（遗传学专业论文）六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导卜进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名 论文使用授权声明 日期： 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名日期： 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究 肖伟 摘要 铬被广泛地应用在皮革工业、电解电镀和染料制造等领域，发挥着巨大的经济价值， 但其生物毒性极大，是造成环境污染的主要重金属之一。因此，铬污染的治理引起了人 们广泛的关注。传统的物理和化学治理法包括调节p h 、絮凝沉淀、离子交换和活性炭 吸附等，但这些方法需要消耗其他能源或使用大量的化学试剂，处理成本较昂贵，且存 在着二次污染的可能。因此，铬污染的生物治理被看作是一个可以替代的治理策略。 自然环境中的铬可以2n + 6 等多个价态存在其中三价铬和六价铬是两种主要的 存在形式。六价铬的毒性最大，因为它很容易被生物体吸收，并且具有强氧化性，能引 起生物体的突变。相比之下，三价铬的毒性要低很多，因为它不易溶于水，也比较难于 穿过生物膜。已经发现许多微生物具有六价铬抗性和还原性，但能工业应用的还十分有 限，且六价铬还原的作用机理及相关还原酶的性质也不是很清楚。 为了系统筛选和分离目标菌株用于铬污染生物治理，以及研究微生物的六价铬还原 机理，本课题从宝钢电镀污泥中分离得到一系列高六价铬抗性菌株。经诱变驯化，其中 一株s 5 4 显示出高六价铬还原性，经形态和生理生化特征及1 6 sr d n a 序列比对，鉴定 为b a c i l l u s c e r e u s 。该菌株好氧生长，在固体l b 培养基上培养4 8 h 能耐受4 0 m m o l l c r 6 + ， 并对其他重金属显出耐受多样性；在液体l b 培养基中培养7 2 h 完全还原2 m m o l l c ， 并能在补充培养基和六价铬的条件下连续还原。该菌株还原六价铬时，最适浓度为 2 m m o i lc ，最适温度范围3 0 - 3 7 ，最适p h 7 - p h 9 。 对该菌株六价铬还原酶的性质及还原机理进行了初步的研究，实验发现，细菌的细 胞壁膜能阻止六价铬进入细胞，是六价铬发生还原的主要场所，其通透性的改变将影响 六价铬还原酶的作用。该菌株六价铬还原酶为非分泌型，在细菌细胞内侧发生作用，其 最适温度范围2 5 3 7 c ，最适p h 7 ，c u 2 + 有增强六价铬还原酶活性的作用。在3 7 ， 该菌株六价铬还原酶k m 为1 2 5 6 1j u n o l l ，v m 。为7 6 8 n m o l ( m i n m g m 删n ) 。 关键词：b a c i l l u s c e r e l l $ ；六价铬抗性；六价铬还原；微生物鉴定；六价铬还原酶 中图分类号：x 7 0 3 1 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 a b s t r a c t c h r o m i u m ，e v e nt h o u g l ii 缸g r e a te c o n o m i cj m p o f f a n c ei ni n d u s u yu s es u c ha si e a t h e r t a n n i n g , e l e c t r o p l a t i n g ，p a i n tp i g m e n ta n dd y em a n u f a c t u r i n g ，h a sb e e nr e c o g n i z e da so n eo f t h em o s ts e r i o u sp o l l u t a n t sa m o n gh e a v ym e t a l si ne n v i r o n m e n tf o ri t st o x i c i t yt ol i v i n g o r g a n i s m s t h u s r e m e d i a t i o no fc h r o m i u mp o l l u t i o nr e c e i v e sm u c hm o r ec o n c e m c o n v e n t i o n a lp h y s i c a la n de h e m i c a lm e t h o d sh a v ea l r e a d yb e e na p p l i e dt oc h r o m i u m r e m o v i n gt r e a t m e n ts u c ha sp r e c i p i t a t i o n ，i o ne x c h a n g e ，a b s o r p t i o no na c t i v a t e dc a r b o na n d p ha d j u s t m e n t i ng e n e r a l ，t b e s em e t h o d sa r ee x p e n s i v ed u et ot h e i rr e q u i r e m e n t sf o rh i g l l e n e r g yo rl a r g eq u a n t i t i e so fc h e m i c a la d s o r b e n t s c o n s e q u e n t l y , b i o r e m e d i a t i o ni sc u r r e n t l y r e g a r d e da sa l la l t e m a t i v es t r a t e g yf o rc h r o m i u mt r e a t m e n t i ti sw e l lk n o w nt h a tc h r o m i u me x i s t si nn a t u r a le n v i r o n m e n tw i t hd i 腩r c n tf o r i l l sw h o s e v a l e n c e sr a n g ef r o m - 2t o + 6 a n dt h a tt r i v a l e n ta n dh e x a v a l e n tc h r o m i u ma r et h et w om a i n s t a b l eo x i d a t i o ns t a t e s h e x a v a l e n tc h r o m i u ms p e c i e sa r ec o n s i d e r e da st h em o s tt o x i cf c ，r i l l o fc h r o m i u m d u et oj t se a s ya b s o r p t i o nb yd i v i n gc e l l sa n dh i g ho x i d a t i o ns t a t ew h i c hm a y c a u s em u t a t i o n s i nc o n t r a s t t r i v a l e n ts t a t ei sr e g a r d e da sm u c hl e s st o x i cb e c a u s eo fi t sl e s s s o l u t i o na n dd i s a b i l i t yt oc r o s s t h r o u g hb i o l o g i c a l m e m b r a n e s m o r ea n dm o r e m i c r o o r g a n i s m s ，w h i c hh a v es t e a d i l ys h o w nr e s i s t a n c ea n dr e d u c t i o na b i l i t yo fh e x a v a l e n t c h r o m i u m ，h a v eb e e ni d e n t i f i e d 。b u tf e wc a nb ea p p l i e dt oi n d u s t r i a lf i e l d sa n df e wh a sb e e n u n d e r s t o o df o rt h em e c h a n i s m sa n de n z y m a t i cc h a r a c t e r so f h e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t i o n t os y s t e m a t i c a l l yi s o l a t eb a c t e r i a ls t r a i n sf o rb i o r e m e d i a t i o no f c h r o m i u mp o l l u t i o n a n d s t u d yt h em e c h a n i s mo fh e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t i o nb ym i c r o o r g a n i s m s ，as e r i e so f b a c t e r i aw i t hh i g hr e s i s t a n c eo fh e x a v a l e n tc h r o m i u mw e r ei s o l a t e df r o mt h ee l e c t r o p l a t i n g s l u d g eo fb a o s t e e lc o r p o r a t i o n ，s h a n g h a i a f i e rm u t a g e n e s i sa n da c c l i m a t i z a t i o n 。as t r a i nn a m e d s 5 4 w h i c hs h o w e dh i g hr e d u c t i o na b i l i t yo fh e x a v a l e n tc h r o m i u ma tt h es a m et i n e 。w a s i d e n t i f i e da sb a c i l l u sc e r e u sb ym o r p h o l o g i c a l p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r sa n d i t s1 6 sr d n as e q u e n c e u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n s t h i ss t r a i nw a sa b l et og r o wo nl bp l a t e s w i t h4 0 m m o j 几c ra f t e r4 8 h a n ds h o w e de n d u r a n c ed i v e r s i t yo no t h e rh e a v ym e t a l s a i s o t h i ss t r a i nw a sa b l et oc o m p l e t e l yr e d u c e2 m m o l lc r o + i nl bl i q u i da f t e r7 2 h a n dw o r k c o n t i n u o u s l yw i t hs u p p l e m e n to fc u l t u r a lm e d i u ma n dh e x a v a l e n tc h r o m i u m t or e d u c e h e x a v a l e n tc h r o m i u m ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r er a n g ea n dp hr a n g ei s 2 m m o l lc r 3 0 3 7 a n dp h 7 p h 9 r e s p e c t i v e l y t h es t u d yo ft h em e c h a n i s m sa n de n z y m a t i cc h a r a c t e r ss h o w e d ，c e l l u l a rw a l l sa n d m e m b r a n e s ，w h i c hw e r ea b l et op r e v e n th e x a v a l e n tc h r o m i u mo u tf r o ml i v i n gc e l l s ，w e r et h e m a i ns i t e sw h e r eh e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t i o nt o o kp l a c e ，a n dc h a n g e so ft h e i r o e r m e a b i l i t yw o u l dt a k ee r i e c to nt h ef u n c t i o no fh e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t a s e t h e r e d u c t a s ew a sn o n - s e c r e t i v ea n dt o o ke f f e c to nt h ei n n e rs i d eo fl i v i n gc e l l s t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r er a n g ea n dp ho f t h er e d u c t a s ew a s2 5 3 7 a n dp h 7 r e s p e c t i v e l y c a z h a d s o m ee f f e c t o n t h ep r o m o t i o no f r e d u c t a s ea c t i v i t y a t t h e t e m p e r a t u r eo f 3 7 ，k m a n d v 帐 o f t h er e d u c t a s ew a s1 2 5 6lg m o l la n d7 6 8u m o m i n m g p r o 曲) ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：b a c i l l u sc e r e u s ；h e x a v a l e n tc h r o m i u mr e s i s t a n c e ；h e x a v a l e n tc h r o m i u m r e d u c t i o n ；m i c r o o r g a n i s mi d e n t i f i c a t i o n ；h e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t a s e c l c ：x 7 0 3 1 2 一 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究 肖伟 土上 j 一 日盯舌 l 重金属铬及其对环境的污染 1 1 铬的理化特性 铬，属第一过渡系的第六副族，原子序数为2 4 ，原子量为5 1 1 9 9 6 ，银白色金 属，质硬而脆。铬常见的氧化态是0 、+ 2 、+ 3 和+ 6 价铬，c p 是强还原剂，在空 气中不稳定，可被迅速氧化成c r 3 + ，因此c r 2 + 在生物体内存在的可能性极小。c ， 是最稳定的氧化态，也是生物体内最常见的一种。它易于形成化学活性极低的配 位化合物，最重要的铬化合物是c r 2 0 3 和c r ( o h ) 3 。c ，是一种很强的氧化剂，主 要与氧结合成铬酸盐和重铬酸盐，而在酸性溶液中易被还原到c r 3 邮1 。 在不同的氧化还原电位和p h 范围内，铬有不同的氧化状态及化学形式。在 p h 3 5 时，三价铬有不同的水合形式c r o h 2 + 、 c r ( o h ) ”、c r ( o h ) 3 0 和c r ( o h ) 4 - 其中c f ( o h ) 3 0 是唯一的沉淀固体状 态，见图1 1 2 j 。 鲥 图l 铬的e h p h 图 六价铬根据p h 的不同，主要以h 2 c r 0 4 、h c r 0 4 一和c r 0 4 2 一的形式存在。p h 6 0 时，主要 形式时c r 0 4 2 一。当铬浓度超过l g l 时，h c r 0 4 一会形成c r 2 0 7 2 一。六价铬在不同 环境条件下的存在形式，见图2 【”。 图2 六价铬在不同环境条件下的存在形式 1 2 铬的生物学功能 三价铬是一种生命必需微量元素。1 9 5 7 年s c h w a r z 和m e r t z 发现啤酒酵母中含 有一种天然物质可以恢复葡萄糖耐量受损的大鼠，称其为葡萄糖耐受因子 ( g l u c o s e t o l e r a n c e f a c t o r ，简称g t f ) ，g t f 即为生物体所能代谢葡萄糖的能力。 1 9 7 4 年他们又证实g t f 的主要成分是铬与烟酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水 溶性配合物。铬作为胰岛素的一种“协同激素”( c o h o r m o n e ) ，协助或增强胰 岛素在体内、外的作用。铬的这种生物学作用可能影响体内所有依赖胰岛素的系 统【4 】，包括糖、脂和蛋白质代谢。 铬通过利用胰岛素来维持稳定的血糖水平，其主要的生物化学功能是促使胰 岛素a 链上的硫与细胞膜上胰岛素受体的巯基形成二硫键，改善靶细胞对胰岛素 的敏感性而促使胰岛素发挥作用。缺乏铬时，组织对胰岛素的剂量效应明显降低， 需要更大剂量的胰岛素才能引起正常的代谢反应。因此，缺铬时机体产生葡萄糖 耐量降低的有关症状，如血糖升高，而补铬则可降低血糖来改善部分糖尿病人症 况( 主要是胰岛素依赖型患者) 。营养不良的儿童有因缺乏铬而致糖耐量异常， 部分表现出轻度糖尿病症状；成人只表现出糖耐量降低。此外，补铬对低血糖症 也有矫正作用，表明铬对于维持机体正常的糖代谢是双向的睁j 。 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 铬对心血管疾病有抑制作用，铬缺乏可弓i 起脂肪代谢异常，使血清胆固醇升 高，主动脉的脂质沉积和斑块形成增加。流行病学研究表明，某些发达国家居民 膳食构成中精致食品和饱和脂肪成分较多，其体内铬含量低于其他地区居民，而 动脉粥样硬化、高血压的发病率却明显高于其他地区。 铬摄入不足，可使甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸渗入心肌蛋白的过程受到妨碍， 补充三价铬可使渗入量明显增加。儿童缺铬后生长发育受阻，可能与蛋白质合成 受损有关。 在一般情况下，人体每日从环境( 主要是食物) 中摄取数微克的铬。1 9 8 0 年 美国国家研究会( n a t i o n a lr e s e a r c hc o u n c i l ，1 9 8 0 1 推荐，成人安全和适量的铬 摄入量为5 0 一2 0 0 9 9 d 【6 】。 1 3 铬的毒性 环境中的三价铬由于不易进入细胞，因而被认为基本无毒，而六价铬易进入 细胞并在其内还原为三价铬【”。铬在生物体中的氧化还原作用，见图3 【钔。 汹c r ( v ) c 删呻- - _ - c 瑶v i ) + c “l v 伽+ c , - m 甜铡哪， c 霄时c i ) 一c r o q + c 程1 1 1 ) c * 0 i + c r ( f l 。卜c f v c 疽掰 ( a ) 铬的氧化还原转化；( b ) 相对稳定的各氧化状态复合物； ( c ) 不同状态铬之间的化学反应 图3 铬在生物体中的氧化还原作用 六价铬具有致癌和诱发基因突变的作用，一种观点认为六价铬以铬酸根的形 式渗入细胞，在细胞内还原成五价铬和四价铬的过程中产生了大量的游离基诱导 产生肿瘤；另一种观点认为进入细胞的六价铬还原为三价铬与细胞内大分子 d n a 相结合，引起遗传密码的改变，进而引起细胞的突变和癌变1 9 。暴露于六价 5 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 铬环境的细胞中d n a 损伤的形成，包括链断裂，非碱基位点和c r ( ) 一d n a 交连，被认为是六价铬诱导致癌的主要原斟。其中，c r ( v ) 复合体引起 d n a 损伤的主要途径，见图4 【“】。 艋删。蜘+ 山勰陬c “i 焖i i ) - d 触 文乃+卜 洲，l 如 c 蜊v 卜渊a i 镊 o n a 坠芝喇l b a 。窆k 刎l l 粕黼 秘咖 八 c “l | i 0 n a d 嘲心融a 图4c r ( v i v ) 复合体引起d n a 损伤的主要途径 c r ( ) 通过口腔进入人体后，可以引起一系列病变，如口腔粘膜增厚、水 肿、上腹部疼痛、肝肿大，重者循环衰竭、失去知觉，以致死亡。还可引起贫血、 神经炎、肺纤维化、心肌病变、肝、肾病变等等。这些病变大都是慢性的，因此 常常一时觉察不出来，待发现后，病程已经有了相当的发展。而一次性摄入过量， 病人有很快中毒死亡的危险。c r ( ) 以蒸气或粉尘方式通过呼吸道进入人体后， 会引起鼻中脶穿孔、肠胃疾患、白血球下降及类似哮喘的肺部病变。当空气中铬 酸酐的浓度达0 1 3 0 3 l m g m 3 时，就可使鼻中膈穿孔。皮肤接触铬化物，可导致 烧伤、接触性皮炎，还可引起愈合极慢的“铬疮”( “。 1 4 铬对环境的污染 铬盐是重要的工业原料及化工产品，广泛应用于冶金、电镀、建材，皮革、 防腐、染料等工业：据统计全国有1 0 的商品品种与铬盐产品有关o3 1 。但铬盐等 行业排放的铬渣及含铬废水对环境造成的危害日益严重，铬污染事故层出不穷。 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究 肖伟 2 0 0 3 年全国十大环境违法案件的头条，就是重庆某公司堆放的铬渣给重庆市民及 三峡库区的用水环境造成的严重威胁；2 0 0 3 年底被关停的长沙铬盐厂带来的污染 现状也是触目惊心的【。 我国制定了一系列有关铬的环境标准【“。制革工业水污染物排放标准 ( g b 3 5 4 9 - - 8 3 ) 中规定三价铬的总排放量月平均值不得超过1 o m g l ( 二级) ， 日平均值不得超过1 5 m g l ( 二级) 。 地面水环境质量三级标准( g b 3 8 3 3 - - 8 3 ) 中规定六价铬在地面水中的含量不得超过0 0 1 m g l ( 一级) 、o 0 2 m g l ( 二 级) 和0 0 5 m g l ( 三级) 。饮用水水质标准( g b 5 7 4 9 - - 8 5 ) 中规定六价铬 含量不得超过0 0 5 m g l 。世界卫生组织( w h o ) 暂定饮用水中总铬含量不得超 过0 0 5 m g l ( w h o 控制线修改值) ，而美国国家环境保护局( u s e p a ) 规定饮 用水中总铬含量不得超过0 1 m g l 。日本在新排水标准中规定六价铬的最高允许 浓度为0 5 m g l ，总铬含量不得超过2 m g l ；地下水水质标准中规定六价铬含量不 得超过0 0 4 m g l 。 据调查，目前中国直接生产重铬酸盐的企业大大小小多达3 0 家，年生产能力 超过3 0 万吨，总产量居世界第一位。每生产1 吨铬盐，同时产生2 5 3 吨铬渣【1 6 】， 全国每年实际产生约7 5 万吨含铬的新生有毒废渣，加之历年堆存的，累计铬渣不 低于2 0 0 z i r 屯 1 7 】。任意排放、堆存铬渣，不但占用大量土地，而且铬渣经雨水淋洗， 含铬污水四处溢流、下渗，对土壤、地下水、河道造成污染。 2 铬污染的治理 2 1 含铬废水的处理【1 8 】 2 i 1 沉淀法 沉淀法就是使水中的铬形成难溶物沉淀析出的方法，根据沉淀的方法不同又 分2 种，即直接沉淀法和还原沉淀法。 2 i 1 1 直接沉淀法 直接沉淀法是利用铬酸钡和铬酸铅难溶于水的特性，向含铬废水中加入可溶 性钡盐或铅盐使之沉淀析出的方法。该方法属于比较古老的方法，现在几乎没人 再研究，因为该方法本身存在一些问题：如果用钡盐，b a 2 十要过量，不仅成本高， 生成的铬酸钡还难以处理和利用；如果使用铅盐，除去了铬又可能引入铅。两种 7 六价铬还原细菌的筛选鉴定，还原特性及酶学机理研究 肖伟 结果都可能造成二次污染，难以彻底实现环境治理的目的。 2 1 1 2 还原沉淀法【1 蝴2 】 还原沉淀法是先将六价铬还原为三价铬，然后使其生成氢氧化铬沉淀析出的 方法。还原的方法主要是向含铬废液中加入还原剂或采用电解还原，常用的还原 剂有f e s 0 4 ，s 0 2 、n a z s 、硫氢化物、肼及其衍生物、羟胺及其衍生物等，其中 亚铁还原是最常用的方法。普通的添加还原剂还原脱铬的方法大多需分两步进 行，即先在酸性条件下将六价铬还原为三价铬，然后再在碱性条件下沉淀析出氢 氧化铬。 电解还原也属于亚铁还原的一种方法，它可以将上述两步合而为一，在电解 过程中，铁阳极释放出f e 2 + ，将六价铬还原为三价铬，阴极由于释放h 2 而在溶液 生成o h 一，废液自动从酸性转变为碱性，从而实现氢氧化铬的沉淀析出。 还原沉淀法被认为是一种经济可行、行之有效的水中脱铬的方法，这种方法 不仅成本低廉，而且容易操作，但这种方法需要使用大量的化学还原试剂，而且 生成的氢氧化铬沉淀还会引起二次污染。 2 1 2 吸附法【强划 吸附法也是种古老的、被认为经济有效的水中脱铬的方法之一，因此，多 年来一直倍受关注，研究工作颇多，研究重点在于选用不同的吸附剂，文献介 绍的吸附剂多种多样，如活性炭( 包括果壳活性炭、稻壳活性炭、废旧轮胎制得 的活性炭、电弧碳等) 、泥炭、褐煤、烟煤，锯末、树叶、果壳、黄铁矿、水滑 石( m 9 6 a 1 2 ( o h ) 1 6 c 0 3 4 h 2 0 ) 、水合氧化铁、淀粉黄原酸酯、树脂吸附剂、活 性红泥、生物吸附剂等，五花a f 3 ，举不胜数。 吸附法虽然成本低、简单易行，但也有其缺点。首先，大多吸附剂吸附容量 有限，吸附剂处理量大；其次，吸附了铬以后的吸附剂也存在处理问题；再就是 大多吸附剂都只能用于酸性环，中碱性条件吸附效果很差。 2 1 3 萃取法3 1 4 3 】 萃取法也是种常用的从废水中脱除回收重金属离子的方法，常用的脱铬萃 取剂主要是伯胺、仲胺、叔胺、季胺及其衍生物，以及有机磷酸酯如磷酸三丁酯 等有机化合物。近年来两家美国化学品公司( g e n e r a lm i l l sc h e m i c a li n c 和 a s h l a n dc h e m i c a lc o m p a n y ) 研制开发的商品名为“a l a m i n e3 3 6 ”、“a l a m i n e3 0 8 ”、 ， 8 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 “a l i q u a t3 3 6 ”、“a d o g e n4 6 4 ”等几种叔胺和季胺类萃取剂效果不错。 传统的溶剂萃取方法无论是混合沉降槽还是连续逆流萃取塔都存在一些缺 点，如需要分散和再聚并，要求两相有一定的密度差，会产生乳化、液泛等问题， 新近发展起来的非分散溶剂萃取过程较好地解决了这些问题，有广阔的应用前 景。在非分散溶剂萃取过程中，使用疏水性空心纤维作为两相接触介质，水相和 油相分别流过空心纤维的两边，在流动过程中，两相通过空心纤维壁的孔发生接 触，实现萃取的目的。 2 1 4 离子交换法【3 6 】 利用弱碱性离子交换树脂脱除废水中六价铬以及用强碱性离子交换树脂脱 除三价铬的方法也受到重视，由于交换树脂需经常再生，操作麻烦且费用较高， 还需要处理洗脱液，因此，其推广应用受到限制。有消息说，美国开发出了一种 专性交换吸附水中六价铬的树脂，其交换容量是普通弱碱性离子交换树脂的三倍 多，已成功用于华盛顿卅 b o o m s n u b 地下水的脱铬处理。 2 1 5 超滤法【3 1 】 在反渗透技术基础上发展起来的超滤技术特别是微乳强化超滤技术近年来 得到普遍重视。微乳强化超滤脱铬是在含铬废水中加入一种阳离子表面活性剂如 十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化吡啶，形成5 0 1 0 0 个表面活性剂分子组成 的球形微乳团，c r 0 2 - 4 吸附在微乳的表面，当使用孔径足够小的膜过滤时，微乳 及其吸附的铬就会被截留，达到分离脱除的目的，铬脱除率可以达至1 j 9 9 9 。为 了改善过滤效果，还可以采用各种强化措施，如采用电场强化。 随着纳米热的兴起及纳米技术的进步，有人开始研究纳米过滤脱铬技术。纳 米膜的性质介于超滤膜和反渗透膜之问，它允许在较低的压力下操作并且有较大 的渗透流率，还不需要添加任何化学品。 2 2 铬渣的处理【4 2 】 2 2 1 铬渣干法还原解毒 将铬渣和煤炭或锯末、稻壳按比例混合，在8 0 0 4 c 左右高温下进行还原煅烧， 产生的氢气、c o 使渣中有毒的c ，离子还原成无毒的c ，离子。该法解毒后的铬 渣中的c r 6 + 的含量极低，且稳定性较好，可堆存或利用h 3 】。缺点是需要消耗大量 的能源，解毒成本较高( 每吨8 0 元左右) ，解毒后的铬渣综合利用有一定局限性。 9 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究 肖伟 2 2 2 高炉法处理含铬废渣 将含铬废渣制成高炉炼铁中使用的冷压块、烧结熔剂矿料，再将铬渣冷压块、 铬渣烧结熔剂矿料、焦炭、铁矿石、石灰石等原辅材料，按配比称量，经料口入 高炉，在高炉中进行冶炼。在高炉的高温下，铁矿石和铬渣中所含的金属氧化物 均被炽热的c 和c o 还原为金属，从而产生了含铬的铁水( 含c rl 2 ) ，后者 经铸铁机制成含铬生铁，炉渣作水泥原料】。该法实现了废渣资源化，消除了 铬渣的污染。但此种方法生产1 吨烧结矿，要加a 8 0 的铁精矿，由于要消耗大 量的铁精矿，且利用铬渣量较少，因此，成本较高，不能从根本上解决铬渣的处 理问题。 2 2 3 酸性还原 首先将碱性含铬废渣用酸调至酸性，然后加入亚硫酸钠、硫酸亚铁等还原剂， 在液固两相状态，将0 6 + 离子还原为c ，。此种工艺耗酸量较大，适合于有废酸 排放的企业。 2 2 4 碱性还原 直接在碱性含铬废渣中加入硫化钠、硫氢化钠等进行还原反应。反应式如下： 8 n a 2 c r c b + 6 n a 2 s + 2 3 h 2 0 - - , s c r ( o h ) 3 + 3 n a 2 s 2 0 3 + 2 2 n a o h c r 3 + 形成c r ( o h ) 3 沉淀后，过滤回收铬污泥。 2 3 铬污染土壤的修复4 5 1 2 3 1 化学固定化稳定化方法 固定化和稳定化( s o l i d i f i c a t i o n s t a b i l i z a t i o n ，s s ) 是将被铬污染的土壤与某 种粘合剂混合( 也可以辅以一定的还原剂，用于还原六价铬) ，通过粘合剂固定 其中的铬，使铬不再向周围环境迁移。在众多的粘合剂中，水泥和硅土被认为是 一种有效、易得和价廉的产品。 固定化，稳定化方法主要用于处理铬矿冶炼后留下的铬渣，处理后的铬渣可作 为建筑材料使用。采用该方法修复铬污染土壤，需将土壤挖掘出来，成本较高， 处理效果也有待进一步提高。 2 3 2 化学还原法 化学还原法( r e d u c t i o n ) 是一种原位修复方法( i ns i t ur e m e d i a t i o n ) 。其原 理是利用铁屑、硫酸亚铁或其他一些容易得到的化学还原剂( 也可以辅以一定的 1 0 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 粘合剂) 将六价铬还原为三价铬，形成难溶的化台物，从而降低铬在环境中的迁 移性和生物可利用性，从而减轻铬污染的危害。 当六价铬主要集中在土壤颗粒表面时，直接向土壤中加入还原剂能迅速有效 地起作用嗍。但当六价铬存在于土壤颗粒内部时，则难以与还原剂接触并发生 还原反应。另外，向土壤中投加的还原剂有可能造成二次污染。 2 3 3 化学清洗法 化学清洗法( s o i lw a s h i n g ) 是利用水力压头推动清洗液通过污染土壤而将铬 从土壤中清洗出去，然后再对含有铬的清洗液进行处理。清洗液可能含有某种络 合剂，或者就是清水。 化学清洗法费用较低，操作人员不直接接触污染物。但仅适用于砂壤等渗透 系数大的土壤，且引入的清洗剂易造成二次污染1 。 2 3 4 、电修复法 电修复法( e l e c t r o r e m e d i a t i o n ) 是一种在9 0 年代后才得到重视和发展的原位 土壤修复技术。其基本原理是在铬污染土壤两端加上低压直流电场，利用电场的 迁移力，主要是电渗和电迁移的作用，将铬迁移到阴极室( c p + ) 或阳极室( c r 6 + ) ，从而得到分离。 电修复具有耗费人工少，接触毒害物质少，经济效益高等优点，特别是在治 理孔径小、渗透系数低的密质土壤时，电渗流是强化传质的最有效途径，因此， 电修复技术的研究近年来引起人们的重视。 3 微生物还原六价铬 3 1 微生物法治理六价铬污染 近年来出现的铬污染生物治理法是通过微生物的新陈代谢、生长繁殖将有害 物质变成无害物，甚至有用物质的一种生化方法，即微生物能将可溶的有毒的 c r ( ) 转化为低毒或无毒的c r ( 1 1 1 ) 。如k a t s i f a s ，e a 等【4 8 1 分离筛选出一种曲 霉菌a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s ，可用固体发酵法来还原铬硝的皮革废料，其中9 7 的皮革废料能被液化，并能从累积的液体中得到制革所需要的硫酸铬溶液和富含 蛋白质的液体，而这种蛋白质液体可作肥料，动物饲料添加剂或应用于其他的工 业中。微生物法因其投资小、运行费用低、无二次污染等优点，逐步成为对含铬 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究肖伟 废水废渣均适用的价廉、方便而叉彻底的治理方法，使得越来越多的研究人员将 注意力从传统的化学、物理方法转向微生物法。 3 2 用于含铬废水处理的微生物 纯种微生物处理含铬废水是依据获得的高效功能菌对铬的静电吸附作用、酶 的催化转化作用、络合作用、絮凝作用和沉淀作用，使铬被沉积，经固液分离， 使废水被净化。2 0 0 1 年申如香等人【4 川用分离筛选出的功能菌处理冷轧含c r ( ) 废水，当c r ( v i ) 浓度为1 5 0 m g l 、菌废比l ：l 时，处理3 6 h 后铬的去除率达9 9 9 ， 符合废水排放标准。2 0 0 3 年尹华等人【”1 通过菌种培养、分离与筛选，获得一株 对铬具有很强还原与吸附性能的掷抱酵母( s p o r o b o l o m y c e t a c e a es p ) ，该菌株 适宜的吸附p h 值是6 9 ，将l g 培养t 6 0 h 的菌体放在2 0 m l 、p h 为7 、浓度为1 5 m g l 的铬液中，吸附8 h 后，对铬的去除率最高可达到1 0 0 ，且铬在细胞质内主要以 低毒性的3 价铬存在。 3 2 用于含铬土壤修复的微生物 对于被铬污染的土壤也提倡采用生物修复法( b i o r e m e d i a t i o n ) ，即应用植物 和微生物来治理铬污染，现主要集中于微生物方面，就是利用原土壤中的土著微 生物或向污染环境补充经过驯化的高效微生物，在优化的操作条件下通过生物还 原反应，将六价铬还原为三价铬，从而修复被污染土壤。相比于化学还原和化学 清洗法，生物修复的优势在于不会破坏植物生长所需的土壤环境，不会产生二次 污染，可原地处理，操作简单。 由于铬对土壤微生物群活性的影响是长期性的口”，d e s j a r d i nv 等捌就法国 r h o n e a l p e s 地区污染土壤中微生物活性对铬化学状态的影响进行了研究。该地 区土壤中铬的含量为4 7 0 0 m g k g ，其中大约4 0 以可溶性六价铬盐的形式存在。 研究发现，当土壤在3 0 ( 2 时，有葡萄糖且富含营养水溶液，经过培养后，当地的 微生物能有效地将土壤中的六价铬转变为不易迁移的三价铬。将可以降低六价铬 的链霉菌t h e r mo c a r b o x y d u s 菌株从被污染的土壤中隔离出来进行研究，发现该菌 株可以将六价铬固定。 3 4 生物治理六价铬的机理 在好氧情况下，微生物通过可溶性还原酶，以n a d h 或内源的电子作为电子 供体，将六价铬还原；在厌氧情况下，微生物通过可溶性还原酶，或膜锚定还原 1 2 六价铬还原细菌的筛选鉴定、还原特性及酶学机理研究 肖伟 酶，或两者都有，还原六价铬。细菌的六价铬还原机理，见图5 1 5 3 1 。 黩咎髂。l 甜咎馘韬乱 搿舯溉甜 o 渊 掰寸瞳羽瓯o r + 釉嚏翰侧溯 图5 细菌的六价铬还原机理 微生物菌在培菌池存活、生长、繁殖过程中，会产生一定量的代谢产物，这 是一些氧化一还原酶系生化物质，这类生化物质能使废水中的重金属离子改变价 态，如使六价铬还原为三价铬，并吸附三价铬及其他二价金属离子，使其产生络 合、絮凝、静电吸附作用，可经固液分离而与水分开进入菌泥饼。因此，可以将 预先筛选、培育好的、功能各不相同的各种有效的环境保护微生物菌株，各菌株 进行任意组合，配合成能处理不同组成废水的高效复合微生物，有选择地将各类废 水中的某些有害元素离子或有害物质去耐。 电子供体是c r ( ) 还原过程中的重要物质。h i s 协oo h m k e s s 等认为在用阴 沟肠杆菌ec 如觥h o i 还原c r ( ) 时，分别作为唯一碳源的酪氮氨基酸、酪 素、胰化蛋白酶和酵母膏极有可能起到了电子供体的作用。w a n g s 6 等人以苯酚 为唯一碳源和能量源，研究了苯酚降解和c r ( ) 还原的关系，发现苯酚不是直 接作为c r ( ) 还原菌ec o l i 的电子供体。在整个反应体系中，苯酚降解菌p p u t i 删氧气作为苯酚氧化的电子受体，苯酚降解产生的代谢物作为ec d “的电 子供体和能量源。 与六价铬相比，氧气是更受欢迎的最终电子受体，因为以氧气为最终电子受 体，通过含有细胞色素的电子传递系统，细胞自身能获得更高的能量。这也能解 1 3 查竺堡至星塑堕塑堕壅鳖星：至堡壁丝垦堕兰垫堡塑壅堕堡 释为什么在有氧气存在的情况下，六价铬的还原效率总是比较低。细菌以氧气或 六价铬为电子受体的热力学能级图，见图6 【5 3 1 。 融p h 7 0 - 0 4 1 城 螂 乱籀 & 籍 图6 细菌以氧气或六价铬为电子受体的热力学能级图 4 本课题的开展 已经发现许多微生物具有把六价铬还原成三价铬的能力，其中包括 a c h r o m o b a c t e rs p c 1 t 5 7 j 、a r t h r o b a t e r 麟憎s c e n 扩奶、b a c i l l u ss p p 卿c e l l u l o m o n a s f l a v i g e w 侧、d e s u l f o t o m a c u l u mr e d u c e n ss p n o v m i i t 6 ”、e n t e r o b a c t e rc l o a c a e h o i t 6 2 1 、e x i g u o b a c t e r i u ma u r a n t i a c 聊，6 3 1 、m i c r o b a c t e r i u ms p m p 3 0 1 6 4 1 、 m i c r o c o c c u ss p s d c r 4 6 5 1 、o c h r o b a c t r u ms p 嘲、o s c i l l a t o r i as p b j 2 6 7 、 p r o v i d e n c i as p 【6 钔、p s e u d o m o n a ss y n x a n t h 0 6 3 1 、r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e 一6 9 、 s t r e p t o m y c e $ g r i s e u s 7 和s y n e c h o c y s t i ss p 【6 7 1 。在好氧或厌氧的条件下【7 ”，它们的 六价铬抗性为0 2 2 0 m m o l l ，还原能力为0 0 4 3 3 m m o l l ，所需时间为2 4 7 2 0 h 。 上述微生物或六价铬抗性较小，或六价铬还原能力较低，或所需还原时间较 长，普遍离工业应用还有一定距离。为了系统筛选或分离目标菌株用于铬污染治 1 4 六价铬还原细菌的筛选鉴定，还原特性及酶学机理研究 肖伟 理，以及研究微生物的六价铬还原机理，本课题从宝钢电镀污泥出发，分离得到 一系列高六价铬抗性菌株，经过诱变驯化，其中一株