（遗传学专业论文）盐胁迫对拟南芥根的细胞形态及蛋白质表达影响的研究.pdf

摘要 盐的主要成分及衡量指标之一是钠，钠是大多数植物生长所必须的微量元 素。盐分浓度过高，一方面会造成作物的水分胁迫、离子胁迫、膜脂过氧化、生 理紊乱等多种伤害，另一方面，作物自身又会产生对胁迫的适应。 本实验以模式植物野生型拟南芥为实验材料，1 2 0 r a m 盐胁迫处理拟南芥幼苗 1 0 天，得到处理组( a 3 ) 与对照组( c k ) 两组材料。经盐胁迫后，拟南芥的根 在整体形态上，根尖顶部膨大，直径变大长度变小；次生根直径变化不大但长度 变小；根冠表面积及体积均变小约3 0 ；分生区长度变小约3 0 ，直径变大约2 0 ， 伸长区长度变小约5 0 ，直径变大约1 0 ；成熟区根毛数量变少约6 0 8 0 ，且 根毛很短，形态变得不规则。在细胞形态上，根表皮细胞形态变得不规则，对照 组细胞为长椭圆形，处理组细胞为短的不规则形状，且出现突起小泡。用四种单 克隆抗体，标记半薄切片上的材料，发现j i m 5 、7 识别的果胶类物质其表达量变 小，j i m 4 、8 标记的阿拉巴半乳聚糖蛋白表达量也下调。称取对照组和处理组相 同重量( 0 5 9 ) 的根提取蛋白质，称量提取到的蛋白质，发现所得到的干物质， 处理组( 提取到蛋白质约3 8 m g ) 的比对照组( 提取到蛋白质约2 3 m g ) 的重约6 5 2 ； 蛋白质电泳时，保持一致的上样量，s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现小分子量蛋 白质表达量变化较大，2 0 k d a 蛋白质表达明显上调，5 1 k d a 蛋白表达微弱上调， 5 k d a 、2 3 k d a 、7 9 k d a 蛋白表达微弱下调，其他变化不明显。挖取二维电泳凝胶 上差异表达明显的蛋白质点进行质谱分析，已知在p o 0 5 时，s c o r e 大于6 0 就 具有较高可信度，与数据库比对发现有一个蛋白质点的s c o r e 达到6 2 ，数据库 中的这个蛋白含有与拟南芥巾转录因子相似的结构。 关键字：拟南芥；盐胁迫；根；细胞形态；蛋白质表达 4 a bs t r a c t n a t r i u m ，t h em a i ni n g r e d i e n ta n do n eo ft h ei n d i c a t o r so fs a l t ，i st h ee s s e n t i a l m i c r o e l e m e n tf o rt h eg r o w t hi np l a n t 1 ft h es a l tc o n c e n t r a t i o ni st o oh i g h ，o nt h eo n e h a n di tw i l ld o s u c hh a r mt o c r o p s a sw a t e rs t r e s s ，i o ns t r e s s ，m e m b r a n el i p i d p e r o x i d a t i o na n dp h y s i o l o g i c a ld i s o r d e r ，o nt h eo t h e rh a n dt h ec r o p st h e m s e l v e sw i l l a d j u s tt ot h es t r e s s ，w h i c hi sc a l l e ds a l i n et o l e r a n c e t h er e s e a r c ht a k e sm o d e l p l a n tw i l da r a b i d o p s i st h a l i a n aa se x p e r im e n t a lm a t e r i a l s t h ea r a b i d o p s i ss e e d i n g sc u l t u r e di n12 0 m ms a l tm e d i u mf o r10d a y s a n dt h a nw e g e tt w os e t so fm a t e r i a l sa f t e rs a l ts t r e s sw h i c ha r et r e a t m e n tg r o u p ( a 3 ) a n dc o n t r o l g r o u p ( c k ) c o m p a r e dw i t hc k ，o nt h eo u t l i n eo fr o o ta p i e x ，a 3r o o tt i pb e c o m e s w e l l i n g ，d i a m e t e rb e c o m eb i g g e ra n dl e n g t hb e c o m es m a l l e r d i a m e t e ro fs e c o n d a r y r o o th a v el i t t l ec h a n g e db u tl e n g t hb e c o m es m a l l e r b o t ho fs u r f a c ea r e aa n dv o l u m e o fa 3r o o tc a pb e c o m e3 0 s m a l l e rt h a nc k l e n g t ho fm e r i s t e m a t i cz o n eb e c o m e 3 0 s m a l l e ra n dd i a m e t e r10 l a g g e r t o t a ln u m b e ro fr o o th a i r so fm a t u r a t i o nz o n e o fa 3b e c o m e6 0 - 8 0 l e s st h a nc k ，a n dt h e yb e c o m es h o r t e ra n di r r e g u l a r o nt h e m o r p h o l o g y , r o o tc o r t e xc e l l sb e c o m ei r r e g u l a r , t h ec k a r eo v a l ，a 3a r es h o r t e rt h a n c ka n db e c o m ei r r e g u l a r , a n ds a l ts t r e s sm a k ev e s i c l e s a p p e a r i n g u s ef o u r m o n o c l o n a la n t i b o d i e sw h i c ha r ej i m 4 ，5 ，7 ，8t ot a go ns e m i - t h i ns e c t i o n s ，a l lo ft h e f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo na 3s e c t i o n sa r ew e a k e rt h a nc k i ts h o w st h a tt h ee x p r e s s i o n a m o u n to fa r a b i n o g a l a c t a np r o t e i n sa n dp e c t i nl o c a t e do nc e l ls u r f a c eo fa 3a r el e s s t h a nc k t a k et h es a m ew e i g h tr o o to fc ka n da 3t oe x t r a c tp r o t e i n ，w ef o u n dt h a t t h ed r yw e i g h to fp r o t e i no fa 3a r e6 5 2 m o r et h a nc k k e e pt h es a m es a m p l e a m o u n tw h e nr u ns d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s ，w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs m a l l m o l e c u l a rp r o t e i nc h a n g ev e r ym u c h ，f o re x a m p l e ，e x p r e s s i o no f2 0 k d ap r o t e i na r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d a n ds o m ec h a n g en o tv e r ym u c h ，f o re x a m p l e ，e x p r e s s i o no f 5lk d ap r o t e i na r e s l i g h t l yi n c r e a s e d ，a n d5 k d a ，2 3 k d a ，7 9 k d ap r o t e i na r es l i g h t d o w n w a r d a n dt h eo t h e r sc h a n g ev e r yl i t t l e a f t e r2 - d er u n n i n g ，t a k ep r o t e i np o i n t s w h i c he x p r e s s e dd i f f e r e n tm a k em a s ss p e c t r u m ，w ef o u n da p r o t e i nw h i c h s c o r ei s6 2 u w h e np o ，0 5 ，t h i sp r o t e i ni sg i l 6 6 3 4 7 7 4w h i c hc o n t a i n sas t r u c t u r es i m i l a r i t yt o g b l y l 3 7 2 0h a p 2 at r a n s c r i p t i o nf a c t o rf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；s a l ts t r e s s ；r o o t ；m o r p h o l o g y ；p r o t e i n e x p r e s s , o n i i i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服 务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保 密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： j 一 一、月l j 舌 盐渍土是一种世界性的低产土壤，甚至是不毛之地，但是在很多情况下又兼 具地势平坦和灌溉之便，因而自古以来又为世人所瞩日1 6 。特别是在当前，随着 工农业生产的飞速发展，人口的不断增加，粮食需求的日益高涨，以及耕地资源 的愈趋缺乏，盐渍土的开垦利用则更为众多国家或地区所高度重视。我国已在这 方面建立了较好的工作基础。长期以来，关于如何提高植物的抗盐性，增加在盐 胁迫下农作物的产量一直是人们关注的焦点。植物对盐胁迫的反应机制和抗盐机 理的探明，是指导通过生物工程方法或其他措施改造植物提高其抗盐能力的前 提。 1 1盐胁迫对植物的影响 1 1 1盐胁迫对植物种子荫发及幼苗生长的影响 立苗是盐碱土作物生产上的一个实践性问题、虽然目前还没有发现植物在萌 发时的抗盐性和后来生长阶段的抗盐性之间有直接的生理联系，但种子萌发是保 证出苗的前提【l l 】。 n o b e l 提出与植物生长相比，种子萌发更易遭受盐害。在研究盐胁迫时，发 现低浓度盐对种子发芽率没有影响，一定范围内增加盐的浓度还可以刺激发芽率 的提高，进一步增加盐的浓度，发芽率才受到抑制。他还认为盐胁迫下的发芽率 与温度高低也有一定的关系。一般认为随着盐浓度的提高，种子的发芽率和根茎 比下降。郑青松等的研究表明盐胁迫下芦荟幼苗叶片的生长速率和干物质积累量 明显下降。盐浓度影响种子的萌发主要有三方面效应，即增效效应、负效效应和 完全阻抑效应。低浓度盐分对种子萌发有促进作用，随盐分浓度的升高，种子发 芽率、发芽指数和活力指数都减小，盐浓度过高就会抑制种子萌发。沈禹颖等研 究发现，盐浓度低于0 5 4 9 l o o m l 时，碱茅随盐浓度的增加累积发芽率呈增加趋 势，最高可达9 0 5 ；居于0 5 4 o 7 2 9 l o o m l 之问时，处于稳定状态；而在0 7 2 4 7 4 9 l o o m l 范围内，碱茅种子萌发总曲线随盐浓度的增加反而呈下降趋势；盐 浓度人于4 7 4 9 1 0 0 m l 时曲线贴近x 轴，李昀等对碱茅、黑麦草、野人麦、碱蓬 4 种牧草研究得出，随盐浓度的升高，发芽率降低，在马铃薯、番茄、苦瓜等作 湖北大学硕士学位论文 物上也得到与上述相似的结果。 1 1 2 盐胁迫对植物生长发育的影响 盐分胁迫对植物最普遍和最显著的效应就是抑制生长。盐胁迫会造成植物发 育迟缓，抑制植物组织和器官的生长和分化，使植物的发育进程提前。植物被转 移到盐逆境中几分钟后，生长速率即有所下降，其下降程度与根际渗透压呈正比。 最初盐胁迫造成植物叶面积扩展速率降低，随着含盐量的增加，叶面积停止增加， 叶、茎和根的鲜重及干重降低。盐胁迫下，棉花叶片发软、色暗、功能期变短， 侧根发生少，出叶速度减慢，生长势下降，果枝、显蕾、开花、结铃数目减少。 马铃薯试管苗的苗高、根长、生物量显著下降。随盐浓度的增加，小麦株高、根 长、叶片数均有减小，春小麦根系受危害比地上部更大，而在饲料酸模和苇状羊 茅上盐胁迫对地上生长的抑制大于对根的影响。 关于盐分胁迫影响植物生长的机理，学者们开展了深入细致的研究i l l , 3 0 。 m u n n s 认为盐分对植物生长发育造成的影响主要有三方面的原因：一是盐土中的 低水势引起植物叶片水势下降，导致气孔导度下降是盐影响多种生理生化过程的 根本原副1 1 】；二是盐害降低光合作用速率，减小同化物和能量供给，从而限制植 物的生长发育【4 】；三是盐害影响某些特定的酶或代谢过程 1 , 1 5 , 3 5 , 3 6 】。余叔文认为膨 压大小、壁的松弛和细胞内溶质的不断积累是决定细胞扩展生长的三个重要原 因。余叔文认为n a c l 显著抑制由葡萄糖合成壁多糖的过程。k u i p e r 等认为，n a + 对根系细胞分裂素生物合成的影响是植物对盐胁迫的第一反应，叶片中a b a 的增 加是根系对盐反应的结果，较高的a b a 含量抑制了植物的生长。t a t t i n i 等认为 是由于盐胁迫抑制c a 2 + 和k + 的吸收，从而导致分生组织和叶片内营养平衡受到破 坏。s t o r e y 等认为盐胁迫对植物生长发育抑制是由于盐胁迫增加了根系下表皮 的木栓化作用，从而抑制对水分和无机离子的吸收。k u l i e v a 等发现盐胁迫通过 影响有丝分裂，减少细胞分化而减少生长。关于盐胁迫对植物生长发育的起始作 用和主要原冈仍众说纷纭，尚无一致结论。 1 1 3 盐胁迫对根形态的影响 姚静等研究番茄幼苗生长和根构型在盐胁迫下的变化，发现番茄幼苗地上部 2 、ur 干、鲜重随着盐浓度增加而减小，根生物量受其影响相对较小；幼苗叶片叶绿素 含量显著降低。5 0 m m o l ln a c i 显著抑制了侧根发育，侧根数显著降低，而 1 0 0 m m o l ln a c l 贝0 显著抑制了主根和侧根伸长，由此可见，番茄根对盐胁迫比较 敏感【引。 1 1 4 对叶片解剖学的影响 盐分会增加豆类、棉花叶片的表皮厚度、叶肉厚度、栅栏细胞长度、栅栏细 胞直径和海绵细胞的直径 8 】。相反，红树植物小花鬼针草叶片中，表皮和叶肉的厚 度及细胞间隙会随n a c l 处理水平的升高而迅速减小。番茄中叶面积和气孑l 密度 随盐浓度的升高而降低。盐胁迫会导致甘薯叶片中液泡形成、内质网部分膨胀、 线粒体脊数目减少、线粒体膨大、囊泡形成、液泡膜破碎或胞质降解。 1 2 盐胁迫对植物生理代谢的影响 1 2 1 对植物光合作用的影响 盐胁迫导致净光合速率下降 4 1 。净光合速率的大小能直接反映植物的生长情 况。众多实验证明，非盐牛c 3 植物的光合作用易受盐分影响，并且降低程度与 盐浓度呈正相关，而非盐生c 4 植物的光合作用则受盐分影响的程度较小。张川 红报道，中林4 6 杨受胁迫后，短期内净光合速率便发生明显的下降，且高盐时 下降更多。而国槐受盐胁迫后净光合速率上升，并且在一定时问和一定浓度的胁 迫条件下能维持其光合速率不低于不施盐的对照，可见国槐具有c 4 植物的特点。 许多的盐生c 4 植物如红松等的光合作用需要较高的盐分浓度，低浓度或无盐条 件下反而造成光合的下降。当然c 。植物对盐分的忍耐也不是无限制的。 盐胁迫导致叶绿素含量降低【2 引。叶绿体足植物进行光合作用的主要场所。叶 绿素含量是反映植物光合作用强度的生理指标。由于盐胁迫下，植物吸收不到足 够的水分和矿质营养，造成营养不良，致使叶绿素含量低，影响色素蛋白复合体 的功能，从而降低叶绿体对光能的吸收。色素蛋白复合体的损伤，不仅影响能量 的吸收，还会影响类囊体膜的垛叠，使叶绿体中的基粒的数量和质量下降，从而 影响了光合性能。 据s t r o g o n o v 报道，叶绿素和叶绿体蛋白的结合程度取决于植物叶片细胞内 湖北人学硕十学位论文 离子的含量。在盐碱逆境下，由于植物叶片内离子含量高，使这种结合变得松弛， 其结果使更多的叶绿素被解离卅米。马焕成等研究认为：叶绿素a 、叶绿素a b 都随盐分浓度的升高而增加，而叶绿素b 含量随盐分浓度的升高而减少。w e r n e r a 等研究耐盐植物红树时，也指m 叶绿素含量和叶绿素a b 比例都随盐浓度的增 加而增加。吴永波等研究3 种白蜡幼苗抗盐性时指出随着盐分浓度的增加，白蜡 幼苗叶片的叶绿素含量是逐渐减少的。 关于n a c l 抑制植物光合作用的机理，是个非常复杂的问题，与植物光合系 统的许多方面有关【3 6 1 。赵可夫认为盐渍条件下光合速率降低的原因主要有四方 面：影响c o ：扩散到结合部位；改变负责光反应的细胞器的结构和功能； 改变暗反应的化学过程；抑制同化产物转移。而朱新广认为盐胁迫对光合作用 的影响有3 种可能的途径，即离子伤害、渗透伤害和糖分积累造成反馈抑制。许 多证据表明，盐分胁迫下气孔导度的降低不是由水分关系决定，而是由盐刺激根 系所形成的物理或化学信号物质诱导，即在盐渍环境巾植物根系产生一种或一些 化学信号物质影响气孔导度，有人认为这些信号物质就是a b a 或其他一些未知抑 制物。有些报道认为气孔的关闭可充分说明a b a 对光合作用的抑制，并证明对光 合作用无非气孑l 影响。而非气孔限制则主要是囚植物细胞内积累大量的n a 和 c l 一，使光合机构及与光合作用有关的酶活性受到损伤引起光合速率下降。 1 2 2 对呼吸作用的影响 呼吸作用提供植物大部分生命活动所需要的能量，同时，它的中间产物又是 合成多种重要有机物质的原料。植物积累或拒绝盐离- 了，合成有机渗透调节物质 适应或抵抗盐胁迫等一系列过程都需要消耗大量能量，因此盐胁迫下植物呼吸强 度首先增强，后随着时间的延长而减弱。植物的呼吸作用和光合作用是既相互对 立又相互依存的，盐胁迫打乱正常呼吸代谢的同时也影响到植物的光合代谢，造 成一系列不良的连锁反应。 1 2 3 对水分关系的影响 植物的水势和渗透压势与盐分的增加呈负相关，而细胞膨胀压则会随着盐分 的增加而升蒯2 。多年生草本植物u r o c h o n d r as e t u l a s a 在含盐基质上培养时， 4 、前言 叶片的水分、渗透势和气孔导度与盐分的增加具有极大的负相关，压力势随着盐 分的增加而降低。在盐地碱蓬中，随着盐分的增加，叶片的水势和蒸发速率会显著 降低，然而它的叶片相对含水量却没有变化【7 们。 1 2 4 对蛋白质合成的影响 盐害能破坏蛋白质的合成，使体内积累的氨过多，氨的存在对植物体是有害 的i l 】。盐害使叶绿体内的蛋白质合成受到破坏，叶绿体内蛋白质的数量减少，叶 绿体与蛋白质的结合削弱，叶绿体趋向分解。叶绿素和类胡萝卜素的合成也受干 扰，叶片失去绿色。过多的盐分抑制蛋白质合成而促进其分解，抑制的直接原因 可能是由于破坏了氨基酸的合成。如蚕豆在盐胁迫下叶内半胱氨酸和蛋氨酸合成 减少，从而使蛋白质含量减少。 通常在盐胁迫下，叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素总量下降，老叶枯萎并凋 落。盐胁迫下，番茄叶片中c h l - a + b 、c h l a 和1 3 一胡萝卜素的含量降低。藻青菌 中藻青蛋白p t 绿素比降低，而类胡萝卜素叶绿素比却没有明显变化。小麦经 n a c l 处理后，2 6 k d a 蛋白含量增加，1 3 和2 0 k d a 蛋白含量减少，2 4 k d a 蛋白完全消 失。小花鬼针草中一种2 3 k d a 的多肽在4 0 0 m mn a c l 处理4 5 天后会完全消失，而 当盐胁迫消失时，这条蛋白带重新出现【”】。 1 2 5 对脂类的影响 脂类对于很多生理胁迫的耐受都有很重要的作用，不饱和脂肪酸可以消除水 胁迫和盐胁迫的危害。花生中脂类含量在低浓度n a c l 条件下增加，高盐下降低。 n a c l 胁迫下，盐沼草根部质膜中脂类成份发生改变，而且固醇和磷脂的摩尔比随 盐分的增加而降低，胆固醇磷脂比却不受影响。从抗1 0 0 m mn a c l 番茄愈伤组织 中分离的质膜囊泡中，磷脂和固醇含量较高，磷脂游离固醇低磷脂脂肪酸不饱和 指数较低 3 0 , 3 5 。 1 2 6 对离子水平的影响 盐胁迫下，植物在吸收矿物元素的过程中，盐离子与各种营养元素相互竞争 而造成矿质营养胁迫，严重影响植物正常生长。高浓度n a 严重阻碍植物对k + 的吸 湖北人学硕十学位论文 收和运输。在很多植物中，n a + 和c l 含量随n a c l 处理水平的升高而增加，而c a 2 + ，k + 和m 9 2 含量降低。2 0 0 m mn a c l 处理后，骆驼刺叶n a 含量是对照的4 5 倍，而且植株 在叶片含有如此高浓度n a + 的情况下仍然没有死亡。盐分会增加蚕豆n a + 、c l 一和 c a 2 + 含量，而k n a + 比降低3 5 ，3 6 1 。 1 2 7 对抗氧化酶及抗氧化剂的影响 盐胁迫影响植物体内s o d 、c a t 和p o d 等抗氧化酶类的活性。刘婉等认为， 盐胁迫下小麦叶片中抗坏血酸含量下降，用活性氧清除剂处理可明显缓解抗坏血 酸含量下降，且外源抗坏血酸能明显缓解由盐胁迫造成的细胞膜伤害。 s r e e n i v a s u l u 等用相同浓度梯度的n a c l 处理耐盐和盐敏感的谷子，发现耐盐谷 子幼苗中总s o d 活性随盐浓度的提高而逐渐升高，盐敏感幼苗中总s o d 的活性逐 渐下降 8 , 3 4 , 5 2 】。 1 3 植物对盐胁迫的适应 1 3 1 组织结构的适应 盐生植物最典型的一个结构特性是叶的肉质性，其叶片往往厚且肉质化，含 有较大的液泡，细胞内汁液丰富。有些盐生植物甚至具有专门的表皮储水囊泡， 这些囊泡的存在能大大提高植物的储水体积4 2 1 。植物储水体积的增加意味着植物 保水能力增强，有利于植物避免因盐害而导致的生理干旱。 1 3 2 稀盐作用 稀盐的盐生植物将吸入茎和叶的盐类，借体内肉质化的结构，将盐稀释，减 低其盐离子的危害，盐愈多，肉质化愈增加。非盐生植物的稀盐是通过快速生长 进行稀盐，使有机物质、胁变数量和植物体积增加的速度远远超过离子的摄入速 度，结果植物体虽吸入一定量的盐离子，但其浓度却有一定程度的降低，从而使 植物免受盐离子的毒害作用 3 0 】。 1 3 3 泌盐作用 盐生植物吸收了盐分，但并不在体内积存，而是通过特异机构( 盐腺和盐毛 6 一、h u 石 等) 主动地排i 1 i f 到茎叶表面，而后冲刷脱落，这是盐生植物最常用的形式，防止 体内过量n a + 、( 、c 1 等离了的积存。非盐生植物没有盐腺结构，所以它不可能 通过盐腺进行泌盐f 3 0 1 。 1 3 4 拒盐作用 盐生植物的拒盐作用是依靠其对盐的不透性，阻止盐分进入植物体或进入植 物体内进行重新分配。非盐生植物的拒盐作用除了依靠质膜对盐的不透性或利用 其他方式阻止盐分向地上部分转移外，其根部的根茎木质薄壁细胞及叶片薄壁细 胞会分化成传递细胞，前者可从木质部导管中重新吸收n a + 运回根部，后者可将 n a + 随营养物质运到根部即“脉内再循环”【3 0 】。 1 4 植物对盐胁迫的抗性机理 抗盐性是植物在高盐基质上生长并完成整个生命周期的一个能力。根据适应 能力的不同可把植物分为盐生植物与淡土植物。能在高盐环境中生存并生长良好 的植物称为盐生植物。不同的盐生植物，虽然它们都生活在同样的高盐分下，但其 抗盐机理却是不一样的【1 1 ，3 0 ，3 5 1 。迄今为止，植物耐盐机理尚不十分清楚。 1 4 1 渗透调节 中生植物在盐渍土壤中有一定的抗盐能力，主要是新陈代谢朝向适应盐渍的 方向发展，有一种保卫适应反应。如在盐渍条件下，植物体内形成许多本身不需 要的有机酸，从根系分泌出去，中和根系周围的碱性，创造适宜的酸度，同时， 也减少部分碱性离子进入根系。 为调节作物在高盐下的渗透胁迫，细胞从外界吸收无机离子的同时，自身合 成许多有机小分子物质，作为渗透渊节剂共同进行渗透调节降低细胞水势，使水 分的跨膜运输朝着有利于细胞生长的方向流动，保证作物的生理需要。渗透调节 机制分为无机渗透调节和有机渗透调节。无论是盐生植物还是非盐生植物，都是 通过从外界吸收盐离子和自身合成有机小分子物质来进行渗透调节，只是不同的 植物中，进行渗透调节的无机离子和有机小分子物质的种类和比例不+ 样。盐生 湖北人学硕十学位论义 植物以无机离子为主要渗透调节剂，而非盐生植物则主要以k 和有机渗透调节物 质为主。 1 4 1 1 无机渗透调节 参与渗透调节的无机离子主要有n a + 、k + 和c 1 一，不同植物对离子的选择性不 同，有些植物选择k + 而排斥n a + ( 如很多非盐生植物) ，有些植物则选择n a + 而排斥 k + 。也有报道认为许多盐生植物吸收k + 作为主要渗透调节剂，h a j i b a g h e r i 等报 道一些非盐生植物由于体内积累了大量的k + ，抗盐能力显著提高。 1 4 1 2 有机渗透调节 植物自身合成的有机小分子物质有：脯氨酸、甜菜碱、多胺、甘油醇、山梨 醇和肌醇以及一些多糖分子。这些物质极性电荷少，溶解度高，分子表面有较厚 的水化层，因此不仅可以维持细胞的膨压，而且还能稳定细胞质中酶分了的活性 结构，保护其不受盐离子的直接伤害。这些小分子物质在正常情况下含量往往很 低，只有在盐胁迫等逆境条件下合成反应才被激活。 脯氨酸是植物在盐胁迫下的主要渗透调节物质之一，它不仅是生物大分子的 保护剂和羟基的清除剂，还是植物从胁迫条件恢复正常过程中迅速、有效的氮源、 碳源和还原剂。脯氨酸能够防止质膜透性的变化，对质膜的完整性有保护作用， 原因可能是脯氨酸与膜磷脂及转运蛋白相互作用，以稳定其结构。 甜菜碱是生物界广泛存在的细胞相容性物质，也是公认的在微生物和植物细 胞中起无毒渗透保护剂作用的主要次生代谢物之一，其积累使许多代谢关键酶在 渗透胁迫下能继续保持活性。许多高等植物，尤其是藜科和禾本科植物，在受到 水盐胁迫时积累人量甜菜碱。甜菜碱作为渗调剂、酶的保护剂，在一定程度上 保持盐胁迫下细胞膜的完整性。另外，甜菜碱对类囊体膜也有稳定作用，并显著 提高光系统i i 光合放氧的稳定性。由胆碱经由甜菜碱醛合成甘氨酸甜菜碱在甜菜 碱生物合成途径中占主导地位，主要由胆碱单加氧酶( c m o ) 和甜菜碱脱氢酶( b a d h ) 完成。甘露醇、山梨醇和肌醇都属- 丁多元醇，因含多个羟基，亲水性强，能有效 的维持细胞膨压，从而起到抗盐作用。 1 4 2 清除活性氧的膜保护体系 盐胁迫诱导产生的活性氧若不能被及时清除，就会导致氧化损伤及其损伤的 一、前言 转移【5 1 1 。活性氧在植物体内存在的时间取决于其抗氧保护体系的活力。植物体内 的抗氧保护体系包括酶促保护系统和非酶促保护系统( 小分子化合物) 。 酶促保护系统包括s o d 、p o t 、c a t 等酶，植物清除的酶丰要是s o d ，清除h ：0 ： 的酶主要是c a t 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 及谷胱甘肽还原酶( g r ) 等。其中， s o d 是抗氧化系统中一种极为重要和在生物体内普遍存在的金属酶。在酶保护系 统中，s o d 处于核心地位，许多报道认为：水分胁迫下植物体内的s o d 活性与植 物抗氧化胁迫能力呈正相关。 非酶促保护系统包括g s h 、a s a 、类胡萝卜素等。此外酚类、类黄酮化合物、 脯氨酸、甘露醇、多胺、激动素等也有清除活性氧的功效。在正常条件下，植物 体内的活性氧的产生和猝灭是处于动态平衡的，盐胁迫下，这种平衡被打破，若 保护系统不能及时猝灭过量的活性氧，就可导致生物膜受损等一系列伤害。因此， 活性氧清除系统对植株抗盐生理有十分重要的作用。 1 5 植物耐盐的生理生化指标 1 5 1电导率 几乎所有的环境胁迫都与膜系统透性升高有关。维持膜系统的完整性，使其 发挥正常功能对植物的代谢是十分重要的。在盐胁迫条件下，细胞质膜旨先受到 盐离子胁迫影响而产生胁变，导致质膜受损。质膜胁变最明显的表现是质膜透性 增加。电导率的大小能直接反映质膜受伤害的程度：数值越大，质膜受到的伤害 也越大。许多实验都表明，电导率的大小在表明植物耐盐性指标中有一定参考意 义。 1 5 2m d a 含量 盐分能增加细胞膜透性，加强脂质过氧化作用，最终导致膜系统的破坏。在 植物生命活动中干扰或破坏膜结构和功能的因素很多，脂质过氧化作用是最引人 重视的一个因素。m d a 作为脂质过氧化作用的产物，其含量的多少可以代表膜损 伤程度的大小。 1 5 3 保护酶系统 9 湖北大学硕士学位论文 超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 和过氧化氢酶( c a t ) 共同组 成保护酶系统，特别是s o d 和p o d 是防御活性氧及其它自由基对细胞膜系统伤害 的更为重要的酶。 1 5 4 渗透调节物质 在盐胁迫下，由于胞外水势低于胞内，细胞不仅不能吸收到水分，而且内部 水分会向外倒流，引起细胞的失水。为保持胞内的水分，维持细胞的正常生理代 谢，细胞通过渗透调节，降低胞内水势，使水分的跨膜运输朝着有利于细胞生长 的方向流动。参与渗透调节的无机离子主要有n a + 、k + 和c l 。有机渗透调节物质 主要是可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等。可溶性糖是很多植物的主要渗透调节剂， 盐胁迫条件下，耐盐植物的可溶性糖含量高于不耐盐的植物；脯氨酸积累是植物 体抵抗渗透胁迫的有效方式之一。脯氨酸的增高能够降低叶片细胞的渗透势，防 j 卜细胞脱水；脯氨酸具有很高的水溶性，可以保护细胞膜系统，维持细胞内酶的 结构，减少细胞内蛋白质的降解。大量研究表明，许多植物在盐胁迫下脯氨酸迅 速积累，耐盐植物中的脯氨酸含量高于不耐盐植物。但也有研究认为脯氨酸的积 累与抗渗透胁迫能力没有相关性。因此，脯氨酸的积累作为植物耐盐性评价生理 指标还需进一步探讨；甜菜碱广泛存在于植物中，由于在盐胁迫下，大量盐离子 会进入细胞，且主要集中在液泡中，这样就使液泡与细胞质之间形成渗透势差， 导致细胞质失水，造成机械损伤，而此时甜菜碱是定位于细胞质中，它的浓度与 细胞汁液的渗透势有关，故它在细胞质内的积累可平衡液泡与细胞质之间的渗透 压，且甜菜碱在细胞质中浓度很高时，也不抑制体内酶的活性，对细胞无伤害作 用。 1 5 5内源激素 在盐分胁迫下，植物体内的i a a 、c t k 、g a 、e t h 、a b a 等均发生不同程度的 变化，其中a b a 是受环境条件影响最大的一种。目前，大家公认a b a 是一种逆境 激素，它存在于几乎所有的高等植物中，对植物种子的发育和植物对逆境条件的 适应过程中起着重要的调控作用。 1 6 植物耐盐的分子机制 l o 一、刖舌 在分子水平上，盐胁迫可使植物中一些基冈的表达状况发生改变，促进或抑 制某些蛋白质的合成，提高其抗盐性。在植物耐盐相关基因的克隆方面，近十多年 来主要涉及到渗透调节、光合作用与代谢、钙调蛋白、通道蛋白的基因克隆等几 个方面。根据编码蛋白的类型，抗盐基因可以分为三类：渗透调节酶类基因、离子 区域化酶类基因和自由基清除酶类基因。 1 6 1渗透调节酶类基因 在正常条件下这些渗透调节物质的调控基因表达量极低，但是在盐胁迫条件 下会大量表达并产生一些小分子有机物，如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。通过这些 小分子物质维持细胞渗透势，提高植物的耐盐性。 1 6 1 1 脯氨酸合成相关基因 1 9 9 0 年，d e l a u n e y 等在大豆中发现p 5 c s 酶与渗透调节有关，由此提取m r n a ， 反转录获得c d n a ，进一步筛选得到了p 5 c s 基因。到目前为止，p 5 c s 基因已经从紫 花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻等物种中克隆和鉴定。在紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、 水稻中的研究表明：盐处理或干旱条件下p 5 c s 基因转录水平有很大程度的提高， 并最终导致了脯氨酸含量的增加。因此在过表达脯氨酸以提高植物耐盐性的基因 工程中一般以p 5 c s 基因作为首选对象。1 9 9 5 年k i s h o r 等人将m o t h b e a n ( v i g n a a c o n i t i f o l i a ) 的p 5 c s 基因导入烟草，发现转基囚烟草中脯氨酸的含量比对照提 高了1 0 1 8 倍，盐胁迫条件- 卜转基因烟草的根比对照长4 0 ，生物产量比对照高2 倍，而_ 月蒴果数量及蒴果中的种子数量均增加，表明通过基因工程手段在植物中 提高脯氨酸的含量可以改善植物的耐盐性。 但也有实验证明，植物体中游离脯氨酸含量的增加会导致脯氨酸脱氢酶 ( p r o d h ) 的分解作用随之加强；高浓度的脯氨酸对p 5 c s 的活性也具有反馈抑制作 用【1 1 。因此，在过表达渗透保护物质提高植物耐盐性的基因工程中己突出表现出 了两个方面的问题：一方面是关于这些渗透保护物质在植物体内累积的代谢限度 问题，另一方面是转化植株对于盐胁迫的忍耐程度与转基因植物体内的渗透保护 物质累积数量并不存在必然的相关性。这些问题的存在使得基因工程中利用该途 径提高植物的耐盐性的程度是有限的。 1 6 1 2 甜菜碱合成相关基因 湖北大学硕士学位论文 甜菜碱脱氢酶( b a d t ) 是胆碱合成甜菜碱的最后一个催化酶基冈，f a l k e n b e r g 等从菠菜中克隆了b a d h 的c d n a 片段，并证明甜菜碱的增加与b a d h 的活性有 关，b a d h 基因可增强植物的耐盐性。菠菜的b a d h 基因被先后转入烟草、草莓和 小麦，经盐胁迫试验表明，转基因植物的b a d h 酶的活性升高，耐盐能力增强。 但由于作为甜菜碱合成底物的胆碱在细胞质中合成，甜菜碱在叶绿体中合成， 在细胞质中合成的胆碱必须通过叶绿体外膜上的转运蛋白转运到叶绿体中才能 发挥作用【3 4 1 。此外，在有些转基因植物中，甜菜碱的合成速度和最终浓度会受到低 含量的内源胆碱的限制，因此，在通过甜菜碱合成途径改良植物耐盐性的基因工 程中，胆碱的代谢流、库的大小和基因表达已成为某些植物耐盐性提高的限制因 素。 除甜菜碱和脯氨酸外，其他渗透调节物的合成关键酶基因也已有了很多研 究。王慧中等通过农杆菌介导法将卜磷酸甘露醇脱氢酶( m t l d ) 基因和6 一磷酸山 梨醇脱氢酶( g u t d ) 基因同时整合进入水稻基因组并使其耐盐性得到明显提高。 g a r g 等将海藻糖合成基因转入水稻中，转基因水稻中海藻糖的累积水平可达对照 的3 1 0 倍。在盐渍、干旱以及低温胁迫的条件下，这些转基因植株的光氧化破 坏程度较轻，具有较强的维持营养元素平衡的能力，并能持续生长。 1 6 2 离子区域化酶类基因 液泡膜上的n a + h + 反转运蛋白直接参与了n a + 在液泡中的积累。1 9 9 9 年， g a x i o l a 等首先克隆得到了第一个高等植物的液泡膜n a + h + 反向转运蛋白基因 a t n h x i ( 来源于拟南芥) ，并利用酵母互补实验证明了其与拟南芥液泡膜质子泵 h 一p p a s e 基因a v p l 一起执行n a 的液泡区域化功能。随后，a p s e 等( 1 9 9 9 ) 在证实 了a t n h x i 液泡膜定位的同时，发现过表达a t n h x i 拟南芥的耐盐性提高，转基因植 株中液泡膜的n a h 离子交换活性提高与a t n i i x i 的表达量正相关。s h i 等从拟南 芥中克隆了1 个n a + h + 反转运蛋白基囚s o s l ，并证明s o s l 基因是n a + 和k 存液泡 中富集所必需的，与植物耐盐性直接相关。2 0 0 2 年，w a d i t e e 等首次在淡水型藻青 菌s y n e c h o c o c c u s s p p c c 7 9 4 2 中进行了质膜n a + h + 反向运转蛋白的过表达研究。 结果显示，与其它基因相比，质膜n a + h 反向运转蛋白基因a p n h a p 对于转基因菌 株耐盐性的提高最有效。该研究小组认为质膜n a 。h 。反向转运蛋白催化的n a + 的 1 2 一、h u 晶 外排是光合生物获得耐盐性的关键。由于大多数盐敏感型植物主要依赖质膜上的 反向转运蛋白外排盐分而并不在液泡中积累，因此提高该类基凶在植物中的表达 水平，是通过基因工程方法进行植物抗盐育种的重要手段。 目前，已从盐地碱蓬、小麦、玉米等多种植物中克隆到了a t n h x l 同源基因。 到目前为止，液泡膜n a + h + 反向转运蛋白基因的克隆和表达研究已成为植物耐盐 分子生物学研究领域的热点之一，其异源过表达研究也是当前通过植物基因工程 手段提高耐盐性的主要策略，已有多种植物的抗盐性通过过表达液泡膜n a + h 反 向转运蛋白而得到改善，一些转基因植物在田间也表现了耐盐性的提高。 1 6 3 活性氧清除酶类基因 胁迫引起的植物伤害大部分与活性氧伤害有关，而防御这种伤害的最好方法 之一是提高植物体内s o d 、p o d 、c a t 酶的活性。s o d 是人们研究较早与盐胁迫有 关的物质之一，在1 9 8 9 年就已经获得了它的d n a 序列，s o d 基因既有单拷贝系列， 也有多基因家族。 在各种抗氧化酶类中，研究最深入的是s o d 同工酶。几种s o dc d n a 己从植物 中得到克隆并用来转化不同的植物，最终获得s o d 活性增强的转基因植株。酵母 线粒体m n s o d 在水稻叶绿体中的过量表达提高了转基因植株对盐胁迫的耐受性， 而r 日盐胁迫下转基因植株中s o d 和a p x 的活性都较对照植株提高了1 5 - 2 0 倍，c a t 活性降低的程度也小于对照株。从拟南芥中获得的耐盐突变株幼苗s o d 和a p x 的活性分别比野生型提高1 3 和3 倍。然而转基凶烟草f e s o d 的过量表达， 并未提高其对冷害和盐胁迫的耐受性。多数s o d 基因的表达都具有组织特异性， 并受许多环境因素的影响。不同的s o d 基因表达受不同的因素诱导，这可能是由 于： s o d 同工酶。叮能具有不同的抗氧化功能；转基因植株中基因表达水平有 所差异，s o d 同工酶的表达只在一定的范围内是有效的，超出这一范围的过量表达 往往是有害的； s o d 与其它活性氧清除酶类如抗坏血酸过氧化物酶和谷苷甘肽 还原酶之问的酶活性平衡可能是很关键的。因此，仅转入1 个或1 种类型的s o d 基凶难以提高植物的耐盐能力。 1 7 提高植物抗盐性的几种途径 湖北大学硕十学位论文 通过采取一些措施，增强植物内在的抗逆性以减轻逆境引起的伤害，在理论 和实践卜都取得了一些成果。传统育种是获得抗盐性优良品种的最重要的途径， 已为人类作出了巨大贡献，但是由于该方法周期长、手续烦琐等特点，寻找另外 的途径作为对传统育种手段的补充是必要的，从理论上也是可行的，为此，世界 各地的科学工作者作了大量的基础性研究工作。 1 7 1 逐步适应锻炼 植物通过锻炼( a c c l i m a t i o n ) 获得抗逆性是一种普遍现象，已经有很多关 于锻炼的研究文献，如冷、旱、盐、淹水等( u m e z a w a 等，2 0 0 0 ) 。植物耐盐能 力随生育时期而不同，且对盐分的抵抗力需要一个适应的锻炼过程，也就是说植 物更容易适应逐步上升的盐胁迫。如把小麦幼苗逐步放在0 1 、0 2 、0 3 、 0 4 、0 5 的n a c i 溶液中进行水培，小麦能在0 5 n a c l 溶液中的正常生长，而 若直接放在0 5