（遗传学专业论文）人类新蛋白ntklbp1及其相互作用蛋白的生物学功能研究.pdf

复旦大学博士学位论文 人类新蛋白n t k l _ b p l 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 摘要 人类基因组计划的完成，宣告了“后基因组时代”的到来，对新蛋白的生物 学功能研究成为了当前的热点。h n t k l b p l 基因是本实验室从人胎盘c d n a 文库 中克隆得到的一个新基因。本论文对h n t k l b p l 蛋白及其相互作用蛋白h p i r h 2 的功能进行了初步研究。 通过r t p c r 实验，我们发现h n t k l b p l 基因在1 6 种成人组织中广泛表达， 在心脏、肝脏、胰腺、脾、胸腺、和前列腺中表达量较高。n o r t h e r n 杂交结果 显示h n t k l b p l 基因具有两种大小不同的剪接本。我们又从人胎肝c d n a 文库中 克隆得到了较小的剪接本h n t k l b p 2 ，并对两种剪接本所编码蛋白的结构和细胞 定位进行了比较。h n t k l b p l 和h n t k l b p 2 的c 端结构的差异和细胞定位的不同 预示了两者在细胞中行使不同的生物学功能。生物信息学分析发现，h n t k l b p l 与d y n a t i n 家族成员有一定相似性，尽管酵母系统的功能互补实验表明 h n t k l b p l 并不具有与酵母中d y n a t i n 家族成员n i p l 0 0 相同或相似的功能，但 我们发现h n t k l b p l 的过量表达对酵母细胞的生长有一定的抑制作用。并且，细 胞集落形成实验、细胞生长曲线检测和裸鼠荷瘤实验结果都显示h n t k l b p l 蛋白 的过量表达可以明显抑制肝癌细胞s m m c7 7 2 1 的生长和体内的成瘤。我们通过 f a c s 实验和a t l a ss y s t e m 实验进一步分析了h n t k l b p l 对细胞周期的影响，发 现h n t k l b p l 通过对细胞g 2 一m 期的影响抑制细胞生长，并且h n t k l b p l 的过量 表达引起三个与细胞增殖相关基因表达的下调。这暗示了h n t k l b p l 很可能是一 种细胞分裂周期的调节因子，参与了细胞周期不同时期转换的调控，它的表达异 常会直接影响细胞的增殖。本文对新蛋白h n t k l b p l 的发现和功能研究有可能为 肿瘤的基因治疗开辟新的途径，我们相信对h n t k l b p l 蛋白的深入研究将会有很 好的应用i j 景。 我们通过酵母双杂交实验得到两个能够与h n t k l b p l 发生相互作用的蛋白： h n t k l 和h p i r h 2 。h n t k l 的n 端含有一个激酶样结构域，因此，h n t k l 可能通过 与h n t k l b p l 的相互作用影响其磷酸化水平。h p i r h 2 被报道具有泛素连接酶活 性，能够与p 5 3 相结合，促进其泛素化，并能抑制p 5 3 的功能。我们通过体外结 合实验、免疫共沉淀实验和亚细胞免疫荧光共定位实验证实了h p i r h 2 与 h n t k l b p l 之间的特异性相互作用，并且通过体外实验发现h p i r h 2 能够催化 h n t k l b p l 的泛素化。因此，h n t k l b p l 很有可能是h p i r h 2 的一个新底物，细胞 通过h p i r h 2 对h n t k l b p l 的泛素化，来调节h n t k l b p l 在胞内的蛋白质水平。 复旦大学博士学位论文人类新蛋白n t i l _ b p i 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 h n t k l 和h p i r h 2 都与h n t k i 一b p l 的翻译后修饰有关。蛋白的翻译后修饰是细胞 调节的一种基本方式，对于蛋白翻译后修饰的研究是阐明蛋白质生物学功能的关 键环节。h n t k l 、h p i r h 2 与h n t k l b p l 相互作用的研究为了解h n t k l b p l 的生物 学功能提供了很好的线索。 在用酵母双杂交方法筛选能够与h n t k l b p l 相互作用的蛋白时，我们还得到 了h p i r h 2 的一种新剪接本。我们对h p i r h 2 及其新剪接本的生物学功能进行了初 步分析。基因表达谱分析显示，h p i r h 2 基因在心脏和骨骼肌中高表达，在脑、肺 和肾组织中低表达，并且存在大小不同的几种剪接本。目前我们克隆得到的两个 剪接本分别为1 6 k b 和1 3 k b ，暂时命名为h p i r h 2 a 和h p i r h 2 b 。两种剪接本所编 码的蛋白质h p i r h 2 a 和h p i r h 2 b 具有不同的c 端结构和不同的细胞定位；但都可 以同p 5 3 发生相互作用，不过h p i r h 2 b 并不具有泛素连接酶活性。这暗示两种剪 接本在细胞中具有不同的生物学功能。我们通过r t p c r 对1 0 对肝癌和癌旁组织 中的h p i r h 2 的表达进行检测，其中有7 对表现为h p i r h 2 在癌组织中的表达量高 于癌旁组织，而其中两个肝癌样品中高表达的剪接本为h p i r h 2 b ，其余样品中为 h p i r h 2 a 。这表明两种剪接本都有可能与癌症的发生有密切的关系，两种剪接本 都有可能通过与p 5 3 的结合抑制其功能，从而造成细胞增殖的异常。剪接本 厅用砌易在两例肝癌组织中的高表达与其在正常组织中的低表达形成了反差。这 一结果暗示了h p i r h 2 b 有可能是一种与癌症相关的特异性剪接形式。目前，尚没 有对h p i r h 2 剪接形式以及剪接的选择性的研究报道，h p i r h 2 b 是有关h p i r h 2 研 究的一个新发现，为h p i r h 2 的生物学研究提供了很好的线索。我们相信h p i r h 2 将成为临床治疗中的新靶向，对h p i r h 2 的深入研究将为癌症的诊治开辟一条新 的途径，本文的研究为此奠定了很好的基础。 关键词：h n t k l b p l ，可变剪接本，细胞增殖，酵母双杂交，n t k l ，h p i r h 2 ， 磷酸化，泛素化，肝癌，过表达，p 5 3 复旦大学博士学位论文 人类新蛋白n t k l b p i 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 a b s t r a c t f o l l o w e dt h eh u m a ng e n o m ep r o j e c t ，t h ep o s t - g e n o m i ce r ai s c o m i n g t h e f u n c t i o nr e s e a r c ho fn o v e lp r o t e i n sb e c o m e sah o ts p o t an o v e lh u m a ng e n e h n t k l b p lw a sc l o n e df r o mp l a c e n t ae d n al i b r a r yi no u rl a b o r a t o r y t h i ss t u d y w a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fh n t k l - b p la n dt h ep r o t e i ni n t e r a c t i n g w i t hh n t k l b p l t h r o u g hr t - p c r w ef o u n dh n t k l b pi i sw i d e l ye x p r e s s e d 、n1 6k i n d so f a d u l tt i s s u e s i nh e a r t ，l i v e r , p a n c r e a s ，s p l e e n ，t h y m u sa n dp r o s t a t e ，t h ee x p r e s s i o no f h n t k l - b p li sh i g h t h r o u g hn o r t h e r nb l o t ，t w ot r a n s c r i p t so fh n t k l - b p lw e r e o b s e r v e d w ec l o n e dt h es m a l lo n e ，h n t k l b p 2 ，f r o mf e t a ll i v e rc d n al i b r a r y w e c o m p a r e dt h es t r u c t u r ea n dt h es u b - c e l l u l a rl o c a t i o nb e t w e e nh n t k l - - b p la n d h n t k l b p 2 t h e yh a v ed i f f e r e n tct e r m i n u sa n dd i f f e r e n ts u b - c e l l u l a rl o c a t i o n ， w h i c hi n d i c a t e st h e yh a v ed i f f e r e n tf u n c t i o n h n t k l b p lh a ss o m eh o m o l o g yw i t h m e m b e r so fd y n a c t i n lf a m i l y , b u tt h ec o m p l e m e n tt e s ti ny e a s tf a i l e d h n t k l b p l c a l ln o tc o m p l e m e n tt h ef i m c t i o no fn i p l 0 0 ，w h i c hi sam e m b e ro fd y n a c t i n lf a m i l y i ny e a s t b u tt h ee x p r e s s i o no fh n t k l b p li n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o no fy e a s tc e l l s f u r t h e r m o r e ，t h ec o l o n yf o r m a t i o ne x p e r i m e n t ，t h er e s u l to fc e l lg r o w t hc u r v ea n di n v i v ot u m o r i g e n i c i t ya s s a ya l ls h o w e do v e r - e x p r e s s i o no fh n t k l - b p l s u p p r e s st h e g r o w t ho fl i v e rc a n c e rc e l ls m m c7 7 2 1a n dt h et u m o rf o r m a t i o n t of u r t h e ra d d r e s s t h em e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h ed e c r e a s e dc e i l p o p u l a t i o n a f t e rh n t k l b p l o v e r e x p r e s s i o n ，w ep e r f o r m e df a c ss c a n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x c e s s i v e a m o u n t so fh n t k l b p lp r o t e i n sc o u l dd e c r e a s ec e l lp r o l i f e r a t i o nb yi n t e r f e r i n gt h e g 2 mp r o g r e s s i o n t h r o u g ht h ea t l a ss y s t e ma s s a y ，3g e n e s ，w h i c hc a np r o m o t et h e c e l lp r o l i f e r a t i o n ，w e r ef o u n dd o w n r e g u l a t e da f t e rt h eo v e r e x p r e s s i o no f h n t k l b p l o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a th n t k l b p lp r o t e i nm i g h tm o d u l a t ec e l lc y c l ep r o g r e s s i o na s ac e l l c y c l er e g u l a t i o nf a c t o ra n di t sa b n o r m a le x p r e s s i o nw i l l a f f e c tt h ec e l l p r o l i f e r a t i o n o u rr e s e a r c ha b o u tl f l q t k l b p 1 m a yr e p r e s e n tan e wa p p r o a c hf o r a n t i c a n c e rt h e r a p y f u r t h e rr e s e a r c ho f h n t k l - b p li sp r o m i s i n g t h r o u g ht h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ，w e o b t a i n e dt w op r o t e i n sa st h e h n t k l b p li n t e r a c t i n gp r o t e i n ：h n t k la n dh p i r h 2 h n t k lh a sak i n a s e l i k e d o m a i ni nt h en t e r m i n u s t h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nw i t hh n t k l b p l ，h n t k lm a y a f f e c tt h ep h o s p h o r y l a t i o no fh n t k l - b p l w i t ht h ei n t a c tr i n gf i n g e rd o m a i n ， 3 复旦大学博士学位论文 人类新蛋白n t k l b p l 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 h p i r h 2c a l lf i m c t i o na sa nu b i q u i f i n p r o t e i nl i g a s e i tc a ni n t e r a c tw i t hp 5 3a n d f a c i l i t a t et h eu b i q u i t i n a t i o no fp 5 3 t h es p e c i f i ci n t e r a c t i o no fh n t k l - b p lm a d h p i r h 2w a sc o n f i r m e db yp u l l - d o w na s s a yi nv i t r oa n dc o i n a r n u n o p r e c i ；，i t a t i o ni nv i v o m o r e o v e ga ni m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n ga s s a ys h o w e dt h a th n t k l - b p lc o l o c a l i z e s w i t hh p i r h 2i ns m m c7 7 2 1c e l l s nv i t r ou b i q u i t i n l i g a s e a c t i v i t ya s s a ys h o w e d h p i r h 2c o u l dp r o m o t et h eu b i q u i t i n a t i o no fh n t k l b p l ，s oh n t k l - b p lm a yb ea n e ws u b s t r a t eo f h p i r h 2 i nc e i l s ，t h eq u a n t i t yl e v e lo f h p i r h 2m a yb er e g u l a t e db yt h e u b i q u i t i n a t i o n b o t hh n t k la n dh p i r h 2a l ea s s o c i a t e dw i t ht h ep o s t - t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o no fh n t k l b p l t h er e s e a r c ho fp o s t t r a n s l a t i o nm o d i f i c a t i o no f p r o t e i n si sv e r yi m p o r t a n tt ot h ee x p l o r a t i o no fp r o t e i nf u n c t i o n s ot h er e s e a r c ho f i n t e r a c t i o n sb e t w e e nh n t k l b p lw i t hh p i r h 2o rh n t k lm a ys h e ds o m el i g h to nt h e f u t u r es t u d yo f h n t k l b p l i nt h ey e a s tt w o - h y b r i da s s a y , w ea l s oo b t a i n e dan e wt r a n s c r i p to fh p i r h 2 w e i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no ft h et w ot r a n s c r i p t so fh p i r h 2 t h en o r m a lt i s s u ee x p r e s s i o n p a t t e r no fh p i r h 2w a si n v e s t i g a t e d e x p r e s s i o nw a sh i g h e r i nh e a r ta n ds k e l e t a l m u s c l e s ，l o w e ri nl i v e ra n dp a n c r e a s s o m et r a n s c r i p t sw e r eo b s e r v e d t w ot r a n s c r i p t s w eo b t a i n e da r e1 6 k ba n d1 3 k b ，r e s p e c t i v e l yn a m e dh p i r h 2 aa n dh p i r h 2 b h p i r h 2 a a n dh p i r h 2 bh a v ed i f f e r e n tc t e r m i n u sa n dd i f f e r e n ts u b c e l l u l a r1 0 c a t i o n w ef o u n d h p i r h 2 bc a na l s oi n t e r a c tw i m p 5 3 b u tw i t h o u tu b i q u i t i n - p r o t i e nl i g a s ea c t i v i t y t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt w ot r a n s c r i p t sh a v ed i f f e r e n tf u n c t i o n b yr ，r p c r w ed i s c o v e r e d t h a t7o u to fl0p a i r so fl i v e rc a n c e r n o n - c a n c e r o u st i s s u e ss h o w e dh i g h e re x p r e s s i o n o th p i r h 2i nl i v e rc a n c e rt i s s u e st h a nn o n c a n c e r o u st i s s u e s f u r t h e r m o r e w ef o u n d h p i r h 2 bw a se x p r e s s e di nt w oc a n c e rt i s s u e sa sam a j o rt r a n s c r i p t t w ot r a n s c r i p t s m a yi n h i b i tp 5 3f u n c t i o nb y i n t e r a c t 、v i t hp 5 3a n dp l a yar o l ei nt u m o r i g e n e s i s t h e s e o b s e r v a t i o n ss u g g e s tt h a th p i r h 2e x p r e s s i o ni sa l t e r e di nh u m a nl i v e rc a n c e r h i g h e r e x p r e s s i o ni nl i v e rc a n c e rt i s s u ea n dl o w e re x p r e s s i o ni nn o r m a lt i s s u eo fh p 打h 2 b i n d i c a t et h a ti tm a yb eas p l i c i n gv a r i a n ta s s o c i a t e dw i t l lt u m o r t h i si st h ef i r s tr e p o r t o fa l t e r n a t i v es p l i c i n go fh p i r h 2a n dw i l lg i v ean e wc l u et ot h ef u n c t i o nr e s e a r c ho f h p i r h 2 m o r er e s e a r c hf o ra n a l y s i so ft h eh p i r h 2w i l ls h e dan e wl i g h to nt h ec a n c e r t h e r a p ya n dd r u gd i s c o v e r y o u rr e s e a r c hm a yl a y as o l i df o u n d a t i o nf o rf u t u r es t u d y k e y w o r d s ：h n t k l b p l ，a l t e r n a t i v es p l i c i n gv a r i a n t s ，c e l lp r o l i f e r a t i o n ， y e a s tt w o h y b r i d ，n t k l ，h p i r h 2 ，p h o s p h o r y l a t i o n ，u b i q u i t i l a i t o n 1 i v e rc a n c e r ， o v e r e x p r e s s i o n ，p 5 3 4 复巨大学博士学位论文人类新蛋白n t k l - b p l 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 1 前言 第一部分 h n t k l - b p l 蛋白的生物学功能初步研究 h n t k l - b p l ( n m _ 1 5 2 2 8 1 ) 是本实验室从人胎盘e d n a 文库中克隆得到的新基 因，因其小鼠同源基因z a v t k l - b p l ( x m1 2 9 5 8 4 ) 所编码的蛋白能与m n t k l ( n t e r m i n a lk i n a s e l i k ep r o t e i n ，n 端激酶结构样蛋白，b e 6 7 5 0 4 8 ) 发生相互 作用而得名( n t k l b i n d i n gp r o t e i n l ，n t k l 结合蛋白1 ) 1 。 2 0 0 0 年，l i us i m o nc h 等人首次克隆得n d , 鼠的m n t k l 基因，其编码一 个1 0 5 k d a 的蛋白，在小鼠的各种组织中广泛表达 2 。人的h n t k l 蛋白与小鼠的 具有约9 0 的高度同源性。2 0 0 2 年，k a t om a s a h i r o 等人克隆得到了人的h n t k l 基因 3 。h n t k l 基因定位于人的l l q l 3 染色体区域，跨越了两个微卫星标记 d 1 1 s 4 9 3 3 和d 1 1 s 5 4 6 之间约1 5 k b 的区间，在一些癌症研究中发现该区域存在染 色体易位断裂，因而h n t k l 基因被认为可能与癌症的发生有关e 4 ，5 ，6 。h n t k l 基因被发现具有三种可变剪接本，其中h n t k l 和h n t k lv a r i 在整个细胞周期中 都定位在细胞浆，而h n t k lv a r 2 则被发现在细胞有丝分裂的过程中定位于中心 体上 3 。三种剪接本定位的不同预示了其功能的差异性，h n t k lv a r 2 可能具有 有丝分裂相关性功能，例如参与纺锤体的形成和染色体的分离 3 。h n t k l 蛋白 自身可以形成聚合体，在细胞中以三聚体的形式存在。生物信息学分析表明，n t k l 的同源蛋白在人，果蝇，线虫，拟南芥等真核生物中广泛表达，这些蛋白的n 端都具有保守的蛋白激酶结构域。但是，同其它激酶结构域比较发现，该结构域 缺少一个蛋白激酶活性所不可缺少的亚结构域i ，其它的亚结构域中也存在一些 保守氨基酸的缺失。在k a t om a s a h i r o 等人的研究实验中发现，n t k l 不能自身 磷酸化，也不具有蛋白激酶活性。因此，研究者推测n t k l 的激酶样结构可能会 与需要磷酸化的蛋白结合，而竞争抑制这些蛋白的磷酸化 2 ，3 。在最近的一些 研究中发现，细胞中含有一些假激酶( p s e u d o k i n a s e ) ，这些蛋白含有类似于蛋 白激酶结构域的假激酶结构域( k i n a s e l i k ed o m a i n ，p s e d o k i n a s ed o m a i n ) 区 段，它们不具有蛋白激酶活性，功能尚不清楚 7 ，8 。有些假激酶结构域被发现 能够与典型激酶结构域相结合，如s t r a d 含有一个s t e 2 0 激酶样结构域，但缺少 一些保守氨基酸位点，它可以同蛋白激酶l k b l 形成复合物，激活l k b l 的活性， 导致两者的磷酸化 9 。苏氨酸激酶j a k 含有一个苏氨酸激酶结构域( j h l ) 和一 个假激酶结构域( j h 2 ) ，j h 2 则参与了j h l 激酶活性的调节，影响后者的激酶活 复旦大学博士学位论文人类新蛋白n t k lb p l 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 性l 1 0 3 。 在细胞中，由细胞周期因子( c y c l i n s ) 、细胞周期因子依赖性蛋白激酶 ( c d k s ) 、细胞周期因子依赖蛋白激酶抑制蛋白( c k i s ) 等组成的细胞周期调控 系统决定着细胞增殖周期中g 1 、s 、g 2 、m 期的转换，这些蛋白的异常便有可能导 致恶性增殖。其中c y c l i n s 与c d k s 结合后，c d k s 被激活，对细胞周期起正调节作 用，而c k i s 则能与c d k s 、c y c l i n s 或c d k s 与c y c l i n s 组成的复合物相结合，从 而抑制c d k s 的活性，研究表明c k i s 的异常与癌变有着密切的关系 1 1 。在细胞 有丝分裂过程中，一些c d k s 定位在着丝粒上，说明蛋白的磷酸化对调控这种转 移的过程非常重要 1 2 。一些与此相关的基因在人的恶性肿瘤中过表达，这说明 着丝粒上的蛋白激酶的异常调节和癌症的发生和肿瘤的发展有关 1 3 。n t k l 蛋 白可能是这类蛋白激酶的一种，作为激酶使得一些蛋白磷酸化，或是这类蛋白激 酶的抑制因子，竞争底物位点抑制激酶活性，通过调节一些分裂相关的蛋白的磷 酸化或去磷酸化在有丝分裂中起作用。所以寻找n t k l 的特异性相互作用蛋白将 有助于了解它在细胞内的功能。在本实验室的前期研究中，曾以m n t k l 为诱饵蛋 白进行酵母双杂交筛选，结果发现m n t k l 能够与一个新的小鼠蛋白发生相互作 用，因该蛋白的功能未知，故作为一个与m n t k l 作用的新蛋白命名为m n t k l b p l ， 后经体外和体内结合实验进一步证实了二者的相互作用是特异和稳定的，二者共 定位在细胞质中 1 。 a v v t k l - b p 7 基因编码一个具有3 8 6 个氨基酸的蛋白，其分子量约为4 0 k d a ， 具有2 个c o l l e d c o i l 结构域，一个双向核定位信号以及2 3 个预测的磷酸化位 点。在细胞定位研究中发现，m n t k l b p l 主要分布在细胞核周的胞浆中。人类的 同源基因h n t k l - b p 7 的o d n a 全长2 1 8 7 b p ，开放阅读框2 1 b p 一1 2 0 5 b p 编码3 9 4 个氨基酸，蛋白分子量约为4 5 k d a 。两种同源基因编码的蛋白同源度达到8 9 ， 此外，在其它物种中也存在同源度较高的蛋白，其中一些位点的氨基酸在生物进 化过程中比较保守( 图1 ) 。m n t k l - b p l 与d y n a c t i n 家族成员在氨基酸的组成和 结构上也有一定的相似性，如与小鼠的d y n a c t i n l 基因具有一定的同源性。尽管 相似度不是很高，但已经达到了d y n a c t i n 家族成员之间的相似程度的水平，所 以不能排除它可能是这个家族的新成员的可能性。d y n a c t i n ( 肌动蛋白) 家族成 员是微管结合蛋白( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n ，m a p ) 复合物的组分之 一，主要在细胞有丝分裂过程中，从胞核分裂到胞质分裂的过程中起到迁移细胞 骨架成分的作用。果蝇的d y n a c t i n 家族成员p 1 5 0 6 “蛋白定位在微管结构的( + ) 端 1 4 ，它的磷酸化影* j n 微管( + ) 端的定位特异性 1 5 。p l s o “和d y n e i n ( 动 力蛋白) 在有丝分裂的两个g 2 m 转换过程中，磷酸化水平会发生显著的变化，g 2 期出现过度磷酸化，持续至分裂结束，而在分裂问期保持低的磷酸化水平 1 6 。 复旦大学博士学位论文人类新蛋白n t k l b p l 及其相互作用蛋白的生物学功能研究 因此，m n t k l b p l 有可能在有丝分裂过程中起着重要作用。而m n t k l 是否通过与 m n t k l b p l 的相互作用而影响后者的磷酸化水平，并进而可能作为细胞分裂周期 的调节因子或检验点的蛋白，一旦功能发生改变或在细胞中过量表达将可能引起 细胞分裂过程的改变，影响细胞的增殖呢? 这些都有待于进一步深入的研究。 x p0 4 4 4 5 5 x 1 11 2 9 5 8 4 e a a d 2 9 3 5 e a a l 0 4 5 9 a e 0 0 3 5 2 43 2 z p0 0 0 8 l j 9 l x p0 4 4 4 5 5 x p1 2 9 5 8 4 e 缸0 2 9 3 5 e m l 0 4 5 9 a e 0 0 3 5 2 43 2 z i ，0 0 ( 1 8 1l9 i x p0 4 4 4 5 5 x p1 2 9 5 8 4 e a 0 2 9 3 5 e a a l 0 4 5 9 a e 0 0 3 5 2 43 2 z p0 0 0 8 1 1 9 l x p0 4 4 4 5 5 x p1 2 9 5 8 4 e 舡0 2 9 3 5 e a a l 0 4 5 9 i m 3 5 2 4 ：1 2 z p0 0 0 8 1 1 9 i x p0 4 4 4 5 5 x p1 2 9 5 8 4 e 0 2 9 3 5 e a a l 0 4 5 9 a e 0 0 3 5 2 43 2 z p0 0 0 8 1 1 9 i x p0 4 4 4 5 5 x p1 2 9 5 8 4 e a a 0 2 9 3 5 e a a l 0 4 5 9 a e 0 0 3 5 2 43 2 z l 0 0 0 8 1 t 9 j - f s e e e l r r l k q t k d p f e p q r r l p a k k s 嗽3 l q r e k a l v e q s q k i x i 叫9 g s t s l p e q f s e e e i 。r r l k q n k d f e iq r r i i w k k t r q q l q r e k a l l e q s q k l g l q d g s a s l l p e q f s d d d i f k i f r q l s 一一一s k e k a k e l s r i ) i i s r i i f e a p i ) g a v k f v p p i v l l i v d n g - f s d d d h ：k i t r c q s - - - - s k e k a k e l s r p h s r h p k a p i g a v k f v p p p t i v d n g i f r q a i ) q l r k q q c q q p q q p i q k p d v a i c k t k s g t a t p t e k p p t l l p a a e d d v 麒g s h l d r q a s p p d l ，t t s d i i + m p v v d g y a f c r e c k k t a q i ，n d v p f i f y t a t f t e a e d e k 川5 l 正a d r ： ： t i | s a p k q r v w o k p p f s s p t i 用h f t 【t s p v g d g q p o g i e s o p k e i 届【| e n s h d g i i n n v i j 。s a p k o n n s o k p k s p s i v l 唱p 1 1 _ f f i s s s g d g k f ) g v g s q i 吣f p g i e n s i i h g h k s a e v n l s t v s c v d s s i y p i p i q o a v a f k p l p 酬i n a p e d e s i l v l p n q p v k s r s f e f f v a s t m 扎s 。r v s c v d s s i y p q i i p 【( 1 q a v a f k p i p 州t n a p e d e s i 。v ij ) n q p v k s r s f e p t v s w i ) 1 s d s i ，i e a i j i t g n a 。f a r d k k l p a i y a d a e l q l s t i ) o s s l l k i s g g i 】s q r i s s r o d g s l l p l i l l k 【卅d e 删r i v r e l i a v p l t g 旺r s e k ( m q a e h i ，q i ( y g e a i f r k ie k r m a d i k i p p k f ) 眦1 ( l e k k k v e i , q e k s r w e v l e q r 【瑚i ；一 一e k n k r k k a 1 。a k aa r a p k p i y c k v e k k k 骓e l q e k s r w e v l e q i c i m e 一一一e k n k r k k a l l a q a i a l g t g 料n v v l t p f k 删s l k d f e 础峨一一e o n 阉k r d i l i i k a i e l g t ( 孙懈r w n e v l t i f k 删s i k d e e ( _ j q r k i m h _ _ e q n r q k r d l l i l k a l e s 1 日d i 葛p r e r i w b s p f k g 艘。k o f e q h r 心l e 一一一一一哪n 啪k k o m l y q a i e o a n r a l e h e i e e r k k a e l e l q q v n r 1 l e e r v m g 汀a i 。l a a 1 越l 岛e e v q r s 8 q a q n e i a ： ： e r s k r l 口 e i m k l k r l q k e i 。q a i o i ) v w s a i ) 1 g i k 一一一x r i i ) q a s i 。i i y e r s k k t o e t i k l k r i q k e l q l d d m v s g ，r - - 一一一n r d o a s l e y q l a q k t a a e a n k i 觚l r s e n 一一一p a g i r 一一一一a g 【( ； 。i l a q k t a a e 州k i 觚i k s e l t r l d s e l a s d v a i r 一一r o t d a a s i j i f q i l l k q k l m e s r k i e e i r i l e ，s k i ，e s d i , a v i ) v a i 【。r 一一一一一k q i d n a c l i i f i + l n d v i v r r t e s i e g i ，n r e i e a i 啦s a v 。l i ) i 舢h p l 。r s i i ( i y a gt v r e e c e n a v f ) g s v l 点y t ： 3 2 7 2 3 2 3 5 0 4 1 l ；2 黜 e a e a e e y i y i t a a a k k i l d d m i q r r k k t t 一- _ e - e i r k k e 鼬q 矫器 5 祷 跋e l e l r r k k a ( a k k l k l e e e e l l 川”8 i 7 9 ； s n v e k w l t i 列l r l k a i ( v e u i ( ) a l 一一e k k 咧l t e i l l c a i i s i i n e e r k a r r i 。s f , l m e 2 8 0 】n v e k q y v k i e a q f l r a k i e i h n a s 一一e k k e i ，i ，t e h l c t v i a h n e d r k a q k i t e 【沁3 1 8 i g r i e r s v n r v i n e l i e a l r d l s q a s s a a l h p d t v n l s t i v r e i