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果蝇d x l 6 多克隆抗体的制备及基因表达型分析 王善治谢维 东南大学基础医学院 中文摘要 前体m r n a 剪接在真核细胞基因表达产物多样性、基因表达的时空差异性方面具有 重要作用。s r ( s e r i n e a r g i n i n er i c h ) 蛋白是具有帮助识别正确剪接位点并促迸剪接体 成熟功能的一类重要剪接因子。d x l 6 是果蝇s r 蛋白家族的新成员。已有r n a 原位杂 交的研究提示，d x l 6 是果蝇胚胎发育过程中中枢神经系统特异性表达的基因。 为了能够深入研究d x l 6 蛋白的功能。了解其在果蝇胚胎及胚胎后发育，尤其是中枢 神经系统发育中的作用，通过基因工程的亚克隆技术，在体外融合表达纯化d x l 6 两段 截短蛋白，免疫动物后制备并分别纯化抗d x l 6 蛋白r s 结构域和抗d x l 6 蛋白中间部分 的两种多克隆抗体，经免疫印迹法鉴定结果显示，用两种抗体在原核表达体系中分别检 测目的蛋白时均出现特异性的显色带，而只有抗d x l 6 蛋白r s 结构域的抗体能特异识别 果蝇组织中的d x l 6 蛋白。 利用抗d x l 6 蛋白r s 结构域的抗体通过果蝇胚胎的免疫染色技术，分别检测了d x l 6 蛋白在野生型黑腹果蝇胚胎中的分布型及其亚细胞定位，进而在p 因子插入突变体果蝇 k 0 0 2 1 3 、n o p 5 。0 0 2 3 0 c y o 和d o a 0 1 7 0 5 b r r m 3 三种品系的胚胎中检测d x l 6 蛋白的表达情况 并作统计分析。结果显示，d x l 6 蛋白在野生型黑腹果蝇胚胎发育的早期分布广泛，后期 逐渐集中于中枢神经系统：而且早期主要集中于细胞核内，后期在细胞核与细胞质中均 有分布；在三种突变体果蝇胚胎中部有约1 4 胚胎未检测到d x l 6 蛋白的表达，而其余胚 胎中该蛋白的表达分布与野生型一致。 本研究为d x l 6 蛋白研究的后续工作制备了有利的工具，通过在果蝇模型中的检测说 明d x l 6 蛋白是果蝇胚胎中枢神经系统发育过程中特异的前体m r n a 剪接因予；d x l 6 蛋 白极有可能也是一种穿梭蛋白；k 0 0 2 1 3 与k 0 0 2 3 0 两种p 因子插入均直接影响了d x l 6 的表达；d o a o ”b t m 3 品系中p 因子的插入间接影响了d x l 6 的表达，进而提示d x l 6 可能是一种自剪接蛋白。 关键词：前体m r n a 剪接；s r 蛋白；剪接因子：免疫染色：亚细胞定位 p r e p a r a t i o n o f p o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t d r o s o p h i l a d x l 6 a n da n a l v s i so ft h eg e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n w a n g s h a n - z h ix i ew e i m e d i c a ls c h o o l ，s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t p r e - m r n a s p l i c i n gp l a y sa l li m p o r t a n t r o l ei nt h ep r o d u c tv a r i a t i o no f e u k a r y o t i cg e n e s a n dd i f f e r e n te x p r e s s i o no fg e n e ss p a t i a l l ya n d t e m p o r a l l y s rp r o t e i nf a m i l yi so n eo f t h e m u l t i p l es p l i c i n gf a c t o r st h a tc o u l dh e l pt or e c o g n i z et h ec o r r e c ts p l i c i n gs i t e sa n dh e l pt h e s p l i c e o s o m eb em a t u r e d x l 6i san e w m e m b e ro ft h es r p r o t e i nf a m i l yi nd r o s p h i l aa n di s n e u r o s p e c i f i ce x p r e s s e dw i t ht h ee m b r y od e v e l o p m e n ta c c o r d i n gt ot h er e s u l to f r n ai ns i t u h y b r i d i z a t i o n i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o no f d x l 6 ，i n c l u d i n gi t sf u n c t i o ni ne m b r y oa n dp o s t - e m b r y o d e v e l o p m e n t ，e s p e c i a l l y i nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m d e v e l o p m e n t ，t w ot r u n c a t e dp r o t e i n so f d x l 6w e r ef u s i o ne x p r e s s e di nv i t r o a f t e ri m m u n i z i n gr a b b i t sw i t l lt h em i x t u r eo ft h e s et w o p u r i f i e dp r o t e i n s ，a n t i b o d i e sa g a i n s td x l 6r sd o m a i na n da g a i n s td x l 6m i d d l ep a r tw e r e p u r i f i e dr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f w e s t e r nb l o ts h o w st h a tt h et w oa n t i b o d i e sa r es p e c i f i ct o e a c ht r u n c a t e dp r o t e i n se x p r e s s e di nt h ep m k a r y o t i cs y s t e mr e s p e c t i v e l y , b u to n l ya n t i d x l 6 r sd o m a i n a n t i b o d y i ss p e c i f i ct ot h ed x l 6i nt h et i s s u e so f d r o s o p h i l a t h ea n t i b o d ya g a i n s td x l 6r sd o m a i nw a su s e dt o s t u d yt h ee x p r e s s i o np a t t e ma n d s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fd x l 6i nt h ee m b y o so f d r o s p h i l am e l a n o g a s t e r d x l 6e x p r e s s i o n w a sa l s os t u d i e di nt h r e em u t a t i o nl i n e s ：k 0 0 2 1 3 n o p 5 k 0 0 2 3 0 c y oa n dd o a o 7 0 5 b t m 3 t h e r e s u l ts h o w st h a td x l 6 p r o t e i ni sg r a d u a l l yl i m i t e di nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e mw i t ht h ee m b y o d e v e l o p m e n ta n di tl o c a l i z e si nb o t hn e u c l e a ra n dc y t o p l a s m d x l 6p r o t e i ni sn o td e t e c t e di n t h en e a r l y1 4e m b y o so f e a c hm u t a t i o nl i n e t h i ss t u d ym a k eau s e f u lt o o lf o rt h ef o l l o w i n gr e s e a r c ho n d x l 6 ，i n d i c a t e st h a td x l 6i sa d e v e l o p m e n t a l l yn e u r o s p e c i f i cs p l i c i n gf a c t o ra n dp e r h a p si sa l s oas h u t t l i n gp r o t e i n t h e i n s e r t i o nb ype l e m e n ti nt h et h r e em u t a t i o nl i n e sa l li n t e r f e r e dw i t hd x l 6 e x p r e s s i o nd i r e c t l y ( k 0 0 2 1 3 ，n o p 5 如0 2 3 0 c y o ) o ri n d i r e c t l y ( d o a 0 1 7 0 5 b t m 3 ) ，a n dt h el a t t e ri m p l i c a t e dd x l 6m a v b eas e l f - s p l i c i n g p r o t e i n k e yw o r d s ：p r e - m r n as p l i c i n g ，s rp r o t e i n ，s p l i c i n g f a c t o r ，i m m u n o s t a i n i n g ，s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名： 期：乡同硼d 绪言 绪言 真核生物基因表达的调控分为d n a 水平、转录水平、转录后水平及蛋白质水平等 多个层次，涉及到众多的参与因子及复杂的信息网络，一直是人们研究的热点问题。随 着人类基因组计划的完成，科学家估计人类的基因总数大约有3 - 4 万个，而编码的蛋白 质产物却有十几万种之多。如此少的基因是如何编码如此多的蛋自质昵? 现在普遍认为 其中转录后水平的前体m r n a 剪接是造成这一现象的主要原因之一。因此有关前体 m r n a 剪接的机制引起越来越多的关注。 前体m r n a 的剪接主要有组成型剪接和选择型剪接两种类型。前者是将内含子从 前体m r n a 中去除，然后将所有的外显子拼接成成熟的m r n a ；后者不仅将内含子从 前体m r n a 中去除，而且有选择的去除一些外显子，然后将剩余的外显子拼接成成熟 的m r n a 。目前对前体m r n a 的研究大体可分为两部分，一部分是有关前体m r n a 序 列，即顺式作用元件的研究，另一部分是有关与前体m r n a 相互作用的剪接复合体， 即反式作用因子的研究。两部分研究相互依赖，相辅相成，共同阐明了剪接机制的精确 性和复杂性。 目前对前体m r n a 中与剪接有关的序列已研究的较为清楚，发现了许多普遍存在的 剪接识别序列以及一些特殊的剪接因子结合序列丑4 5 ，6 ，7 8 】。相对而言，有关剪接因子的 研究则显得很不充分。至今为止研究较清楚的剪接因子主要有剪接复合体中小核糖核蛋 白颗粒( s n r n p ) 睇芦j 。而对剪接复合体中其它非s n r n p 的剪接因子成员，却只发现了为数 不多的几个剪接因子家族。其中研究者比较关注的是s r 蛋白家族和h n r n p 蛋自家族 口，3 月，l o ，1 1 ，。2 】。前者主要结合于外显子剪接增强子序列，后者则主要结合于外显子剪接抑制 子序列。近几年发现的剪接因子还有c e l f ( c u g b p a n de t r 3 1 i k ef a c t o r s ) 蛋白家族， 以及一些多嘧啶区结合蛋白( p t b ) “。但有关这些蛋白功能的研究均尚不深入。 实际上，前体m r n a 剪接的意义不仅在于产生不同的蛋白质异形体【1 3 】，更重要的是 它能够影响细胞的生长分化。这一点集中体现在前体m r n a 剪接对基因表达的时空调 控方面。例如，与细胞周期有关的如s r p 2 0 基因( 编码一种剪接因子) 在细胞周期的不 同阶段有不同的表达量i l 。同一基因在同一时期的不同组织内表达不同蛋白产物的例子 如脊椎动物中的c g r p ( c a l c i t o n i n - g e n e r e l a t e dp e p t i d e ) 基因，它在甲状腺中表达一种维 持钙稳定的激素，而在神经系统则表达一种具有血管舒张作用的神经肽【1 5 1 。n c a m ( n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c l l l e ) 则是同一基因在同一组织的不同发育阶段表达不同蛋白 产物的较好例证。在胎鼠脑中，该基因的前体m r n a 在剪接时跳过了v a s e ( v a r i a b l e a l t e m a t i v e l ys p l i c e de x o n ) 外显子，表达了一种抑制轴突生长的蛋白质；而在成年鼠脑中， 由于剪接时保留了v a s e 外显子，则表达一种促进轴突生长的蛋白质 1 5 】。 对前体m r n a 剪接的研究，不仅在于理解真核生物基因表达调控的机制，更有助于 我们理解一些与前体m r n a 剪接有关疾病的发病机理，从而为疾病的诊断与治疗提供 理论依据。目前人们已经发现了许多由于前体m r n a 剪接的错误而导致的疾病，如囊 性纤维化，马凡氏综合症，脊髓病性肌萎缩以及贝克尔氏肌营养不良等【3 , 9 , 1 0 】。甚至有数 据显示，在引起遗传病的点突变中，约有1 5 影响了前体m r n a 的剪接【9 】。但可能是由 于核酸技术相对成熟与稳定的缘故，目前发现的与前体m r n a 剪接有关的疾病主要集 中于发现融叮a 序列的异常，如一些点突变改变了原有的剪接位点，生成了新的剪接位 点，或改变了外显子和内含子中的一些序列元件进而影响了他们与剪接因子的亲和力吐 但由于剪接因子的异常影响前体m r n a 剪接从而导致疾病的例子尚未见报道。剪接因 子作为参与m r n a 剪接的另一重要部分，通过对其自身表达、调控以及生理功能的研 究也势必有助于我们理解前体m r n a 剪接的精密机制以及与前体m r n a 剪接有关疾病 的发病机理，因此有关剪接因子的研究工作更具有开创性的意义。 由于蛋白质技术相对复杂，关于剪接因子本身的研究也不够充分，所以在人体中研 衮南大学硕士学位论文 究剪接因子的可行性犹为不强。于是模式生物成为我们研究相关问题的良好替代品。果 蝇是公认的模式动物，它生长周期短，繁殖速度快，繁殖量多，容易产生突变体，这些 为我们的研究提供了便利条件。d x l 6 是我们实验室与其它实验室菸同发现的果蝇中一个 编码剪接因子的基因，而且我们已利用转基因技术制造了该剪接因子异常的果蝇突变 体，发现纯合突变体果蝇发育至3 龄幼虫期死亡。这一动物模型成为我们研究剪接因子 异常导致疾病的有利工具。为了对该蛋白的功能进行深入研究，我们通过该蛋白的体外 表达、纯化，动物免疫及抗血清的纯化，得到了抗该蛋白的抗体，检测了该蛋白的在体 分布及亚细胞定位。这项工作不仅为下一步实验制作了必备的工具，而且为有关该蛋白 的后续研究积累了必要的数据和经验，为在该果蝇模型中研究剪接因子异常导致疾病奠 定了基础。 2 文献综述 文献综述 自从上世纪7 0 年代科学家发现断裂基因以来，人们已逐渐认识到，从低等的真核生 物到脊椎动物、哺乳动物和高等动物，甚至包括少数原核生物在内都存在着断裂基因【1 6 1 。 进而有关前体m r n a 剪接的研究成为人们认识基因表达调控的重要方面。尤其是选择 性剪接，被认为是基因表达产物多样性的主要原因之一，同时也调控着基因时空表达的 特异性，影响了细胞的生长分化。 前体m r n a 剪接过程涉及到一系列的顺式作用元件和反式作用因子。研究发现在外 显子和内含子相邻的区域有相对保守的剪接位点以供剪接体识别，内含子内部尚有相对 保守的分支点序列，以及在内含子3 剪接点上游的多嘧啶区。这些序列在外显子和内 含予中普遍存在，主要与剪接复合体中不同的固定成份相作用。如：u 1 s n r n p 主要结 合于5 剪接点，s f l m b b p 和u 2 s n r n p 主要结合于分支点，u 2 a f 主要结合于3 剪 接点及其上游的多嘧啶区l l ，2 j 。但由于前体m r n a 中尚含有大量的假剪接位点，所以仅 靠识别上述的r n a 序列并不足以决定正确的剪接位点p j 。随着研究的深入，人们又发 现了许多具有特殊性的r n a 序列，如许多外显子中的剪接增强子序列和剪接抑制子序 列，5 6 】，甚至一些特定基因的内含子中的某些序列1 7 s 】，如心肌钙蛋白t 基因中的内含 子4 和内含子5 中的序列。这些序列可以和一些特殊的剪接因子相结合从而帮助识别正 确的剪接位点。这些研究结果固然有助于了解前体m r n a 剪接过程中涉及的顺式作用 元件的功能，但前体m r n a 的剪接是一个由顺式作用元件和反式作用因子共同作用的 过程，单单对某一方面功能的了解并不足以阐明整个过程的生物学意义，因而对反式作 用因子的研究也不可或缺，但目前在这方面研究较清楚的除了剪接复合体中的小核糖核 蛋白颗粒( 包括u 1 、u 2 、u 4 、u 5 和u 6 ) 以及u 2 s r 吐p 的辅助因子( u 2 a f ) 外，尚 仅局限于几个蛋白家族的范围。其中s r 蛋白( s e r - a r gr i c h p r o t e i n ) 家族是目前研究比 较多的一个，它们在剪接体的成熟和剪接位点的识别方面起着关键性的作用。现就s r 蛋白的研究综述如下： 1s r 蛋白的结构与功能 目前已知的人类s r 蛋白家族成员包括：s r p 2 0 、s r p 3 0 c 、s r p 4 0 、s r p 4 6 、s r p 5 4 、 s r p 5 5 、s r p 7 5 、s c 3 5 、s f 2 a s f 以及9 g 8 等，它们在结构上均含有一个羧基末端的r s 结构域( s e r - a r gr i c hd o m a i n ) ，一或二个氨基末端的r n a 结合结构域( r n ab i n d i n g d o m a i n ) 1 2 j 。对某一蛋白质而言这两个结构域在不同物种之间具有较高的保守性。这两 个结构域在行使功能时各司其职又互相影响，共同确保s r 蛋白发挥正常功能。 1 1r n a 结合结构域及其功能 r n a 结合结构域又叫r n a 识别基序( r n ar e c o g n i t i o nm o t i f , r r m ) ，是决定s r 蛋白识别特异性前体m r n a 并与之结合的功能单位。现在人们普遍认为s r 蛋自主要识 别并结合于外显子中的剪接增强子序列( e x o n s p l i c i n g e n h a n c e r , e s e ) ，这些序列在外显 子中普遍存在而不是仅仅分布于少数被选择性剪接的外显子 3 , t 7 】。e s e 主要位于外显 予中5 或3 剪接点附近，通过与s r 蛋白结合来确定外显子与内含子的分界l 。不同的 s r 蛋白其r n a 结合结构域所识别的e s e 各不相同。利用r n a 结合结构域与其底物之 间的高亲和力特性，人们发明了s e l e x ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o nl i g a n d sb ye x p o t e n t i a l e n r i c h m e n t ) 技术，并通过此技术鉴定了一些s r 蛋白的结合序歹l j 2 , 1 8 , 1 9 , 2 0 , 2 q ，结果显示 各s r 蛋白自身所识别的e s e 序列并非高度保守；而且有体外实验显示任一的s r 蛋白 均可以在剪接缺失的体系中完成前体m r n a 的剪接。这些现象说明虽然r n a 结合结构 域识别的序列有所不同，但这种不同不是绝对的，亦即它们的识别与结合能力在不同 s r 蛋白之间具有一定的互补性。 蔓塑查堂堡主堂竺笙苎 一些s r 蛋白的氨基末端仅含有一个r r m ，如s c 3 5 ；还有一些s r 蛋白的氨基末端 含有两个相连的r r m ，分别称为r r m l 和r r m 2 ，如s f 2 a s f 吲。含有单一r r m 的 s r 蛋白其r n a 结合结构域足以完成它识别并结合于r n a 序列的功能，而含有两个 r r l v l 的s r 蛋白，该功能完成就需要这两个r r l v l 协同作用。如仅含单一r r m l 的 s f 2 a s f 突变体所选择的高亲和力r n a 元件与野生型s f 2 a s f 所选择的有明显不同； 而且野生型的s f 2 a s f 没有剪接i g m 前体m r n a 的能力，而仅含r r m l 的s f 2 a s f 却能完成前体i g m 剪接 2 2 1 。 虽然r r m 作为s r 蛋白的一个功能单位具有其一定的独立性，但在一些情况下，其 功能的正常发挥还有赖于r s 结构域的状态对它的影响。如s r p 4 0 的r r m 与前体m r n a 中具有高亲和力的结合位点相结合时需要该蛋白r s 结构域的磷酸化，否则其r r m 与 r n a 底物相作用没有序列特异性【l ”。 1 2r s 结构域及其功能 r s 结构域主要因含有大量的丝氨酸、精氨酸残基而得名。该结构域主要参与s r 蛋 白与其它蛋白质的相互作用。如果某剪接位点不宜被识别，在剪接体复合物形成早期， s r 蛋白与e s e 结合后，通过其r s 结构域将u l s n r n p 招募至下游的5 剪接点；同样 s r 蛋白也可以与e s e 结合后，通过其r s 结构域将u 2 a f 3 5 ( t h e3 5 k d a s u b u n i to f t h eu 2 s m a l ln u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i np a r t i c l ea u x i l i a r yf a c t o r ) 招募至上游的3 剪接点，从而帮 助这些结合因子识别并结合于正确的位点 2 , 3 , 9 1 。另外，s r 蛋白还可通过r s 结构域与剪 接复合体中的剪接共作用子( c o a c t i v a t o r ) s r m l 6 0 ( s r - r e l a t e dn u c l e a rm a t r i xp r o t e i no f 16 0 k d a ) 相互作用m “。 r s 结构域也是某些s r 蛋白穿梭于胞核与胞浆之间的必要条件【2 4 1 。如s r p 4 0 是一种 非穿梭蛋白，将其r s 结构域代替穿梭蛋白s f 2 a s f 的r s 结构域，使得后者丧失了穿 梭能力。但用s f 2 a s f 的r s 结构域代替s r p 4 0 的r s 结构域，不仅在胞核，而且在胞 浆中也发现了s r p 4 0 。 由于r s 结构域中含有大量蛋白激酶作用的丝氨酸残基位点，所以r s 结构域经常处 于磷酸化和去磷酸化的动态转化之中，这种状态的改变直接影响了s r 蛋白的功能。首 先可以影响s r 蛋白对特异性底物的结合，如前所述【1 嘲。其次可以影响s r 蛋白之间的 相互作用 2 6 , 2 7 ，如磷酸化后的s f 2 a s f 与u l s n r n p 的作用增强，而在s r 蛋白激酶s k y l 缺失的情况下，s f 2 a s f 与u l s n r n p 之间、u 2 a f 3 5 与s f 2 a s f 或s c 3 5 之间的作用均 消失拉副( 正常情况下s f 2 a s f 与u l s n r n p 、u 2 a f 3 5 与s f 2 a s f 或s c 3 5 之间均有相互 作用) 。 磷酸化去磷酸化除了影响s r 蛋白的功能外，还可能影响s r 蛋白的细胞内定位。 有实验显示在真核生物细胞核中，有一个染色质间颗粒簇集区( i n t e r c h r o m a t i ng r a n u l e c l u s t e r s i g c s ) 这一区域贮存了包括s r 蛋白在内的各拼接因子【2 8 1 。当r s 结构域被 磷酸化后，s r 蛋白即从i c j c s 中释放，并转移至活性转录产物的部位，相反当r s 结构 域去磷酸化后，s r 蛋白又可重新回到i g c s 中。也有实验显示，r s 结构域的磷酸化不 仅影响s r 蛋白的核内运动1 2 “，而且对于具有穿梭能力s r 蛋白而言还会影响其在胞核 与胞浆间的运动【2 啦”。c l k s w 是一种主要存在于核内的蛋白激酶。e l k s t y 的过量表达会 使得胞浆内s f 2 a s f 的含量增加，而且这种过磷酸化的状态还会抑制s f 2 a s f 再次进 入核内。 2 s r 蛋白与前体m r n a 剪接 由于在组成型剪接的外显子中发现了许多s r 蛋白结合的增强子序列，人们认为e s e 在大多数外显子中都应该存在口”。于是s r 蛋白在组成型剪接中的作用也变得更有意 义。由于区别外显子和内含子的5 和3 剪接点序列并不绝对保守在前体m r n a 序列 中仍然含有大量的假剪接位点，所以为了正确识别剪接位点从而界定正确的外显予和内 4 苎坚簦垄 含子分界，在正确的剪接位点附近存在剪接增强子序列有助于提高剪接的准确性和剪接 效率，这样主要与e s e 结合的s r 蛋白在组成型剪接过程中的作用变的不可或缺。s r 蛋白通过与e s e 相结合帮助识别正确的剪接位点，同时与其它剪接因子相互作用共同完 成剪接体现了它的基本功能。 在选择型前体m r n a 剪接中，s r 蛋白不仅具有其帮助识别正确剪接点的普遍意义， 而且对于特定的外显子还有识别与选择的特殊意义。例如1 2 , 2 9 , 3 0 j 在果蝇体内性别决定基 因d o u b l e s e x 的前体m r n a 剪接中，s r 蛋白与外显子4 中的剪接增强子序列结合后， 帮助剪接体识别其周围的剪接位点，于是外显子4 被保留下来，果蝇向雌性发育：反之 s r 蛋白未与外显子4 中的e s e 结合，果蝇即向雄性发育。当然在这样的剪接过程中， 单独s r 蛋白可能还不足以完成特殊性剪接位点的识别，此时另外一类剪接因子t r a 和 t r a 2 是必不可少的。同样1 2 3 0 】对果蝇另外一个雌雄不同的基因f r u i t l e s s 进行选择性剪接 时，也需要s r 蛋白和t r a 、t r a 2 的共同作用。 在选择型剪接中，s r 蛋白帮助确定选择性剪接位点还有另外一种方式，即与其它剪 接因子的竞争性拮抗方式。实验显示一些能够被选择性剪接的外显子，其中除含有s r 蛋白结合的剪接增强子序列外，还含有与剪接抑制因子结合的剪接沉默子( e x o n i c s p l i c i n gs i l e n c e r , e s s ) 序列，最主要的剪接抑制因子是h r 州p 蛋白家蒯3 ，l o 】。s r 蛋白与 e s e 结合后促进外显子的剪接，同时也拮抗了h n r n p 蛋白与e s s 结合后产生的抑制剪 接作用，二者拮抗的最终结果决定了该外显子的去留f 3 , 1 1 。由于s r 蛋白和h n r n p 蛋白 与各自结合的特异性序列均有一定的亲和力，所以两者通过调节局部的蛋白质含量来影 响彼此的竞争力，从而对外显子的剪接进行调节 1 1 , 3 0 】。类似于h n r n p 蛋白家族中许多 成员的穿梭功能，人们认为s r 蛋白也有可能通过其自身的磷酸化和去磷酸化在胞核与 胞浆间穿梭，借以调节其在核内的浓度，进而达到调节剪接位点选择的作用 1 1 , 2 4 , 3 0 】。 当然，在少数情况下，s r 蛋白参与前体m r n a 剪接也可以表现出形式的多样性。 如p 2 j 在腺病毒l 1 单位的前体m r n a 剪接中，s r 蛋白可以通过与内含子中位于分支点 上游的嘌呤富集序列高效结合，影响分支点与u 2 s n r n p 的结合，进而影响3 剪接点的 选择，使腺病毒l l 单位产生5 2 5 5 k 和i i i a 两种产物。 3s r 蛋白与细胞的生长分化 s r 蛋白通过在前体m r n a 剪接中的微观作用，影响着细胞蛋白质的表达，进而影 响了细胞的生长。尤其是s r 蛋白在选择型剪接中的作用，进一步影响了细胞的分化。 如【7j 由于s r 蛋白的作用，鸡体内的b - 原肌球蛋白基因可被选择性剪接成平滑肌细胞型 和骨骼肌细胞型两种产物。再如h 】丰申经细胞黏附分子基因，由于s r 蛋白的作用在神经 细胞内而产生了神经原细胞特异性的蛋白产物。s r 蛋白的这种作用与前文所述的前体 m r n a 剪接在基因表达的时空调控方面的作用相一致。 利用反向遗传学等方法，人们p 3 】发现失去s r p 2 0 小鼠的受精卵难以形成胚泡，并死 于桑椹胚期。在秀丽线虫中抑制s r 基因c e s f 2 a s f 后会导致线虫胚胎晚期的死i = 3 4 1 。 如果同时阻碍两种或更多s r 蛋白的作用，将会导致线虫的死亡或其他类型的发育缺陷。 对肿瘤的研究发现脚j ，在肿瘤形成之前，不同组织细胞中s r 蛋白的表达类型各不相同， 一般只表达一个家族中的一个亚型，随着肿瘤的发展，s r 蛋白表达类型逐渐增多，以 至最后恶性肿瘤中s r 蛋白的表达类型变得十分复杂。这些实验都说明s r 蛋白在细胞 的生长分化过程中有非常重要甚至是不可缺少的作用。 4s r 蛋白研究的实验技术与手段 根据s r 蛋白的作用特点，关于s r 蛋白的功能研究也相应的分为两个部分。其一为 s r 蛋白作用底物的研究，其中包括研究特定s r 蛋白作用的e s e 序列或是内含子中的 某些序列，这些研究的目的仅仅是确定这些序列是什么；以及对含有s r 蛋白结合序列 5 查妻查兰堡圭兰垡丝奎 一 的前体m r n a 特点的研究，这些研究将有助于确定s r 蛋白与这些序列结合的意义。关 于s r 蛋白的功能研究另外一部分着重于s r 蛋白与其它剪接因子相互作用的研究，这 其中包括s r 蛋白与其它因子直接的相互作用以及s r 蛋白在剪接复合体内与其它因子 的间接作用，同时还包括磷酸化对s r 蛋白与其它因子相互作用影响的研究。 对于前一部分研究而言，目前比较有效的方法是s e l e x 技术，该技术利用s r 蛋白 的r r m 与r n a 序列之间的高亲和力，在体外从分子文库中筛选出与特定s r 蛋白特异 性相互作用的r n a 序列 1 8 3 6 1 。至于与s r 蛋白特异结合的r n a 序列在前体m r n a 中的 作用，可以通过核酸水平的定点突变实验以及紫外交联后进行的凝胶电泳分析，配合体 外的剪接实验来验证1 1 6 t 1 8 j 。 对于第二部分而言，通过酵母双杂交实验，g s t - p u l l d o w n 实验可以研究s r 蛋白与 其它因子的直接相互作用，通过免疫共沉淀可以研究其与其它因子的间接相互作用。而 有关磷酸化对s r 蛋白的影响可以通过体外蛋白激酶实验进行s r 蛋白的磷酸化，进而 通过体外剪接实验检验其影响【2 5 ，”删j 。 伴随着有关s r 蛋白这两方面研究的深入，一些有关s r 蛋白基本特点的研究有时也 是必要的。如有关s r 蛋白基因的研究【3 4 4 0 j ，可以帮助我们从该基因的表达特征方面了 解s r 蛋白功能。涉及这方面研究的技术包括许多基础的如p c r 技术、凝胶电泳技术等， 也包括比较复杂的如n o r t h e r n 杂交技术、原位杂交技术以及免疫印迹技术等。再如s r 蛋白在体内的分布，尤其是其亚细胞水平的分布，以及磷酸化对这种分布的影响，可以 从侧面反应s r 蛋白的功能状态。这些研究的实验方法可以选择免疫染色法4 2 4 ，同 时还可辅以细胞培养和质粒共转染等技术。 5 问题与展望 目前有关剪接因子( 包括s r 蛋白) 的研究速度远远落后于前体m r n a 序列的研究 速度，到目前为止，已经发现了大量由于剪接序列的改变而引起引起的疾病，这固然可 以说明有关前体m r n a 序列的研究已经由纯基础性研究发展到和人类疾病相联系。但 为何有关s r 蛋白的变异引起的疾病却至今未见报道，难道在众多引起不同疾病的病因 中真的不存在s r 蛋白变异这一影响因素吗? 也许对这一问题的最圆满的解释就是对 s r 蛋白研究的技术与方法限制研究的进程。如上所述，欲研究s r 蛋白作用的底物，首 先要得到s r 蛋白本身；要研究s r 蛋白与其它因子的相互作用，首先也要得到s r 蛋白 本身，有时甚至要求有检测蛋白的探针即特定s r 蛋白的特异性抗体。这其间所涉及的 技术周期长，资金投入多，技术含量要求高。除此之外，可能单单研究某一特定的s r 蛋白的变异有时也并不能说明问题，因为正如前文所提到的，s r 蛋白之间的功能有一 定的互补性。而且由于s r 蛋白参与前体m r n a 剪接时形式的多样性，使得了解s r 蛋 白对某一底物的剪接作用并不一定意味着它对其它底物的剪接作用亦是如此 2 , 3 8 1 。 “伟大在于细节的积累”。对s r 蛋白的研究也需要人们做大量耐心细致的基础性工 作，积累足够多的实验数据，配合r n a 序列的研究。深入理解s r 蛋白的功能，从最 具体的实例出发理解前体m r n a 剪接的意义。可能最终也不会有一个统一的关于s r 蛋 白和前体m r n a 剪接的理论，但也应该还复杂性以复杂的本来面目，而不是一个模糊 的面目，为人们理解真核生物基因表达调控，甚至为将来疾病的诊断与治疗提供扎实的 理论基础。 6 第一章抗果蝇d x l 6 抗体的制各、纯化及特异性分析 第一章抗果蝇d x l 6 抗体的制备、纯化及特异性分析 前言 d x l 6 基因是新近发现的果蝇s r 蛋白家族的新成员。它由两个外显子和一个内含子 组成，其编码区全长7 7 4b p ，编码2 5 8 个氨基酸，大小约2 8 k d a 。已有文献报道，d x l 6 的m r n a 表达产物随着果蝇胚胎的发育，逐渐由弥散性的表达转至中枢神经系统特异 性的表达1 ；还有结果显示4 5 1 ，d x l 6 的插入突变会导致果蝇三龄幼虫或蛹期致死。上 述结果说明d x l 6 基因是中枢神经系统发育过程中特异性的基因。如前所述，大部分s r 蛋白的功能都可被s r 蛋白家族中其它成员所代替，那么为什么d x l 6 的功能不能被其它 s r 蛋白取代而一定要表达一个神经系统特异性的剪接因子呢? 它本身的表达又是受到 怎样的调控呢? 对于这些问题的解答首先需要我们对d x l 6 蛋白的基本特性有所了解。 为了能够进一步研究d x l 6 的功能，我们体外表达了该基因的蛋白，并制备了抗d x l 6 蛋 白的多克隆抗体。 我们将d x l 6 的两个片段( 见图l 1 ) 分别亚克隆入p g e x 4 t 1 ( h i s ) 6 c 载体中，表达 了d x l 6 的r s 结构域( d x l 6r sd o m a i nd x l 6 r s d ) 和d x l 6 的中闻部分( d x l 6m i d d l ep a r t d x l 6 m p ) 两个截短蛋白，用纯化的融合蛋白免疫家兔。随后在p e t 3 2 a 中又分别融合表 达了这两个截短蛋白，用它们的纯化产物分别纯化了抗体。为了表述方便，本文中所提 到的g s t 融合蛋白均为p g e x - 4 t 1 ( h i s ) 6 c 中重组质粒的表达产物，而h i s 融合蛋白则 专指p e t 3 2 a 中重组质粒的表达产物。 材料和方法 1 材料 1 1 主要试剂 1 ) 菌种：d h 51 1 ，b l 2 i ( d e 3 )( 本实验室保存) 2 ) 氨苄青霉素( 山东鲁抗医药股份有限公司) 配成1 0 0 m g m l 。分装后2 0 0 c 冻存。 3 ) 质粒载体及重组质粒：p g e x - 4 t 1 ( h i s ) 6 c ( a m e r s h a mp h a r m a r c i a 公司) 和p e t 3 2 a ( n o v a g e n 公司) 。 4 ) d n t p ：g i b c o 公司。 5 ) t a qd n a 聚合酶：t a k a r a 公司。 6 ) 限制性内切酶：b a m hi ( m b i 公司，t a k a r a 公司) 、x h oi ( n e b 公司，t a k a r a 公 司) 。 7 ) 溶液h5 0 m m 葡萄糖，2 5 m m t r i s h c l 0 h 8 o ) ，1 0 m m e d t a ( p h 8 0 ) ，4o c 保存。 8 ) 溶液i h5 m n a o h 4 0 l a l ，1 0 s d s1 0 0 u l ，加蒸馏水至l m l ，混匀，现用现配。 9 ) 溶液i i i ：5m 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ，加水定容至1 0 0 m l ，4o c 保存。 1 0 ) t e 溶液：1 0 m m t d s - h c i q h7 4 ) ，l m m e d t a ( p h8 o ) ，4 0 c 保存。 1 1 ) 琼脂糖：基因公司。 1 2 ) 5 t b e ：5 4 9 i r i s 碱，2 7 5 9 硼酸，2 0 m lo 5 m e d t a ( p h 8 o ) ，加水定容至l 升，室 温保存。 1 3 ) 溴化乙锭：1 0 m g m l ，室温保存。 1 4 ) 割胶纯化试剂盒：上海华舜生物工程有限公司。 1 5 ) t 4d n a 连接酶：t a k a r a 公司。 1 6 ) 0 1 mc a c l 2 水溶液：2 5 微米滤膜过滤后，4 o c 保存。 1 7 ) l b 液体培养基的配制：胰蛋白胨( o x o i d 公司) 5 9 ，酵母提取物( o x o i d 公司) 2 5 9 ，n a c l5 9 ，加水定容至5 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，4 0 c 保存。 东南大学硕士学位论文 1 8 ) i p t g ：配成0 i m 的溶液，分装后- 2 0o c 冻存。 1 9 ) 3 0 聚丙烯酰胺：2 9 9 丙烯酰胺，i gn - n 亚甲双丙烯酰胺，溶于1 0 0 m l 蒸馏水中。 2 0 ) 1 0 过硫酸铵：0 1 9 过硫酸铵溶于l m l 蒸馏水中，现配现用。 2 1 ) 1 0 m t r i s h c i 缓冲液：3 0 3 9 t r i s 碱溶于2 0 0 m l 蒸馏水中。加浓盐酸调p h 值至6 8 ， 加水定容至2 5 0 m l 。 2 2 ) 1 5 m t r i s h c i 缓冲液：4 5 5 9 t r i s 碱溶于2 0 0 m l 蒸馏水中，加浓盐酸调p h 值至8 8 ， 加水定容至2 5 0 m l 。 2 3 ) t e m e d 2 4 ) d n a f r e e 的r n a 酶：1 0 m g m l ，分装后2 0 0 c 冻存。 2 5 ) 4 s d s 凝胶上样缓冲液：5 m l0 1 m i r i s h c i ( p h 6 8 ) 溶液，0 4 m lb 巯基乙醇，4 m l 甘油，o 8 9s d s ，o 2 m g 溴酚兰，加蒸馏水定容至1 0 m l ，分装后2 0 o c 冻存。 2 6 ) 考马斯亮兰r 2 5 0 染色液：甲醇5 0 0