（遗传学专业论文）线粒体遗传转化及筛选标记研究.pdf

摘要 摘要 线粒体( m i t o c h o n d r i a ) 是真核生物细胞中广泛存在的重要细胞器之一，它 不但是真核细胞进行呼吸氧化产生a t p 的主要场所，而且还执行着三羧酸循环、 电子传递、氧化磷酸化及脂肪酸的生物合成等职能。线粒体是半自主性细胞器， 含有自己的基因组d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) ，能够单独进行复制、 转录及合成蛋白质。因此可以通过构建适当的线粒体表达载体，大量生产外源 蛋白。与传统的核基因转化相比，细胞器转化有着无可比拟的优点。这一新领 域的相关研究不仅在理论上极大地丰富了有关线粒体的研究，并且为细胞器转 化、构建新型的生物反应器( b i o r e a c t o r ) 以及线粒体相关疾病的基因治疗奠定 了坚实的基础。 本文通过设计突变引物，p c r 扩增得到带有定点突变的黄瓜线粒体细胞色 素b ( c y t o c h r o m eb ，c o b ) 基因，突变后的c o b 基因所编码蛋白的第4 3 位氨基 酸由缬氨酸取代了原来的甘氨酸。由于该位点是抗霉素a 敏感位点，突变后将 可能导致线粒体细胞色素b 对抗霉素a 的敏感性降低。将突变后的c o b 基因作 为抗霉素a 抗性基因插入到线粒体表达载体p s k e g f p 中，从而构建带有抗性 筛选标记的黄瓜线粒体表达载体p s k e g f p c o b m l 。 本文利用生物信息学方法对黄瓜线粒体表达载体p s k e g f p 上的c o b 基因 57 上游调控序列进行分析，初步预测该序列中含有假定的启动子区。p c r 扩增该 序列片段，并将其正向插入到带有a c z 报告基因的启动子缺失质粒p d n l 9 1 a c f l 上。通过测定启动子a c z 报告基因融合质粒在大肠杆菌d h 5 a 中的伊半乳糖苷 酶活性，确定该启动子序列具有转录活性。对这一序列进行测定和分析，发现 存在许多典型植物基因启动子顺式作用元件。此外，用荧光显微镜观察带有脚 基因的线粒体表达载体p s k e g f p 在大肠杆菌d h 5 a 中，经一定波长的光源激 发后，能够发出绿色荧光。由此证明黄瓜线粒体表达载体上的启动子确实具有 启动转录的活性。 本文经过前期的实验摸索，确定了黄瓜离体线粒体电转化的条件，通过p c r 扩增外源基因加，证明线粒体表达载体p s k e g f p 已经成功地转入到离体的黄 瓜线粒体中。随后在此基础上，本文初步摸索了线粒体体外转录条件，成功地 摘要 提取了电转化后的线粒体总r n a 。然而，由于离体线粒体在经电击后是否具有 结构和功能完整性，以及体外转录孵育时间等未知因素的影响，外源基因在离 体线粒体中的转录情况尚未可知，确切的结论还有待进一步地研究。 关键词：线粒体表达载体定点突变细胞色素b 启动子细胞器转化 a b s t r a c t a b s t r a c t a sau b i q u i t o u so r g a n e l l ei ne u k a r y o t i co r g a n i s m s ，m i t o c h o n d r i o ni sc r u c i a lf o r v a r i o u sm e t a b o l i s m si nt h ec e l l ，s u c ha st h et r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l e ，o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o na n de l e c t r o nt r a n s f e r b e i n gas e m i - i n d e p e n d e n to r g a n e l l ec a p a b l eo f s e l f - r e p l i c a t i o n ，m i t o c h o n d r i o nh a si t so w ng e n o m et h a tc o u l de n c o d er r n a s ，t r n a s ， a n dan u m b e ro fe n z y m e si n v o l v e di nr e s p i r a t i o n t h e r e f o r e ，i ti sp o s s i b l et oc o n s t r u c t m i t o c h o n d r i a lv e c t o r sf o rt h ee x p r e s s i o no fal a r g eq u a n t i t yo fa i m e dp r o d u c t s c o m p a r e d w i t ht h et r a d i t i o n a ln u c l e a rt r a n s f o r m a t i o n s y s t e m s ，o r g a n e l l e t r a n s f o r m a t i o nh a si t su n i q u ea d v a n t a g e s r e s e a r c h e so nt h i sn e wf i e l de n r i c ht h e t h e o r e t i c a lu n d e r s t a n d i n go nm i t o c h o n d r i aa sw e l la sl a yt h ef o u n d a t i o no fp r a c t i c a l u s eo ng e n er e p l a c e m e n tt h e r a p yo fm t d n ab a s e dd i s e a s e sa n dt h ed e v e l o p m e n to f n o v e le x o g e n o u sg e n e sb i o r e a c t o r i nt h i sw o r k , t h eg l y c i n e 一4 3r e s i d u ei nt h ep r o t e i nc y t o c h r o m ebo fc u c u m b e r m i t o c h o n d r i aw a sr e p l a c e db yav a l i n et h r o u g hs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s t h e p r e s e n c eo fg l y c i n ea t t h i ss i t eo ft h ep e p t i d ec h a i ni sh i g h l yc o n s e r v e da m o n g d i f f e r e n to r g a n i s m s r e c e n tr e s e a r c hr e v e a l e dt h a tt h eg l y c i n e 一4 3r e s i d u ei sa s s o c i a t e d w i t ht h es e n s i t i v i t yt oa n t i m y c i na t h em u t a n tc o bg e n ew a st h e nc l o n e di n t oa m i t o c h o n d r i a le x p r e s s i o nv e c t o rp s k e - g f pa sap o t e n t i a lr e s i s t a n tg e n e ，w h i c h m i g h tb ec a p a b l eo fc o n f e r r i n gt h ev e c t o rr e s i s t a n c et o w a r da n t i m y c i na b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so ft h eu p s t r e a mr e g u l a t o r ys e q u e n c eo fc o bg e n ei n s e r t e d i np s k e g f ps h o w e dt h a tt h e r ee x i s t st h ep o t e n t i a lp r o m o t e rs e q u e n c ei nt h i sr e g i o n s e v e r a lp l a n ts p e c i f i cc s - e l e m e n t sw e r ed i s c o v e r e di nt h i sc o bu p s t r e a ms e q u e n c eb y s e q u e n c i n g a n dh o m o l o g i cc o m p a r i s o n a f t e rc l o n i n gt h i ss e q u e n c ei n t o t h e p r o m o t e r - l e s sp l a s m i dp d n 19 1 a c f 2h a r b o r i n gar e p o r t e rg e n el a c za n dt r a n s f o r m i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i di n t oe c o l id h 5 ac e l l s ，e n h a n c e df l - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y w a sd e t e c t e d ，i n d i c a t i n gt h ep r o m o t e r - a c t i v i t yo ft h i ss e q u e n c e m o r e o v e r , g f p e x p r e s s i o nw a sa l s od e t e c t e di nt h es t r a i nt r a n s f o r m e dw i t hm i t o c h o n d r i a le x p r e s s i o n v e c t o rp s k - e g f pc o n t a i n i n gt h e 叻r e p o r t e rg e n e t h e r e f o r e ，i ti sn od o u b tt h a tt h e i i i a b s t r a c t p r o m o t e rr e g i o no nt h em i t o c h o n d r i a le x p r e s s i o nv e c t o ri sa v a i l a b l et ob ea p p l i e di n t h er e s e a r c ho nm i t o c h o n d r i a lt r a n s f o r m a t i o n f u r t h e r m o r e ，e l e c t r o p o r a t i o np a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e dt oi n t r o d u c et h ec h i m e r i c p l a s m i dp s k - e - g f pw i t h 咖a st h er e p o r t e rg e n ei n t oi s o l a t e dm i t o c h o n d r i a p c r a m p l i f i c a t i o nv e r i f i e dt h ep r e s e n c eo ft h i sp l a s m i di nt h ee l e t r o p o r a t e dm i t o c h o n d r i a t o t a lr n ao ft h em i t o c h o n d r i aw a se x t r a c t e di no r d e rt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no ft h e r e p o r t e rg e n e h o w e v e r , w ef a i l e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no ft h ef o r e i g ng e n ei nt h e s e t r a n s f o r m e dm i t o c h o n d r i a s i n c et h es t r u c t u r a la n df u n c t i o n a l i n t e g r i t y o f e l e c t r o p o r a t e dm i t o c h o n d r i ai su n k n o w n ，t o g e t h e rw i t ho t h e ru n s t a b l ef a c t o r sl i k ei n v i t r oi n c u b a t i o nt i m ew h i c hm i g h ti n f l u e n c em i t o c h o n d r i a lt r a n s c r i p t i o n ，f u r t h e r r e s e a r c hi sn e e d e dt oi d e n t i f yt h ee x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n ei nt h et r a n s f o r m e d m i t o c h o n d r i a i v 符号说明 符号说明 i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：昔毫 砌7 年j 月。多日 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的e l l , 昂u 本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 世乒 噶为 尸年，月彤日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： r 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) ；秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) ； i j 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) o 一一，。，。，? ，。，。，一。，一，。? 。，j t 第一章引言 第一章引言 线粒体( m i t o c h o n d r i a ) 是真核生物细胞中广泛存在的重要细胞器之一，它 不但是真核细胞进行呼吸氧化产生a t p 的主要场所，而且还执行着三羧酸循环、 电子传递、氧化磷酸化及脂肪酸的生物合成等职能。自1 9 6 3 年m n a s s 及s n a s s 发现线粒体d n a 以来【1 】，对线粒体的结构、功能等多方面进行的大量研究表明， 线粒体在能量代谢、细胞质遗传、线粒体基因表达调控、线粒体与细胞核的相 互作用、信号转导以及细胞凋亡等生命活动中具有重要作用。 线粒体是半自主性细胞器，含有自己的基因组d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ， m t d n a ) ，因此可以通过构建适当的线粒体表达载体，大量生产外源蛋白。尽管 核基因转化技术已经很成熟，但到目前为止，线粒体的遗传转化始终没有形成 一套常规的体系和方法。因此，这一新领域的相关研究不仅在理论上极大地丰 富了有关线粒体的研究，并且为细胞器转化、构建新型的生物反应器( b i o r e a c t o r ) 以及线粒体相关疾病的基因治疗奠定了坚实的基础。 第一节线粒体基因组的特点 1 1 1线粒体主基因组 线粒体是半自主性细胞器，含有自己的基因组d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ， m t d n a ) ，可以编码细胞器的一些蛋白质。除少数低等真核生物( 如衣藻和四膜 虫) 的线粒体基因组为线性双链分子外【2 3 】，大多数线粒体基因组为双链超螺旋 闭合环状分子。每个细胞中存在着多个线粒体，并且一个线粒体里也有多份基 因组拷贝，因此不同物种的线粒体基因组大小相差悬殊。哺乳动物的线粒体基 因组较小，约为1 6 6k b ；酵母的线粒体基因组约为8 4k b ；植物的线粒体基因组 最大。在已知的高等植物中，白芥( b r a s s i c ah i r t a ) 的线粒体基因组最小，约为 2 1 8k b ；甜瓜( c u c u m i sm e l o ) 的线粒体基因组最大，约为2 3 0 0k b l 4 。 线粒体d n a 含有大量信息，如r r n a s ，t r n a s 和蛋白质。细胞色素b 、细 胞色素氧化酶及a t p 酶等亚基的m r n a 是在线粒体中合成并保留在其中，由线 第一章引言 粒体所含有的核糖体进行翻译，合成蛋白质。在线粒体的核糖体中有两类r r n a 分子，它们也是由m t d n a 编码。线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成 蛋白质，但这并不意味着线粒体基因组的遗传完全不受核基因的控制，线粒体 自身结构和生命活动都需要核基因的参与并受其控制。这说明真核细胞内尽管 存在两个遗传系统，各自合成一部分蛋白质和基因产物，形成细胞核和细胞质 之间的遗传相互作用，但是核基因在生物体的遗传控制中仍然起主宰作用。 哺乳动物线粒体基因组d n a 没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基 因的组成，并非每个基因都有自己的启动子，因此具有明显的原核生物性质。 植物细胞的线粒体基因组大部分由非编码的d n a 序列组成，且有许多短的同源 序列。这些同源序列之间的d n a 重组会产生较小的亚基因组环状d n a ，与完 整的主基因组共存于细胞内【5 。因此，对植物线粒体基因组的研究更为困难。 由于真核生物雄配子的细胞质极少，子代的m t d n a 基本上都是来自雌配子 细胞，因此一般认为，m t d n a 是母性遗传( m a t e r n a li n h e r i t a n c e ) 的。但是，近 年来p c r 及杂交实验结果证实，一些动物( 如小鼠) 及高等植物( 如黄瓜) 的 精子也会对受精卵提供一些m t d n a ，这是造成线粒体d n a 异质性 ( h e t e r o p l a s m y ) 的原因之一，而这种异质性对于种系发生的分析研究同样造成 了一定的困难【l l l2 1 。 1 1 2 线粒体类质粒 1 9 7 7 年p r i n g 等人在研究玉米细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i c g e n i cm a l e s t e r i l i t y ，c m s ) 与线粒体基因组的关系时，意外地在玉米s 组细胞质雄性不育 植株的线粒体中发现两种线性d n a 分子【_ 7 1 。这些较小的核酸分子能够独立于线 粒体主基因组以外进行自主复制，并且对于其宿主细胞没有毒害作用。由于其 以上几个特性与原核生物的质粒非常相似，因此这种小的核酸分子又被称为线 粒体类质粒或线粒体质粒。在此后的3 0 多年时间里，许多学者也相继在甜菜、 高梁、蚕豆、油菜、水稻、向日葵等多种高等植物中发现线粒体类质粒【5 卅0 1 。截 止到目前，已有禾本科、棕榈科、豆科、藜科、十字花科、菊科及葫芦科共7 个科的高等植物的线粒体中存在类质粒，同时在一些真菌线粒体中也有类质粒 的发现。 本实验室在2 0 0 2 年首次报道了“津研四号 黄瓜线粒体中三种环状类质粒 2 第一章引言 的存在，并依据其分子量大小分别命名为，p c l 、p c 2 和p c 3 ，其中p c 3 是迄今 为止所报道的真核生物线粒体环形类质粒中最小的，长度为5 5 1b p 。s o u t h e r n 杂 交结果显示p c 3 与线粒体基因组、叶绿体基因组和细胞核基因组均有杂交信号。 尽管p c 3 是否具有编码功能以及其编码产物为何尚属未知，但是由于它能够在 线粒体中自主复制，并且与基因组存在着一定的同源序列，那么以p c 3 为复制 子的质粒很可能同样能够通过自主复制，独立存在于植物细胞或线粒体中，或 者通过同源重组整合到线粒体、叶绿体或核基因组中去。因此，线粒体类质粒 作为细胞器遗传转化潜在的载体，无疑为这一领域的研究开辟了一条新的道路。 第二节线粒体基因的遗传转化及表达 1 2 1 线粒体遗传转化的研究意义 线粒体是真核细胞内特殊的细胞器，它不仅为各种生命活动提供能量，并 且还参与细胞凋亡、维持细胞内钙、铁离子稳定以及细胞其他生命活动的信号 转导。如果m t d n a 发生碱基替换或片段缺失等突变，那么线粒体氧化磷酸化能 力就会下降。当线粒体提供的能量低于细胞行使正常生理功能所需的最低能量 时，就会累及脑、视神经、心脏、骨骼肌、肾脏和内分泌系统等多种器官和组 织，引起多种人类疾病。自从1 9 8 8 年w a l l a c e 等首次提出l e b e r 氏遗传性视神 经病( l e b e r sh e r e d i t a r yo p t i cn e u r o p a t h y ，l h o n ) 是由m t d n a 错义突变引起 的，现在已有上百种疾病被证实或怀疑是与m t d n a 突变相关的【1 3 】。 目前线粒体疾病的治疗尚缺乏有效的措施，因此医学界正在积极地探索被 普遍认为极具潜力的基因治疗的可能性【1 4 1 。早在1 9 9 5 年c h r z a n o w s k a 就提出了 线粒体疾病基因治疗的三种途径【1 5 】：第一种途径是将线粒体缺陷基因的正常拷 贝用适当的载体导入细胞核内，使之转录并在细胞质中翻译成正常的线粒体蛋 白，然后表达产物通过信号肽序列靶向导入线粒体中，进行线粒体外基因代偿 性表达。第二种途径是借助转染或阳离子脂质体与细胞融合的过程，将与线粒 体信号肽序列共价连接的突变部位的正常基因拷贝转入线粒体中，经过特异性 重组或表达正常的蛋白质从而达到表型补救。第三种途径是向线粒体中导入反 义核酸，使其能够在线粒体d n a 复制的单链形成期特异性阻断突变基因复制而 使野生型线粒体基因保持较高的复制优势，从而使其生物功能得以恢复。正是 3 第一章引言 由于线粒体的特殊性及其在人体细胞中的重要作用使得它一直成为人们关注的 焦点。 植物在有性繁殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的遗传现象称 为雄性不育( m a l es t e r i l i t y ) 。细胞质雄性不育( c m s ) 在开花植物中广泛存在， c m s 品系的培育是高等植物传统杂交育种的关键环节，在农业生产中占有举足 轻重的地位。近期的研究显示c m s 与m t d n a 和核基因组相互作用有关，m t d n a 的重排或基因变异都可导致c m s 发生，某些核基因产物如m s h l 、r f l a 和r f l b 等通过影响m t d n a 结构或阻止m t d n a 中c m s 相关基因的表达而使其恢复育 性【l6 1 7 】。因此，可以针对c m s 相关基因进行m t d n a 遗传操作和转化，在分子 水平上大量培育杂交育种所需要的细胞质雄性不育系、保持系和恢复系，从根 本上改变目前建立不育系中繁琐地使用回交育种程序。 一直以来，外源基因向细胞核中转化是植物基因工程的主要研究方向。然 而随着研究的不断深入，人们逐渐认识到细胞核基因组的遗传转化有其难以克 服的弊端。例如：由于细胞核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整 合的拷贝数难以人为控制，从而造成外源基因表达效率低，在后代中表达不稳 定，以及容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象。近年来，随着植物 转基因技术的发展，很多物种已经广泛地进行了田间试验，有些已被批准商业 化应用，随之而来的安全性问题也引起了全球的普遍关注。国外许多学者也曾 对此进行过专门研究，结果发现在靠近转基因植物甚至是相距很远区域内的非 转基因植物中能够检测到转基因的扩散，即发生了由花粉介导的转基因向野生 近缘种逃逸 18 1 。此外，l o s e y 等人还发现转基因抗虫玉米的花粉对王蝶幼虫( 鳞 翅目斑蝶科) 可产生毒害【l9 1 ，这更加重了人们对转基因植物的担忧。为了克服 外源基因导入细胞核所带来的这些弊端，学术界相继开展了细胞器遗传转化的 研究。细胞器转化与核基因转化相比有可定点整合、不存在基因沉默及外源蛋 白产量高等优点，是未来极具潜力和优势的生物反应器。因此，开发植物线粒 体表达载体，进行线粒体基因工程的探索，有着重要的理论价值和广阔的应用 前景。 1 2 2 线粒体遗传转化的研究方法和进展 线粒体的双层膜结构一直是其遗传转化的物理性障碍，因此线粒体基因表 4 第一章引言 达研究的主要困难就是如何将外源基因导入线粒体中。目前线粒体遗传转化所 采用的最为简便、有效的方法就是使用基因枪粒子轰击法。1 9 8 8 年，f o x 等人 将带有o x i i 基因的质粒经c a c l 2 和亚精胺等溶液处理后吸附于钨粒表面后，对涂 布于含山梨醇的基本培养基金属盘中的酵母r h o 。突变株细胞进行粒子轰击，得到 了转化子【2 们。2 0 0 6 年，r e m a c l e 等人优化了基因枪转化衣藻线粒体的条件，并 检测出不同形态质粒以及p c r 片段的转化效率。其中p c r 片段和线性质粒的转 化率分别为环形质粒的3 倍和5 倍【2 。然而到目前为止，基因枪粒子轰击法的 使用仅限于酵母、衣藻以及与其相近的单细胞物种的线粒体转化。 2 0 世纪7 0 年代信号肽概念的提出及其发现，使人们了解到真核生物细胞质 合成的蛋白质是通过其n 端的信号肽序列准确地运输到细胞核和各种细胞器中 的，并由此为线粒体遗传转化的研究提供了一种新的方法，即将线形d n a 或 r n a 片段连接到线粒体信号肽上，从而引入离体线粒体。1 9 8 9 年，v e s t w e b e rd 和s c h a 亿g 将2 4 b p 的双链d n a 分子5 端共价连接到线粒体信号肽的c 端， 成功地将外源d n a 分子导入离体酵母线粒体中1 2 引。在该研究基础上，1 9 9 5 年 p e t e rs e i b e l 等人合成了一段3 9 n t 的片段，其中含有部分回文结构，能够形成1 7 b p 双链。5 端剩余4 个碱基用以与外源d n a 片段相连，另1 个碱基经过氨基 修饰后，在生物交联剂的作用下可以与小鼠鸟苷酸氨甲酰基转移酶( 线粒体定 位蛋白) 的信号肽共价连接，利用线粒体蛋白运输机制将d n a 片段转运n d , 鼠 肝细胞的离体线粒体中【2 引。该方法不仅解决了目前研究中缺少定位于线粒体内 的可用载体的问题，并且为外源基因、反义r n a 或反义d n a 分子向各种细胞 器的运输开辟了道路。此后，在2 0 0 1 年g e r o m e lv 等人进一步发展了线粒体信 号肽介导的转化技术，他们将共价连接于线粒体信号肽上的寡核苷酸以阳离子 脂质体包裹。由于脂质体带正电，能够与表面呈负电的细胞膜进行融合，从而 将外源片段导入人类成纤维细胞。进入胞质后脂质体被降解，外源片段则可以 在信号肽的引导下进入线粒体 2 4 1 。这项技术省去了复杂的线粒体分离过程，能 够直接将d n a 导入细胞并最终进入线粒体，最大程度地保证了线粒体的活性， 从而为线粒体疾病的基因治疗提供了宝贵的方法。 利用线粒体信号肽介导的转化通常只能转移小片段的d n a 分子，而要将构 建的质粒及大片段的d n a 分子转入线粒体中，常采用类似于细菌电转化的方法 来进行离体线粒体的转化。1 9 9 7 年，j e a n m a r ec o l l o m h e t 将7 2k b 的质粒转入 小鼠肝细胞的离体线粒体中，并进行了转化条件的摸索。实验结果表明，当电 5 第一章引言 压为1 4k v c m 时，进入线粒体内的质粒达到最大量，约为4 4n g ，并且大部分 质粒为开环状态；当电压低于或超过1 4k v c m 时，进入线粒体中的质粒逐渐减 少，且电压超过1 4k v c m 时大部分质粒为线性状态；整个过程中没有发现以超 螺旋形式存在的质粒。通过对线粒体酶活性、呼吸作用进行测定以及免疫电镜 下的观察，发现在电压小于1 2k v c m 时，转化后的线粒体与对照相比完整性为 8 3 ；当电压大于此值时起完整性开始下降。因此为保证转化后线粒体的完整性， 1 2k v c m 是电转化哺乳动物线粒体的最佳条件【2 5 1 。2 0 0 1 年f a r r 6 在植物线粒体 基因表达的研究过程中使用了同样的方法，将所构建的能够为线粒体所识别的 质粒导入小麦离体线粒体中，最终检测到外源基因的表达，确定了植物线粒体 基因瞬时表达的最适条件【2 6 1 。 尽管电转化是目前进行离体线粒体遗传转化的常用方法，但电击往往会对 线粒体造成不可修复的损伤，从而阻碍了线粒体向细胞内的回输。2 0 0 5 年y o o n 受到细菌接合过程的启发，提出并实验了一种新型的线粒体转化方法，即细菌 线粒体接合法。实验将该方法和信号肽介导转化法结合起来，首先构建带有小 鼠线粒体转录因子a 信号肽( 1 e a d e rs e q u e n c eo f m o u s em i t o c h o n d r i a lt r a n s c r i p t i o n f a c t o ra ，t f a m l ) 的质粒，将t 7 r n a p 基因连接在该信号肽序列下游后，磷酸 钙转染小鼠细胞并分离表达t 7 r n a p 的线粒体；然后将线粒体与含有接合质粒 转移原点序列( o r l t ) 、由t 7 启动子启动外源基因加的大肠杆菌进行孵育，利 用接合机制最终获得转入了咖的离体线粒体。由于接合过程相当温和，并且是 通过性菌毛来实现转化的，接合机制完全依赖于供体细胞，因此细菌一线粒体接 合法不仅可以将较大的d n a 片段转入线粒体而不破坏其完整性，并且扩大了可 作为d n a 受体的细胞范创2 7 】。 在细胞核与线粒体和叶绿体等细胞器之间遗传信息交流的相关研究中，人 们还发现了线粒体主动摄入外源d n a 的现象。2 0 0 3 年，m i l a n a 等人以来自玉 米的2 3k b 双链线性d n a 类质粒为载体克隆了脚基因，将重组质粒与离体的 马铃薯线粒体短暂培养后发现外源d n a 不仅能进入线粒体中，而且能够稳定存 在并转录g 力。基因，由此获得了植物线粒体通过渗透转运孔道复合物进行外源 d n a 主动转运的突破性成果 2 引。这些研究充分表明对高等植物的线粒体进行遗 传转化不仅可行，而且有着重要的价值。 1 2 3 线粒体基因表达中的r n a 编辑 6 第一章引言 线粒体基因表达是一个极其复杂的过程，包含着诸如转录、顺反式剪接、 r n a 编辑以及翻译等一系列步骤，其中r n a 编辑是目前研究的一个热点问题。 r n a 编辑一词是在1 9 8 6 年锥虫线粒体m r n a 中发现有插入或缺失尿嘧啶核苷 酸的现象后首次被采用的 2 9 1 。r n a 编辑位点在大部分m r n a 的编码区中都能够 发现，而很少出现在内含子及非编码区内。内含子的切除和外显子的拼接使基 因的表达增加了一个步骤，但这种加工仍然保持d n a 编码序列不发生改变，即 m r n a 全部信息都来自d n a 。而r n a 编辑就不同了，它是在m r n a 水平上改 变遗传信息的。成熟的m r n a 序列中有几种意想不到的变化，包括u 与c 的相 互转化、u 的插入或缺失、多个g 或c 的插入等 3 们。最典型的r n a 编辑的例 子是锥虫动质体( k i n e t o p l a s t i d ) 线粒体m r n a 的编辑，它涉及上百个u 的缺失 和插入【3 1 1 。 1 9 9 0 年，l s i m p s o m 等在研究锥虫线粒体m r n a 时发现了一类新的小分子 r n a ，这种r n a 可以和m r n a 分子被编辑的部分及相邻的序列发生非常规的 g u 互补配对，对m r n a 前体分子的编辑起了指导作用，故称为指导r n a ( g u i d e r n a ，g r n a ) 。在编辑时，g r n a 的5 端与编辑区域下游配对，形成锚定复合 物；然后以g r n a s 内部的序列作为模板进行转录物的校正，同时产生编辑的 m r n a 。反应完成后，g r n a 和m r n a 彼此分离，m r n a 可以进一步进行翻译 【3 l 】。许多基因转录产物必须经过编辑才能有效地起始翻译，或产生正确的开放 阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 。正是r n a 编辑实现了真核生物线粒体d n a 编码信息与功能性细胞器蛋白质合成的衔接。 目前研究植物线粒体r n a 编辑的主要手段是将构建的线粒体质粒转入离体 线粒体中，通过r t - p c r 扩增得到前体m r n a 及成熟m r n a 序列后进行测序比 对分析。f a 盯6 等人构建了一系列由c o x l i 启动子和c o b 终止子组成的质粒，将不 同的外源基因连接到启动子下游后转化小麦等植物的离体线粒体，以此找到了 发生r n a 编辑的位点，并在此基础上通过针对编辑位点附近序列进行定点突变 从而预测出编辑识别序列。研究结果表明，小麦线粒体c o x l i 基因有1 6 个位点 由c 发生脱氨基反应转变为u 【26 ，并且该编辑位点c 上游一1 位置多为t 或a 。 实验还指出编辑位点附近一1 6 - - 一+ 6 区域对于该位点的识别是至关重要的，其中 上游5 端序列对于c 7 7 位点的识别更为重要，而c 2 5 9 位点的编辑更易受到下 游3 端序列的影响【3 m 4 1 。而在双子叶植物( 如豌豆) 线粒体中，编辑位点c 上 游一1 5 - 一5 区域为核心识别序列，并且在一4 0 - - 一3 5 区域有一个增强子，可 7 第一章引言 以增强体外编辑的效率【3 5 1 。如果上述序列内的碱基发生突变，则会不同程度地 影响r n a 编辑。 r n a 编辑不但使编码基因组的遗传信息得到了扩增，同时对基因的表达产 物也有影响。目前对r n a 编辑的机制还不完全清楚，细胞内仍存在着大量未被 发现的编辑酶和辅助因子，r n a 编辑的调节和功能及其对生物体的影响等问题 都有待于更加深入的研究。 第三节线粒体遗传转化的筛选标记 线粒体遗传转化所面临的一个巨大问题是缺少适当的筛选标记，也正因为 如此，无法对离体转基因线粒体和含有线粒体转基因的细胞进行有效地筛选和 分离。因此，建立线粒体遗传转化体系的另一个重要方面就是要找到有效的筛 选标记。 1 3 1电子传递链中的细胞色素b 电子传递链是存在于线粒体内膜上的一系列电子传递体，如f m n ( f l a v i n m o n o n u c l e o t i d e ) 、c o q ( c o e n z y m eq ) 和各种细胞色素等。各电子传递体的氧化 还原反应从高能水平向低能水平顺序传递，在传递过程中释放的能量通过磷酸 化而被储存到a t p 中。细胞色素是一类含有血红素辅基的电子传递蛋白质的总 称。细胞色素在细胞呼吸中的重要作用是1 9 2 5 年d a v i dk e i l i n 最先发现的。他 根据吸收光谱的不同浆细胞色素分为a 、b 、c 三类。细胞色素几乎存在于所有的 生物体内，只有极少数的专性厌氧微生物没有这类蛋白。细胞色素还原酶又称 呼吸链复合体i i i ( 图1 1 ) ，它是由2 f e 2 s 铁硫蛋白、细胞色素b ( 图1 2 ) 和 细胞色素c l 组成的州。 8 第一章引言 图1 1 细胞色素还原酶的部分结构模式 细胞色素还原酶有两种细胞色素b 类型的血红素，两者的最大吸收光谱不 同，分别被命名为b h 和b l 。b 类型细胞色素的血红素是铁原卟啉( p t o t o p o r p h y r i n i x ) ，其结构如图1 2 。细胞色素还原酶血红素辅基的铁原子，在电子传递中发 生可逆的2 价p 和3 价f e 3 + 的价态变化。在电子传递链中细胞色素还原酶的 作用是催化电子从还原型辅酶q ( u b i q u i n 0 1 q h 2 ) 转移到细胞色素c ( c y t o d 嘧o m e c ) 。 幽12 细胞色素b 的结构图13b 型血红煮铁一原卟啉的结构 9 第一章引言 32 电子传递抑制剂 抗霉素a ( a n f i m y 西na ) 和粘噻唑( m y x o t h i a z 0 1 ) 是真菌、动物及植物线 粒体中细胞色素通路中电子传递链的抑制剂1 3 7 ”1 这两种抑制剂可以直接或间 接地分别与细胞色素b 组分中的q 。和q 。电子传递位点发生作用从而阻碍电子传 递p 。o r t e g a 等人在研究烟草的原生质体和细胞悬浮培养物对抗霉素a 和粘噻 唑的敏感作用时发现，线粒体中对抗霉素a 和粘噻唑敏感的部位是位于呼吸链 复合体l i i 的细胞色素b 中一些高度保守的氪基酸。通过比较烟草、衣藻、酵母 以及小鼠的c o b 基因编码区，发现烟草c o b 蛋白第4 3 位的甘氪酸与酵母中该 蛋白第3 7 位以及小鼠中该蛋白第3 8 位的甘氨酸相对应，三者都是抗霉素a 的 敏感位点( 图1 4 ) ；而烟草c o b 蛋白第1 3 5 位的苯丙氨酸与表藻中该蛋白第1 2 9 位及酵母中该蛋白第1 2 9 位苯丙氨酸相对应，是粘噻唑的敏感位点( 图15 ) 。 将蛋白4 3 位上的甘氨酸残基用缬氨酸取代，或者将1 3 5 位上的苯丙氨酸用亮氨 酸取代以后，能够提高抗性，可以作为有效的筛选标记日”。 图14 抗霉素a 与细胞色素b 结合模式图图15 粘噻唑与细胞色素b 结合模式刚 蓝色部分为抗霉紊 ；黄色部分为细胞 色素b 第4 3 位甘氨酸残基 蓝色部分为粘噻唑；黄色部分为细胞 色素b 第1 3 5 位苯丙氨酸残基 然而，向烟草细胞悬浮培养物中添加抗霉素a 和粘噻唑并不能完全抑制细 胞生长。当抗霉素a 的浓度为1 0 0i l m 时，培养物的净生长量仅为对照组的 1 14 1 0 ，而提高抗霉素a 的浓度也不会进一步抑制细胞生长；在加入同样浓 第一章引言 度的粘噻唑条件下，净生长量仅为对照组的1 7 4 ；此外，将这两种物质共同 添加到悬浮培养物中也不会增强对细胞生长的抑制作用【3 8 1 。 这种不完全抑制是由多方面因素造成的，最合理的解释可能是由于呼吸的 细胞色素途径受阻从而诱导植物细胞培养物中交替氧化酶( a l t e r n a t i v eo x i d a s e ， a o x ) 的表达。尽管这一交替呼吸途径跳过了a t p 合成的几个偶联位点，却仍 然可以保证烟草细胞进行呼吸代谢和生长】。因此，o r t e g a 等人又对交替呼吸 途径的抑制剂进行了实验。结果发现，当a o x 的抑制剂水杨基氧肟酸 ( s a l i c y t h y d r o x a m i ca c i d ，s h a m ) 的浓度为1m m 时，并不抑制烟草细胞的生 长。然而将1m m 的s h a m 与1l x m 或1 0r t m 的抗霉素a 混合加入培养物中则 完全抑制细胞生长，培养后的细胞鲜重比对照组有所减少。经显微观察发现， 培养物中有许多细胞碎片。这可能是由于a o x 活性异常，造成烟草细胞中累积 大量活性氧化物从而诱导了程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 。因 此交替呼吸途径抑制剂s h a m 与细胞色素途径抑制剂抗霉素a 两者共同使用可 作为线粒体基因组转化子的筛选标记【3 引。 第四节本文的研究目的及意义 线粒体是真核生物中重要的细胞器，不仅是重要的能量代谢中心之一，还 与生物体的生长发育及衰老密切相关。线粒体遗传工程这一新的研究领域的发 展不仅使人们更加深刻地认识和了解这种细胞器的结构、功能、起源，其基因 表达特点及其与细胞核之间的相互作用，丰富了有关线粒体的理论研究，并且 为细胞器遗传转化、线粒体疾病的基因治疗以及构建高效表达目的产物的新型 生物反应器奠定了基础。 实现高等植物线粒体转化的关键要素是构建合适的载体。尽管原核生物质 粒已被大量开发和利用，但其复制通常具有严格的宿主要求。