2 2 次生胞间连丝 高等植物次生胞间连丝形成起始是内质网和质膜接触，在接触区域发生了细胞 壁的松弛与变薄。由于质膜连着内质网一起外突，随后向前越过各自的壁，最终导 致相邻细胞质膜融合。就结构而言，很难将次生胞间连丝和初生胞间连丝从形态上 区分开，这极大地限制了对次生胞间连丝的研究( e h l e r sk e ta ，2 0 0 1 ) 。通常在嫁 接体，嵌合体以及寄生植物的接触面研究次生胞间连丝，因为在这些接触面上生成 的胞间连丝都是在已有细胞壁上形成的，属于次生胞间连丝的范畴。 8 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 关于次生胞间连丝的生成有两种说法，其一认为所需的水解酶是在内质网内合 成，然后释放到细胞质中；另一种意见是水解酶的分泌是通过类溶酶体的小泡而来。 后来实验证明两种方式都可能存在( 郑国铝等，1 9 8 7 ) ，水解酶可能仍然是由内质 网合成，然后由内质网直接释放到细胞质中或由腔室分离出来的小泡，逐渐转移到 质膜附近，释放出水解酶，紧靠细胞壁，降解，穿孔形成次生胞间连丝。 3 胞间连丝的组分 由于胞间连丝深深地嵌入到植物的细胞壁中，从富含胞间连丝的细胞壁碎片中 很难分离得到完整的胞间连丝，因此对胞间连丝组分的研究一直进展缓慢。近年来 己通过遗传和生化的手段得到了很多定位于胞间连丝的蛋白。 在哺乳动物中，肌球蛋白可以在相邻的两细胞间产生张力来调节两者的连接。 在植物细胞中，o v e r a l l ( o v e r a l l ，1 9 9 6 ) 等在提出的胞间连丝模型中认为肌动蛋白 附着在连丝微管上，肌球蛋白将质膜与肌动蛋白连接在一起，这样的一种结构可以 使得肌球蛋白通过在连丝微管和质膜之间产生张力来调节胞间连丝孔径的大小。近 来研究也发现植物的肌球蛋白定位于胞间连丝，能够调节胞间连丝的运输。推测肌 球蛋白通过其c 端的球形疏水结构域与质膜相连，含有与其他肌球蛋白相似的马达 结构域和与钙调蛋白的结合的能力。由此推测肌球蛋白以肌动蛋白为轨道运输信号 分子和大分子蛋白通过胞间连丝。 肌动蛋白和肌球蛋白可以看成是胞间连丝的结构组分，是胞间连丝必不可少的 成分。然而单纯依靠肌动蛋白和肌球蛋白还不能完成胞间连丝的运输，近年来在动 物和植物中发现蛋白质的磷酸化和去磷酸化在信号传导中起着级联放大的作用，很 有可能蛋白质的磷酸化水平在胞间连丝的运输过程中起着重要的作用。通过对植物 病毒研究发现运动蛋白在病毒传染的过程中被不同程度的磷酸化，同时在胞间连丝 附近也发现了蛋白激酶，实验证明其在胞间连丝的运输过程中发挥着作用( v c i t o v s k ye ta l ，1 9 9 3 ) 。 从遗传学角度入手，通过筛选胞间连丝突变体的办法已得到许多与胞间连丝结 构和功能相关的基因，p a tz a m b r y s k i 在通过筛选拟南芥胚胎阶段胞间运输缺陷的突 变体时，发现了i s e l ( k i me ta l ，2 0 0 0 ) 和i s e 2 ( k o b a y a s h ie ta l ，2 0 0 5 ) 基因，i s e l 9 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞问连丝介导的物质运输 基因编码d e a d 盒的r n a 螺旋酶，i s e 2 基因编码一种与胁迫小体相关的d e v h 类型 的r n a 螺旋酶。i s e l 4 砌s e 2 突变体的多效性表明i s e i 和i s e 2 基因只是间接的影响胞间 连丝的性质，可能通过降解相关r n a 来实现。在另一相似的胞间连丝突变体筛选的 实验中，j a c k o n 以g f p 在根中的扩散水平为标准筛到t g a t l 突变体( b e n i t e z a l f o n s o e t a l ，2 0 0 9 ) ，在该突变体中，g f p 只存在于根中的韧皮部中，未能扩散到整个根尖。 g a t l 基因编码m 型的铁氧还蛋白，在突变体中发现其过氧化氢含量相比野生型含量 上升，胼胝质也明显增加，进而推测g h ”基因突变后，影响了体内过氧化氢的含量， 过氧化氢可能作为信号分子调节胼胝质的生成，从而影响胞间运输。 在筛选胞间连丝突变体的同时，有关胞间连丝蛋白生化方面性质的研究也在进 展中。用生化手段研究胞间连丝的关键在于分离鉴定完整胞间连丝的方法。一种烟 草的胞间连丝相关的蛋白激酶( p l a s m o d e s m a l a s s o c i a t e dp r o t e i nk i n a s e ，p a p k ) ( l e e e ta l ，2 0 0 5 ) 已被鉴定定位在胞间连丝，它能够磷酸化某些植物病毒的运动蛋白和 植物内源的细胞非自主性转运蛋白。另夕f b e m i ee p e l 等则通过改良的提取富含胞间 连丝细胞壁组分的方法，筛选了一些可能位于胞间连丝的候选蛋白，其中一个便是 蛋白可逆糖基化多肽家族1 ( r e v e r s i b l yg l y c o s y l a t e dp o l y p e p t i d el ，r g p l ) ，该家族的 的蛋白定位于胞间连丝，并且实验证明该家族蛋白利用胞内的分泌途径将自身运输 到胞间连丝( g u ys 画e ta l ，2 0 0 5 ) 。 一直以来，胼胝质被认为在胞间连丝的运输中发挥着重要作用，胞间连丝的孔 径的大小是由沉积在胞间连丝颈环处的胼胝质的厚薄决定的( r a d f o r de l a l ，2 0 0 1 ) 。 而肼胝质的沉积程度是由葡聚糖酶和葡聚糖合成酶之间的活性对比所决定的。当葡 聚糖酶活性低时，胼胝质合成大于降解，胞间连丝的孔径增大，1 3 1 ，3 葡聚糖酶 与gfp 融合蛋白定位后发现，其在细胞壁上呈点状分布，并且与经苯胺蓝染色的 胞问连丝周围胼胝质共定位。研究其突变体发现，胞间连丝周围胼胝质积累增加， 孔径明显减小( a m i tl e v ye ta l ，2 0 0 7 ) 。在质壁分离实验中发现，1 3 1 ，3 葡聚糖 酶从胞间连丝处消失，定位于细胞膜上，说明此酶与胞间连丝的结合并不是很紧密。 c a r o l e 鉴定了一组定位于胞间连丝，类似膜受体i 的蛋白，称为定位胞间连丝的 蛋白( p l a s m o d e s m a t a - l o c a t e dp r o t e i n ，p d l p ) 。实验表明此家族的基因与胞间运输 有关，各成员之间功能冗余，单个基因突变后并不会对胞间运输产生影响，而特定 1 0 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞问连丝介导的物质运输 的双突组合会对增大胞间连丝的通透性，提高胞间通讯的效率。用b f a 处理后，发现 p d l p l a 不能定位于胞间连丝，说明p d l p l a 是通过胞内蛋白分泌途径运输到胞间连丝 处( c a r o l ee la l ，2 0 0 8 ) 。这些蛋白的c 端与胞间连丝相连，n 端位于细胞质，跨膜区域 包含了定位于胞间连丝的信息。 最近在拟南芥中鉴定出一组胼胝质结合蛋白( p l a s m o d e s m a t ac a l l o s eb i n d i n g p r o t e i n ，p d c b ) ，在拟南芥中含有1 1 个同源蛋白。该家族所有蛋白都定位于胞间连 丝，具体说是定位于胞间连丝的颈环区域。该基因的突变体不会对植物的表型产生 明显影响，可能是由于体内有该家族多个蛋白，它们功能冗余的原因。过表达该基 因后胞间运输受到了显著影响。其中的原理可能为该家族的蛋白能够激活葡聚糖合 成酶的活性或者降低葡聚糖酶的活性。 r c m o r i n s ( r e m s ) 是在番茄中新近发现定位于胞间连丝处的蛋白。不仅在胞间连 丝有分布，生化和原位标记的手段也发现其在细胞膜的脂筏上也有分布( s y l v a i n r a f f a e l ee t a l ，2 0 0 9 ) 。在础泐转基因番茄中，p 助韵传播效率大大降低。进一步实 验证明r e m o f i n f i 皂够与p v x 的t g p l 相互作用，进而调控p v x 的胞间运输。文章还推 测脂筏可能是作为胞间连丝特有的功能组分在胞间连丝介导的物质运输中发挥作 用。 4 细胞非自主性因子 凡是能够在胞间发生移动的因子都可以被称为细胞非自主性因子，例如外源的 g f p ，植物病毒的运动蛋白等，植物体内也包含着许多非自主性因子，一些转录因子能 通过胞间连丝运输到相邻的细胞中发挥作用。许多植物病毒在感染寄生植物时必须 依靠自身编码的运动蛋白来协助完成通过胞间连丝的运输。许多转录因子也能通过 胞间连丝来完成胞间转运，从其起始合成的部位运送到相邻细胞或者更远距离的细 胞来调控植物的发育，发挥应有的功能，例如l ( n 1 ，f l o ，l f y ，g l o 和d e f 等。越来 越多的实验证明这些具有细胞非自主性转运功能的转录因子在植物的发育中发挥着 很重要的作用。 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 表l 病毒运动蛋白和植物内源性蛋白的胞问移动能力 t a b l e1t h em o v m e n tc a p a c i t yo fv i r a lm o v m e n tp r o t e i n sa n dp l a n te n d o r s ep r o t e i n s 病毒运动蛋白和植物内源性蛋白的胞间移动能力 m i 表示微注射，e 为e x t e n t 的简写。 烟草花叶病毒的运动蛋白是至今为止研究最为深入、了解最为清楚的外源非自 主性蛋白，它能够与烟草花叶病毒的r n a 结合，扩大胞间连丝的的分子排阻限度， 以r n p 的形式运输到相邻细胞。k n l ( h a k ese t a l 。1 9 8 6 ，v o l l b r e c h te e t a l ，1 9 9 9 ) 1 2 兰大硕士论文过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 是在植物中第一个被发现能够通过胞间连丝运输的转录因子，在玉米的s a m 中发 现，k n l 蛋白在整个s a m 中都有分布，而k n a 的m r n a 只在l 2 ，l 3 中分布。叶片注 射实验表明k n l 不仅能够在相邻的细胞间移动( k e r s t e t t e rr ae ta l ，1 9 9 7 ) ，而且 能够扩大胞间连丝的分子排阻限度，使k n l 与其自身的m r n a 形成r n a 蛋白复合体 通过胞间连丝运输( l u c a sw je ta l ，1 9 9 5 ，k r a g l e rfe ta l ，2 0 0 0 ) 。在s t r o l l 的l 1 层表达g f p k n l 能够使突变体的表型恢复，此实验也证明了k n l 具有胞间运输能 力。k n l 在拟南芥中的两个同源基因s 和k n a t l 也具有此种功能( b y m em e e ta l ， 2 0 0 2 ，d o u g l a ss je ta l ，2 0 0 2 ) 将s t m 和k n a t 分别与g f p 相连后在s a m 的l l 层表达， 发现在l 2 和l 3 中也发现了g f p 的分布，表明s t m 和k n a t l 有胞间运输的能力( k i m 甜a l ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ) 。 不仅在茎顶端分生组织中存在着转录因子细胞非自主性转运的现象，根的顶端 分生组织的一些转录因子如s h r ，也能够通过胞间连丝运输。s h r 是g r a s 家族转 录因子中的一员( h e l a r i u t t ae ta l ，2 0 0 0 ) ，s h r 的m r n a 只存在于中柱中，而s h r 蛋白在中柱和相邻的内皮层中都有分布，说明s h r 在根的中柱中表达，运输到相邻的 内皮层中，调节内皮层的形成和发育( n a k a j i m ak e t a ! ，2 0 0 1 ) 。 l f y 是众多开花识别基因之- - ( s e s s i o n sa e ta l ，2 0 0 0 ) ，实验证明它能够在胞间 移动( w u x 甜a l ，2 0 0 3 ) 。在a t m l l 启动子控制下，g f p l f y 的融合蛋白在l l 层 专一表达时，发现荧光蛋白能扩散到下层l 2 ，l 3 细胞中。免疫实验证明l f y 的蛋白存 在于整个s a m 的三层中，并且在a t m l l 启动子的控制下，l f y g f p 、g f p l f y 、 g l f y 在l l 层的表达能够恢复砂突变体的正常表型，发现g f p 的荧光强度在l l 中最 强，l 2 、l 3 层的荧光强度依次递减。这种荧光在各层中逐层递减的情况说明l f y 在 s a m 中的分布是自由扩散的结果，后续实验也证明荧光的扩散范围与荧光在核质中 的分离比有很大的相关性，荧光在细胞质中分布的越多，其扩散范围也越大。 d e f 和g l o 属于m a d s 家族转录因子( p e r b a lm ce t a l ，1 9 9 6 ) ，在花器官的发 育过程中起着重要的作用。两者在l 2 和l 3 层中表达，翻译成的蛋白运输n l l 层中起 作用，并且这种运输是单方向的，只能由l 2 和l 3 向l 1 转运，而d e f 和g l o 不能由l l 向下两层运输。 c p c 是决定侧根发育的重要转录因子，其基因编码有9 3 个氨基酸组成的，具有 1 3 兰大硕士论文 过氧化氢胁迫下胞问连丝介导的物质运输 m y b r 3 结构域的蛋白，在c p c 的缺失突变体中( w a d at e ta l ，1 9 9 7 ) ，主根上的侧 根数目减少。c p c 的m r n a 在非生毛细胞有分布，但c p c 蛋白在整个根的表皮中都 有分布，表明c p c 蛋白可以从非生毛细胞中向生毛细胞中运输( w a d a te t a l ，2 0 0 2 ) 。 在调节根表皮发育的过程中还有两个比较重要的转录因子( b e m h a r d tce t 讲， 2 0 0 3 ，2 0 0 5 ) ，g l 3 和e g l 3 。与c p c 相反。g l 3 和e g l 3 在生毛细胞中表达，而通过 对两个转录因子的单突变体和双突变体的功能分析发现，g l 3 和e g l 3 在非生毛细胞 中发挥作用，并且g l 3 y f p 的融合蛋白也发现定位与非生毛细胞中的细胞核中。 5 细胞非自主性转运的分子机制 细胞非自主性转运可以分为胞内运输和胞间运输两部分，鉴定参与该转运过程 蛋白是阐释细胞非自主性转运机制的关键。烟草花叶病毒的运动蛋白是研究细胞非 自主性转运机制的最好对象，至今已通过鉴定与m p 相互作用的植物内源蛋白发现了 了许多该转运途径的内源因子。 5 1 胞内运输的参与蛋白 细胞非自主性运输是许多信号分子普遍采用的运输方式，如转录因子、激素、 m i c r o r n a 等信号分子大都可以采用非自主性运输的方式来行使其功能。虽然胞内 运输是细胞非自主性运输过程中不可缺少的一部分，但胞内运输的分子机制至今还 不甚明了，最重要的原因是参与胞内运输的蛋白鉴定困难，只有少数几个蛋白被认 定可能参与胞内运输过程，如m p b 2 c 、e b l a 、n c a p p l 、c r t 、p m e 等。 m i n g h u e ic h e n 等以烟草花叶病毒的运动蛋白为诱饵，从富含蛋白的烟草叶片细 胞壁碎片中得到了与运动蛋白肝相互作用的果胶甲基酯晦( p m e ) ( m i n g - h u e ic h e n e ta l ，2 0 0 0 ) ，随后的酵母双杂实验证明m p 的1 3 0 - 1 8 5 个氨基酸区域与p m e 存在着相 互作用，将其区域截除后，烟草花叶病毒的胞间迁移效率大受影响，表明m p 与p m e 的相互作用对于病毒的胞间迁移是必需的。然而这个结论和观点是备受质疑的，将 m p 的如此大的一个区域截除后，可能会对m p 的功能造成不可恢复的影响，并且仅 有体外实验证明两者存在着相互作用，没有体内相互作用实验证明支持，更为重要 的是在体内同时表达m p r f p 与p m e g f p 时，两者之间没有明显的共定位现象。 微管结合蛋白2 c ( m p b 2 c ) 是f r i e d r i c hk r a g l e r 利用基于s r s 酵母双杂系统鉴定 1 4 兰大硕士论文 过氧化氢胁迫下胞间连丝介导的物质运输 出的与烟草花叶病毒运动蛋白相互作用的蛋i 刍( f r i e d r i c h e l a l ，2 0 0 3 ) ，它在微管上呈 点状分布，并能够与m p g f p 共定位实验证明过表达m p b 2 c 时，能够显著降低m p 的胞间运输效率。因此推测认为m p b 2 c 与m p 相互作用，将船锚定在微管上，从而使 肝到达胞间连丝的效率降低，对归的胞间运输起到了负调控的作用。 m i n h u e ic h e n 等以烟草花叶病毒的运动蛋白为配体，利用亲和层析的方法得到 了与m p 相互作用的蛋白钙网蛋白( c r t ) ( m i n g h u e ic h e ne ta l ，2 0 0 5 ) ，钙网蛋白 是钙隔离蛋白，在不同的物种中高度保守，具有收集、储存钙离子的功能。c r t - y f p 的融合荧光蛋白定位发现钙网蛋白在细胞壁上成点状分布，并且与m p g f p 共定位， 说明钙网蛋白定位于胞间连丝。体内和体外实验也证明c r t 与m p 之间存在着相互作 用，过表达钙网蛋白c l 玎发现m p 大量存在于内质网和微管上，使m p 不能正常的定 位于胞间连丝处。同时病理学的实验表明过量表达钙网蛋白后，会影响植物病毒局 部的感染效率，大大降低感染速率。 n t n c a p p l ( l e ee ta l ，2 0 0 3 ) 是在以c m p p l 6 为诱饵，在b y 2 烟草的富含胞间连 丝蛋白的细胞壁碎片中筛选出来的，在随后的实验中发现，n t n c a p p l 不仅能够与 c m p p l 6 相互作用，而且与韧皮部中的其他转运蛋白也有相互作用，说明n t n c a p p i 是细胞非自主性转运通路的核心成分。n t n c a p p l - 五z 能够选择性的抑制某些细胞非 自主性因子的胞间运动，如f i t c d e x t r a n ，t m vm p ，n f l 等，而对k n i 和c m vm p 等因子的胞间运动则没有影响，由于n t n c a p p l 定位于内质网，因此推测n c a p p l 能够在细胞非自主性因子的胞内运输过程中起作用。 e b l a 是微管末端结合蛋白，它能结合在微管的正极，在微管的装配和卸载过程 中发挥着重要作用，如纺锤体的形成等。实验证明过表达a t e b l a 对烟草花叶病毒的 感染速率起负调控作用，并且a t e b l a 茬e 体内能与t m vm p 相互作用( r i t z e n t h a l e re t a l ，2 0 0 7 ) ，借此将病毒复合体固定在微管上。从而推测微管在病毒感染过程中起着 非常重要的作用。 突触结合蛋白( s y n a p t o t a g m i n s ，s y t s ) 是动物体内钙信号感应器，能够调节突 触突触囊泡的胞吞和胞吐作用。最近在拟南芥中也发现了类似功能的蛋白s y t a ， 它能够与c a l c u v )和t m v 的m p 相互作用，调节m p 的胞间运输效率( j e n n i f e rd l e w i se ta l ，2 0 1 0 ) 在s y t a 突变体中，c a l c u v 的感染效率受到抑制，进一步研究