代谢控制原理与方法.ppt

谷氨酸的生物合成途径,生产谷氨酸的主要菌株生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径,Glu发酵常用菌种谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)北京棒杆菌(C.peikingAS.1229)黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum),谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途径）戊糖磷酸途径（pentosephosphatepathway，HMP途径）三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle）乙醛酸循环(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）等,由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？,谷氨酸生物合成的理想途径,谷氨酸发酵的代谢途径,生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸,CO2固定酶系活力强,Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强,乙醛酸循环弱,异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱,谷氨酸脱氢酶能力强,控制谷氨酸合成的重要措施,乙醛酸循环的作用,谷氨酸发酵的代谢途径,乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环,第四节谷氨酸生物合成的调节机制,优先合成与反馈调节生物素的调节作用,优先合成谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制,一、优先合成与反馈调节,-酮戊二酸脱氢酶的调节在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱谷氨酸脱氢酶的调节谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸,Glc,丙酮酸,草酰乙酸,CO2,天门冬氨酸（Asp）,AC-coA,CO2,羧化酶,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,Glu,反馈抑制,谷氨酸,脱氢酶,-酮戊二酸,脱氢酶,合成酶,反馈阻遏,Glu产生菌主要生理生化特性需氧，生物素缺陷型bio-,有乙醛酸循环，羧化酶活性强（bio作为辅酶）柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，Glu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于Glu胞外分泌。,二、生物素对代谢的调控作用,生物素对CO2固定反应的影响生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以上），CO2固定反应可提高30%。,生物素对糖代谢速率的影响生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出生物素对乙醛酸循环的影响乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动。,生物素控制磷脂的合成使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中,控制生物素添加量使菌种生产Glu高浓度bio增强羧化酶活性，促进羧化反应利于Glu合成。低浓度bio降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向Glu合成，低浓度bio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于Glu胞外分泌，解除反馈调节，利于Glu合成并大量积累。添加亚适量，5-10g/L培养基，生产Glu,培养前期，bio充足，存在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累Glu，细胞形态正常。,8hr,Glu非积累型细胞,Glu积累型细胞,培养中后期，bio浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未溶解。,第五节Lys代谢控制发酵,生产菌种谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）黄色短杆菌(B.flavum)乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径及正常调控机制,Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、Ile，最后合成LysThr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏,3.Lys代谢控制发酵菌种的遗传改造(1)切断支路代谢Hse营养缺陷型(Hse-)菌株筛选选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys(2)用Hse-菌株选育解除Lys反馈抑制突变株,Hse-,诱变,Hse-Lys反馈抑制,Hse-抗Lys反馈抑制,长出菌落(Hse-,AECr),基本培养基Hse(高浓度)AEC(Lys结构类似物),Hse-,AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同反馈抑制，大量积累Lys,(3)Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株日本椎尾等人黄色短杆菌突变株,亚硝基胍,Hse脱氢酶活性仅为野生型菌株的1/30Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长代谢流转向Lys大量合成Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，大量积累Lys，产量达25g/L,(4)Lys生产菌种遗传标记及Lys产量谷氨酸棒杆菌HseK.Nakyama13g/LHseAECR中山清（日本）42g/L黄色短杆菌HseAECRCSIFpsI.shiio51g/L(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)黄色短杆菌AIIIHse-AECr徐所维50-55g/L钝齿棒杆菌pI-3-2Hse-AECr陈琦50g/L,(5)乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌。特殊调控：代谢互锁调控机制互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径产物反馈调节Lys生产菌种遗传标记和产量：HseAECRLeu110g/L（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）HseAECRLeu-TARAla110g/L（加Hse、Leu，限量加Ala，-TA是Leu结构类似物）,Asp,Asp激酶,Asp-P,Asp-半醛,Hse,Met,Thr,Lys,Ile,DDP,协同反馈抑制,DDP还原酶,DDP合成酶,反馈抑制,Ala,Leu,反馈阻遏,第六节产氨基酸菌种的分离、检测原理与方法1、营养缺陷型补充营养检测法,影印接种,His产生菌,大量UV照射,细胞死亡,鉴定生长区,丰富细菌培养基平板分离,产氨基酸培养基,基本培养基E.coliHis混合上层培养基,鉴定菌：E.coli各种氨基酸营养缺陷型,2、可逆抑制测定法,-2-噻吩丙氨酸（抑制剂）L-苯丙氨酸（解除抑制剂）,培养基,枯草杆菌（指示菌）,生长,不生长,原理：指示菌在抑制剂存在条件下生长，证明存在解除抑制剂；指示菌不生长，证明不存在解除抑制剂。用氨基酸的结构类似物作指示菌生长抑制剂，通过指示菌是否生长而判断是否存在解除抑制剂氨基酸。,上层培养基有指示菌,影印接种,有抑制剂,L-丙氨酸产生菌,枯草杆菌生长区,丰富细菌培养基平板分离,产氨