（遗传学专业论文）脱毛蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究.pdf

四川大学博士学位论文 脱毛蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究 专业遗传学 博士生黄庆指导教师张义正教授 中文摘要 短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) u n - 4 2 c - 3 l 是一株从成都市生活垃圾中分 离，经过多次反复诱变后得到的碱性蛋白酶产生菌。摇瓶和1 0 0 l 小型发酵实验 结果表明，其发酵液中台有的碱性蛋白酶具有很好的脱毛效果，且对皮革胶原 没有损伤 对该菌株5 0 0 l 大规模发酵的蛋白酶活性检铡发现，接种1 6 h 后开始产生蛋 白酶，在2 8 h 达到高峰( 4 2 0 0 u m l ) 。对发酵液进行的硫酸铵饱和沉淀实验发 现，在2 0 7 0 的硫酸铵饱和度范围内可以得到绝大部分( 9 6 ) 的蛋白酶。 对发酵液进行s d s ，p a g e 和蛋白酶的活性染色分析表明，发酵液中的蛋白 质种类不多，且只含有一种碱性蛋白酶。该发酵液所含蛋白酶活性能够被丝氨 酸蛋白酶抑制剂p m s f d f p 完全抑制。该发酵液对牛皮，羊皮和猪皮均有良 好的脱毛效果。 通过c m s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析。d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w 离 子交换层析，s e p h a c r y ls - 10 0 s c p h a e r y ls - 2 0 0 凝胶过滤层析，疏水层析等纯化 步骤对短小芽孢杆菌发酵液中的碱性蛋白酶进行了纯化。纯化产物通过 s d s - p a c 昆电泳检查，已经达到了电泳纯标准。与纯化前的初酶液相比，酶的 比活力提高了3 8 6 5 倍，达到1 7 5 3 0u m g ，但其回收率仅为0 8 8 。脱毛实验 证明，纯化的蛋白酶能够单独完成整个脱毛过程。因此，该酶是一种脱毛碱性 蛋白酶，命名为d h a p ( d e h a i r i n g a l k a l i n e p r o t e a s e ) 。 x 四川大学博士学位论文 d h a p 的分子量约为3 2 0 0 0 d ，等电点为9 0 ，最适反应p h 为1 0 ，最适反 应温度为5 8 。该蛋白酶活性能够被丝氨酸蛋白酶的专一性抑制剂p m s f 和 d f p 完全抑制，同时也能被e g t a ，e d t a 等金属蛋白酶抑制剂所部分抑制。 此结果表明，d h a p 为一种丝氨酸蛋白酶，其酶活性的发挥需要某些金属离子 的参与，如n a + ，c 2 + ，m 9 2 + 等金属离子能提高d h a p 的活性，但c u 2 + 与z n 2 + 能抑制d h a p 的部分活性。 将纯化的d h a p 进行转膜，测定了n 末端的2 0 个氨基酸残基的序列，其 结果是：a q t v p y g i p q i k a p a v h a q g 。该序列与来自其它芽孢杆菌属菌株的 丝氨酸蛋白酶的n 末端氨基酸序列有较高的同源性，并和另一株短小芽孢杆菌 的丝氨酸蛋白酶n 末端氨基酸序列完全一致。 在此基础上，设计了用于扩增全长基因片段的引物，从短小芽孢杆菌的总 d n a 中扩增得到了相应的片段。将扩增的全长基因片段用t 载体进行克隆，然 后测定了全序列。该片段全长1 5 8 8 b p ，包括一个1 1 5 2 b p 的编码区序列，编码全 长为3 8 3 个氨基酸残基的蛋白质。根据软件分析与同源性比较推测。该蛋白质 含有由2 9 个氨基酸残基组成的信号肽，7 9 个氨基酸残基组成的前肽。成熟蛋白 酶全长2 7 5 个氨基酸残基，其中，d 3 2 ，h 6 4 ，和$ 2 2 l3 个氨基酸残基为催化活 性中心。 将克隆到的碱性蛋白酶基因( 命名为a p ) 编码的成熟蛋白n 端序列与纯 化的脱毛蛋白酶n 端序列进行比较，二者完全相同。同源性分析表明，该基因 序列与已报道的另一短小芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶基因序列有9 7 的同源 性，氮基酸序列同源性高达9 9 2 。但与其它丝氨酸蛋白酶基因相比，则同源 性低于6 0 。该蛋白酶可以认为是枯草杆菌蛋白酶家族( s u b t i l i s i n ) 的新成员。 将该蛋白酶基因插入大肠杆菌( e s c h e r i a c h i ac o l i ) 表达载体p e t 1 5 b ，在 大肠杆菌中进行了表达。s d s - p a g e 显示出相应的蛋白质带，含量约为总蛋白 的3 0 。表达的蛋白质形成包涵体，但经交性和复性后，未能表现出蛋白酶活 性。 将来自短小芽孢杆菌u n 3 1 c 4 2 的基因启动子( b p 5 3 片段) 和脱毛蛋白 酶全基因( a p ) 进行融合，然后将重组基因( 命名为b p a p ) 插入到大肠杆菌一 枯草杆菌穿梭质粒载体p s u g v 4 中，构建成表达质粒p s u - b p a p 。当把p s u - b p a p 转入到枯草杆菌w b 6 0 0 后，所得转化子能够在牛奶平板上产生透明的水解圈， x l 四j i l 大学博士学位论文 在其发酵液中能够检测到蛋白酶活性，s d s - p a g e 分析也能清晰的显示出相应 的蛋白质带，这些结果都表明脱毛蛋白酶在枯草杆菌中得到表达。转化子发酵 液也具有脱毛效果。 上述的研究结果表明，纯化后的短小芽孢杆菌d h a p 和在枯草杆菌w b 6 0 0 表达的d h a p 都具有良好的脱毛活性，这些结果都说明了脱毛过程仅需一种蛋 白酶即可完成。 关键词：短小芽孢杆菌；碱性蛋白酶；纯化；基因克隆；基因表达 脱毛活性； x i l 四川大学博士学位论文 p u r i f i c a t i o n ，g e n ec l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f a n u n h a i r i n g a l k a l i n ep r o t e a s ef r o mb a c i l l u s p u m i l u s m a j o r ：g e n e t i c s p h d c a n d i d a t e ：q i n gh u a n gt u t o r ：p r o f y i - z h e n gz h a n g a b s t r a c t b a c i l l u sp u m i v su n 一3 1 一c 一4 2w a so b t a i n e d b ym u t a t i o n so fs t r a i n b a ( 0 6 ) 。w h i c hi sa na l k a l i n ep r o t e a s ep r o d u c e ra n ds e p a r a t e df r o m1 i f e w a s t ei n c h e n g d u t h er e s u l t so fb i t hs h a k i n ga n di o o lf e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o n1 i q u i dh a sh i g hd e h a i r i n ga n d l o wc o l l a g e n d e g r a d a t i o n a c t i v i t y ，i n d i c a t i n gt h a tt h ep r o t e a s ep r o d u c e d b yt h i ss t r a i nm i g h tb ei d e a le n z y m ea g e n tf o rl e a t h e ri n d u s t r y w h e nt h i ss t r a i nw a sf e r m e n t e d ，i tp r o d u c e da l k a l i n ep r o t e a s ea f t e r i n o c u l a t i o no f1 6 ha n dt h ee n z y m ea e t i v i t yg o tt h e p e a ka t 2 8 hw i t h 4 2 0 0 u m l a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n ts h o w e dt h a ta b o u t 9 6 o fa l k a li n e p r o t e a s e w a sr e c o v e r e di nt h e2 0 7 0 c o n e e n t r a t i o n a 1 t h o u g hs d s p a g ed i s p l a y e dt h a tt h e r ew e r es e v e r a lp r o t e i nb a n d si nt h e s a m p l ea f t e r1 6 hf e r m e n t a t i o n ，e n z y m a t i ca c t i r es t a i nd e m o n s t r a t e dt h a t t h e r ew a so n l yo n eb a n dd u r i n gt h ew h o l ef e r m e n t a t i o np e r i o d ，i n d i c a t i n g t h a tt h e r ei so n l yo n ek i n da l k a l i n e p r o t e a s ei nt h ef e r m e n t a t i o n1 i q u i d t h ee n z y m ea c t i v i t yi nf e r m e n t a t i o nl i q u i dc o u l db ei n h i b i t e db yp m s f a n dd f p t h ef e r m e n t a t i o n1 i q u o ra l s os h o w e dg o o dd e h a i r i n ga e t i v i t y 四川大学博士学位论文 t h ea l k a l i n ep r o t e a s e ( n a m e dd h a p ，d e h a i r i n ga l k a l i n ep r o t e a s e ) i n t h ef e r m e n t a t i o n1 i q u i d w a s p u r l f l e d w i t h h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，i o ne x c h a n g ea n dg e lf i l t r a t i o n t h ef i h a ly i e l dw a s a b o u t0 8 8 a n dt h es p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yw a si n c r e a s e d3 9 一f o l d ，w i t h 1 7 5 3 0u r a g t h ep u r i f i e dp r o t e a s ea l s od i s p l a y e dd e h a i r i n ga c t i v i t y i n o t h e rw o r d s ，d h a pc a na c c o m p l i s ht h ew h o l ep r o c e s so fd e h a i r i n gb yi t s e l f a n dw i t h o u ta n yo t h e rp r o t e a s e sc o o p e r a t i o n d h a ph a dap io f9 0a n dam o l e c u l a rw e i g h to fa p p r o x i m a t e3 2 0 0 0 d a l t o n t h ep r o t e a s eh a st h em a x i m a la c t i v i t ya tp h l oa n d5 5 t h ee n z y m e a c t i v i t yc o u l db ec o m p l e t e l yi n h i b i t e db yp m s fa n dd f p a n dp a r t i a l l y i n h i b i t e db yp e p s t a t i na ，e d t aa n de g t a l e u p e p t i n ，b e n z a m i d i n ea n d h y d r o c h l o r i d ea p r o t i nh a dn oi n f l u e n c eo n t h ed h a pa c t i v i t y c a ”，m 9 2 + a n dn a + c o u l ds l i g h t l yi n c r e a s e ，b u tc u 2 + a n dz n 2 + s l i g h t l y i n h i b i t e d p r o t e a s ea c t i v i t y a 1 1t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a td h a pi sas e r i n e p r o t e a s e t h ef i r s t2 0a m i n oa c i dr e s i d u e so ft h ep u r l f i e dd h a pw e r ed e t e r m i n e d a n dt h es e q u e n c ei sa q t v p y g i p q i l ( a p a v h a q g t h eh o m o l o g o u sa n a l y s i ss h o w e d t h a tt h en - t e r m i n a ls e q u e n c eo fd h a pi s i d e n t i c a lt ot h a to fs e r i n e p r o t e a s ef r o ma n o t h e r 凰p u m i l u s s t r a i nt y o - 6 7a n dh a sh i g hh o m o l o g yw it h t h o s ef r o mo t h e rb a c i l l u ss p e c i e s b a s e do nt h eh o m o l o g o u sa n a l y s i s ，t h r e ep a i r so fp r i m e r sw e r e d e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e d t h r e ef r a g m e n t s ，c o n t a i n i n gi n t a c tg e n e ，w h o l e a n dm a t u r ep r o t e a s ec o d i n gr e g i o nw a r ea m p l i f i e df r o mt o t a ld n ao f 且 p u m i l u su n 一3 1 一c 一4 2 b yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 。r e s p e c t i v e l y a f t e r c l o n e di n t ot - v e c t o r ，t h es e q u e n c eo fi n t a c tg e n ef r a g m e n tw i t ht h es i z e o f1 6k b ，w a sd e t e r m i n e d t h eg e n ec o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f 1 1 4 9n u c l e o t i d e s ( n a m e da pg e n e ，e n c o d i n g3 8 3a m i n oa c i d s ) ，w h i c h c o n t a i n sas i g n a lp e p t i d ec o n s i s t i n go f2 9r e s i d u e sa n dap r o p e p t i d eo f 7 9r e s i d u e s t h ed e d u c e d3a m i n oa c i dr e s i d u e s ，d 3 2 ，h 6 4 ，a n ds 2 2 l ，w e r e i d e n t i c a lw i t h3e s s e n t i a la m i n oa c i d si nt h ec a t a l y t i cc e n t e ro fp r o t e a s e x i v 四川大学博士学位论文 c o m p a r i s o no ft h ee n t i r ed e r i v e dp e p t i d es e q u e n c ew i t ho t h e rs e r i n e p r o t e a s er e v e a l e ds i g n i f i c a n th o m o l o g y ，e s p e c i a l l yw i t har e p o r t e dg e n e f r o ma n o t h e r 丑p u m i l u ss t r a i nt y o 一6 7 ( 9 9 9 6h o m o l o g y ) t h en - t e r m i n a la m i n o a c i ds e q u e n c eo fd e d u c e dm a t u r ep r o t e a s ei si d e n t i c a t ot h a to ft h e p u r i f i e da l k a l i n ep r o t e a s e t h es e q u e n c ea r o u n dt h e s er e s i d u e sr e v e a l e d t h a ta pw a san e wm e m b e ro ft h es u b t i l i s i nf a m i l y t h eg e n ew a se x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ia f t e rc l o n e di n t op e t 一1 5 b s d s p a g es h o w e dt h ee x p r e s s e dp r o d u c tc l e a r l y ，b u tn op r o t e a s ea c t i v i t y w a sd e t e c t e d i no r d e rt oe x p r e s sa l k a lin ep r o t e a s eg e n e ( a pg e n e ) i nb a c i l l u s s u b t i l i s t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d w a sc o n s t r u c t e d t h i s p l a s m i dc o n t a i n sap r o m o t o rb p 5 3 ，a l s of r o m 丑p u m i l u su n 一3 1 一c 一4 2 ，a p g e n ea n dt h es h u t t l ev e c t o rp s u g v 4 a f t e ri n t r o d u c e d i n t o 且s u b t i i s w b 6 0 0 ，t h et r a n s f o r m a n t sd i s p l a y e dt h eh y d r o l y z e dz o n eo nm ii kp l a t e t h ef e r m e n t a t i o n l i q u i d o ft h et r a n s f o r m a n t ss h o w e daf e wa t k a l i n e p r o t e a s ea c t i v i t i e s t h ee x p r e s s e dp r o d u c tc o u l db ee a s i l yd e t e c t e dw i t h s d s p a g ea n da l s od i s p l a y e dd e h a i r i n ga c t i v i t y k e y w o r d s ：b a c i l l u s p u m i l u sa l k a l i n ep r o t e a s e ，p u r i f i c a t i o n ，g e n ec l o n i n g g e n ee x p r e s s i o n ，u n h a i r i n ga c t i v i t y 四川大学博士学位论文 前言 2 1 世纪是一个绿色的世纪，但人类却面临着日益严重的环境和资源问题。 世界各国将在实施可持续发展战略承诺的基础上采取实质性行动，进行环境的 保护。然而迄今为止，多数被人类认为属于现代化的工业、农业都会对环境带 来不同程度的损害【3 l 。因此，如何在防止自然界环境恶化的同时保持人类社会 的持续发展，已经成为当今世界的重大课题。虽然在一定意义上环境污染源于 科学技术的发展，但解决的方法也必然来自科学技术的进一步提高。 中国是一个皮革生产大国，每年有2 亿多张动物皮可用于制革。皮革行业 一直是我国轻工业的重要支柱产业之一，其出口创汇额位居轻工产品前列。过 去1 5 年里，由于污染严重，废水处理费用高昂，世界制革工业的重心逐渐从发 达国家移向了发展中国家。中国皮革产量增加了8 倍，其中猪皮年产量达1 亿 多张，居世界首位，牛皮5 0 0 0 万张，羊皮7 0 0 0 万张以上。1 9 9 4 年我国皮革及 制品出口创汇额达8 3 3 亿美元，1 9 9 8 年更是达到了9 7 亿美元，居我国轻工业 创汇首位，并且是继石油产业后的第二大出口刨汇产业1 1 4 j 。 但是，在皮革工业发展给国民经济带来巨大效益的同时，它也给环境保护、 生态平衡带来的巨大负担和压力。据统计，我国皮革行业每生产一吨原料皮需 要消耗硫化钠4 8 埏，红矾5 0k g ，同时产生约1 0 0 - - 1 2 0 吨的污水【j j 。现在，皮 革行业已经成为我国仅次于造纸业的第二大有机物污染源，制革业所产生的废 水仅次于造纸废水，每年已超过1 亿吨【i q 。 制革业中的废水主要来自脱毛阶段，达8 0 以上。现在国内所使用的脱毛 方法主要是灰碱法，该法的主要优点是脱毛速度快，成本低，脱毛后的皮质量 高。但它有两个最大的缺点：一是由于大量使用硫化物，导致对环境的破坏； 二是造成资源的大量浪费。为了解决传统脱毛工程中的硫化物污染，必须对硫 化物污水进行处理，使之达到规定的排放标准。然而这种方法投资大，成本高， 目前国内除较大规模的2 0 0 多家制革厂有条件治理污水外，其余遍及全国的数 以万计的小厂根本无法治理含硫污水，制革污水不能达标排放甚至放任自流。 因此，如果继续采用这种脱毛方法，将严重地破坏自然生态环境和阻碍资源的 充分利用。制革行业要得到可持续发展，必须发展新的脱毛工艺，以彻底解决 x v i 四川大学博士学位论文 脱毛工艺造成的严重污染问题 t m 2 1 。 实践证明，用酶法脱毛取代灰碱法脱毛，能够将污染源消灭在生产工艺过 程之中，是减少环境污染的行之有效的方法1 3 ”2 1 。因此，自从1 9 1 0 年德国入 r o e h i m 将酶法脱毛引入制革工业后，各国对酶法脱毛工业都发生了浓厚的兴 趣。事实证明，蛋白酶用于皮革脱毛及软化工序，代替了传统的石灰一硫化钠 脱毛法，消除了制革工业的头号污染物一脱毛废液中的硫化物对环境的污染， 是皮革生产史上的重大变革，在很大程度上缩短了古老的皮革工业与现代化文明 生产之间的距离1 4 】。 在制革脱毛工艺中开始应用蛋白酶的根据是基于蛋白酶能水解蛋白质这一 笼统的概念。然而，蛋白酶的种类甚多，每一种蛋白酶又有不同的特异性1 7 8 。 它们对各种不同结构的底物表现出来的水解能力也不一样。现在所用的蛋白酶 制剂，仅仅是微生物在其代谢过程中所产生的各种活性物质的混合物。因此， 目前进行的酶法脱毛实际上是个由多种蛋白酶共同作用于生皮中各种蛋白质 底物的反应混合体系。由于粗酶中含有的胶原蛋白酶( 脱毛终点时，溶液中羟 脯氨酸含量较脱毛开始时有显著增加) 使得应该保留的胶原蛋白受到了损失1 8 j 。 这种“综合性”蛋白质水解的结果，极容易出现成革松面等毛病，造成成革质 量低劣。尽管可以通过细心摸索，严格控制操作条件，包括酶的用量多少，脱 毛时间长短、温度高低以及p h 值大小等等对其加以调整，但是往往也难以达到 预期的要求。同时，对操作条件要求越严，推广就越不容易。显而易见，这种 费用商、产品质量低，操作不方便的脱毛方法是难以坚持的。 要使酶法脱毛取代灰碱法脱毛并得以推广应用，关键在于找到一种优良的 脱毛用酶制剂。若能研制出既有良好脱毛效果，又不损伤皮胶原的酶制剂用于 皮革行业，将大量降低皮革工业的污染，从而大幅度降低高昂的废水处理费用， 最终降低生产成本。利用基因工程技术，克隆到脱毛专一性强的蛋白酶基因， 构建无脱原酶的高效表达蛋白酶基因工程菌，可明显提高蛋白酶制剂产量，大 规模降低成本，使酶法脱毛工业得到广泛的应用。同时，通过基因工程菌生产 的酶制剂是一种单一的蛋白酶制剂，可以有效的避免胶原的水解。这种方法与 纯化粗酶液中的脱毛蛋白酶相比，很明显是一种更加廉价，简便的方法1 5 一。因 此，问题的焦点在于寻找一种优良的脱毛蛋白酶产生菌，然后克隆它的基因用 于构建基因工程菌。 四川太学博士学位论文 本论文研究工作的目的有2 点：一是利用蛋白酶纯化方法和基因工程方法 获得单一的碱性蛋白酶进行脱毛实验，以证明一种蛋白酶就可以完成脱毛过程。 二是利用分子克隆技术获得碱性蛋白酶基因，通过测序和分析，以获得该蛋白 酶的氨基酸全序列，为最终高效表达该基因奠定基础。 x v l l i 第一章 短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 的发酵试验及发酵液中蛋白酶性质的研究 四j i l 大学博士学位论文 摘要 短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) u n 4 2 c 3 1 是一株分离自成都市生活垃 圾，经过多次诱变后得到的碱性蛋白酶产生菌。摇瓶和1 0 0 l 小型发酵实验结果 表明，其发酵液中含有的碱性蛋白酶具有很好的脱毛效果，且对皮革胶原没有 损伤。在此基础上，进行了5 0 0 l 和1 2 0 0 l 扩大规模发酵试验。 对该菌株5 0 0 l 大规模发酵的蛋白酶活性检测发现，接种1 6 h 后开始产蛋白 酶，在2 8 h 达到高峰。4 次放大规模发酵试验所获结果类似，最高的蛋白酶活性 可达4 2 0 0 u 佃l 。对5 0 0 l 规模的发酵液进行的硫酸铵饱和沉淀实验发现，在 2 0 7 0 的硫酸铵饱和度范围内可以得到绝大部分( 9 6 ) 的蛋白酶。该发酵液 中的碱性蛋白酶对温度有一定的耐受性，在低温保存条件下，蛋白酶并不会失 去活性。 对发酵液进行s d s p a g e 和蛋白酶的活性染色分析表明，该发酵液中含有 的蛋白质种类不多，且只含有一种碱性蛋白酶。同时，对发酵液中蛋白酶性质 研究发现，该发酵液至少含有2 种类型的蛋白酶。其中中性蛋白酶中最佳反应 p h 值为7 ，碱性蛋白酶的最佳反应p h 值为9 5 ，最适反应温度为5 0 c 。该蛋 白酶活性能够被丝氨酸蛋白酶抑制剂p m s f ，d f p 完全抑制，e d t a ，e g t a 对 该酶也有一定的抑制作用。 发酵液的脱毛实验表明，该发酵液对牛皮。羊皮和猪皮均有良好的脱毛效 果。其脱毛效果与碱性蛋白酶活性有很好的对应关系，该结果暗示其脱毛作用 可能是由碱性蛋白酶引起的。 关键词：短小芽孢杆菌发酵蛋白酶脱毛作用 2 四川大学博士学位论文 1 引言 蛋白酶在制革工业中有着重要的地位与用途“”。利用蛋白酶进行脱毛，是 大势所趋，传统的石灰一硫化碱法脱毛虽然生产成本低、脱毛效果好，但排出的 含硫污水对生态环境造成了严重的污染。因此，自从1 9 1 0 年德国人r o e h i m 将 酶法脱毛引入制革工业后，各国对酶法脱毛工业都发生了浓厚的兴趣。事实证 明，运用酶法脱毛可以从根本上消除硫化物对环境造成的污染m 1 。 我国自1 9 6 8 年开始试验酶法脱毛工艺，1 9 7 3 年开始在全国范围内推广。地 衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s n o2 7 0 9 ) 是目前我国脱毛碱性蛋白酶的主要 生产菌，枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i sn o1 3 9 8 ) 产生的中性蛋白酶a s l 3 9 8 也是目前我国使用较多的脱毛蛋白酶。它们的优点是具有很高的产量，以碱性 蛋白酶2 7 0 9 ( s u b t i l i s i n2 7 0 9 ) 为例，其发酵单位在1 0 0 0 0u m l 以上，远高于碱 性蛋白酶基因工程菌l o o o 一1 5 0 0u m l 的水平f 7 j 。但由于对推广中出现的一些 实际问题没有认真加以研究解决，酶法脱毛未能坚持下去。出现这种状况的表 面原因是因为微生物蛋白酶制剂成本高，应用酶法脱毛后在成革时容易出现松 面，如有不慎还会造成烂皮，酿成生产事故。归根结底，真正原因则是对脱毛 蛋白酶的基础理论研究不够深入。目前需要对脱毛蛋白酶进行进一步的研究， 并且筛选新的蛋自酶产生菌。 本实验室利用平板筛选法、蛋白酶活性测定法、s d s p a c e 分析法和脱毛 实验等4 种方法相结合的方法，从初筛到的3 1 7 株蛋白酶产生菌中，筛选到一 株蛋白酶活性为5 0 0 u l m l ，几乎不具有胶原水解活性和具有很好脱毛效果的短 小芽孢杆菌b a ( 0 6 ) ( b a c i l l u s p u m i l u s ) 。然后对此菌进行多轮诱变处理，获得 一株蛋白酶活性可达到5 ，5 0 0 u m l 的突变菌株，命名为u n 3 1 - c - 4 2 。实践证明， 该菌株产生的蛋白酶不仅对猪皮、羊皮、牛皮均有良好的脱毛效果( 对羊皮、 牛皮的脱毛效果尤佳) ，完全能达到传统脱毛工艺的成革质量。而且，该蛋白酶 还可使胶原纤维发生分散作用，以达到使皮革软化的目的，其软化的成革物性 均达到国际标准。尤其重要的是，该蛋白酶对胶原的水解活性也很低，是一种 非常优秀的脱毛蛋白酶，在皮革工业中有着巨大的应用前景。 在对该菌株最佳发酵条件的研究基础上，对短小芽孢杆菌u n 一3 1 - c 一4 2 进行 了大规模的发酵实验，并对得到的发酵液的性质进行了初步研究，为以后的脱 毛蛋白酶的纯化以及脱毛蛋白酶基因的克隆打下了良好的基础。 3 四川大学博士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 短小芽孢杆菌u n 一3 t c - 4 2 ：由自成都市生活垃圾分离、诱变所得，其蛋白 酶有良好的脱毛效果，且胶原水解活性极低。 2 1 2 发酵用培养基 按照本实验室所得到的短小芽孢杆菌u n - 3 1 c - 4 2 最佳产酶条件配制。培养 基中含麸皮2 5 ，2 黄豆粉( 水解液) ，k 2 h p 0 4o 4 ，n a h 2 p 0 40 0 4 ，酵母 膏o 3 ，c a c 0 30 3 ，p h 7 5 ，植物油0 4 0 6 。 2 1 3 溶液和缓冲液 2 1 3 1 硼酸缓冲液( p h 9 6 ) 1 1 2 】 0 0 5 m o l l 硼酸钠 5 0 m l l m o l ln a 0 h5 m l p h 计标定至p h9 6 ，加水至终体积2 0 0 m l 。 2 1 3 20 4m o l l 三氯乙酸溶液 5 5 8 9 三氯乙酸加水至1 0 0 m l 。 2 1 3 32 酪素蛋白溶液 2 9 酪索蛋白溶解于1 0 m l0 1 mn a o h 溶液中。放置过夜。反复加热至沸腾， 直至酪素蛋白完全溶解。加入5 0 m l 水，用相应的缓冲液调节至使用对的p h 。 加水定容至1 0 0 m l 。 2 1 3 4 聚丙烯酰胺母液i l 】 3 0 丙烯酰胺，0 8 亚甲双丙烯酰胺。 2 1 3 5 4 t r i s c l ，s d s ( p hs s ) t 1 】 在3 0 0 m l h 2 0 中溶解9 1 9t r i s 碱( 1 5 m o l l ) ，用l m o l lh c l 调节p h 值至 8 8 ，补加h 。o 至整体积达到5 0 0m l 。再加入2 9s d s ，于4 可以保存1 个月。 2 1 3 64x t r i s - - c i s d s ( p h6 8 ) e 1 】 在4 0 m lh ：0 中溶解6 0 5 9t r i s 碱( 0 5 m o l l ) ，用l m o l lh c l 调节p h 值至 6 8 ，补加h , 0 至整体积达到1 0 0 m l 。再加入0 4 9s d s ，于4 可以保存1 个月。 4 四川大学博士学位论文 2 1 3 7s d s 电泳缓冲液，5 【l 】 t r i s 碱( 0 1 2 5 m o l l )1 5 i g 甘氨酸( 0 9 6 m o l l )7 2 o g s d s 5 o g 加去离子蒸馏水至1 0 0 0 m l ，使用前稀释至lx s d s 电泳缓冲液。 2 1 3 8s d s 样品缓冲液，2 x 1 l 4 t r i s c i s d s p h 6 8 2 5 m l 甘油 2 0 ( w v ) 2 0 m l d t t3 i g 溴酚蓝i m g 加去离子蒸馏水至l o o m l 并混匀。等量分装成i m l 并于一7 0 贮存。 2 1 3 9 考马斯亮蓝r - - 2 5 0 染色液1 】 甲醇 5 0 ( v v ) 考马斯亮蓝r - 2 5 0 0 0 5 ( v v ) 乙酸l o ( v v ) h , o 4 0 2 1 3 1 0 考马斯亮蓝脱色液f l l 乙酸 5 ( v v ) 甲醇1 6 s ( v l v ) h ，07 8 5 瓢 2 1 4 发酵罐 5 0 0l 发酵罐，圆盘弯叶涡轮式搅拌器，搅拌速度1 8 6 r m i n 。 2 1 5 生化试剂 电泳所需的生化试剂为超纯试剂，分别购自美国b r l 公司，s i g m a 公司， f l u k a 公司：t r i t o n x - - 1 0 0 购自上海生工公司，其余试剂均为国产分析纯试剂。 四川大学博士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 发酵工艺条件 灭菌：过滤器及空罐灭菌，2l c m 2 ，0 5h 定容：5 0 6 0 ，即5 0 0l 定容2 5 0 ，3 0 0l 接种：5 0 0l 发酵罐接8 1 0 个克氏瓶斜面菌种悬液 发酵期间罐压：0 3 0 7k e , c m 2 培养温度：3 4 3 5 通气量：l ：o 2 4 。0 5 5 v v m i n 2 2 2 蛋白质的硫酸铵沉淀【9 】 1 以蛋白溶液的体积为基础，在硫酸铵表上查出配成所需饱和度需要的 固体硫酸铵量。按照计算结果，称取适量的固体硫酸铵，并将团块研 成细粉。 2 将蛋白溶液置于大容量的容器中，并放入大的磁力搅拌子，在磁力搅 拌器上慢慢搅拌。 3 缓慢的将硫酸铵粉末加入到溶液中。如果固体硫酸铵沉于容器底部， 可停几分钟让其溶解。每5 0 0 9 硫酸铵加入的时间不低于3 0 m i n 。 4 硫酸铵完全加入后，再继续搅拌3 0 r a i n 。 5 停止搅拌，将溶液放入4 。0 冰箱过夜，以让蛋白质沉淀完成。 2 2 3 蛋白酶酶活检测 按照轻工部部颁标准方法进行： 1 蛋自酶液按照一定比例稀释成l m l 样品液； 2 样品液与底物一酪素蛋白溶液( 2 ) 在5 0 水浴预热2 r a i n ； 3 混合l m l 样品液与l m l 底物溶液，s o 下反应t o m i n ；对照中加入2 m l 三氯乙酸溶液( o 4m o l l ) ，5 0 反应2 0 m i r a 4 样品液中加入2 m l 三氯乙酸溶液( o 4 t o o l l ) ，5 0 反应2 0 m i n ( 中止酶 切反应) ；对照在2 0 r a i n 后，加入l m l 酪素溶液，5 0 保温l o m i m 5 将反应后液体过滤，保留滤液； 6 在l m l 滤液中加入5 m l 碳酸钠溶液( o 4m o y l ) ，l i n lf o i l n 酚溶液， 6 四川大学博士学位论文 4 0 水浴中显色1 0 m i n ： 7 5 0 0 n m 测光吸收值； 8 酶活的计算公式：酶活( u t 0 0 1 ) = o d 5 0 0 n x 稀释倍数斜率。 2 2 4 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - - p a g e ) 【1 l ： 1 用2 块干净的玻璃平板和垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定 在灌胶支架上。 2 在2 5 m l 量杯中，先后加入5 2 5 m l h 2 0 ；3 7 5 m l 4 x t d s c i s d s ，p h 8 8 ： 6 0 0 m l 聚丙烯酰胺母液，混匀后加入0 0 5 m l1 0 过硫酸铵和0 0 1 m l t e m e d 。将配好的分离胶溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹 层中。 3 分别从两边垫片往夹层中缓慢加入一层重蒸去离子水。让凝胶在室温下 聚合3 0 6 0 m i n 。 4 倾去顶层的水，并以l t r i s c i s d s ，p h 8 8 缓冲液冲洗凝胶的顶部表面。 5 在2 5 m l 量杯中，混匀3 0 5 m lh 2 0 ；1 2 5 m l4 x t r i s c 1 s d s ，p h 6 8 ； 0 6 5 m l 聚丙烯酰胺母液，混合后加入o 0 2 5 m l1 0 过硫酸铵和0 0 0 5 m l t e m e d 。将配好的积层胶溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹 层中，直至离夹层的顶部约l e m 高为止。 6 将梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶溶液充盈剩余 空间。让积层胶在室温下聚合3 0 - 4 5 m i n 。 7 在具螺口盖的微量离心管中，用2 s d s 加样缓冲液按1 ：1 ( v v ) 稀释待 测蛋白质样品，于1 0 0 煮沸3 - 5 m i n 。同样缓冲液溶解蛋白质分子量标 准混合物。 8 小心地拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶的加样孔。 9 将玻璃平板安装在电泳装置上删入1 s d s 电泳电极缓冲液，使之淹没 凝胶的加样孔。 l o 微量注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，对照孔中 加入蛋白质分子量标准样品，若有空置的加样孔，须加等体积的空白l s d s 样品缓冲液 以防相邻泳道样品的扩散。 1l 连接电源，先在1 0 m a 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶， 四川大学博士学位论文 再将电流调至1 5 m a 至溴酚蓝到达凝胶底部为止。 1 2 关闭电源并撤去导线，弃去电极缓冲液。 1 3 在不损坏凝胶的基础上，将凝胶剥离出来并切去凝胶的一角做上标记。 接着就可以进行蛋白质的检测。 2 2 5s d s 聚丙烯酰胺凝胶的染色1 1 1 1 将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器中并以3 5 倍体积的固定液覆盖，在旋 转摇床上缓慢摇动2 h 。 2 倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，并缓慢摇动4 h 。 3 倾去染色液，用约5 0 m l 固定液冲洗凝胶。 4 倾去固定液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2 h ，倾去脱色液，在加入 新脱色液同时至获得蓝色条带及干净的背景。 5 凝胶可放于7 乙酸或水中保存。 2 2 6s d s 聚丙烯酰胺凝胶的蛋白酶活性染色f 2 5 】： 用于活性染色的s d s 聚丙烯酰胺凝胶在配制时需在分离胶中加入酩素，至 终浓度o 2 ，作为蛋白酶反应的底物。 1 复性：电泳完毕以后，用1