（遗传学专业论文）平菇木聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究.pdf

摘要 木聚糖酶降解自然界中大量存在的木聚糖，在物质循环中起重要作用，它在造纸制 浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。但是，木聚糖酶要实现有效 应用，要求木聚糖酶具有良好的酶学性质，在不同领域的应用要求木聚糖酶具有不同的 酶学性质。因此开发新的木聚糖酶，获得高产木聚糖酶基因工程菌具有重要的意义。本 文从p l e u r o t u so s t r e a m s 中将所克隆的木聚糖酶基因在毕赤酵母里进行了高效表达，研 究了重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。 本研究先通过生物信息学的手段发现已知的真菌1 1 家族木聚糖酶大多都有两个保 守的氨基酸序列g k g w n p g 和e g y f s s g ，根据这两个序列，设计两条简并引物，成 功地以p l e u r o t u so s t r e a t u s 的染色体d n a 为模板，扩增出木聚糖酶基因片段，并通过 b l a s t 比对发现这个片段编码新的木聚糖酶基因，然后构建基因组文库，通过基因组 步行p c r 的方法得到全长基因序列。经b l a s t 比对分析，该基因含有一个大小为5 2b p 的内含子，利用d p n i 介导的外显子拼接的方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪 接，获得该基因的全长c d n a ，推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为7 0 。 这也是从平菇中克隆到的第一个木聚糖酶全长基因。将克隆到的c d n a 与经c p d i 及n o t l 酶切后的毕赤酵母表达载体p h b m9 0 5 b 连接后，构建成重组酵母表达载体p h b m 3 g ， 重组子经线性化后转进宿主菌g s l l 5 中，经菌落p c r 鉴定后挑选阳性转化子，在毕赤 酵母g s l l 5 中进行了表达。重组酶经甲醇诱导表达后测得该酶的最适反应温度为5 5 ， 最适反应p h 值为6 6 ，在p h 5 5 8 5 维持5 0 以上的活性，该酶在7 0 。c 处理5 m i n 完全 失活，在5 0 和6 0 处理1 0 m i n ，分别残余8 2 3 和4 1 0 的活性，对山毛榉材木聚 糖具有最好的水解效果。金属离子的添加使重组酶活性降低，e d t a ，1 3 巯基乙醇和 d m s o 对酶的活性基本没有影响，这提示着该酶不是一个金属酶，在工业生产中可能有 着潜在的应用价值。 关键词：木聚糖酶；基因组步行p c r ；p i e r o t u so s t r p a t u s ；毕赤酵母 a b s t r a c t e n d o 一1 3 1 ，4 - x y l a n a s e sc a t a l y z et h eh y d r o l y z a t i o no ft h ex y l a nb a c k b o n et op r o d u c e o l i g o s a c c h a r i d e s t h e yh a v es h o w ng r e a t l yp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h eb l e a c h i n go fk r a f tp u l p ， b a k e r y ，a n i m a lf e e d ，p r o d u c t i o no fa l c o h o l ，e t c h o w e v e r ，w h e nx y l a n a s ea p p l i e di ni n d u s t r y ， x y l a n a s e sw i t he x c e l l e n tc h a r a c t e r sa r ef a v o r a b l e m o r e o v e r , d i f f e r e n tk i n d so fx y l a n a s e sa r e r e q u i r e d i nd i f f e r e n t a p p l i e df i e l d s s o ，e x p l o i t i n g n e wx y l a n a s ea n dc o n s t r u c t i o no f e n g i n e e r e ds t r a i nw i t hh i g h - y i e l dx y l a n a s eh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e s i nt h i ss t u d y ，a n x y l a n a s eg e n ew a sc l o n e df r o mp l e u r o t u so s t r e a t u sa n dw a se x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s t h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： b yc o m p a r i n gt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fo v e r1 0 x y l a n a s e si n11f a m i l i e sf r o mf u n g i t h r o u g hb l a s t , t w oh i g h l yc o n s e r v e dr e g i o n s ，w i t haf r a g m e n to fa b o u t1 5 0a m i n oa c i d s c o d i n gs e q u e n c ei nb e t w e e n ，w e r ei d e n t i f i e d d e g e n e r a t ep r i m e r sc o m p l e m e n t a r yt ot h ee n d s o ft h e s et w oc o n s e r v e dr e g i o n sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h ei n - b e t w e e ns e q u e n c ef r o m f u n g u sp l e u r o t u so s t r e a t u s t h et o t a lg e n ee n c o d i n gf o ran e wx y l a n a s ew i t hh i ! g hs p e c i f i c a c t i v i t y ，n a m e dx y n p g ，f r o mt h e 只o s t r e a t u sw a sc l o n e db yg e n o m e - w a l k i n gp e r m e t h o d a 5 2b pi n t r o nw a sf o u n dt h r o u g hb l a s t , t h ew h o l ee d n ax y n p gw a sc l o n e db yp c rt o s p l i c i n gt w oe x o n s t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h o w e d7 0 i d e n t i t yw i t he n d o - 1 3 1 ， 4 - x y l a n a s ef r o ml e u c o a g a r i c u s g o n g y l o p h o r u si nt h eg e n b a n k ，w h i c hm e a n sx y n p g i san e w x y l a n a s eg e n e t h ec d n aw a sc l o n e di n t ov e c t o rp h b m 9 0 5 b ，a n de x p r e s s e di n p i c h i a p a s t o r i sg s l1 5 x y l a n a s e - s e c r e t i n gt r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e dt h r o u g hp c r t h eo p t i m a l p ho ft h er e c o m b i n a n te n z y m ew a sp h 6 6 i tr e m a i n so v e r5 0 r e l a t i v ea c t i v i t ya tp h 5 5 - 8 5 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s5 5 。c w h e nt r e a t e da t7 0 cf o r5m i n u t e s ，t h ee n z y m eh a sl o s t i t sa c t i v i t y w h e nt r e a t e da t5 0 。ca n d6 0 。cf o r1 0m i n u t e s t h ee n z y m er e m a i n s8 2 3 a n d 4 1 o r e l a t i v ea c t i v i t y ，r e s p e c t i v e l y t h em o s tf a v o r a b l es u b s t r a t ef o rx y n p gi sb e e c h w o o d x y l a n m e t a li o n sr e d u c et h ee n z y m ea c t i v i t y e d t b - m e r c a p t o e t h a n oa n dd m s o d o n t a f f e c tt h ee n z y m ea c t i v i t y i ti n d i c a t e st h a tt h er e c o m b i n a n te n z y m ei sn o tam e t a le n z y m ea n d t h i se n z y m em i g h th a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o nv a l u ei ni n d u s t r y k e y w o r d s ：x y l a n a s e ；g e n o m ew a l k i n gp e r ；p l e u r o t u so s t r e a t u s ；p i c h i ap a s t o r i s ； l i a m p u l b p d d m s o d m e d t a g g l c n a c g w p c r h h i s 4 k a n k b k d m fq s s m g m i n m l n s p s o d o r i p a o x l p c r p e g s s d s 乃o x l t e m e d r m i n 缩略词 a m p l i c i l l i n m i c r o l i t e r b a s ep a i r d a y d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i n e d i a m i n et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d g r a m n - a c e t y l - - g l u c o s a m i n e g e n o m i cw a l k i n gp c r h o u r h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n a s e k a n a m y c i n k i l o b a s e k i l o d a l t o n s e c r e t a t i o ns i g n a lo fam a t i n gf a c t o r m i l i g r a m m i n u t e m i l i l i t e r n o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s o p t i c a ld e n s i t y o r i g i no fr e p l i c a t i o n p r o m o t o ro fa l c o h o lo x i d a s eg e n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l s e c o n d s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e t e r m i n a t o ro fa l c o h o lo x i d a s eg e n e n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e r o t a t i o np e rm i n u t e 氨苄青霉素 微升 碱基对 天 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 克 n 乙酰葡萄糖胺 基因组步行p c r 小时 组氨酸脱氢酶 卡那霉素 千碱基 千道尔顿 q 交配因子信号胎序列 毫克 分钟 毫升 非淀粉多糖 光密度 复制起始区 乙醇氧化酶基因启动子 聚合酶链式反应 聚乙二醇 秒 十二烷基磺酸钠 乙醇氧化酶基因终止子 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 每分钟转速 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：叶友 e t 期：a o 毯年箩月如日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的 印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数 字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学 位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 、x 1 幺 指导教师签名： 日期：砌g 悯硐 日期：w 呵牟姻粥日 月| j 舌 i j l i 一 月i j舌 1 1 木聚糖的结构 木聚糖是半纤维素的主要成分，它是由b d 1 ，4 木糖苷键连接起来的并带有多种取 代基的多聚糖，它的含量相当丰富，是一种巨大的生物资源，而木聚糖酶则是降解该物 质的最主要酶之一。 半纤维素是由木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖等杂聚物组成的。半纤维 素中的主要单体是d 木糖、d 甘露糖、d 半乳糖和l 厂阿拉伯糖。植物中的木聚糖或半 纤维素位于木质素和纤维素纤维之间，木聚糖以共价键与木质素相连，以非共价键与纤 维素相互作用，在维持原位纤维素的完整性和防止纤维免受纤维素酶的降解方面起重要 作用。大多数木聚糖为杂多糖，含有8 5 8 9 的d 木糖残基，其侧链含有不同的取代 基，最常见的取代基是乙酰基、阿拉伯糖残基和葡萄糖残基。木聚糖的一些主要结构特 征见图1 【1 1 。 o 0 图1 木聚糖的结构 f i 9 1 x y l a ns t r u c t u r e 木聚糖属异质性多糖。构成木聚糖主链的糖单位为吡喃型木糖，木糖间以1 3 d 1 ，4 木糖苷键连接成链状骨架，同时在主链上以q 糖苷键连接有l - n 拉伯糖、葡萄糖醛酸等 侧链基团和分枝。自然界中的木聚糖在主链聚合度、侧链基团的含量、种类等方面存在 着较大的多样性【2 】。在被子植物来源的硬木中，木聚糖主链的长度相对较长，平均有1 5 0 2 0 0 个木糖残基，这其中大约有1 0 的木糖在o 。2 位上以q 1 ，2 糖苷键连接有d 葡 萄糖醛酸或4 o 甲基d 葡萄糖醛酸残基。同时主链木糖在c 3 或c 2 位上被高度乙酰 化，乙酰化可使木聚糖在水中的溶解度大大增加。而在来源于裸子植物的软木中，木聚 糖主链的聚合度相对较低，通常为7 0 1 3 0 个木糖残基。软木木聚糖主链上连有更多葡 萄糖醛酸侧链残基，没有乙酰化修饰。与硬木木聚糖不同的是软木木聚糖，大约有1 2 的主链木糖在o 3 位上与l ，呋喃型阿拉伯糖以q 1 ，3 糖苷键相连接。此外，来自于 湖北大学硕士学位论文 草本植物的木聚糖还具有由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸以及木糖等残基构成的分支。 木聚糖是植物次生细胞壁的重要成分，在植物性材料中与纤维素和木质素紧密地结 合在一起。木聚糖的侧链基团和木质素之间以化学键相互连接，再通过氢键并在果胶等 物质的参与下与纤维素结合，并形成致密的结构。这种致密结构对维持植物形态具有重 要作用。木聚糖在自然界中存在广泛，含量丰富。绿色植物每年通过光合作用固定了大 量的生物物质和能量。据统计，地球上每年生长的生物物质的总量约为1 5 1 0 1 1 吨， 这其中有2 0 3 0 为木聚糖。木聚糖成为自然界中仅次子纤维素的含量第二丰富的可再 生多糖资源。 1 2 木聚糖酶的分类 木聚糖是存在于自然界中的丰富再生资源之一，木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖 分子中的1 3 1 , 4 木糖苷键，其主要水解产物为木二糖和木二糖以上的低聚木糖，还有少 量木糖和阿拉伯糖。根据对催化区的保守氨基酸和疏水簇的分析，将糖苷键水解酶分为 5 8 个族。木聚糖酶根据氨基酸序列的同源性，分属糖苷水解酶类的两个家族，即1 0 族 和1 1 族【3 】。属于同一家族的木聚糖酶催化区域具有同源性，可以根据已知家族的酶来推 测未知酶的催化特性。1 0 族的木聚糖酶分子量一般大于3 0 k d a ，结构较为复杂，通常 具有较低的等电点。水解速度快，水解产物为低分子量的寡糖，该家族的木聚糖酶可以 作用于对硝基苯( p n p ) 和对硝基苯纤维二糖，与底物结合需较少数量的位点。在催化 性质上，除能催化水解木聚糖外，还具有纤维素酶活性。1 1 族的木聚糖酶分子量较小， 结构上相对简单，热稳定性差，一般具有很强的底物专一性，除木聚糖外几乎不水解其 他任何底物1 4 1 。水解产物为聚合度2 1 0 左右的木寡糖。1 1 族木聚糖酶一般具有较高的 p i 值。一般来讲，1 0 家族的木聚糖酶在n 末端附近具有t - e n m k 的保守序列，而1 1 家族的木聚糖酶具有y g p e y y 的保守序列。 1 3 木聚糖酶基因的克隆 自七十年代末，八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真 菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在不同的异源宿主中进行了表达。 细菌的木聚糖酶基因的克隆一般都是采用传统的方法：提取染色体d n a ，用不同的 限制性内切酶进行完全或部分酶切，与质粒载体构建重组质粒，再以c a c l 2 法制备感受 2 前言 态细胞或电转化法转化受体细胞大肠杆菌，从转化子中筛选出阳性克隆。 真菌木聚糖酶基因的克隆方法主要有四种：一种是分离纯化该酶，对其蛋白质两端 的氨基酸进行测序，根据氨基酸序列反推设计简并引物，p c r 扩增全长基因【5 】；二是根 据已发表的基因序列设计引物，以产木聚糖酶菌株的总d n a 为模板作p c r 扩增，经测序 获得木聚糖酶基因片段或者以异源的木聚糖酶基因为探针，从基因组文库中通过杂交获 得阳性克隆，经测序后获得基因两端的序列，设计引物，经r t - p c r 克隆到全长c d n a 6 】； 三是通过常规的建c d n a 文库的方法，含有木聚糖酶基因的转化子在底物平板上可分解 底物从而在菌落周围产生透明圈而检出阳性克隆。但是，真菌的木聚糖酶基因大多不能 在大肠杆菌中表达，而无法通过简单的将转化子点种在含有底物的选择平板上快速检出 阳性克隆。2 0 0 2 年r e n a t o 等通过以啤酒酵母为宿主的c d n a 文库克隆到一个木聚糖酶基 因1 7 1 。四是通过r t - p c r 扩增出保守的片段，通过5 ，3 r a c e 的方法克隆到全长基因，这种 方法3 1 a c e 效率很高，但5 r a c e 成功率只有3 0 ，来源于香菇【8 】和草菇【9 】的木聚糖酶基因 用此方法克隆。但是，上述四种方法克隆全长c d n a ，必须先对出发菌株实验室培养条 件，产木聚糖酶诱导条件进行摸索，才能得到木聚糖酶基因的全长c d n a ，所以效率较 低，无法高通量克隆真菌木聚糖酶基因的全长c d n a 。 1 4 木聚糖酶基因的异源表达 1 4 1 在大肠杆菌中的表达：在大肠杆菌表达提高木聚糖酶产量的例子很多，如 来自碱性a e r o m o n a ss p l l 0 1 、b a c t e r o i d e sr u m i n i c o l a l l l 】和f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e s l 3 5 1 1 2 】 的木聚糖酶。来自cs a c c h a r o l y t i c u m 的耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌超量表达，重组酶 在8 0 有2 3m i n 的半衰期【1 3 】。虽然这个酶在应用上还不够理想，但是分离的基因本身 就是一个用于改善工程酶性质的材料。k o o 掣1 4 峙艮道来自c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的木 聚糖酶基因在大肠杆菌超量表达，重组酶最适温度为6 0 ，最适p h5 4 。且s u b t i l i s 和 丑c i r c u l a n s 的木聚糖酶基因也在大肠杆菌大量表达。按照大肠杆菌的密码偏爱性，以 且c i r c u l a n s 的木聚糖酶基因为参照，设计了一个基因。合成的且c i r c u l a n s 基因通过密 码替换变成bs u b t i l i s 的木聚糖酶基因，然后一起在大肠杆菌表达，在l a c 启动子的控制 下，重组木聚糖酶在细胞质的表达量每升高达3 0 0m g ，而且重组酶经纯化后能正确地行 使功能1 1 5 】。es u b t i l i s 的木聚糖酶基因融合到cc i m i c e n a 基因的5 端，在大肠杆菌共表 达，融合蛋白对微晶纤维素和再生纤维素都有很强的亲和性1 16 。经改造的厌氧真菌 3 湖北大学硕士学位论文 n e o c a l l i m a s t i xp a t r i c i a r u m 的木聚糖酶c d n a 的i i 区域在大肠杆菌高水平表达，表达蛋 白比酶活高达1 2 2 9u m g ，这种高效表达的原因归结为n 端编码区为大肠杆菌偏爱密码 1 7 1 。l a p i d o t 等报道且毒t e a r o t h e r m o p h i l u st 6 的耐热木聚糖酶基因在1 7 启动子控制下高 效表达，表达的蛋白占总蛋白的7 0 ，通过一步加热就可以纯化，每升可得到2 9 可溶 的活性蛋白【1 8 】。来自极端嗜热真菌r t 8 b 4 的木聚糖酶a 在大肠杆菌超量表达，表达蛋 白在7 00 c ，p h 7 时至少可稳定1 2h f l 9 l 。 1 4 2 在酵母中的表达：来自b a c i l l u sp u m i l u sp l s 9 2 0 l ，a s p e r g i l l u s ，l 玩肠，z s 【2 1 1 ， c r y p t o c o c c u s 口场f 咖s 【2 2 1 ，a s p e r g i l l u s 妇m 如f f 【2 3 1 ，a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s t 2 4 1 和 t r i c h o d e r m ar e e s e i 2 5 】的木聚糖酶基因在酿酒酵母s a c c h a r o m y c ec e r e v i s i a e 中实现了表 达。但是在& c e r e v i s i a e 中表达，往往表达量低，杂蛋白多，而且基因在没有选择压力 时不稳定，这不适应于工业应用。目前将木聚糖酶基因在毕赤酵母pp a s t o r i s 中表达， 因为这个表达系统可以高密度发酵，表达蛋白产量高，杂蛋白少易纯化。几个真菌的木 聚糖酶基因如a s p e r g i l l u sn i g e r 2 6 1 ，t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 2 刀，a s p e r g i l l u so r y z a e i 捌， c e l l u l o n o n a sl 童m i 2 9 1 ，l e n t i n u l a 鲥删砖f 3 0 】已在毕赤酵母表达系统表达。 1 5 木聚糖酶基因的定点诱变 随着各种新技术的发展与应用，人们对木聚糖酶基因的研究不断深入。大部分克隆 的基因已被测序，并推知了木聚糖酶的氨基酸序列。为了阐明木聚糖酶的作用机制，鉴 定其氨基酸组成中哪一个氨基酸残基对酶的催化作用是必要的，这一点十分重要。使用 化学修饰及随机诱变和定点诱变技术，在这方面已取得了多项进展，尤其是定点诱变技 术，利用合成的寡核苷酸作诱变物，根据设计的方案，在已知的核苷酸序列中准确地改 变蛋白质氨基酸编码中一个或数个碱基，来改变组成蛋白质的一个或数个氨基酸残基， 以研究蛋白质的结构与功能的关系。另外，通过对克隆的木聚糖酶基因进行定点诱变以 改变木聚糖酶性质，如酶活性、热稳定性、p h 值稳定性等，对该酶在工业生产上的应 用具有十分重要的意义。 o k a d a 3 1 1 等根据前人研究的木聚糖酶的作用机理可能与蛋清溶菌酶的酸碱作用机 理相似，推测催化过程可能涉及酸性氨基酸残基，即羧基氨基酸，又根据短小芽孢杆菌 木聚糖酶的三维结构及其氨基酸序列与其它菌木聚糖酶的氨基酸序列的同源性比较，选 出a s p 2 1 ，g l u 9 3 和g l u 1 8 2 三个氨基酸残基进行定点诱变，分别用s e r ，g l u 残基替 4 前言 代a s p 一2 1 ，用s e r ，a s p 残基替代g l u 9 3 和g l u 1 8 2 ，结果表明诱变的六种酶的分子量 都没有变化，质谱分析只有一种酶的二级结构稍有变化，其它诱变对二级结构都没有影 响。但是g l u 9 3 和g l u 1 8 2 的改变导致木聚糖酶的比活剧减，而a s p 2 1 的改变使酶活 丧失却没有那么大，因而推测g l u 9 3 和g l u 1 8 2 最有可能是短小芽孢杆菌木聚糖酶的催 化残基。 m o r e a u l 3 2 】等认为酶的某一特定部位的高度保守的氨基酸残基应该对该酶的结构和 功能起着十分重要的作用，他们选择浅青紫链霉菌木聚糖酶的p h e 1 5 5 ，a r a 1 5 6 和 a s n 1 7 3 作体外定点诱变，替代残基是一些极性相同侧链改变或侧链相同极性改变的残 基，结果发现突变酶f 1 5 5 y ，r 1 5 6 e ，r 1 5 6 k 和n 1 7 3 d 的相对酶活分别比非突变酶高 2 8 ，1 0 ，5 0 和2 5 ，而且r 1 5 6 e 和n 1 7 3 d 在6 0 的半衰期比野生型酶分别长6 分钟和4 0 分钟，虽然双突变e 1 6 5 1 7 3 d 和k 1 5 6 1 7 3 d 的酶活降低了，但是e 1 6 5 1 7 3 d 在6 0 的半衰期是野生型酶的2 倍。木聚糖酶的催化活性及热稳定性的提高有利于该酶 在造纸工业中的应用。 在提高酶的热稳定性方面有人尝试在木聚糖酶分子内和分子间引入二硫键，热稳定 性虽然提高了，但是酶的活性并不一定都随着升高。在耐热机制方面有人证明，木聚糖 酶的热稳定性与带电侧链和螺旋偶极子的疏水堆积及有利的相互作用有关，还与在螺旋 n 末端引入的脯氨酸残基有关。另外，还有人证明川地曲霉木聚糖酶的a s p 3 7 对该酶 在低p h 值下维持较高的酶活性十分重要【3 3 】。 总的来说，通过对木聚糖酶的三维结构和突变酶的性质分析，发现酪氨酸和色氨酸 残基位于底物的结合位点，谷氨酸和天冬氨酸残基位于催化位点。在酶分子改造方面， 各实验室根据不同目的作了不同的尝试，取得了许多有价值的数据。 1 6 木聚糖酶的结构与功能 通过x 射线晶体衍生法已分析了近百个木聚糖酶的三维结构，其中包括真菌和细菌 来源的木聚糖酶。1 0 族木聚糖酶的结构与1 1 族木聚糖酶的有所不同，s t r e p t o m y c e s l i v i d a n s 产生的木聚糖酶属于1 0 族，其典型结构具有8 个( q 6 ) 结构围成的桶状结构， 桶状结构内部具有5 个吡喃型木糖的结合位点，底物结合于桶状体底部的浅槽中，催化 部位点靠近c 末端【3 4 】。 1 1 族木聚糖酶一般含有b 折叠结构，来源于b a c i l l u sc i r c u l a n s 的木聚糖酶是一个典 型的1 1 族的代表【3 5 】，它含有2 个8 折叠片层和1 个短的q 螺旋，类似一个半张丌的右 气 湖北人学硕士学位论文 手；两个b 折叠片层山一些反向平行的链组成，疏水面叠在一起井形成“右手”的“手 指”，日折叠的一侧扭转将近9 0 度的转角与n 螺旋一起被称为“手掌”；扭转的部分 在分子的一侧形成一个裂缝，活性中心位于裂缝的门侧面，底物与术聚糖酶结合时，就 嵌入这个裂缝中。j e f f r i e s 认为，山于1 1 旅木聚糖酶的底物结合部位为很深的狭缝，底 物结合时比1 0 族的木聚糖酶要紧密，同时1 1 族木聚糖酶相对分子较小，不像1 0 族分 子那样可以允许较大的构象变化，因此1 1 族的木粜糖酶具有更强的底物专一性。l o 族及1 1 族小聚糖酶的分子结构见图2 。 瞬警 图2 木聚糖酶的分子结构 f i 9 2s t r u c t u r eo f x y l a n a s e as t r u c t u r eo f b a c i l l u sc i r c u l a n sx y l a n a s e ( f a m i l y1 1 ) bs t r u c t u r eo f s t r e p t o m y c e sl i v i d a n sx y l a n a s e ( f a m i l y l 0 ) 木聚糖酶的催化机制与其他糖苷水解酶一样，符合双替位机制 3i 。在催化过程中， 有两个关键性氨基酸残基起作用，一般是酸性氨基酸a s p 或g l u ，这两个氨基酸一个以 去质子化的形式存在，在催化过程中作为亲核基攻击底物的片构碳原子，形成茫价巾 问体。另一个被完全质子化，在催化过程巾起广义的酸碱催化，提供质子。为了维持这 个氨基酸的质子化状态，通常还需要其他氨基酸残基通过氢键来稳定它。在催化过程中， 首先由去质子化的氨基酸攻击片构碳原子形成共价中m 体，接着又执行碱催化，将水分 子去质子化，最终完成水解过程。小聚糖酶的催化过程见图3 。 前言 一u 、 舶拢 ， 钆 勘a 口i 。“ c 图3 木聚糖酶催化机制 f i 9 3 c a t a l y s i sm e c h a n i s mo fx y l a n a s e s t o r r o n e n 等人【3 8 】比较最适p h 偏碱的木聚糖酶与最适p h 偏酸的木聚糖酶，发现碱 性木聚糖酶的酸碱催化残基周围起稳定作用的氨基酸为a s n 。而在酸性木聚糖酶中相应 位置则为a s p ，表明木聚糖酶的耐碱性与维持酸碱催化残基有关。 对于一些耐热木聚糖酶的耐热机制，l e g g i o 等【3 9 】通过分析木聚糖酶分子的晶体结 构，比较了1 0 族的耐热木聚糖酶分子和非耐热木聚糖酶分子的氨基酸分布，发现耐热 木聚糖酶的q 1 3 桶状结构中，q 螺旋中特定的氨基酸分布使螺旋之间产生偶极作用，这 种作用稳定了木聚糖酶的分子结构，研究认为这是1 0 族木聚糖酶耐热性的普遍机制， 此外还认为疏水作用和p r o 的引入也与耐热机制有关。 当然，木聚糖酶分子作为一个整体，其耐热性和耐碱性等特殊的性质不仅与分子的 局部有关，而且涉及到整个分子结构。木聚糖酶分子内部的各种相互作用共同维持着木 聚糖酶分子的结构与状态，也影响着其功能。t u r u n e n 的研究结果表吲删，木聚糖酶分 子表面氨基酸的改变可以提高木聚糖酶的耐热性，并使木聚糖酶的最适p h 向碱性转移。 7 o 峻 吩蟛 誉尜毒 讯 矿 。 湖北大学硕士学位论文 1 7 木聚糖酶的应用研究进展 二 木聚糖酶在造纸、食品、饲料、苎麻生产等工业中具有极大的应用前景。 1 7 1 木聚糖酶在造纸工业中的应用。 木聚糖酶对硫酸盐纸浆进行预漂白，是未来制浆和造纸工业的一个重要发展方向。 硫酸盐制浆技术在加拿大制浆和造纸工业中占主导地位，应用该技术不仅能生产出高强 度的木材纤维，而且所使用的化学药品可以回收利用。对于硫酸盐纸浆，尤其是软木的 硫酸盐纸浆，漂白难度较大，为使纸浆白度提高，必须使用大量的氯和含氯化合物( 如 次氯酸钙，次氯酸钠和二氧化氯) 漂白。这带来许多问题：( 1 ) 该法对纤维素降解较 为严重，从而降低了纸张的强度；( 2 ) 漂白废液中的有机氯化物，具有毒性、致畸性、 持久性，可在生物体内富集，造成严重的环境污染，并且扰乱生态系纠4 1 】；( 3 ) 漂白废液 c o d 值很高，也会造成严重的环境污染；( 4 ) 漂白废液对设备的腐蚀也较严重，不 利于水的循环利用。为了达到日益严格的环保标准，造纸工业目前正在改变以前的方法， 使含氯的化学药品的使用尽可能地减到最低限度。可供选择的方法包括氧漂、延长蒸煮 时间、以二氧化氯代替氯、过氧化氢和臭氧。但大多数方法在处理过程中需要较高的成 本，因此，酶的使用给减少氯和其他漂白药品的使用提供了一个非常简单和经济有效的 方法。木聚糖酶可以通过提高纸浆的可漂性来减少氯的用量，从而减轻对环境的污染， 既可提高纸张的白度，又降低了生产成本。 木聚糖酶帮助漂白的机制尚不完全清楚，酶并不是直接漂白纸浆，而是通过改变纸 浆的化学性质来帮助漂白，其可能机制是这些酶将沉积在纤维表面的半纤维素解聚，从 而打开了纸浆的结构，使漂白的化学物质容易进入1 4 引。木聚糖酶预漂白的另一个可能的 机制是木聚糖酶对木质素碳水化合物复合物中部分碳水化合物切割，产生更容易去除 的较小的残余木质素分子【4 3 1 。b e g 等【4 4 】用扫描电镜观察来源于跏印幻聊y c 缈s p q g 1 1 3 的木聚糖酶处理的桉树纸浆发现，木聚糖酶的预漂白打开了纸浆的结构，而未处理的纸 浆在电镜下观察其表面平滑，说明用木聚糖酶处理后纸浆结构发生改变，使后续处理阶 段使用的氯及其他化学物质容易进入到纸浆内部。因此，酶的预漂白加速了硫酸盐纸浆 的漂白过程，木聚糖酶处理能减少对起氧化作用的化学物质需求的2 0 4 0 【4 5 1 。 为了获得最佳漂白效果，选择具有理想理化性质的木聚糖酶是十分重要的，从微生 物中提取的酶液必须完全没有任何纤维素酶活性j ，因为任何的纤维素酶活性会造成纸 浆中纤维素的损失，降低纸浆的质量和增加排放物的处理成本。其他的因素包括p h 值、 8 前言 温度、酶的剂量和分散性、浆的稠性和反应时间。木聚糖酶处理的最适p h 值随着不同的 酶而变化，一般来说，真菌来源的木聚糖酶p h 值在4 6 的范围内最有效【4 7 j ，而来源于放线 菌和细菌的木聚糖酶p h 值则在5 9 的更广范围内有效。木聚糖酶作用的最适温度范围介 于3 5 6 0 c 之间。在浆厂，木聚糖酶的预处理是在棕色的高密度储藏罐中进行的，其中 的纸浆以高温( 大约6 0 。c ) 和碱性p h 值的状态存在，因此，在高温和碱性条件下有效和稳 定的木聚糖酶是最理想的。目前关注的筛选标准是具有热稳定性和最适p h 的木聚糖酶。 此外，为了获得酶的最佳使用效果，酶的剂量和浆的稠性必须达到最优化，使酶能够得到 有效分散。一般地，酶的最适剂量在2 5 砌g 干浆的范围内，浆的稠度在5 1 0 之间比 较合适。木聚糖酶只预处理1 2h 即可获得较好的预漂白效剁矧。 未来纸浆漂白技术的发展趋势是低氯和无氯漂白，另外，在造纸工业中废纸的回收 利用也是很重要的，而这些废纸中油墨的脱除，一般是使用化学方法，这也会造成严重 的环境污染，利用木聚糖酶酶法脱墨不仅可以减少污染，而且可以提高纸张白度。 1 7 2 木聚糖酶在食品行业中的应用。 酶在食品工业有广泛的应用，最近几年，面包工业中加入不同的酶改善面团的操作， 面包的新鲜度，延长货架期。用在面包制作中的酶有q 一淀粉酶，用于提高面包的体积， 改善面包屑的质地，面包皮和面包屑的颜色，甚至于影响面包的风味。再就是用非淀粉 多糖水解酶，添加这类酶可改变小麦非淀粉多糖的初始结构，对面团和面包的特性有正 面的影响。戊聚糖酶的添加可以提高面粉的弹性而影响面包的质量1 4 引。 谷类细胞壁的复杂多糖，主要是纤维素和半纤维素，添加纤维素酶和半纤维素酶可 以提高面包的体积，增加整个面包的孔数，从而提高面包的质量。最近，如何延长面包 的货架期成为一个重要的课题，焙烤食品长时间放置会变得坚硬，没有新鲜度，导致这 一结果的机制之一是淀粉倒退。延长焙烤食品的货架期包括添加不同的酶、水状胶体、 乳化剂等。但是使用化学物质安全性不足，用酶能有效地代替常用的这些面包添加剂， 提高食品安全性。添加特效的木聚糖酶使面团有较好的捏合性，提高产品的体积，增强 保水性，最终延长货架期。因为评价面包质量主要从外观( 体积和颜色) 和感官( 易碎 性和香气) 两个方面进行【矧。而木聚糖酶提高面包体积的原因是使水在戊聚糖和谷类面 团物质之间的再分配。谷类面团物质中水分的增加使面团的延伸性更好，最终更膨大1 5 。 提高谷类面团物质的体积导致了面包的增大和高的发泡性，添加木聚糖酶改善体积也可 能是水不溶性戊聚糖的水解，也可能是释放少量的寡糖吸收了相当少的水。开始，木聚 9 湖北大学硕士学位论文 糖酶作用释放大的水溶性片段，表现为粘度的提高，再进一步水解生成木二糖、木糖， 一 表现为粘度下刚5 2 j 。 木聚糖酶在食品工业中的另一个主要应用就是酶解木聚糖生产功能性木寡糖，木寡 糖在生理学功能方面主要有以下作用：( 1 ) 促进双歧杆菌的繁殖，而有害和兼性细菌 均不能利用或利用很少；( 2 ) 提高动物排便速度；( 3 ) 减少血氨浓度，因双歧杆菌增 殖，产生大量有机酸，降低肠道p h 值抑制肠道产氨菌的活性，同时产氨菌产生的氨态 氮能被双歧杆菌摄取； ( 4 ) 促进矿物质的吸收；( 5 ) 增强免疫功能。日本是世界上 较早开发功能性低聚糖的国家，据日本y a k u i t 药品工业2 0 0 0 年功能性低聚糖的销售额 统计，低聚木糖的销售额位居第三，而制备低聚木糖的主要方法是用木聚糖酶水解木聚 糖来生产。 1 7 3 木聚糖酶在饲料工业中的应用。 饲料中一般含有较多的非淀粉多糖( n o n s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s ，n s p s ) ，主要包括阿 拉伯木聚糖、1 3 葡聚糖、q 半乳糖苷、果胶等。其中前二者占n s p s 的3 0 ，因单胃 动物不能分解n s p s ，从而使其成为一种抗营养因子。已有实验证明n s p s 能结合大量的 水，使采食动物消化道中的食糜体积增大，粘度增加，并形成凝胶。这会干扰消化酶的 功能和吸收作用，影响食糜在小肠中滞留，而引起微生物异常繁殖，造成动物生长受阻、 饲料转化率降低。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚 糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低因粘 度增加而引起的抗营养作用，另外，低聚木糖还是一种微生态制剂，可以改善动物肠道 的菌群。由于饲料中一般含有多种抗营养成分，所以添加的酶一般为含有多种酶成分的 复合酶，如1 3 一葡聚糖酶、纤维素酶、半乳糖酶等，特别是1 3 一葡聚糖酶，它与木聚糖酶 、 协同作用，效果非常显著。 我国农业部制定的允许使用的饲料和饲料添加剂品种目录上，将木聚糖酶列入 饲料级酶制剂。目前在我国已有一些饲料厂生产木聚糖酶，但仅限于自用，由于其产量 低，成本高，未形成产业化。对木聚糖酶等聚糖酶作为饲料添加剂的应用效果的研究较 多，但对其理化性质、作用机理、活性测定、适宜添加量等理论研究方面还比较薄弱。 木聚糖酶在饲料行业的应用面临产量低、成本高、耐热性及抗酸性酶难以获得等问题， 所以亟待运用基因工程和蛋白质工程手段来生产适于商业化应用的产品。 1 7 4 木聚糖酶在苎麻生产中的应用 1 0 h h 舌 苎麻纤维是一种优良的纺织原料，我国是世界苎麻的主要生产国。在苎麻中，除纤 维素外，还含有半纤维素、果胶物质和木质素等，后3 种物质统称为胶质。苎麻中含有 2 5 3 0 的胶质。在纺纱前必须将这些胶质除去，并使苎麻单纤维分散，这一过程称 为脱胶。传统的脱胶采用化学法，需要强酸、强碱，并要求高温、高压的处理条件，不 仅使生产环境变差，并能造成环境污染，而且还因特异性不强而损坏纤维。中国科学院 遗传研究所将木聚糖酶与果胶酶复配试验用于苎麻脱胶，并取得良好效果，酶法脱胶后 残胶率小于1 ，并改善了劳