（遗传学专业论文）rac、cdc42信号转导通路的fret单分子探针的特征分析.pdf

摘要 r h o 鸟苷三磷酸酶( r h og t p a s e s ) ，包括r a c 和c d c 4 2 ，是一类在细 胞信号转导领域中研究较多的蛋白分子，其主要调节细胞转录、细胞迁 移、细胞形态和基因表达等一系列细胞过程。细胞信号转导过程中，r h o g t p a s e s 通常作为分子开关将上游信号刺激传递给下游效应分子或靶蛋 白，产生相应的生物学效应。鸟苷酸交换因子、r h og t p a s e s 活化蛋白和 g d p 解离抑制因子三类蛋白分子调节r h og t p a s e s 的有无活性状态。 本文利用本实验室根据f r e t 原理构建的包含红色荧光蛋白d s r e d l 全基因，信号分子r a c l 或c d c 4 2 全基因，效应分子p a k l 或n - w a s p 的g t p 酶联结区域，青色荧光蛋白c f p 全基因的几种单分子探针转染动物细胞。 转染动物细胞后，以胰岛素、缓激肽为诱导剂，分别激活r a c l 、c d c 4 2 信号转导通路。离体荧光光谱检测表明，在转染的动物细胞中产生了f r e t 现象。在未诱导激活前，不同信号转导通路的f r e t 效率已达相对较高水 平。诱导激活5 m i n 后，均达到最高值，但增加幅度有显著差异。随着诱 导时间的延长，f r e t 效率下降，但下降速率在不同信号转导通路间有较 大差异。蛋白激活试验证实，诱导激活的转染细胞中，r a c l 、c d c 4 2 均处 于激活状态，其在不同诱导时间的相对激活程度与f r e t 效率表现一致。 诱导激活的r a c l 、c d c 4 2 信号转导通路，分别导致转染的活细胞中出现 片状伪足和丝状伪足。这表明采用这些f r e t 单分子探针，可直接监测细 胞中激活的信号转导通路的时空变化及其产生的相应的细胞学效应。采 用这些单分子探针，分析、判断一些调节蛋白对r a c l 、c d c 4 2 的鸟苷酸 转换因子或g t p a s e s 活化蛋白特性，从而可以提供一种有效的鉴定待测 蛋白分子的方法。 关键词：r a c ，c d c 4 2 ，f r e t ，单分子探针 l l a b s t r a c t r h og t p a s e s ，i n c l u d i n gr a ca n dc d c 4 2 ，a r eak i n do fp r o t e i n st h a t h a v eb e e ns t u d i e dw e l li ns i g n a lt r a n s d u c t i o n r h og t p a s e sm a i n l y r e g u l a t eav a r i e t yo fc e ll u l a rp r o c e s s e ss u c ha sc e l lt r a n s c r i p t i o n ， m i g r a t i o n ，m o r p h o l o g y ，a n dg e n ee x p r e s s i o n i nt h ec o u r s eo fs i g n a l t r a n s d u c ti o n ，r h og t p a s e su s u a ll yt r a n s d u c et h e u p s t r e a m s t i m u l a t i n gs i g n a l s t ot h ed o w n s t r e a me f f e c t o r so r t a r g e t p r o t e i n s ，a n dp r o d u c e t h e c o r r e s p o n d i n gb i o l o g i c a lo u t c o m ea s m o l e c u l a rs w i t c h e s t h r e ek i n d so fp r o t e i n s n a m e i yg e f ( g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g ef a c o t o r s ) ，g a p ( g t p a s e a c t i v a ti n gp r o t e i n s ) a n dg d i ( g u a n i n en u c l e o t i d ed i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s ) r e g u l a t et h e c h a n g ef r o ma c t i v et oi n a c t i v ef o rt h er h og t p a s e s i nt h i st h e s i s ，s e v e r a lf r e t b a s e ds i n g l e m o l e c u l ep r o b e s w h i c hc o n t a i n e do i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i nd s r e d l ，r a c l o rc d c 4 2 ，t h eg t p a s eb i n d i n gd o m a i no ft h ee f f e c t o rt h a ti sp a k l o rn w a s p ，a n dc y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i nc f pc o n s t r u c t e db yo u r l a b o r a t o r y t ot r a n s f e c tt h ec e l l s r a c ia n dc d c 4 2 s i g n a l i n g p a t h w a y s w e r ea c ti v a t e di nt h et r a n s f e c t e dc e ll s b y t h e i n d u c e r ，i n s u li no rb r a d y k i n i nr e s p e c ti v e l y nv xt r of l u o r e s c e n t s p e c t r o s c o p ya s s a y ss h o w e dt h a tf r e tp h e n o m e n o nw a so b s e r v e di n t h et r a n s f e c t e dn i h 3 t 3c e l l s f o ra l lt h r e es i g n a l i n gp a t h w a y s ，t h e i l l v a l u e so ff r e te f f i c i e n c yw e r er e a l t i v e l yh i g hb e f o r et h ei n d u c t i o n ， a n dr e a c h e dt h eh i g h e s ta f t e ri n d u c e df o r5m i n ，b u tt h ei n c r e a s i n g e x t e n t so ft h ev a l u e so ff r e te f f i c i e n c yv a r i e di nt h r e es i g n a l i n g p a t h w a y s t h e v a l u e s o ff r e t e f f i c i e n c y d e c r e a s e d w i t ht h e e x t e n t i o no ft h ei n d u c t i o nt i m e ，b u td i f f e r e ds i g n i f i c a n t l yi nt h e d e c r e a s i n gs p e e df o r t h es i g n a l i n gp a t h w a y s r a c la n dc d c 4 2 a c t i v a t i o na s s a y si n d i c a t e dt h a tr a c la n dc d c 4 2w e r ei nt h e a c t i v a t e ds t a t ei nt h ei n d u c e dc e l l s t h e i rr e l a t i v e l ya c t i v a t e d a c t i v i t i e si nt h ec e l l si n d u c e df o rd i f f e r e n tt i m ew e r ec o n s i s t e n t w i t ht h ev a l u e s o f f r e t e f f i c i e n c yo f i nv l t r of l u o r e s c e n t s p e c t r o s c o p ya s s a y s t h e a c t i v a t e dr a c la n dc d c 4 2 s i g n a l i n g p a t h w a y sl e dt ot h ef o r m a ti o no fl a m e l1i o p o d i aa n df il o p o d i ai n t h et r a n s f e c t e dc e ll sr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s e s i n g l e m o l e c u l ep r o b e sc o u l db ed i r e c t l yu s e dt om o n i t o rt h e s p a t i a la n dt e m p o r a li m a g i n ga n dt h ec o r r e s p o n d i n gc e l l u l a re f f e c t o ft h ei n d u c e da c t i v a t i o no ft h es i g n a l i n gp a t h w a y si nl i v i n g c e l l s w i t ht h e s es i n g l e - m o l e c u l ep r o b e s ，t h eg e fo rg a pa c t i v i t i e s o fp u t a t i v er e g u l a t o r yp r o t e i n sf o rr a c la n dc d c 4 2w i l lb ea n a l y z e d a n dj u d g e d ，t h u sp r o v i d e da ne f f e c t i v em e t h o df o ri d e n t i f y i n gt h e r e g u l a t o r yp r o t e i n sf o rr h og t p a s e s k e yw o r d s ：r a c l ，c d c 4 2 ，f r e t ，s i n g l e m o l e c u l ep r o b e i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：射磁 力口群6 月多日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密留。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：衬烈日期：刎牌 占月3 日 导师签名：新翘囊日期：弼年石。月尹日 r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 1 引言与文献综述 细胞信号转导是生物细胞中除物质代谢和能量代谢之外的另一种 特殊的代谢过程，其主要传递环境变化的信息，调节和控制细胞的物质 代谢和能量代谢以及生物体一系列生理反应与生长发育过程。细胞信号 转导途径中，r h o 家族蛋白( r h og t p a s e s ) 是一类研究较多的调节蛋白， 在调节细胞骨架、细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡、细胞转录等方面具 有重要作用。 1 1r h og t p a s e s 1 1 1r h og t p a s e s 概述 r h o 家族鸟苷三磷酸酶( r h og t p a s e s ) ，是一类具有g t p 酶活性的鸟苷 酸结合蛋白，是d x g 蛋白( s m a l ig t p b i n d i n gp r o t e i n s ) 的成员之一，为 r a s 超家族的一个重要分支，包括r h o a 、r a c 和c d c 4 2 等，一般大小为2 0 0 个 氨基酸，分子量为2 0 3 0 k d ，其各成员间有5 0 - 5 5 m 源性n 怎3 1 。 r h og t p a s e s 在真核生物酵母到人的一些生物中都有发现，目前已 证实哺乳动物有1 8 种r h og t p a s e s ，果蝇有7 种r h og t p a s e s ，线虫有5 种r h og t p a s e sh 3 。研究表明哺乳动物的1 8 种r h og t p a s e s ，可以分为 5 个亚群：r h o ( r h o a ，r h o b ，r h o c ) ，r a c ( r a c i ，r a c 2 ，r a c 3 ，r h o g ) ， c d c 4 2 ( c d c 4 2 h ，g 2 5 k ，t c l o ) ，r n d ( r n d l r h 0 6 ，r n d 2 r h 0 7 ，r n d 3 r h o e ， r h o d ) ，t i f5 个亚家族1 ( 图i - i ) 。r h o 亚家族中的r h o a 、r h o b 和r h o c 在序列上具有高度同源性，在多种细胞中都有表达，其中r h o a 和r h o c 主 要参与细胞骨架的调节，形成应力纤维( s t r e s sf i b e r ) 和粘着斑( f o c a l a d h e s i o n ) ，并且r h o a 还参与细胞转录、细胞生长和细胞凋亡等过程， 1 硕十学位论文 r h o b 参与细胞的膜泡转运的过程。r a c 亚家族中的r a c l 和r h o g 主要参 与细胞骨架的调节，形成片状伪足( 1 a m e l l i p o d i u m ) 和膜皱褶( m e m b r a n e r u f f l e s ) ，另外r a c l 还参与调节细胞转录、细胞分泌和细胞凋亡等过程。 c d c 4 2 亚家族中的c d c 4 2 主要参与细胞骨架的调节，形成丝状伪足 ( f il o p o d i a ) 。r n d 亚家族中的r n d l 、r n d 3 r h o e 和r n d 2 在细胞中可拮 抗r h o 信号通路晴1 。目前，r h o a 、r a c 和c d c 4 2 三种r h og t p a s e s 是r h o 家族蛋白中研究较多的，本文将重点介绍r h o a 、r a c 和c d c 4 2 的各种生 物学功能。 图卜1哺孚l 动物r h o 家族蛋臼 1 1 2r h og t p a s e s 的分子开关( m oie c uia rs w it c h e s ) 作用 在细胞信号转导过程中，r h og t p a s e s 通常作为信号转换器或分子开 关，即以结合g d p ( g d p b o u n d ) 的失活形式和结合g t p ( g t p - b o u n d ) 的激活 形式两种形式存在并相互转换，将上游信号刺激转导到下游相应的效应 分子( e f f e c t o r ) 。通常情况下，r h og t p a s e s 以结合g d p ( g d p b o u n d ) 的失 活形式游离于胞浆( c y t o s 0 1 ) 中，而以结合g t p ( g t p - b o u n d ) 的激活形式作 r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 用于细胞信i 号转导途径下游的效应分子，引。与r a s 超家族的所有成员一 样，r h og t p a s e s 的活性由g t p g d p _ b o u n d 的比值决定随1 。r h og t p a s e s 在活 细胞中信号转导的具体过程如下( 图1 - 2 ) ：信号转导过程中，上游信号刺 激激活r h og t p a s e s ，促使r h og t p a s e s 从联结g d p ( g d p - b o u n d ) 的失活状态 解离g d p ，r h og t p a s e s 再结合g t p 转换为激活状态( g t p - b o u n d ) ，使r h o g t p a s e s 的构象发生改变，进而与下游效应分子的g b d 结合区域( g t p a s e b i n d i n gd o m a i n ) 相互作用，引发下游效应分子产生一系列生物学效应。 信号转导完成后，r h og t p a s e s 与效应分子分离，细胞内的g t p 酶水解r h o g t p a s e s 中的g t p ，使r h og t p a s e s 由激活状态( g t p b o u n d ) 转换为失活状态 ( g d p - b o u n d ) 阳1 。按照上述过程，r h o 作为分子开关在失活状态和激活状态 之间相互转换，将上游信号刺激转导到下游效应分子，从而调控细胞内部 的细胞信号转导过程。 掌脚澈硼翩l 簟渤啪婀n 曩l 翮嘲唾刚鳓 图卜2r h og t p a s e s 信号转导模式图 1 1 3r h og t p a s e s 的调节 在细胞信号转导的过程中，r h og t p a s e s 结合g d p 的失活形式和结合 硕十学位论文 g t p 的激活形式的相互转换受到细胞内的一些调节因子的调节。调节上述 转换过程的主要是3 类蛋白分子( 图1 - 2 ) ：( 1 ) 鸟苷酸交换因子( g u a n i n e n u c l e o t i d ee x c h a n g i n gf a c t o r s ，g e f ) ，其主要功能是促进r h og t p a s e s 的g d p 的释放，转而使r h og t p a s e s 与g t p 的结合，使激活状态的r h o g t p a s e s 与下游相应的效应分子结合，产生特定的生物学效应。( 2 ) g t p a s e s 活化蛋白( g t p a s e s a c ti v a ti n gp r o t ei n ，g a p ) ，其主要功能是提 高自身内在的g t p a s e s 活性而负相调节r h og t p a s e s 的活性，加速r h o g t p a s e s 的g t p 水解，使g t p 水解为g d p ，将r h og t p a s e s 由激活状态转换为失 活状态；( 3 ) g d p 解离抑制因子( g d pd i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r ，g d i ) ，其 主要功能是r h og d i 与r h og t p a s e s 定位在胞浆( c y t o s 0 1 ) 内形成复合物， 阻止g d p 从r h og t p a s e s 上分离，抑$ 1 j r h og t p a s e s 的活性10 i 。 目前通过研究已发现一系列与r h og t p a s e s 相关的调节因子，其中 哺乳动物大约有5 0 种鸟苷酸交换因子、4 0 种g t p a s e s 活化蛋白和3 种 g d p 解离抑制因子，并且它们对r h og t p a s e s 的调节机制也进一步得到认 识( 表1 - 1 ) 。 1 1 3 1 鸟苷酸交换因子( g e f ) d b l 是第一个被发现的鸟苷酸交换因子，它是原癌基因d b l 的蛋白产 物。e v a 等在对n i h 一3 t 3 细胞的研究中发现原癌基因d b l 能够导致细胞转化 灶( f o c u sf o r m a t i o n ) 的形成和细胞癌变n 。r o n 等对其进一步研究发现 d b l 与酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s f a e ) 的细胞周期蛋白c d c 2 4 有2 9 的序列是相同的，而且后者位于r h og t p a s e s 的c d c 4 2 的上游位置，在体外 d b l 能将g d p 从人的c d c 4 2 分子的结合状态解离。综合以上研究，r o n 等证 r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 实d b l 是鸟苷酸交换因子，具有将r h og t p a s e s 由失活状态转换为激活状态 的功能n 2 邝1 。 目前的研究结果表明，大多数r h og t p a s e s 的鸟苷酸交换因子是一些 原癌基因的产物，它们在结构上都具有相同的1 个d h ( d b l h o m o l o g y ，阴) 结构域和1 个p h ( p l e c k s t r i nh o m o l o g yd o m a i n ，p h ) 结构域。d h 结构域 是催化结构域，其功能是与r h og t p a s e s 结合并促使其构象改变，催化g t p 取代g d p 从而活化r h og t p a s e s ，p h 结构域紧靠d h 结构域，其主要通过和 细胞膜上特定的脂质相互作用，准确进行细胞定位n 2 1 副。进一步的研究 表明，d h 结构域是鸟苷酸交换因子行使其功能必需的结构。如果将d h 结构 域剔除，鸟苷酸交换因子失去其催化r h og t p a s e s 转换的功能n 包蝤1 。另外， b e n i a n 和s o n e 在果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 和线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 体内也发现了相同的具有d h 结构域和p h 结构 域的g e f n 6 1 7 1 。除t d h 结构域和p h 结构域之外，c e r i o n e 等n 羽发现一些g e f 还具有s r ch o m o l o g y ( s h 3 ) 等其他的结构域，这些结构可能具有其他重要 的作用。上述的这些结构特点对于今后进一步发现和研究g e f 提供了重要 依据。 在已发现的g e f 中，体外研究表明一些g e f 对r h og t p a s e s 的调节具有 特异性，另一些不具有特异性。c r e s p o 等n9 2 0 2 妇发现鸟苷酸交换因子v a v 、 b c r 幂i a b r 对r h og t p a s e s 的调节不具有特异性，可以调节r h og t p a s e s 中的 r a c 、c d c 4 2 和r h o 。另一些鸟苷酸交换因子对r h og t p a s e s 具有特异性，如 l b c 、l s c 矛i l f c 只调节r h og t p a s e s 中的r h o ，t i a m 只调节r h og t p a s e s 中的 r a c ，f g d l 只调节r h og t p a s e s 中的c d c 4 2 眩2 2 3 3 。 硕十学位论文 表1 - 1r h o r a c c d c 4 2 蛋白的调节因子 r e g u l a t o r s r h og t p a s e s g e f s d b l r h o ，r a e ，c d e 4 2 v a v l r h o ，r a c ，c a e 4 2 d b s r h o ，c d c 4 2 l b cr h o l f cr h o l s cr h o v a v 2r h o p 1 1 5r h o g e f r h o p d z r h og e fr h o t i a m 一1r a c f g d lc d e 4 2 f r a b i nc d c 4 2 t r i o r a c r h o o s t c d c 4 2r h o b e tr a cc d c 4 2r h o a b rr a cc d e 4 2r h o g e f rr a cc d c 4 2 g 姆 p 5 0r h og a pr h o ，r a c ，c d e 4 2 p 1 9 0r h og a pr h o ，r a c ，c d c 4 2 g r a f r h o ，c d c 4 2 m y r 5 r h o ，c d c a 2 b e t r a c ，c d c 4 2 n - c h i m a e d nr a c c d 0 4 2 8 c ：l l i m a e r i a 3 b p 1r a c a b r r a c p 1 2 2 r h o r a l b p l r l i p 7 6 i t 口1c d e 4 2r a c g d i r h o g d i r h o ，r a e ，c d c 4 2 d 4 l y g d i r h o r h og d i 3r h o b 目前，有许多报道提供了一些体外研究方法可以对细胞中的r h o g t p a s e s 的g e f 进行鉴定，在体外这些方法检测到的结果与体内的结果是 一致的。o l s o n e t 等利用显微注射技术将l b c 和f g d l 两种g e f 分别导入细胞， 结果发现l b c 可以调节r h o 形成应力纤维，f g d l 可以调节c d c 4 2 弓1 起片状伪 6 r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 足的出现。另外，d b l 和v a v 可以调节c d c 4 2 、r a c 和r h o ，分别形成丝状伪足、 片状伪足和应力纤维瞳3 l 。m i c h i e l s 等研究发现，在成纤维细胞中过度表达 t i a m 会导致细胞形成膜皱褶眩制。以上这些方法和结果为今后对细胞信号 转导途径的进一步认识奠定了基础。 1 1 3 2g t p a s e s 活化蛋白( g a p ) p 5 0 r h o g a p 是第一个被发现的r h o 家族蛋白的g t p a s e s 活化蛋白，它是 从人的脾脏和牛的肾上腺细胞的提取物中获得的。体外研究发现它对r h o g t p a s e s 中的r h o 、c d c 4 2 和r a c 具有g t p 酶的活性，能够催化r h og t p a s e s 中的g t p 水解一个磷酸分子成为g d p ，从而使r h og t p a s e s 转为失活状态 2 5 , 2 6 。目前，在哺乳动物体内已发现l o 余种具有g t p 酶活性的g t p a s e s 活化 蛋白。另外，人们在果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 和线虫 ( c a e n o r h a b d it i se l e g a n s ) 体内也发现了具有g a p 活性的蛋白分子乜7 28 l 。 这些已发现r h og t p a s e s 的g a p 分子，它们都具有一个长度为1 4 0 个氨基酸 的g a p 结构域( g a pd o m a i n ) ，这个结构域对于g a p 的活性是不可缺失的。 同g e f 相似，g t p a s e s 活化蛋白对于r h og t p a s e s 的调节同样具有特异 性和非特异性。例如，p 5 0 r h o g a p 和p 1 9 0 g a p 可以调节r h og t p a s e s 中的 r a c 、c d c 4 2 s h r h o ，而p 1 2 2 只调节r h og t p a s e s 中的r h o ，n - c h i m a e r i n 和 b - c h i m a e r i n 只调节r h og t p a s e s 中的r a c 乜9 30 | 。另外，一些g a p 分子在体外 表现非特异性，但在体内却表现严格的特异性。r id le y 等发现p 5 0 r h o - g a p 在体外可以调节r a c 、c d c 4 2 和r h o ，在体内却只调节r h o ，并且他们将 p 1 9 0 g a p 通过显微注射到成纤维细胞中，发现p 1 9 0 g a p 抑制了r h o 介导的应 力纤维的形成，而对r a c 介导的膜皱褶没有影响乜9 3 。 硕十学位论文 1 1 3 3g d p 解离抑制因子( g d i ) r h og d i 是第一个被发现的r h og t p a s e s 的g d p 解离抑制因子。r h og d i 可能在g d p 与g t p 的转换矛h g t p 水解的这两个环节调节r h og t p a s e s 的活性。 f u k u m o t o e t 等发现在胞浆( c y t o s 0 1 ) 中r h og d i 与r h o a 矛h r h o b 的g d p 形式结 合，可以抑锘i j g d p 的解离，且r h o ，g d i 也可以激活c d c 4 2 矛h r a c 2 3 3 ，朋1 。另外有 报道指出r h og d i 也可与r h o 、r a c 矛h c d c 4 2 的g t p 形式( g t p - b o u n d ) 发生微 弱结合，这时r h og d i 贝t 抑锘i g a p 催化g t p 酶水解g t p 的活性。 目前，已发现的3 种r h og t p a s e s 的g d p 解离抑制因子对r h og t p a s e s 的调节作用有一系列的研究。例如，r h og d i 可以调节r h og t p a s e s 中的 r h o 、r a c 和c d c 4 2 的活性。d 4 l y - g d l 只调节r h og t p a s e s 中的r h o ，r h o g d i - 3 调节r h og t p a s e s 中的r h o b 眵6 i 。 目前研究表明，r h og d i 对于r h og t p a s e s 在细胞内的定位具有重要 作用。t a k a i 等研究发现，在未激活的细胞胞浆( c y t o s 0 1 ) 内r h og d i 与r h o g t p a s e s 结合形成g d i r h o 复合物，可以抑带t j g d p 与g t p 的相互转换；当细 胞被激活时，r h og t p a s e s 与r h og d l 分离，r h og t p a s e s 转移至细胞膜处 盼引。对于r h og t p a s e s 与r h og d l 分离机理，目前还不清楚。但是t a k a h a s h i 等通过研究e r h 蛋白与r h og d i 相互作用，对r h og t p a s e s 与r h og d l 分离 机理的研究取得了一些进展d 8 j 。e r m 蛋白包括埃兹蛋白( e z r i n ) 、根蛋白 ( r a d a x i n ) 和膜突蛋白( m o e s i n ) ，该类蛋白通过其羧基末端和氨基末端与 跨膜蛋白c d 4 4 等结合9 删。另外，e r m 蛋白也可以与r h og d i 相互作用1 。 t a k a h a s h i 研究发现根蛋白等e r m 蛋白的氨基末端能抑带i r h og d i 的活性， 其主要是e r m 蛋白的氨基末端与r h og d i 结合形成复合物，进而促使r h o r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 g t p a s e s 与r h og d l 分离口8 l 。另外，在根蛋白等e r m 蛋白存在的情况下，r h o 的g e f 可以加快与r h og d i 结合的r h o 的g t p g d p 转换速度，这些研究表明 e r m 蛋白家族参与r h o 的活化。 综合以上研究结果，可以看出r h og d i 具有三种不同的生物学功能： ( 1 ) 抑铝i j g d p 从r h og t p a s e s 上解离，使r h og t p a s e s 处于与g d p 结合的失活 状态，并阻止r h og t p a s e s 被g e f 激活；( 2 ) 与g t p 结合的r h og t p a s e s 蛋白 结合，抑锘l j r h og t p a s e s 的g t p 酶活性，并阻止r h og t p a s e s 和相应的效应 分子相互作用；( 3 ) 促使r h og t p a s e s 从细胞膜的释放，有助于亚细胞定 位铊4 驯。 1 1 4r h og t p a s e s 的上游信号分子、串话及r h o 蛋白之间的相互作用 除了上述调节r h og t p a s e s 活性的调节因子外，细胞信号转导过程中， 细胞内还存在激活r h og t p a s e s 细胞信号通路的上游信号分子，可以将细 胞外信号刺激通过细胞质膜受体传递到细胞内部，产生一系列的生物学 效应。 目前，已发现细胞信号转导过程中r h og t p a s e s 的一些上游信号分子， 如异源三聚体g 蛋白( h e t e r t r i m e r i cg t pp r o t e i n s ) 、磷脂酰肌醇3 激酶 ( p 1 3k i n a s e ，p 1 3 k ) 等。异源三聚体g 蛋白由q 、和y 三种亚基组成， 具有7 个跨膜结构域，各种异源三聚体g 蛋白的q 亚基都具有一个g t p 结合 位点m 3 。缓激肽( b r a d y k i n i n ) 、溶血凝脂酸( 1 y s o p h o s p h a t i d i ca c i d ，l p a ) 和盘舌蟾素( b o m b e s i n ) 等在细胞膜上受体是一些异源三聚体g 蛋白。 c o lli n s 等报道，激活突变型( a c ti v a t e dm u t a n tf o r m ) 异源三聚体g 1 2 蛋 白的q 亚基同r a c 一样，可以激活j n k 的生物活性，异源三聚体g 蛋白b 和 硕十学1 ：) = 论文 y 亚基也参与细胞内毒蕈型胆碱受体m 1 、m 2 ( m la n dm 2m u s c a r i c r e c e p t o r s ，m a c h r s ) 至i j j n k 的信号转导过程n 5 删。另外，在酿酒酵母细胞体 内也发现，异源三聚体g 蛋白1 3 和y 亚基是c d c 4 2 的上游信号分子n 引。另 一种r h og t p a s e s 的上游信号分子p 1 3 k 也参与r h og t p a s e s 调节的细胞信 号途径。k o t a n i 等发现，p 1 3 k 参与血小板生长因子( p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 和胰岛素( i n s u l i n ) 等诱导物所诱导的细胞骨架 重组的细胞信号转导过程。他们在成纤维细胞中发现，用p 1 3 k 的抑制剂 渥曼青霉素( w o r t m a n n i n ) 处理细胞，发现渥曼青霉素会抑$ 1 j p d g f 等诱导 物诱导的细胞膜皱褶的出现h 8 49 i 。另外的研究发现，p d g f 可通过激活p 1 3 k 来调节g e f 的活性，将信号刺激传递给r a c 腩0 | 。因此，p 1 3 k 可以作用为r a c 的上游信号分子，将细胞外界刺激转导到细胞内，完成细胞信号转导过 程。 一些小g 蛋白的其他家族蛋白和r h o 家族蛋白之间会出现串话 ( c r o s s t a l k ) ，这些不同的蛋白相互作用，共同调节细胞的各种生命活 动。例如，成纤维细胞中显性激活突变( d o m i n a n ta c t i v em u t a n t ) 的r h o 不会诱导癌变，但负显性突变( d o m i n a n tn e g a t i v em u t a n t ) 的r h o 却能抑 s j r a s 诱导的细胞癌变嵋1 5 2 1 。另有报道指出，负显性突变的r a c 和c d c 4 2 会 抑$ 1 j r a s 诱导的细胞癌变，但显性激活突变的r a c 和c d c 4 2 却可以加速原癌 基因r a s 诱发的细胞形态学的改变3 5 4 f 。 另外，r h o 家族蛋白分子之间相互作用，形成一系列信号级联反应， 从而将信号传递给下游效应分子。在r h o 家族蛋白与细胞骨架的研究中， l p a 激活r h o 诱导细胞骨架形成应力纤维和粘着斑，缓激肽激活c d c 4 2 诱导 r a c 、c d c 4 2 信号转导通路的f r e t 单分子探针的特征分析 细胞骨架形成丝状伪足，而胰岛素或p d g f 激活r a c 诱导细胞骨架形成膜皱 褶和片状伪足( 图1 - 3 ) 。n o b e s 在对成纤维细胞s w i s s3 t 3 的研究中发现， 被缓激肽激活的c d c 4 2 可激活r a c ，r a c 再激活r h o 晴引。c d c 4 2 激活形成丝状 伪足，c d c 4 2 又激活r a c 从而在细胞中形成膜皱褶和片状伪足，因此，细 胞内同时出现丝状伪足和片状伪足。但很难观察到由r h o 诱导形成的应力 纤维和粘着斑，其可能是级联反应中激活的r a c 活性较弱或者是r h o 的激 活滞后所造成的。但是值得注意的是在成纤维细胞s w i s s3 t 3 存在上述r h o 家族蛋白分子信号级联反应，其他类型的细胞中的级联反应却很少见到。 另外，培养细胞n 1 e - 1 1 5 还出现r a c 和c d c 4 2 抑$ 1 r h o 的活性，同时r h o 抑制 r a c 和c d c 4 2 的活性的现象汹1 。 图卜3r h o 蛋白之问相互作用模式图 1 1 5r h og t p a s e s 的下游效应分子 r h og t p a s e s 在上游信号分子和g e f 的调节下，将细胞信号刺激传递给 下游效应分子。目前已发现了一系列r h og t p a s e s 的下游效应分子，这些 效应分子沿着不同的细胞信号转导途径调节细胞的各项生命活动过程。 表1 - 2 是在真核生物的哺乳动物和酵母两类生物中已证实的r h o 、r a c 和 1 1 硕十学位论文 c d c 4 2 的下游效应分子，其中p 1 3 k 是r h o 、r a c 和c d c 4 2 的三者共同效应分 子，但其他的效应分子与其相应的r h og t p a s e s 各不相同，表明在细胞内 有各种不同的细胞信号途径调控着细胞的各项生命活动。 表1 2r h o r a c c d c 4 2 的效应分子 p l ，p h o s p h a t l d y l i n o s i t o l 在上述各种效应分子中，p a k 是研究较多的一类效应分子，它是r a c 和 c d c 4 2 的下游效应分子，能被活化的r a c 和c d c 4 2 激活。p 2 1 活化激酶 ( p 2 1 一a c t i v a t e dk i n a s e ，p a k ) 是一类保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶， 分子量为6 0 - 7 0 k d 。目前已经发现两个亚群6 种p a k 家族成员，第一个亚群 包括p a k l ，p a k 2 和p a k 3 _ 一= 种亚型，第二个亚群包括p a k 4 ，p a k 5 和p a k 6 三种 亚型引。其中p a k l 主要分布在脑、肌肉和脾中。p a k l 包含c 一末端激酶区 和n 一末端调节区。卅末端调节区含