（遗传学专业论文）小麦光温敏雄性不育系孤雌生殖和育性调节研究.pdf

首都师范人学硕l ：学位论文 摘要 我国在小麦光温敏雄性不育系培育及二系杂交小麦研究方面直处于国际领先地位。 但目前仍存在两个重要问题，分别为小麦光温敏不育系育性不太稳定和二系杂交小麦制种 成本高。本试验利用孤雌生殖技术进行优良光温敏不育系选育，并对孤雌生殖后代进行了 分析鉴定；同时开展了两系法杂交小麦高产保纯制种试验，分析了外源施用植物激素对现 有不育系b s 3 6 6 和b s 4 0 0 育性转换的作用，以及父本8 6 e 2 2 和母本b s 3 6 6 在自繁地盖膜制 种的效果，主要结果如下： 1 在阜阳从l o 种药剂中筛选出3 种诱导效果好的药剂，分别为2 ，4 一d ( 1 0 0 m g k g ) 、 激动素( 1 0 0m g k g ) + 肌醇( 5 0m g k g ) + 2 ，4 - d ( 5 0 m g k g ) + d m s o ( 2 ) 和n a a ( 4 0 0 m g k g ) ，子 房膨大诱导率分别为6 9 2 6 、6 9 2 3 、7 4 4 1 ，结实率为0 4 5 、 1 6 7 、0 6 3 。 2 在北京用药剂a ( 2 ，4 - d ) 和药剂b ( 激动素+ 肌醇+ 2 ，4 d + n 从+ 6 一队+ d m s o ) 共处 理小花8 8 3 6 个，7 4 0 9 个子房膨大，得到6 2 粒孤雌生殖种子，子房膨大率为8 8 5 4 ，结 实率为0 7 1 ，药剂效果与在阜阳时一致。 3 f l 材料( b s 2 0 偃展4 1 1 0 ) 诱导后代p a l ( 1 ) 和p a l ( 2 ) 在检测的8 个位点上或者和 父本带型一致、或者和母本带型一致，证明是孤雌生殖后代，是纯合体；p a l ( 3 ) 在8 个位 点上既有和父本或母本相同的带型，也有父母本杂合带型，证明p a l ( 3 ) 是f 1 自交产物。 f l 材料( b s 3 6 6 观3 5 ) 诱导后代p a l ( 1 ) 和p a l ( 2 ) 在检测的8 个位点上或者和父本带型一 致、或者和母本带型一致，证明是孤雌生殖后代，是纯合体。 4 2 ，4 一d 、6 - b a 、a b a 、脯氨酸、c o c l 2 、多胺可提高小麦光温敏不育系b s 3 6 6 和b s 4 0 0 结实率，可在不育系繁殖时喷施，提高其可育度。a b t 、c a c l 2 、乙烯利、删可降低b s 3 6 6 和b s 4 0 0 结实率，其中，乙烯利使两种材料都达到了1 0 0 不育。 5 在本研究中，b s 3 6 6 盖膜后育性敏感期比对照提前1 0 1 5 天，抽穗期和开花期均 提静3 天，不育度为9 8 9 ，不育穗数比率为8 2 7 ，不育度明显提高，为创造新的二系 杂交小麦高产保纯制种技术打下了基础。 关键词：小麦光温敏雄性不育育性孤雌生殖化学调控盖膜制种 首都师范人学颂i ：学位论文 t h es t u d i e so np a r t h e n o g e n e s i sa n df e r t i l i t yr e g u l a t i o no f p h o t o - t h e r m o - s e n s i t i v eg e n i cm a l es t e r i l ew h e a t a b s t r a c t t h es t u d i e so np h o t o t h e r m o - s e n s i t i v eg e n i cm a l es t e r i l ew h e a ta n dt w o l i n eh y b r i dw h e a t b r e e d i n gi n c h i n aa r et h em o s tm v a n c e di nt h ew o r l d h o w e v e r , t h em a l es t e r i l i t yo f p h o t o - t h e r m o s e n s i t i v eg e n i em a l es t e r i l ew h e a ti sn o ts t a b l ei nh y b r i ds e e dp r o d u c t i o n ，a n d u s u a l l yt h ep u r i t yo f h y b r i ds e e d si sn o th i g he n o u g hf o rh y b r i dw h e a tp r o d u c t i o n i nt h i ss t u d y , p h o t o - t h e r m o s e n s i t i v eg e n i em a l es t e r i l ew h e a tw a si n d u c e dt oc r e a t ep a r t h e n o g e n e s i sa n d a d j u s ti t sm a l ef e r t i l i t y , a n dt h eh y b r i ds e e d sw e r ep r o d u c e db ym e a n so fp l a s t i cm u l c h i n g t e c h n o l o g y m a j o rr e s u l t sa r ed e s c r i b e db e l o w ： 1 t h r e ek i n d so fr e a g e n t s ，s e l e c t e df r o mt e nk i n d so fr e a g e n t s ，w h i c hh a db e t t e re f f e c to n i n d u c i n gp a r t h e n o g e n e t i cs e e d si nf u n a n ，r e s p e c t i v e l yw e r e2 , 4 一d ( 1 0 0 m g k g ) ，k t ( 1 0 0 r a g & g ) + i n o s i t o l ( 5 0 m g k g ) + 2 , 4 - d ( 5 0 m g k g ) + d m s o ( 2 ) a n dn a a ( 4 0 0 m g k g ) t h ef r e q u e n c yo f o v a r ye x p a n d i n gr e s p e c t i v e l yw a s6 9 2 6 ，6 9 2 3 ，a n d7 4 4 1 ，a n dt h ef r e q u e n c yo fs e e d s e t t i n gw a so 4 5 ，1 6 7 ，a n d0 6 3 r e s p e c t i v e l y 2 8 ，8 3 6e m a s c u l a t e df l o r e t sw e r et r e a t e db yr e a g e n ta ( 2 ，4 d ) a n dr e a g e n tb ( k t + i n o s i t o l + 2 a d + n a a + 6 - b a + d m s o ) ，a n d7 4 0 9o v a r i e se x p a n d e d , 6 2p a r t h e n o g e n e t i cs e e d ss e ti n b e i j i n g t h ef r e q u e n c yo f o v a r ye x p a n d i n gw a s8 8 5 4 a n dt h ef r e q u e n c yo f s e e ds e t t i n gw a s o 7 1 i ts u g g e s t e dt h a tt h em e a ne f f e c to fr e a g e n taa n dr e a g e n tbi nb 蜘i n gw a si n a c c o r d a n c ew i t ht h a ti nf u n a n 3 p a r t h e n o g e n e s i sp r o g e n yo ff 1 ( b s 2 0 y a n z h a n 4 1 1 0 ) a n df i ( b s 3 6 6 g u a n 3 5 ) w e r e i d e n t i f i e db ys s r t h es s rr e s u l t ss h o w e dt h a tp a l ( 3 ) f r o mf 1 ( b s 2 0 y a n z h a n 4 1 1 0 ) w a sn o t p a r t h e n o g e n e s i sp r o g e n y , a n do t h e r sw e r et r u e 4 2 ，4 - d ，6 - b a ，a b a ，p r o l i n e , c o c l 2a n dp o l y a n l i n ec o u l db eu s e dt oi n c r e a s et h ef e r t i l i t y o fm a l es t e r i l el i n e s , w h i c hi n c r e a s e dt h ef e r t i l i t yo fb s 3 6 6a n db s 4 0 0i n t h i ss t u d y a b t , c a c l 2 ，e t h e p h o na n dm hd e c r e a s e dt h ef e r t i l i t yo fb s 3 6 6a n db s 4 0 0 ，e s p e c i a l l yt h ee t h e p h o n , w h i c hd e c r e a s e dt h ef e r t i l i t yo f b s 3 6 6a n db s 4 0 0t o0 5 i nt h i ss t u d y , t h eh e a d i n gs t a g ea n df l o w e r i n gs t a g eo fb s 3 6 6c o v e r e db yp i a s t i ew e r e l l 首都师范人学磷：i 二学位论文 b o t ht h r e ed a y se a r l i e rt h a nc k ，t h es t e r i l i t yw a s9 8 9 ，a n dt h es t e r i l es p i k e sa c c o u n t e df o r 8 2 7 o ft h et o t a l t h er e s u l t sl a i dt h eg r o u n d w o r kf o rt h ef l e wt e d m i q u e sf o rt w o - l i n eh y b r i d w h e a ts e e dp r o d u c t i o n k e yw o r d ：p h o t o - t h e r m o s e n s i t i v eg e n i em a l es t e r i l e ，f e r t i l i t y , p a r t h e n o g e n e s i s ， c h e m i c a lr e g u l a t i o n ，p l a s t i cm u l c h i n g i i i 首都帅范人学坝l 学位论史 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究i | 作所取 得的成果。除文l = j 已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标| ! j j 。 本人完全意识到本卢明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 专1 岬 f 1 期：_ 年臼r 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全r 解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位沦文 并向困家主管部门或其指定机构送交论文的电予版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名 专1 岬 日期：司年6 月】日 首都师范人学硕t 学位论文 第一章文献综述 植物雄性不育是指高等植物中，雌性器官发育正常而雄性器官发育、结构或功能异常， 致使丧失授粉或授精及结实能力的现象，最常见的有雄蕊发育不全、花药皱缩、花药不开 裂、花粉空瘪等。雄性不育系则是指雌雄同株的植物雄性器官不育而雌性器官发育正常， 能够接受正常花粉而受精结实的品系。雄性不育在植物界中是一种常见现象，据k a u l1 9 8 8 年统计已经在4 3 科，1 6 2 属，3 2 0 个种的6 1 7 对种间杂交植物中观察到遗传性的雄性不育 现象，并且这个数目还在不断增加【”。 小麦雄性不育包括细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和光温敏雄性不育；光温敏雄性 不育由遗传和环境互作引起，主要环境因子为光周期和温度。光温敏雄性不育株的育性存 在着从全不育到全可育的各种过渡类型，赵昌平等提出了“小麦雄性育性的相对性原理”， 即小麦雄性育性作为其雄性器官发育状况的最终表现，几乎贯穿小麦生长发育过程中幼穗 分化至开花受精的整个过程，在遗传基因与生长环境互作的基础上可通过环境条件的改 变，实现小麦雄性器官的完全不育或完全可育及各种中间类型【2 1 。 小麦光温敏雄性不育系的发现和研究，开辟了两系法利用小麦杂种优势的新途径。 两系法杂交育种是我国独创的以光温敏雄性不育性的利用为主要内容的高技术，是继三系 法之后的又一重大科技创新。两系法杂交小麦具有显著的优越性：( 1 ) 一系两用：在不育 条件下用于制种，在可育条件下可用于自身的繁殖，不需要借助保持系，因此能简化繁殖， 制种程序，降低种子生产成本。( 2 ) 光温敏雄性不育系与恢复系配组自由，选育优良组合 的几率增大。由于光温敏核不育性是受简单隐性基因控制的，几乎所有正常品种都能使其 育性恢复正常，都是恢复系。而在三系法中，有些组合表现出很强的杂种优势，而父本却 无恢复力；或者结实率良好的组合却不表现杂种优势。( 3 ) 避免不育细胞质的负效应和细 胞质单一化。此外，化杀法也是利用杂种优势的途径之一，但其存在成本高、环境污染及 药物专一性等难以克服的问题，因此两系法被认为是一条最有希望的利用作物杂种优势的 育种途径。 1 1 光温敏不育小麦研究进展 1 1 1 小麦光温敏雄性不育系的育性转换 不同的光温敏雄性不育小麦材料具有各自不同的育性转换敏感期。何觉民、周美兰等 堕塑堑丝查兰堡! ：兰篁堡苎 研究了光温敏不育系e s 一8 、e s - i o 的育性转换特点，认为育性敏感期为幼穗雌雄蕊原基分 化至四分体形成期 3 卅。赵昌平等认为光温敏不育系b s 2 0 的育性敏感期为花粉母细胞形成 期至单核期5 1 。何蓓如等认为温度敏感不育系a 3 3 1 4 的育性敏感期为减数分裂至单核期【6 】。 张建奎等认为光温敏隐性核不育系c 4 9 s 的育性敏感期较长，从花粉母细胞形成期到成熟 花粉期都有一定程度的敏感性，最敏感的时期有两个，即花粉母细胞减数分裂期和小孢子 中期 7 1 。徐乃瑜等认为d 2 型山羊草细胞质的异质系育性敏感期为小花分化则8 1 。 同样，不同的光温敏雄性不育小麦材料具有各自不同的育性转换临界温度和光长。 赵昌平研究表明b s 2 0 临界温度为1 0 - 1 29 c ，临界光长为1 2 - 1 4 h s l 。何蓓如研究表明温度 敏感不育系a 3 3 1 4 的临界温度为1 8 3 c 1 9 1 ；张建奎研究表明c 4 9 s 临界光长l l h ，临界温 度为1 4 c i v 。临界光长和温度是决定一个光温敏不育系是否育性转换彻底、能够制种的 关键，因此明确光温敏不育系的临界光长和温度，对二系法杂交小麦制种具有重要意义。 1 1 2 小麦光温敏雄性不育系的细胞学研究 周美兰等在细胞学水平上观察了小麦光温敏不育系的雄性发育过程，研究表明e s i o 、 e s - 1 4 虽然减数分裂期间出现一些异常现象，但大多数花粉母细胞能进行正常的减数分 裂，形成正常的四分体d o - i i 】。e s i o 在花粉粒发育时期，形成j 下常的单核花粉粒，大部分 单核花粉粒能进行有丝分裂形成二核或三核花粉粒，但其细胞质稀薄解体，营养核不清， 花粉粒变为椭圆形、三角形和多边形，花粉败育主要发生在二核到三核期，以染败为主， 败育率1 0 0 ；e s - 1 4 在发育到单核靠边期后，花粉粒不能进行核分裂，发育停止，然后 核解体，不能形成二核或三核花粉粒。马欣荣等研究表明，c 4 9 s 绒毡层解体时期比普通 小麦6 9 、f 1 ( c 4 9 s 普通小麦9 4 6 4 ) 迟，且c 4 9 s 在单核晚期小孢予细胞核不能定向移动 到萌发孔对测，推测可能是这两个原因导致c 4 9 s 雄性不育【1 2 1 。 1 2 小麦孤雌生殖育种技术研究进展 孤雌生殖是指雌配子体不经过受精，在基因控制下或其他外界刺激下而引起分裂直接 发育成胚的生殖方式。孤雌生殖包括单倍体孤雌生殖和二倍体孤雌生殖。单倍体孤雌生殖 是由1 n 卵细胞发育成1 n 胚或l n 助细胞、反足细胞等发育成l n 胚。二倍体孤雌生殖包括 2 n 卵细胞发育成2 n 胚；珠心或珠被分化为原倍性胚囊：胞原细胞不经减数分裂发 育成胚囊等三种发育方式。 1 2 1 孤雌生殖诱导方法 2 首都师范人学顾十学位论文 目前孤雌生殖诱导方法有以下七种方法： 1 ，2 1 。1 药剂诱导法 此种方法较为简便且应用较广，即在小麦去雄后用化学药剂处理柱头或予房，刺激卵 细胞，使其分裂并诱发孤雌生殖。药剂诱导法目前有两种方式：一种是直接喷施，另一种是 直接注射。李朝灿用t r t a 、g a 。和n a a 附加1 d m s o 诱导福繁1 7 和福宁4 号小麦孤雌生 殖，研究了不同小麦品种对三种药剂的敏感度和不同浓度t r t a 的诱导效果【1 3 】。胡启德等 用0 5 的d m s o 在小麦母本去雄后4 1 0 天于早晨或傍晚对幼穗进行喷雾，诱导产生纯合 二倍体的成功率可达2 9 【l4 1 。孙耀中用动物激素乙烯雌酚、炔诺酮、甲地孕酮诱导小麦 孤雌生殖，效果也很好，说明动物雌性激素也具有诱导小麦孤雌生殖的作用，同时还指出用 药剂处理的时间以每晚7 点后处理效果最好1 1 5 - 1 6 1 。山军建诱导太谷核不育矮败小麦孤雌生 殖，单生化因子以1 0m g k g 吲哚乙酸效果最好，复生化因子以对氯苯氧乙酸( 1 0 0m g k g ) + 肌醇( 5 0m g k g ) + 2 ，4 - 0 ( 1 0m g k g ) 诱导效果最好，施药方法以喷施3 次的效果最好1 1 1 。 1 2 1 2 远缘杂交诱导法 由于亲缘关系很远的花粉既不易使卵细胞受精，又能刺激卵细胞单性发育，产生单倍 体或二倍体的胚。早在1 8 7 6 年，w i l s o n 首次完成了小麦与黑麦属问杂交，标志着小麦远缘 杂交工作的开始【l8 1 。1 9 4 3 年，b a r c l a y 利用普通小麦与球茎大麦杂交获得了高频率的小麦 单倍体，后来的研究表明普通小麦与球茎大麦之间的杂交存在不亲和性，并己证明这种不 亲和性是由于位于小麦5 b 染色体长臂上的k r l 基因和5 a 染色体长臂上的k r 2 基因有阻止 小麦与异源植物交配的功能【1 9 1 。1 9 8 4 年德国学者z e n k t e l e r 最早报道了六倍体普通小麦 与玉米之间的远缘杂交 z o l ，随后1 9 8 8 年l a u r i e 利用小穗培养法获得了小麦与玉米杂交产 生的单倍体植株，同时证明y d , 麦与玉米杂交后，在最初的三次细胞分裂中，来自父本玉米 的染色体被完全排除掉，形成了仅有2 1 条母本小麦染色体的单倍体胚。他们进一步试验表 明，小麦玉米的受精频率不受小麦所携带的k r l 、k r 2 基因的影响，说明k r 基因在小麦与 玉米杂交中是不敏感的【2 l 】。m u j e e b k a z i a 等用秋水仙素浸根加倍法获得了6 0 7 0 的 加倍率【2 2 1 。陈新民等用该法获得了8 6 2 的加倍率，但加倍后植株死亡较多，加倍效率仅为 4 1 7 【矧。目前，小麦x 玉米每授粉1 0 0 朵小花可产生双单倍体植株7 1 5 个左右，已经达 到应用要求。随着技术的完善，远缘杂交法单倍体植株产生频率会进步提高，这种方法将 会更有效地用于育种实践。 1 2 1 3 延迟授粉法 堕堡塑型查兰堡! ：兰些堡兰 若对成熟卵细胞进行延迟授粉，则成熟卵细胞已失去受精能力，而成熟卵细胞受花粉 管刺激后容易引起分裂，所以容易进行孤雌生殖。1 9 世纪4 0 年代中期，木原在一粒小麦雄 性不育系中发现，延迟9 d 授粉的诱导效果最好。中科院遗传所用黑麦和硬粒小麦给普通小 麦品种问杂神f 1 授粉，发现去雄后8 d 授粉效果最好1 2 4 1 。杜连恩、罗景兰等在普通小麦中 诱导孤雌生殖时，均发现去雄后延迟7 9 d ，诱导效果较好1 2 5 1 。苗芳等用黑麦和小黑麦花粉 给普通小麦分段延迟授粉，结果表明不仅易形成胚乳，而且易形成同时具有胚和胚乳的胚 囊【2 6 】。 1 2 1 4 辐射花粉诱导法 在开花前至受精的过程中，用射线照射花粉，影响受精过程的正常进行，或者将父本的 花粉经过射线处理后，再给去雄的母本授粉，以减弱花粉的活力来影响其参与受精作用的 能力，使它能刺激卵细胞发育，达到诱发孤雌生殖的目的。能诱导孤雌生殖的有x 射线、y 射线、紫外线、酽和c 0 6 0 等。1 9 3 4 年片山用x 射线照射小麦，照射1 粒小麦后再给未授粉 的柱头授粉，诱导率为1 7 6 。胡启德等用y 射线处理普通小麦花粉给品种问杂种授粉，发 现有效剂量为5 0 0 0 8 0 0 0 伦琴，结实率为4 4 2 2 5 e h l 。目前，也有少量应用辐照雌 配子体来诱导产生孤雌生殖单倍体的报道，在以后的小麦育种工作中也可以进一步尝试。 1 2 f 5 离体诱导法： 通过组织培养在离体条件下培养未授粉的小麦子房、胚珠或幼穗，获得单倍体或纯合 二倍体植株。s a nn o e u m 培养出大麦单倍体植株唧。祝仲纯等在小麦、烟草及黄花烟草上 获得成功 2 8 - 2 9 1 。影响离体培养效果主要有三个基本因素：一是不同遗传基础、不同基因型 诱导分化能力不同，这是内因。二是消毒方法。这是离体诱导法实施起来最重要的程序， 所以要充分做好预实验确定出适合材料的消毒法。三是培养条件。包括接种时间、接种方 式、培养基成分、外源激素配比等，都将影响培养效果。 1 2 1 5 基因转入法 植物的孤雌生殖可由基因决定，当某一植物获得这基因，该物种的卵细胞或珠心、珠 被就会自发地进行孤雌生殖，并能稳定地遗传下去。近年来，有人在分子水平上研究外源细 胞质诱导小麦单倍体的机理，提出小麦孤雌生殖是由显性基因p t y 操纵，当p r y 与粘果山羊 草细胞质互作时即可产生单倍体，而当有s p g 基因存在时可抑制诱导孤雌生殖基因p t y ，不 能产生单倍体，s p g 为p r y 的抑制基因口o l 。这项研究为在分子水平上探寻植物孤雌生殖机 理提供了尝试。 4 首都帅范大学颂：l 学位论文 1 2 1 5 温度诱导法 n o r d e n s k o i l d 在普通黑麦授粉后2 1 h ，用4 1 的温度处理4 5 m i n ，后代中出现了孤雌 生殖单倍体。m u n t z i n g 在普通黑麦授粉后2 0 h ，用3 c 的低温处理3 0 m i n ，在4 6 株幼苗中 出现了一株单倍体。这两个实验说明温度的突然升高和突然降低均能诱导孤雌生殖。此方 法诱导效率不高。 1 2 2 孤雌生殖后代鉴定方法 1 2 2 1 形态学观察法 孤雌生殖单倍体和纯合二倍体在正常生长状态下外部形态极相似二倍体母本，而且由 于胚和胚乳相对正常种子发育相对较差，所以发育成的植株生活力一般都较弱，出苗顶土 力较差，幼苗较幼弱，植株较矮，分蘖相对较少，营养器官和生殖器官也较小，此种方法简便 易行，但主观性比较大。 i 2 2 2 分子标记法 目前，最可靠有效的孤雌生殖植株鉴定方法就是此方法。首先用一些引物在父本与母 本的d n a 里扩增，进行电泳，找出在同一基因位点父本和母本基因序列不一致的引物，用这 些引物在所得孤雌生殖p a l 的d n a 中扩增，进行电泳，如果只有一条带则说明是在此位点上 是纯合的，则是孤雌生殖后代。 1 2 2 3 细胞学鉴定法 取孤雌生殖后代幼苗根尖，压片观察根尖细胞，计数染色体数目。贾敬鸾、胡启德等在 小麦孤雌生殖后代的鉴定中曾用此法剀。他们用硬粒小麦和黑麦花粉诱导普通小麦品种间 杂种f l 代，以后代幼苗根尖为观察材料。染色体数2 n = 2 8 的肯定是普通小麦与黑麦的杂种； 染色体数2 n = 3 5 的肯定是普通小麦与硬粒小麦的杂种；而染色体2 n = 4 2 可能就是孤雌生殖二 倍体。细胞学方法对鉴定孤雌生殖单倍体材料尤其有效。 1 2 2 ，4 同功酶分析法 对诱导的孤雌生殖后代，进行脂酶同工酶分析，是新近发展起来的一种鉴定孤雌生殖 的方法。如以普通小麦杂交种f 1 为被诱导材料，将被诱导植株所结的种子和原来的母本杂 交种f 1 种子，分别发芽3 4 d 后，取其胚乳做凝胶电泳。如果电泳结果两条谱带一致，则说 明诱导成功。此法配合细胞学鉴定和田问外部形态鉴定，能获得更为准确的结果。 1 2 2 5 流式细胞分析法 5 堕堡堑丝查兰堡! ：兰丝笙塞 该方法是通过流式细胞分析仪对大量的处于分裂| 、日j 期的细胞含量进行检测，然后经仪 器附设计算机自动统计分析，最后绘制出d n a 含量( 倍性) 的分布曲线图。具体的操作分 两步：首先，材料及细胞核准备。新鲜材料置于含有对d n a 特异性的荧光染料d a p i 的缓冲 液内”用剃须刀切碎，悬浮液经2 0 一4 0pm 尼龙网过滤，调整细胞核密度至l o 一3 0 万个m l 。 然后，用流式细胞分析仪检测每个细胞核荧光信号强度，并经仪器自动分析。d n a 含量与 荧光信号强度成正比关系。细胞核的倍性最后以c 值表示，1 c 表示细胞核单倍体，2 c 表示 细胞核二倍体，依次类推。利用流式细胞分析仪的特点是快速、简便、准确。准备好的细 胞核样品在数分钟内即可完成测定和分析，所以特别适合于样品较多的倍性检测分析。缺 点是需要有较昂贵的专门设备。 1 2 2 6 叶片气孔性状测定法 樊冬丽等观察了棉属中不同染色体组的二倍体棉种、四倍体棉种及种间杂种共9 个材 料的叶片气孔，测定了气孔密度、气孔保卫细胞的大小、气孔最大开张程度及保卫细胞内 叶绿体数目。结果表明，不同染色体组问、不同棉种间和不同染色体倍性问在这些性状上 均存在明显的差异。并且，随着染色体倍性提高，四倍体棉种的气孔保卫细胞的大小和叶 绿体数目增加，而气孔密度则比二倍体棉种的小f 3 。目前，此种方法在鉴定小麦染色体倍 性方面的报道较少。 1 3 化学调控对光温敏雄性不育材料育性转换作用研究进展 白克智研究表明，某些内源植物激素等物质的平衡能影晌作物光周期的表达，进而影 响其育性的表达【3 2 】。何长征指出，由于花药发育异常也可能反过来导致内源激素水平的 变化，仅仅对雄性不育材料及其相应的可育材料的内源激素进行比较研究并不能确切了解 植物激素与雄性不育发生的关系1 3 3 】。因此，还必须研究外源施用植物激素、人工合成的 植物激素类似物质、植物激素生物合成抑制剂或促进剂( 前体物质) 以及与内源激素代谢 有关的离子螯合剂等对植物雄性育性的影响，以便进一步了解各种植物激素在雄性不育发 生过程中所起的生理作用，最终通过各种手段调节和改变植物体内激素的水平，实现人工 控制各种植物雄性的育性的目的。 1 3 1 化学调控及其方式： 化学调控是植物生理继化学施肥后对农业的叉一重大贡献，指将少量的化学制剂施用 在植株或土壤中来调节控制作物发育进程。从种子萌动起，生根、发芽、抽枝、展叶、开 6 百都卿范人学坝l ：学位论文 花、授粉、结实直到成熟死亡，每一过程都能运用化学调控加以调节。 化学调控的运用包括以下几个方面：激素施用控制个体发育：用微量的激素或其模 拟物( 人工合成的类似于激素的生长调节物质) 的水溶液处理植物可以调节控制多种生理 过程。混合处理获取综合效应：作物的生理生化程序比较复杂，经常是多种因素参与的 综合效应。因此，调控措施所用溶液的成分不宜过于单纯，时常使复方合用。为了便于作 物表面吸收，除主要成分之外，还要添加少许粘着剂、乳化剂、展开剂、湿润剂、增效剂 等，以便提高它的药效。生物化学调控与生物工程：个别植物的遗传基因组合的表达需 要在一定的发育阶段中通过外界条件的刺激才能实现。目前的基因工程多是把单一性状的 基因转入基因组，只有在适当的机遇下才能表达出来。化学调控的作用之一就是刺激某些 基因组合的表达。制剂处理提高次生代谢产物：栽培经济作物的目的时常是获取其次生 产物，诸如药用生物碱、芳香油、乳汁、糖分等。通过施用化控试剂，能有效的改变植物 体内的些代谢过程，使其能合成人们所需要的次生代谢产物。根外旌肥调节矿质营养： 植物的矿质营养需要氮、磷、钾等常用元素外，还需要铁、锌、硼、锰等微量元素。用含 有这些矿质元素的溶液喷洒或注射茎叶可补充土壤缺乏的这些元素。溶液喷洒根外施肥的 做法，可以使茎叶直接吸收与利用，及时收到速效。生物化学调控与生物防治：生物化 学制剂原本出自生物的制剂，如赤霉素，或是由人工模拟合成的药剂，在e f i 间旌用，也不 会残留，比较妥当，例如用细菌悬液( 根瘤菌) 直接喷洒在土壤与植物体上i 。 1 3 2 化学调控对光温敏雄性不育材料育性的影响 冯剑亚等用乙烯利4 0 0 0 p p m 和氯化钴5 0 0 p p m 在幼穗二级枝梗分化期对农垦5 8 s 进行 喷施，结果表明喷乙烯利显著提高幼穗中乙烯释放量，而喷施氯化钴增加穗中多胺量、减 少乙烯释放量，同时，乙烯利处理后自交结实率与对照相比显著降低，经过氯化钴处理后 自交结实率比对照净增1 8 9 【3 卯。 谭志军等用l o o p p m n a a 、5 0 p p m g k 、3 0 p p m 2 ，4 - d 、l o p p m 6 一b a 、3 0 0 p p m m e t 、5 0 0 p p m 氯 化钴和5 0 p p m g & 混合液在始穗前3 天对光温敏核不育系c y 8 5 2 6 和2 9 青s 进行喷施，结 果表明，2 ，4 一d 能明显提高花粉可育度，同时使可育期延长。m e t 可明显地延长其可育期， 但对其可育度的影响不明显。6 - b a 处理所得自然结实率最高。氯化钴对2 9 青s 的花粉可 育度的提高有明显的促进作用，但对8 5 2 6 s 的影响不明显，推测可能是由于各光温敏材料 的育性转换机制的差异所引起的1 3 6 1 。 许建新等用氯化钴、乙烯利、b 4 0 ( 生长调节荆) 和“9 0 1 ”等四种外源化学物质对 w 6 5 1 4 s 、w 6 1 1 1 s 、5 0 4 7 s 、i s 0 0 1 s 及m 1 0 5 s 等光( 温) 敏核不育水稻进行叶面喷施，结果 7 堕塑些丝叁兰堡：! ：兰丝堡苎 表明，当供试材料育性转换敏感期处于不育条件下，喷施1 0 0 0 p p m 的氯化钴，提高正常花 粉率8 9 一2 5 5 ，提高自交结实率1 4 一7 6 ；当供试材料育性转换敏感期处于可育 条件下，喷施4 5 0 0 p p m 的乙烯利、1 5 0 p p m 的b 4 0 和3 6 0 p p m 的“9 0 1 ”，可提高花粉败育率 4 4 一3 8 5 ，降低自交结实率1 6 一2 6 2 【3 7 】。 莫磊兴通过用红光、远红光处理农垦5 8 s 叶、穗内源多胺和多胺生物合成抑制剂的 使用，认为农垦5 8 s 叶片多胺变化与育性转换无明显关系；幼穗多胺水平受光敏色素问接 调控并与育性转换密切相关。多胺生物合成抑制剂甲基乙二醛一双脒腙( m g b g ) ，能在长 光照完全不育的条件下促进农垦5 8 s 产生少量可育花粉和自交结熨3 虮。 徐孟亮挑选出7 种对水稻不育系育性恢复较为有效的调控剂，代号为c r l c r ，用这 7 种化学调控剂处理不同类型的不育系，结果表明：育性调控的难度表现为：普通核不育) 三系不育系) 两系不育系【3 9 1 。 林友豪研究结果表明，生长素、三碘苯甲酸对农垦5 8 s 的花粉育性的影响表现出较 明显的正效应，阿魏酸和咖啡酸能降低花粉可育率，表现出一定的负效应。并且，同一激 素或生长调节剂不同时期处理对农垦5 8 s 的花粉育性影响效果也不一样【椰】。 张建奎等研究表明，i 从、n a a 、g a 3 对早播不育和晚播可育的c 4 9 s 结实率均有不同 程度的提高，乙烯利对育性表现很强的抑制作用，而a v 6 则对育性有明显的促进作用，爱 多收和氯化钙对结实率有一定程度的提高【4 l l 。 1 4 利用塑料膜覆盖技术进行二系杂交小麦制种 1 4 1 两系法杂交小麦制种技术 自开展两系法杂交小麦研究以来，制种技术的探索同不育系的选育几乎是同步的。目 前已育成光( 温) 敏不育系如b s 3 6 6 、b s 2 1 0 、b s 2 0 、c 4 9 s 系列、e s 系列、k 7 8 s 、k 1 5 6 4 s 、 a 3 3 1 4 、农大3 3 3 8 等，配制成了京麦l o 、京麦2 0 、云杂3 号、云杂5 号、云杂6 号等组 合，并已进行了大面积制种。目前，在三系法和两系法杂交水稻制种的基础上，针对两系 法杂交小麦制种的特点，已基本研究出一套高产保纯制种技术m - 4 4 1 。 1 4 1 1 制种基地的选择 制种基地的选择，既要考虑不育系育性敏感期的安全，又要考虑抽穗扬花授粉期的安 全育性敏感期的安全是两系杂交小麦制种成败的关键，在制种时要以育性敏感期的安全 为前提。一般不育系的选育地就是不育系的自繁地，也可选择纬度稍偏北，海拔稍高的地 首都师范大学硕f ：学位论文 方，推迟不育系的生育期，使其育性敏感期处于相对长同照、高温的条件下，以提高自交 结实率。而杂交制种地则一般选择在与不育系选育地同海拔或相对较高海拔而低纬度的地 区，纬度越低，不育系的育性越低，制种的可能性越大，制种的纯度越高。 1 4 1 2 制种亲本的播期安排 制种亲本的播期安排首先应服从于不育系育性敏感期和抽穗扬花安全期。在此前提 下，双亲之问的播种差期则服从于父母本理想的花期相遇。不同组合、不同地区、不同制 种季节，双亲的播种差期安排又有差异，尽管如此，两系法的制种，双亲播种差期的安排， 一般采用叶龄差法、播始历期差推算法和有效积温差推算法。 1 4 1 3 高产优质制种群体苗穗结构的建立 杂交小麦制种产量的高低还决定于单位面积内母本的颖花量和父本的花粉量及花粉 密度。在制种的栽培管理过程中，使父母本群体苗穗结构合理，生长发育相互协调，是制 种高产优质的基础。一般可用以下方法：1 加大双亲用种量。2 加强对父母本的培养，例 如采用一次性施肥法等方法，增加单位面积上母本的颖花数和父本的花粉密度。 1 4 1 4 花期预测 在制种过程中，由于气候、水肥、土壤等条件和麦茁素质、栽培管理以及病虫害等因 素的影响，都可能使生育期有所延长或缩短，导致原预计的花期变动，造成父母本花期相 遇不理想甚至不遇。花期预测主要的预测时期是幼穗分化发育期，常用预测方法为：剥检 幼穗预测法、父母本对应叶龄预测法、叶龄指数预测法和叶龄余数预测法。 1 4 1 5 花期调节 制种时，父母本花期不育现象是经常产生的，因此花期调节是铝种中重要的技术措施。 花期调节主要是控制与促进相结合，控制生育期快的亲本，促进生育期慢的亲本。般有 以下几种方法：肥料调节法、水分调节法、激素调节法和后备父本田法。 1 4 1 6 制种亲本异交态势的改良 杂交小麦制种亲本的异交态势，包括母本接受花粉的态势和父本散粉传粉态势。母本 接受花粉的态势，主要表现于植株的开颖时问、柱头外露率等。父本散粉态势，主要表现 于植株高度、开花散粉时间。改良母本的异交态势，是提高异交结实率的重要技术环节， 主要方法有：喷施九二0 ，可促使正在生长发育的幼嫩细胞拉长，从而使抽穗时的伸长节 9 蔓塑塑蔓查兰竺兰丝丝苎 间拉长，解除卡颈，并使开花时问提早，提高父母本花时相遇率；还可使母本开花时张颖 角度增大，柱头外露率提高，柱头生活力增强等。 1 4 1 7 父母本花时调节与授粉 在制种过程中，父母本的花时经常会出现不遇现象。花时调节措施包括赶露水、喷父 本冷水、喷施调花物质等。在制种的开花期，单位面积内父本总花粉量已经定量，要使花 粉尽可能及时较多地散落到母本柱头上，必须采用恰当的人工辅助授粉措施( 4 s l 。 1 4 2 塑料膜覆盖技术 塑料膜覆盖技术在农作物上广泛应用f 4 “引。在棉花、油菜、大蒜等作物上可提高土壤 温度，促使作物增产。在早稻种植时可通过塑料膜覆盖保持湿度，利于培育壮秧。在小麦 上，一般有两个用途：一是用地膜覆盖晚播的小麦，增加小麦的生长积温，使晚播弱苗在 冬前形成壮苗；二是用地膜覆盖适时小麦，显著增加穗粒数，在基本苗少的条件下，明显 增加穗数。目前，将盖膜技术与小麦制种技术结合在生产上有效应用的报道还没有。 1 5 本研究的立题依据和意义 1 5 1 两系杂交小麦的重要意义 小麦是世界上分布最广并且具有较大杂种优势的第一大粮食作物，各国一直都在努力 寻求开发利用其杂种优势的途径与方法。由于小麦是自花授粉作物，因此，小麦杂种优势利 用的核心问题是高效生产小麦杂交种的技术体系，前人为此曾做出巨大的努力。并取得一 系歹喧! 要成果和突破性进展。综合5 0 年的前期工作，小麦杂种优势利用研究主要集中于： 核质互作雄性不育的利用( 三系法) ，化学杀雄技术的利用( 化杀法) 和光温敏雄性不育 的利用( - - 系法) 。小麦杂种优势利用在“三系法”和“化杀法”困难重重的情况下，二 系法杂交小麦发展迅速并开始走向大面积生产，已成为今后小麦杂种优势利用技术研究与 应用的主要发展趋势。二系法即光温敏雄性不育的应用，光温敏雄性不育属基因型环境互 作雄性不育( g e m s ) 类型，目前在小麦上发现的光温敏雄性不育多属核环境互作不育类型。 由于此种雄性不育类型不育系系两用，在制种时省去了人工去雄过程且恢复源广泛，较 易获得优势组合，因此被认为是一条最有希望的利用作物杂种优势的育种途径 4 9 - 5 2 。 1 。5 2 两系杂交小麦面临的主要问题 1 5 2 1 小麦光温敏不育系的育性稳定性问题 l o 曹茜l f 帅范人学硕l ：学位论义 光温敏二系杂交小麦育种体系中，要求不育系在自身繁殖时雄性育性越高越好，最理 想的育性是百分之百，因为育性越高结实率越高，自繁的产量就越高，杂交种制种的成本 就会相应地降低。相反，不育系在杂交制种时雄性不育度越高越好，即不育度能够达到百 分之百，雄性不育度越高，自交结实越低，异交率越高，小麦杂交制种的纯度也就越高。 事实上，现在不育系的育性很难达到这两个“百分之百”，这就需要选育新的育性转换稳 定的小麦光温敏不育系，而现有常规育种技术育种周期长，般需8 年左右的时间，且操 作难度大、选择效率低。 1 5 2 2 高产保纯制种问题 自开展两系法杂交小麦研究以来，制种技术的探索同不育系的选育几乎是同步的。目 前，针对两系法杂交小麦制种的特点，己基本研究出一套高产保纯制种技术。其中，首先 需要考虑的是制种基地的选择。一般不育系的自繁地就是不育系的选育地，如要安全制种 就需要选择符合不育系不育条件的异地。但远程异地制种还存在其他三个方面的问题，首 先农艺性状因环境差异引起的变化，给制种带来诸多的困难，以致不能制种；其次不育系 的育性和育性稳定性也不一定达到较理想的水平；第三远程异地制种还存在路程费用等， 增加了制种成本。 1 5 3 解决办法 杂交小麦面临的上述问题，本研究拟从以下三方面解决。 1 5 3 1 利用孤雌生殖技术快速培育优良光温敏雄性不育系 利用孤雌生殖可产生单倍体或纯合二倍体植株，在光温敏材料选育中可使包括光温反 应特性在内的各种优良性状在早世代稳定，提高优良光温敏材料选育效率。目前，国内外 科学家已在水稻、小麦、玉米等植株上成功诱导出孤雌生殖单倍体或纯合二倍体植株 5 2 - 5 6 1 。 本实验的目的是选择出对b s 3 6 6 等不育系及其后代有效的孤雌生殖诱导剂，同时选育出优 良稳定的光温敏不育系，使其育性能够达到上述两个“百分之百”。 1 5 3 2 利用化学调控技术调控雄性不育系育性 本试验拟通过对现有不育系b s 3 6 6 和b s 4 0 0 外源施用植物激素、人工合成的植物激素 类似物质、植物激素生物合成抑制剂或促进剂以及与内源激素代谢有关的离子螯合剂等来 改变不育系体内激素的水平，使不育系不育度提高或降低，实现人工控制雄性不育系的育 性，进而提高制种纯度和降低制种成本。 首都帅范人学硕士学位论文 1 5 3 3 利用塑料膜覆盖技术进行高产保纯制种