（遗传学专业论文）农杆菌介导npr1基因转化安祖花的研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文 致谢 首先感谢周根余、 李建粤和杨仲南老师在这三年中给予我学业上 的悉心指导和生活上的关心照顾 ! 本论文的选题、实验设计、 操作和论文整理等过程， 都凝结着周 老师的心血和汗水。 他严谨的治学态度， 兢兢业业的工作精神以及镇 密的科学思维将使我受用终生，谨此致以虔诚的敬意和衷心的感谢! 感谢本实验室的所有同学 ( 刘石泉、 余庆波、 路群、丁淑燕、吴 翠蓉、于爱萍、赵小梅、周伟、 陈军峰、戴黎明等 ) 给 予的关心和帮 助! 刘石泉同学在实验操作和结果分析等方面都给了我极大的帮助， 再次向他表示诚挚的谢意! 感谢杨老师实 验室的 王晨和李老师实 验室 的刘佳、 闰其涛、 米东等， 实验的成功同样离不开他们的关心和帮助 ! 同时感谢中国科学院植物生理生态研究所何祖华老师的指导与支持生 最后感谢一直支持我、关心我、 理解我的丈夫、 父母和姐姐 全 三 年来，他们的关怀与宽容是我不断前进的动力! 感谢所有关心和帮助过我的人! 上海师范大学硕士学位论文摘 要 摘要 安祖花终年开花，且花枝独特，是极具价值的观花观叶植物。但在栽培过 程中，常常受到病虫的危害， 严重影响其产量和质量。 利用农杆菌把植物系统获 得性抗性的关键调节篡因n p r 1 转化安祖花，以获得抗性转基因植株，具有重大 的现实意义和经济意义。 以安祖花顶芽为外植体诱导愈伤组织，并通过不同切割方式的实验建立了 从愈伤组织在短期内得到大量优质再生苗的组培体系。 为转化提供了良 好的再生 体系。 通过安祖花愈伤组织和芽对不同种类和浓度抗生素敏感性实验，确定了愈 伤 组织和芽 筛选抗 生素的种 类和 浓度为: 潮霉素5 0 m g i l ， 头抱霉 素5 0 0 m g i l , 以愈 伤组织为外植体，通过根癌农杆菌 l b a 4 4 0 4介导， 将构建于质粒 p c a m b i ri 1 3 0 1 的n p r 1 基因 转化安 祖 花 并对转 化条 件进行了一 系列的 优化: 愈 伤组织预培养 3 天， 2 3 时农杆菌菌滚浸染 2 0 m i n ，不用无菌水清洗与农杆菌共 培养5 天。实验结果，最终得到了7 株抗性再生植株， 经 p c r 检测 7 株再生苗均 为转基因植株。 研究结果表明 n p r 1基因利用农杆菌介导转化安祖花可以使安祖花获得具 广谱抗性的种质资源 。 关键词: 安 祖花、 n p r 1 基因、 遗 传转化、获 得胜 广谱抗性。 上海师范大学硕士学位论文摘 要 ab s t r a c t a n t h u r i u n a n d r e a n u m l i n d . , w it h a t t r a c t i v e w a t t l e s , v a r i o u s l e a v e s a n d c o l o r f u l b l o s s o m i n a l l s e a s o n s , i s a f a v o r a b l e f l o w e r i n t h e w o r l d . s u f f e r in g fr o m i n s e c t s a n d v i rus , i t b e a r s a g r e a t l o s s e v e r y y e a r . n p r 1 , c o l o n e d fr o m a r a b id o p s i s t h a l i a n a , i s a k e y r e g u l a t o r y g e n e o f s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e ( s a r ) . a n t h u r i u d a n d r e a n u m l i n d w a s t r a n s f o r m e d w i t h a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s c a r t i n g n p r 1 t o o b t a i n t r a n s g e n i c l i n e s r e s i s t a n t t o s o m e i n s e c t s a n d . v i r u s , w h i c h h a v e m a d e i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n t o z o o l o g y a n d e c o n o m i c s . p e a k b u d s w a s u s e d to in d u c e .a lo t o f c a ll u s . c a ll u s w e re c u t in t h r e e d iff e r e n t w a y s , a n d a n u m b e r o f p l a n e t s w i t h h i g h q u a l i t y w e r e o b t a i n e d . t h u s , a n e f f i c i e n t r e g e n e r a t i o n s y s t e m o f a n t h u r i u n a n d r e a n u m l i n d . f r o m c a ll u s l w a s e s t a b li s h e d d u r i n g a s h o r t t i m e , w h i c h p r o v i d e d a g o o d p r e p a r a t i o n f o r g e n e t r a n s f o r m a t i o n . c a l l u s w e r e u s e d a s r e c i p i e n t o f t r a n s f o rm a t i o n . a s e r i e s o f .t r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n s w e r e o p t i miz e d . a f t e r i n f e c t e d a n d c o - c u lt u r e d w i t h a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s c o n t a i n i n g t r a n s f o r m a t i o n v e c t o r p c a m b i a l 3 0 1 w i t h n p r i u n d e r 3 d a y s p r e - c u l t u ri n g , 2 0 c , 2 0 m i n m a r i n a t i o n , 5 d a y s c o - c u l t u r e d , c a l l u s p r o d u c e d 7 p l a n e t s o n s e l e c t i o n m e d iu m s u p p l e m e n t e d w i t h 4 0 0 m g / l c e f a n d 5 0 m g / l h y g f i n a l l y . t h r o u g h p c r a n a l y s i s t e s t , 7 p l a n e t s w e r e s h o w n t o c o n t a i n n p r i g e n e p r i m a r i l y . r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e b r o a d - s p e c tr u m d i s e ase r e s i s t a n c e c o u l d b e a c h i e v e d b y a n t h u r i u n a n d r e a n u m l i n d . m e d i a t e d b y a g r o b a c t e r iu m t u m e f a c i e n s e a r r i n g n p r i ge n e . k e y w o r d : a n t h u r i u n a n d r e a n u m l i n d . , n p r i g e n e , g e n e t r a n s f o r m a t i o n ， s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e . 上 海 师 范大 学 硕 士学 位 论文第 一 部分文 献综 述 第一部分文献综述 一、安祖花研究进展 安祖花 ( a n t h u r i u n a n d r e a n u m l i n d . )又名大叶花烛、火鹤、红掌，是天南 星科花烛属多年生草本植物。 原产于南美洲热带雨林中， 生长于潮湿半阴的沟谷 环境，喜阴，喜温热，目前在荷兰、以色列和夏威夷广泛栽培。其花枝独特，具 艳丽的红色蜡质佛焰苞和黄色的肉穗花序， 终年开花不断: 安祖花叶型别致，叶 片深绿色，有光泽，呈长圆状、心形和卵圆形，也是一类极具价值的观叶植物。 自1 8 5 3 年t ri a n a m在哥伦比亚的新格林那海拔3 6 0 m的乔寇发现安祖花种， 1 8 7 6 年先由 法国 植物学 家e l o n a r d a n d : 将安 祖花传至欧洲， 并 培育出 许多变 异种。 我 国 直 到19 8 “ 年 荷 兰 半 京 举 办 花 展 时 才 开 始 引 入 ， 1 9 8 7 年 北 京 市 花 木 公 司 首 先 进 行了 安祖花苗 组织 培养 湘栽语方 面的 研究。 在1 9 9 3 年 我国 第3 届花一即 博览 会上 ， 安 ， 。 花 以 其 独 特 的 观 赏 魅 森获 金 奖 ， 在， 9 9 5 年 世 界 花 卉 展 览 会 上 也 倍 受 人 们 的青a，是一种有远大发展前途的名优观赏花卉。 1组织培养 自 然条件 下 ，安祖花以分株方式繁殖， 速度较慢。2 0 世纪 7 0 年代末，荷兰 首先利用组织培养的方法获得无病毒安祖花植株。 随后， 国内外许多学者对安祖 花不同外植体进行了离体培养的研究，以建立一个成本低、 繁殖速度快、 成苗壮 的快速繁殖体系，实现安祖花规模化、产业化的栽培和生产。 1 . 1 外植体 不同部位的外植体， 愈伤组织的诱导率和芽分化率差异较大。 王进茂等的研 究表明， 茎段愈伤组织诱导率和分化率最高， 叶片次之，根尖愈伤组织诱导率仅 为 而且叶片背 面向下比背面向上更有利于愈伤组织的诱导和分化。 对叶片的不同部位的分化能 力进行的研究结果表明， 远轴端的分化能力较强，而近轴端和中轴端的分化能力 较弱。综上所述，安祖花不同外植体的愈伤组织诱导率和分化率差异显著，而且 同一外植体的不同部位、 生理状况和接种方式也影响着愈伤组织的诱导率和分化 率。 1 .2 基本培养基 培养基中无机盐的含量对安祖花的离体培养影响较大口蔡维潘试验 了 n h 4 n o 3 的 浓度 对叶片 诱导的 影响， 结果表明 ， n h 4 n o 3 浓度为2 0 0 m g / l 时， 愈 伤 率高且芽点多。 . 这与肖三元护 黄小光的研究结果一致。 高浓度的大量元素对根的 发 生 有抑制作 用， 所以诱 根培 养基 应以 1 / 2 m s 为宜。 葡萄糖浓 度为 3 % 时， 最 适于愈伤的诱导与生长。 1 . 3 橄素 激素对安祖花的组织培养起着非常重要的作用。2 , 4 - d是影响愈伤组织诱 导 的主要 因素， 浓度为 l m g / l时愈 伤组织的 数量最多， 且质量 最好。 不同 细 胞 分裂素 对愈 伤组织分化的 效果 不同， b a , z t的 效果较好， 而k t 较差， 组合 使 用的细胞分裂素比单独使用一种更有利于芽的继代和增殖。即使低浓度的 n a a c o . l m g / l ) 也 抑制芽 的分 化与增 殖。 生长素的 种类和 浓度对生根 率的 影响不 显 著，生根率都为 1 0 0 % ，但对根的数量和向性有较大的影响，i a a , n a a诱导的 根多为向 上的 气生根， 移栽 成活率 低， 而附 加i b a时， 气 生根仅为2 1 . 3 % . 1 . 4 光照与温度 许多学者的研究表明， 光照是愈伤组织形成和分化必不可少的因素。 光强在 8 0 0 - 1 5 0 0 1 x范围内愈伤率最高.而光强超过 3 0 0 0 1 x时，愈伤组织将褐化死亡。 温度不仅影响愈伤组织的形成， 而且强烈影响安祖花的生长发育。 安祖花愈伤组 织 对 高 温 较 敏 感 ， 温 度 超 过3 0 时 ， 即 褐 化 死 亡 。 安祖花生长的最适温度为2 6 时，此时切花的品质最好:当温度为 1 5 时其产 上海师范大学硕士学位论文第 一 部 分文 献 综 述 量与品质最差， 植株易受寒害; 温度 2 9 .5 时，易受高温伤害。 温度对安祖花生 长发育造成的影响可能与过高、过低温度导致其营养吸收异常，使植株对 c a 元 素吸收能力减弱有关。 2 组织细胞学观察 安组花叶片接种一个月后， 由切口处产生淡黄绿色瘤状愈伤组织， 两个月后， 表面形成锥状突起， 随后形成幼芽。 切片观察发现. 在愈伤组织近表层有大量的 分生细胞团， 主要由一些近圆形的细胞组成，细胞小，核大， 胞质浓厚，为典型 的分生细胞。 通过镜检未发现有丝分裂的细胞， 从来源同一母细胞的子细胞的排 列方式看， 细胞是以无丝分裂的方式增殖， 部分甚至以破碎的方式进行。 这些分 生细胞团向愈伤组织表面扩展， 渐渐发育为芽的生长点。 然后发育成叶原基， 同 时内部细胞发生组织化， 表现为细胞伸长， 部分长形细胞间发生溶壁现象，发展 成为幼芽的维管组织。 芽纵切面上呈现出两个平行排列的维管束， 表明安祖花苗 的发生是以不定芽的途径发育而来的。 杨涛等对安祖花叶片进行离体培养时得到了两种类型的愈伤组织: 疏松型愈 伤组织和致密型愈伤组织。 电镜观察二者在超微结构上有很显著的差异， 疏松型 愈伤组织的细胞质稀薄， 液泡大， 细胞器个数较少， 观察不到典型的质体和前质 体; 致密型愈伤组织细胞质浓， 液泡小，并可清楚的看到叶绿体和线粒体内部结 构和发育过程。由此可知， 疏松型愈伤组织细胞不能分化的原因之一是由于叶绿 体过度退化，丧失再生功能所造成的。 3 基因工程 2 . 1 杂种鉴定 许多 学 者应用 t r n 峨 基因内 序列 细胞核标记 和内 部改 写空间2 ( i t s 2 ) 序列 分析法进行植物分类和进化的研究， 这些标记能有效的区分相近的种。 李云善等 采用以 p c r 技 术为基 础的t r n a c0m 基因内 序列细胞核 标记和内 部改写 空间2 ( i t s 2 ) 序列2 种方法对7 个安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋的属间杂种进行 鉴定。 在t r n 心 基因内 序列 细胞 核标记分 析中， 7 个 属间 杂种及4 个亲本 共扩增 出1 3 个位点。杂种获得的谱带有 2 种类型:无父本特异性谱带出现，新谱带出 上海师范大学硕士学位论文第 一 部 分文 献 综 述 量与品质最差， 植株易受寒害; 温度 2 9 .5 时，易受高温伤害。 温度对安祖花生 长发育造成的影响可能与过高、过低温度导致其营养吸收异常，使植株对 c a 元 素吸收能力减弱有关。 2 组织细胞学观察 安组花叶片接种一个月后， 由切口处产生淡黄绿色瘤状愈伤组织， 两个月后， 表面形成锥状突起， 随后形成幼芽。 切片观察发现. 在愈伤组织近表层有大量的 分生细胞团， 主要由一些近圆形的细胞组成，细胞小，核大， 胞质浓厚，为典型 的分生细胞。 通过镜检未发现有丝分裂的细胞， 从来源同一母细胞的子细胞的排 列方式看， 细胞是以无丝分裂的方式增殖， 部分甚至以破碎的方式进行。 这些分 生细胞团向愈伤组织表面扩展， 渐渐发育为芽的生长点。 然后发育成叶原基， 同 时内部细胞发生组织化， 表现为细胞伸长， 部分长形细胞间发生溶壁现象，发展 成为幼芽的维管组织。 芽纵切面上呈现出两个平行排列的维管束， 表明安祖花苗 的发生是以不定芽的途径发育而来的。 杨涛等对安祖花叶片进行离体培养时得到了两种类型的愈伤组织: 疏松型愈 伤组织和致密型愈伤组织。 电镜观察二者在超微结构上有很显著的差异， 疏松型 愈伤组织的细胞质稀薄， 液泡大， 细胞器个数较少， 观察不到典型的质体和前质 体; 致密型愈伤组织细胞质浓， 液泡小，并可清楚的看到叶绿体和线粒体内部结 构和发育过程。由此可知， 疏松型愈伤组织细胞不能分化的原因之一是由于叶绿 体过度退化，丧失再生功能所造成的。 3 基因工程 2 . 1 杂种鉴定 许多 学 者应用 t r n 峨 基因内 序列 细胞核标记 和内 部改 写空间2 ( i t s 2 ) 序列 分析法进行植物分类和进化的研究， 这些标记能有效的区分相近的种。 李云善等 采用以 p c r 技 术为基 础的t r n a c0m 基因内 序列细胞核 标记和内 部改写 空间2 ( i t s 2 ) 序列2 种方法对7 个安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋的属间杂种进行 鉴定。 在t r n 心 基因内 序列 细胞 核标记分 析中， 7 个 属间 杂种及4 个亲本 共扩增 出1 3 个位点。杂种获得的谱带有 2 种类型:无父本特异性谱带出现，新谱带出 上海师范大学硕士学位论文第 一 部 分文 献 综 述 量与品质最差， 植株易受寒害; 温度 2 9 .5 时，易受高温伤害。 温度对安祖花生 长发育造成的影响可能与过高、过低温度导致其营养吸收异常，使植株对 c a 元 素吸收能力减弱有关。 2 组织细胞学观察 安组花叶片接种一个月后， 由切口处产生淡黄绿色瘤状愈伤组织， 两个月后， 表面形成锥状突起， 随后形成幼芽。 切片观察发现. 在愈伤组织近表层有大量的 分生细胞团， 主要由一些近圆形的细胞组成，细胞小，核大， 胞质浓厚，为典型 的分生细胞。 通过镜检未发现有丝分裂的细胞， 从来源同一母细胞的子细胞的排 列方式看， 细胞是以无丝分裂的方式增殖， 部分甚至以破碎的方式进行。 这些分 生细胞团向愈伤组织表面扩展， 渐渐发育为芽的生长点。 然后发育成叶原基， 同 时内部细胞发生组织化， 表现为细胞伸长， 部分长形细胞间发生溶壁现象，发展 成为幼芽的维管组织。 芽纵切面上呈现出两个平行排列的维管束， 表明安祖花苗 的发生是以不定芽的途径发育而来的。 杨涛等对安祖花叶片进行离体培养时得到了两种类型的愈伤组织: 疏松型愈 伤组织和致密型愈伤组织。 电镜观察二者在超微结构上有很显著的差异， 疏松型 愈伤组织的细胞质稀薄， 液泡大， 细胞器个数较少， 观察不到典型的质体和前质 体; 致密型愈伤组织细胞质浓， 液泡小，并可清楚的看到叶绿体和线粒体内部结 构和发育过程。由此可知， 疏松型愈伤组织细胞不能分化的原因之一是由于叶绿 体过度退化，丧失再生功能所造成的。 3 基因工程 2 . 1 杂种鉴定 许多 学 者应用 t r n 峨 基因内 序列 细胞核标记 和内 部改 写空间2 ( i t s 2 ) 序列 分析法进行植物分类和进化的研究， 这些标记能有效的区分相近的种。 李云善等 采用以 p c r 技 术为基 础的t r n a c0m 基因内 序列细胞核 标记和内 部改写 空间2 ( i t s 2 ) 序列2 种方法对7 个安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋的属间杂种进行 鉴定。 在t r n 心 基因内 序列 细胞 核标记分 析中， 7 个 属间 杂种及4 个亲本 共扩增 出1 3 个位点。杂种获得的谱带有 2 种类型:无父本特异性谱带出现，新谱带出 上海师范大学硕士学位论文 第 一 部分文 献综 述 现。 新谱带的出 现 表明了 杂种的 遗传 组成同亲本相比 发生了 变化， 因 此， 用t r n a c 二 基因序列细胞标记分析只鉴定出一个真正的安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮 小苞叶芋属间杂种。 i t s 2 序列法扩增出 2 8 个位点，杂种谱带有3种类型:无父 本特异性谱带出现， 新谱带出 现， 既有父本特异性谱带又有新谱带出现。杂种是 父本基因转移到母本中产生的， 在分子标记中以父本谱带的形式出现，因此， 父 本谱带的出现和新谱带的出现均可作为鉴定杂种的依据。应用i t s 2序列法鉴定 出6 个属间 杂种。 此研究证实了 t r n 叹 众 基因内 序列 细胞 核标记和内 部改写空间2 ( i t s 2 )序列分析法也可用于安祖花属间杂种的鉴定。 3 . 2 遗传转化 1 9 9 1 年k u e h n l e 和s u g i l 的 研究显示 根癌农 杆菌 可以 浸染安 祖花。 c h e n - f和 k u e h u l e 等用安祖花离体培养再生根与根癌农杆菌 l b a 4 4 0 4进行共培养，得到 转化再 生小 植株， 但转化率 很 低， 仅 为1 . 3 % . g e k - l a n c h i . h e d y k等分别 用含 有p u g c i 玉米 泛素启 动子， p e f - la - a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 拟南芥 启动子和3 5 s 即 p 7 0 g u s - c a m v启动子的 质粒， 进行金微载体的基因 枪轰击愈伤组 织和整个叶 片， 轰击2 4 h 或4 8 h内 可 观察 到g u s 基因的 瞬时 表达。 其中 用p u g c 1 玉 米泛 素启动子， g u s基因得到最高表达量，说明外源基因在安祖花的表达上采用单 子叶植物启动子比采用拟南芥双子叶植物中的启动子更有效。 4 病虫害防治 栽培过程中， 安祖花常常受到病虫的危害， 严重影响其产量和质量。 而且安 祖花在药物防治中很容易出 现药害， 即花朵和叶片的形态发生变异。因此，在喷 施任何一种新的药剂时， 需根据其生长的季节、 长势和危害程度等，事先进行小 区试验。同时， 一些危害安祖花的害虫也非常容易产生抗药性， 同一种药品不能 连续使用三次，最好经常更换使用。表 1 - 1 和表 1 - 2 介绍了有关安祖花病虫害的 种类、症状和防治措施。 f u k u i r等对按祖花病虫害方面的研究甚多，为其栽培提供了大量的理论和 现实意义。 1 9 9 8 年 f u k u i r等检测到安祖花对叶片浸染和系统侵染两个不同时期 的 敏感 性不同。 通过 利用黄单 胞杆菌 的生物发 光菌株v 1 0 8 l r v h i 检测， 发现病 原菌侵染到一个叶片后， 马上会侵染到整个植株， 同时发现安祖花对系统侵染的 上海师范大学硕士学位论文 第 一 部分文 献综 述 现。 新谱带的出 现 表明了 杂种的 遗传 组成同亲本相比 发生了 变化， 因 此， 用t r n a c 二 基因序列细胞标记分析只鉴定出一个真正的安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮 小苞叶芋属间杂种。 i t s 2 序列法扩增出 2 8 个位点，杂种谱带有3种类型:无父 本特异性谱带出现， 新谱带出 现， 既有父本特异性谱带又有新谱带出现。杂种是 父本基因转移到母本中产生的， 在分子标记中以父本谱带的形式出现，因此， 父 本谱带的出现和新谱带的出现均可作为鉴定杂种的依据。应用i t s 2序列法鉴定 出6 个属间 杂种。 此研究证实了 t r n 叹 众 基因内 序列 细胞 核标记和内 部改写空间2 ( i t s 2 )序列分析法也可用于安祖花属间杂种的鉴定。 3 . 2 遗传转化 1 9 9 1 年k u e h n l e 和s u g i l 的 研究显示 根癌农 杆菌 可以 浸染安 祖花。 c h e n - f和 k u e h u l e 等用安祖花离体培养再生根与根癌农杆菌 l b a 4 4 0 4进行共培养，得到 转化再 生小 植株， 但转化率 很 低， 仅 为1 . 3 % . g e k - l a n c h i . h e d y k等分别 用含 有p u g c i 玉米 泛素启 动子， p e f - la - a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 拟南芥 启动子和3 5 s 即 p 7 0 g u s - c a m v启动子的 质粒， 进行金微载体的基因 枪轰击愈伤组 织和整个叶 片， 轰击2 4 h 或4 8 h内 可 观察 到g u s 基因的 瞬时 表达。 其中 用p u g c 1 玉 米泛 素启动子， g u s基因得到最高表达量，说明外源基因在安祖花的表达上采用单 子叶植物启动子比采用拟南芥双子叶植物中的启动子更有效。 4 病虫害防治 栽培过程中， 安祖花常常受到病虫的危害， 严重影响其产量和质量。 而且安 祖花在药物防治中很容易出 现药害， 即花朵和叶片的形态发生变异。因此，在喷 施任何一种新的药剂时， 需根据其生长的季节、 长势和危害程度等，事先进行小 区试验。同时， 一些危害安祖花的害虫也非常容易产生抗药性， 同一种药品不能 连续使用三次，最好经常更换使用。表 1 - 1 和表 1 - 2 介绍了有关安祖花病虫害的 种类、症状和防治措施。 f u k u i r等对按祖花病虫害方面的研究甚多，为其栽培提供了大量的理论和 现实意义。 1 9 9 8 年 f u k u i r等检测到安祖花对叶片浸染和系统侵染两个不同时期 的 敏感 性不同。 通过 利用黄单 胞杆菌 的生物发 光菌株v 1 0 8 l r v h i 检测， 发现病 原菌侵染到一个叶片后， 马上会侵染到整个植株， 同时发现安祖花对系统侵染的 上海师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 敏感性和对叶片侵染的敏感性并不总是一致的， 从而推断出安祖花对疫病的抗性 依赖于病情发生的时期。 1 9 9 9 年 f u k u i r等发现， 从安祖花叶片得到的细菌混合 物即b i o l o g i c a l c o n t r o l a g e n t ( b c a : g u t 3 , g u t 4 , g u t 5 , g u t 6 , g u t 9 ) 对 安祖花叶片吐水液体的黄单胞杆菌的生长和存活有抑制作用。f u k u i r还比较了 单种或多种菌株在生物防治细菌枯萎病中不同。 研究表明， 单独 g u t 6 菌株、任 何一种含 g u t 6的混合菌株、 b c a 、 除g u t 9的4 种菌株混合物均对 v 1 0 8 l r v h 1 感染的伤口和随后的叶片感染有抑制作用，同时还指出，选择有效的b c a混合 成分来发现最有效的b c a组合比单独选菌株再组合起来有效。在对线虫病的研 究的研究上， k o o n - h u i 等对两种安祖花栽培种接种线虫， 9 个月 后， 线虫分布在 整个植株，且茎尖也有线虫的分布，用脱毒增殖的方法也不能去除口 表 1 - 1 :安祖花虫害及防治 t a b l e 1 - 1 : t h e in s e c ts o l an t h u r i u n a n d r e a n u m lin d . a n d r e me d y 害虫种类 害虫特征植物症状防治措施 蚜虫 淡绿色、 粉色、 红色等， 长约2 m，六足，增殖 速度快. 花、叶产生斑点 5 0 % 抗蚜威7 5 0 9 / h m 抗蚜威熏蒸剂3 0片 a. , 氧化乐果工 . 5 l / h . ( 对水 7 5 0 9 0 0 l / m l 喷施) 红蜘蛛 卵圆形，白绿色，透明 虫子 幼叶和幼芽枯萎，老叶变 黄， 花上有棕色斑点， 植株 畸形 4 0 % 三氛杀蜗醇 3 l / h e 2 0 % 三氛杀蜗枫 1 . 5 l am 5 0 % 除靖灵 1 . 5 l / h m 开乐散2 2 5 0 9 / h m ( 对水7 5 0 - 9 0 0 l / m l 喷施) 蓟马类 休形小而细长，两对 翅，谈棕黄色 叶片、 花朵有棕色条纹， 幼 叶受害重时， 叶皱缩或畸形 5 0 % 残杀威1 . 5 k g / h m 灭虫威 9 0 0 - 1 0 5 0 m l / h m 灭多虫 1 . s l / h m 氧化乐果2 . 2 5 l / h m (对水 7 5 0 - 9 0 0 uml 喷施) 介壳虫类 体形小呈球形，棕色 壳，刺吸式口器 生长不良，失去抗病能力， 最终导致植株死亡 4 0 % 速介克乳油3l/he 3 5 % 快克乳油 2 . 2 5 l / h m (对水7 5 0 - 9 0 0 l / m l 喷施) 白 蝇 长l o o n ， 成虫体表有一 层蜡状白粉 叶片脱色 灭 多 虫1 . 5 k g / h m 2 0 % 灭菊酣3 . 7 5 l / h m ( 对水7 5 0 - 9 0 0 l 加1 喷施) 蛾姑 体形大 而长， 约 3 0 m m , 前翅较短 根部受损 4 % 灭虫威5 k m g / h m 鳞翅目 体表附鳞片， 虹吸式口 器 叶片和花朵受损 灭多 虫1 . 5 k g / h m ? 安达灵0 . 6 l / h m 0 ( 对水 7 5 0 - -9 0 0 l / m l喷施) 上海师范大学硕士学位论文第 一 部分文 献综 述 表 1 - 2 : 安祖花病害及防治 病源种类 分类 细菌性枯萎病 x a n t h o m o n a s c a n p e s e r i s p v . d i e f f e n b n c h i e e 症状 叶片、花朵有棕色小点， 点的边缘呈黄色 防治措施 农用硫酸链霉素2 0 0 x 1 0 - 或农霉素、植霉素 细菌病害假杆菌病 p s e u d o s o o a s 沿叶脉生炭疽斑，黑色斑 点，四周有黄色薄圆圈 农用硫酸链霉素2 0 0 x 1 0 - 或农霉素、植霉素 伊尔瘟病 e r ， i n l a 叶变黄，自茎基部开始沿 主脉上升。幼株发病严重 农用 硫 酸链 霉素2 0 0 x 1 0 7 5 % 百菌可湿性粉剂2 2 5 0 g / h m 真菌病害 斑点病 a n t h r a c n o s e 潮湿情况叶片有很多黑斑 点，干燥情况下叶边缘有 淡棕色斑点 5 0 % 苯菌灵2 2 5 0 g / h 斌 5 0 % 多菌灵2 2 5 0 g / h m 7 0 % 代森锌4 5 0 0 g / h m ( 对水 7 5 0 - 9 0 0 l / m l喷施) 根腐病 r o o t n o t 叶边变黄下垂，根外部呈 棕色，或茎、根部都变成 棕色 f o r ig a r i d l o o g - 1 5 0 8 八o o l 水 p a r a t e 1 o g - -s o g / 1 0 0 l水 简状菌缩变病 c , t i n d r e . a 印o n d e s t r u s t a n s 叶变干、变黄至枯萎，植 株基部变棕色，有时收缩 5 0 % 苯菌灵3 0 0 0 g / h m 5 0 % 多菌灵3 0 0 0 g / h 时 7 0 % 甲基托布3 0 0 0 g / h 了 (对 水 7 5 0 - 9 0 0 l / m l 喷 施 ) 简状菌病 c , i i n d r o o i e d i n v s 即 根部、基部呈暗棕色至黑 色 5 0 % 苯菌灵3 0 0 0 g / h m 5 0 % 多菌灵3 0 0 0 盯h 浦 7 0 % 甲基托布3 0 0 0 g / h m ( 对水 7 5 0 - 9 0 0 l / m 1喷施) 镰抱霉菌病 f u , , r i 曲 s p p 基部烂掉 5 0 % 苯菌灵3 0 0 0 g / h m 5 0 % 多菌灵3 0 0 0 g / h m 7 0 % 甲基托布3 0 0 0 g / h m ( 对水 7 5 0 - 9 0 0 l / m l喷施) 叶斑病 s p o t t e d l e a f 叶斑点棕色，中间枯死 四周围绕黄色组织 8 0 % 克菌丹2 2 5 0 - 3 0 0 0 8 / h m 5 0 % 百菌清3 0 0 0 8 / h m 7 0 % 代森锌4 5 0 0 8 / h m (对水 7 5 0 - 9 0 0 l 加i喷施) 根茎腐烂病 r h i . . . t i n i a 植物基部及根部变褐或黑 色 5 0 % 苯菌灵2 0 0 g / 1 0 0 l 水 5 0 % 多菌灵2 0 0 g / 1 0 0 l 水 病毒病 病毒病 y i r u s e s 黑色或青铜色干枯斑点， 外有一圈黄色环纹 5 % 菌毒清 3 0 0 0 m l / 耐 1 . 5 % 植病灵乳 1 . 2 - 2 . 2 5 1 / 耐 ( 对水 7 5 0 - -9 0 0 l / m l喷施) 0 . 2 % 高锰酸钾溶液 线虫病 线虫病 生长缓慢，恨部肿胀，畸 形叶， 植株短期停止 种植前热蒸汽 消毒 甲基澳熏蒸 1 5 % 铁灭克颗粒4 . 5 - 7 . 5 k g / h m 1 0 % 克线丹颗粒2 2 . 5 - 4 5 k g / h m 上海师范大学硕士学位论文第一部分文献综述 二、 n p r 1 基因 研究 进展 植物在长期的进化过程中， 需要不断的抵抗病原菌的毒害， 在这种相互作用、 相互影响的过程中， 植物形成了一系列复杂的防御机制来保护自己。 植物对病原 菌既有专一性抗性，也有非专一性抗性， 有的表达是组成型的，有的是诱导型的。 但人类的活动和现代工业的发展又降低了植物的抗病性， 仅虫害全世界每年造成 的损失可达数千亿美元。 传统使用化学防治的方法弊端很大， 化学试剂是非特异 性的， 在杀死了害虫的同时也杀死了益虫， 从而削弱了生物防治体系破坏了生态 平衡。同时，化学试剂还有一系列的残留问题，如污染环境，危害人体健康等。 值得欣喜的是基因工程技术为培育抗病新品种开辟了捷径。 近年来， 随着植物分 子生物学和现代生物技术的迅速发展， 分子标记技术得到了广泛应用， 分子标记 辅助育种体系日趋建立完善。自1 9 8 7年抗虫转基因植物首次实验成功以来、在 抗病性基因克隆方面， 通过转座子标签技术、 定位克隆以及染色体步行法克隆了 一系列植物抗病基因， 如: 玉米 h m基因， 西红柿 c f - 9 ， 拟南芥r p s 2 基因、 r p m1 基因、 n p r 1 基因和烟草n基因等。 利用植物本身编码的抗病毒基因获得抗性植 株是目 前植物抗病基因工程中人们关注的焦点， 从拟南芥中克隆到的n p r 1 基因 是植物系统获得性抗性的一个关键基因， 它在植物抗病基因工程中起到非常重要 的作用 。 植物抗病反应的分子生物学机制 1 . 1 病原 菌诱导的 系统获 得性 抗性 ( s y s t e m i c a c q u i re d r e s i s t a n c e , s a r 植物遇到病原物的侵袭时， 感病植物无法抵制病原菌的侵袭而发病， 但抗性 植物通过快速的识别和防御机制， 使体内的许多抗性编码基因激活， 其产物与相 应病原菌的无毒基因编码产物之间相互作用， 直接或间接的产生防御应答。 大部 分这样的相互作用将导致病原体感染部位宿主细胞的死亡， 此现象成为过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e , h r ) . h r 导 致植物在 病原菌侵 入处细胞 和组织的 程 序性 死亡 ( p r o gr a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) ，限 制和消 灭侵 入的 活体寄 生型病原 菌。 未感染组织由于受到诱导作用而形成一种长久而增强的非特异性抗病性即系 统 获得 抗性 ( s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e , s a r ) , s a r的 抗性机理不同 于物理 或化学的障碍、植保素的形成、 植物防御素的释放等抗病机理， 而是植物 自 我保 上海师范大学硕士学位论文第一部分文献综述 二、 n p r 1 基因 研究 进展 植物在长期的进化过程中， 需要不断的抵抗病原菌的毒害， 在这种相互作用、 相互影响的过程中， 植物形成了一系列复杂的防御机制来保护自己。 植物对病原 菌既有专一性抗性，也有非专一性抗性， 有的表达是组成型的，有的是诱导型的。 但人类的活动和现代工业的发展又降低了植物的抗病性， 仅虫害全世界每年造成 的损失可达数千亿美元。 传统使用化学防治的方法弊端很大， 化学试剂是非特异 性的， 在杀死了害虫的同时也杀死了益虫， 从而削弱了生物防治体系破坏了生态 平衡。同时，化学试剂还有一系列的残留问题，如污染环境，危害人体健康等。 值得欣喜的是基因工程技术为培育抗病新品种开辟了捷径。 近年来， 随着植物分 子生物学和现代生物技术的迅速发展， 分子标记技术得到了广泛应用， 分子标记 辅助育种体系日趋建立完善。自1 9 8 7年抗虫转基因植物首次实验成功以来、在 抗病性基因克隆方面， 通过转座子标签技术、 定位克隆以及染色体步行法克隆了 一系列植物抗病基因， 如: 玉米 h m基因， 西红柿 c f - 9 ， 拟南芥r p s 2 基因、 r p m1 基因、 n p r 1 基因和烟草n基因等。 利用植物本身编码的抗病毒基因获得抗性植 株是目 前植物抗病基因工程中人们关注的焦点， 从拟南芥中克隆到的n p r 1 基因 是植物系统获得性抗性的一个关键基因， 它在植物抗病基因工程中起到非常重要 的作用 。 植物抗病反应的分子生物学机制 1 . 1 病原 菌诱导的 系统获 得性 抗性 ( s y s t e m i c a c q u i re d r e s i s t a n c e , s a r 植物遇到病原物的侵袭时， 感病植物无法抵制病原菌的侵袭而发病， 但抗性 植物通过快速的识别和防御机制， 使体内的许多抗性编码基因激活， 其产物与相 应病原菌的无毒基因编码产物之间相互作用， 直接或间接的产生防御应答。 大部 分这样的相互作用将导致病原体感染部位宿主细胞的死亡， 此现象成为过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e , h r ) . h r 导 致植物在 病原菌侵 入处细胞 和组织的 程 序性 死亡 ( p r o gr a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) ，限 制和消 灭侵 入的 活体寄 生型病原 菌。 未感染组织由于受到诱导作用而形成一种长久而增强的非特异性抗病性即系 统 获得 抗性 ( s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e , s a r ) , s a r的 抗性机理不同 于物理 或化学的障碍、植保素的形成、 植物防御素的释放等抗病机理， 而是植物 自 我保 上海师范大学硕士学位论文 第 一 部分文献 综 述 护的信号传导，它依赖于植物体内的抗性基因产物 ( r e s i s t a n c e , r )与相应病原 菌无毒基因产物 ( a v i r u l e n c e , a v r )的相互作用，即美国病理学家弗洛尔提出的 “ 基因 对基因 假说” ( g e n e - f o r - g e n e h v o o t h e s i s ) a 水杨酸( s a l i c y l i c a c i d , s a ) 积累 及 病程相 关基因( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e d , p r ) 的表达在 s a r过程中起着重要的作用。s a是介导植物由局部 h r到植物产生 s a r的 信号 分子。 n a h g ( s a k i c y l a t e h y d r o x y l a s e ) 编码s a 化酶，可 降 解s a o 转 n a h g基因植物不能积累 s a ，对随后进行进行的病原菌侵入不能产生抗性， 即无s a r发生， 从而有力的证明了s a是s a r发生所必需的。除了 s a在防卫 反 应中 起重要 的 信号 分子 外， 还有茉莉 酸 ( j a s m o n i c a c i d , j a ) 、 乙 烯 ( e t h y l e n e , e t ) 、活性氧和一氧化氮作为信号分子在植物抗病中的作用也受到越来越多的重 视。 1 , 2 非病原 菌引 起的 诱导系 统抗性 ( i n d u c i n g s y s t e m r e s i s t a n ce , i s r ) 除了病原菌诱导的s a r外， 研究者还发现一些非病原菌诱寻产生的抗病性， 称为诱导系 统抗 性 ( i n d u c i n g s y s t e m r e s i s t a n c e , i s r )该体系 对多 种病原 菌抵抗 也 是非常育 效的， 如e s y r i n g a g , p v . t o m o t o 等， 具 有广谱性。 但i s r 体系与s a r 体系的信号传递途径是不同的。首先， i s r不诱导病原菌基因相关的抗性基因的 表达， 如几丁质酶、蛋白质酶抑制因子等。其次，转n a h g植物并不抑制 i s r的 产生。大量实验结果表明，在 i s r的信号传导过程中，j a和 e t是作为必需的 信号分子，而不是s ao 近年来的研究表明，s a r和i s r虽同为系统抗性，但并不存在拮抗作用。 在拟南芥的研究中发现，可同时诱导两者， 但两者却不互作。 2 . iy p r 1 基因在 s a r中的作用 虽然s a r 和i s r 诱导植物系统广谱抗性