（遗传学专业论文）长穗偃麦草e组染色体特异pcr标记开发.pdf

张超：长穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 长穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 研究生：张超 导n - 陈建民教授 ( 扬州大学，江苏扬州，2 2 5 0 0 9 ) 于两要 植物基因组中存在着大量的重复序列，在小麦中约占基因组的7 5 。植物基因组在进化 过程中通过非同源重组、非等位交换等作用，使d n a 水平积累了不同类型的重复序列，形 成了组别或种间差异的特异性重复序列。分离这些重复序列不仅可以作为研究麦种进化中遗 传组分相互渗透的分子工具，而且还可以利用其丰富多样性发展新的分子标记，进行基因定 位、丰富遗传图谱等研究。长穗偃麦草( t h i n o p y r u me l o n g a t u m ) 是小麦重要的野生近缘植物之 一，具有很多优良性状，是对普通小麦进行遗传改良最有利用价值的野生物种之一。利用长 穗偃麦草与小麦杂交相继培育了小麦长穗偃麦草二体附加系和代换系，以便于长穗偃麦草的 优良性状基因的研究和转移。目前用于检测和跟踪长穗偃麦草遗传物质的标记数量十分有限。 本研究利用i s s r i 凡心i 也m a p 技术，筛选获得长穗偃麦草e 组染色体特异的d n a 片段， 然后将其序列转化成特异p c r 标记。该标记可以用来检n d , 麦背景中的长穗偃麦草染色质， 也可用于小麦长穗偃麦草易位系的检测，为小麦育种中外源染色质的快速便捷检测提供新途 径。主要结果如下： 1 长穗偃麦草e 组染色体特异片段的筛选与分析 利用i s s m ra p 爪e m a p 技术，合成1 1 条引物共3 5 个组合对普通小麦中国春、长穗偃 麦草和中国春长穗偃麦草二体附加系材料进行分析，共筛选出7 4 条分布于长穗偃麦草除2 e 外的其余6 条染色体的特异片段，其中1 e 、3 e 、4 e 、5 e 、6 e 、7 e 分别为7 、7 、1 5 、1 9 、9 、 1 7 条。三类引物组合在不同染色体上的特异性丰度有差别，比如2 e 染色体上未找到特异片 段。另外还发现不同引物组合所揭示的小麦背景中e 基因组特异性程度具有一定的差异，三 类引物组合中，i r a p 和i s s r 类引物组合扩增的特异片段较少，分别为8 和7 条，而r e m a p 类引物组合扩增的特异片段最多，为5 9 条。 2 特异片段的克隆、测序及分析 。 随机选取了1 条5 e 和5 条7 e 染色体特异的片段进行克隆和测序。测序结果经n c b i g e n b a n k 比对结果表明，5 e 染色体上1 条和7 e 染色体上2 条特异的片段去除载体部分后大 小分别为4 4 5 、7 5 7 和3 2 5 b p ，分别编号为z 2 4 4 5 、z 2 1 7 5 7 和z 1 2 3 2 5 。这三个序列除了都 含有1 0 0 b p 左右的大麦反转座子b a r e - 1l t rd n a 序列以外，与小麦基因组无同源序列。由 于扩增片段所用引物是依据l t r 序列设计，可扩增出1 0 0 b p 左右的l t r 序列，实际扩增与 扬州人学硕士学位论文 理论是相符合的，非同源部分序列则有可能是长穗偃麦草特异的单一序列，推测依据这样的 序列设计引物就可扩增出该特异片段，直接通过琼脂糖凝胶电泳观察，方便快捷，从而将其 转化为特异p c r 标记。 3 长穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记的发展 分别对z 2 - 4 4 5 、z 2 1 7 5 7 和z 1 2 3 2 5 三条片段设计三对引物，引物组合分别编号为5 e 1 、 p 4 和z c p l ，理论扩增片段大小分别为3 0 4 、3 2 9 和1 0 5 b p 。利用该三对引物分别对普通小麦 中国春、长穗偃麦草、中国春长穗偃麦草二体附加系和相应代换系进行了p c r 扩增，结果 显示扩增片段只出现在长穗偃麦草、中国春长穗偃麦草相对应的二体附加系及代换系，大小 与理论值相一致，表明位于5 e 染色体( z 2 - 4 4 5 ) p a 及7 e 染色体( z 2 1 7 5 7 、z 1 2 3 2 5 ) 上的3 个e 染色体特异的片段能够被转换为相对应染色体的特异p c r 标记。p 4 和z c p i 进一步扩增7 e s 和7 e l 的端体附加系，又能将z 2 1 7 5 7 和z 1 2 3 2 5 这两个标记进一步定位到7 e 染色体臂。 结果表明p 4 、z c p l 两对引物只在7 e l 端体附加系中扩增出条带，即7 e 染色体长臂特异的 p c r 标记。对于转化成功的长穗偃麦草5 e 和7 e 染色体特异p c r 标记，经多次验证重复性 好，扩增稳定，操作便捷，花费低，尤其适合无相关基因组序列信息的情况下需要发展分子 标记。可以利用其来鉴定小麦染色体工程育种中的易位系或渐渗系材料中二倍体长穗偃麦草 染色质部分，为基因定位克隆提供更多分子标记。 关键词：长穗偃麦草；附加系；代换系；简单重复序列问区；反转座子位点间扩增多态性； 反转座子微卫星间扩增多态性 张超：k 穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 d e v e l o p m e n t o fe c h r o m o s o m es p e c i f i cp c rm a r k e r sf o r t h i n o p y r u me l o n g a t u m p o s t g r a d u a t e ：c h a oz h a n g a d i v i s o r ：p r o f j i a n m i nc h e n ( y a n g z h o uu n v i e r s i t y , y a n g z h o uj i a n g s u ，2 2 5 0 0 9 ) a bs t r a c t r e p e a ts e q u e n c e sc o n s t i t u t em a j o rf r a c t i o no ft h eh i g h e rp l a n tg e n o m e s i tw a sr e p o r t e dt h a t 7 5 o fw h e a tg e n o m es e q u e n c ew a so c c u p i e db yt h e m u n h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，i l l e g i t i m a t e r e c o m b i n a t i o na n ds e l f - m u t a t i o n s ，a sg e n o m i ce v o l u t i o np o w e r , c a u s em a n yk i n d so fm u t a t i o n si n d n al e v e l ，w h i c hp r o v i d ea b u n d a n td i v e r s i t yi np l a n tg e n o m e sa n df o r mg e n o m e - s p e c i f i co r s p e c i e s - s p e c i f i cr e p e a ts e q u e n c e s s o m eo ft h e ma l en o to n l yu s e da su s e f u lm o l e c u l a rt o o lt od e t e c t g e n e t i ci n t r o g r e s s i o nb e t w e e ng e n o m e so rs p e c i e s ，b u ta l s ou s e f u lf o rd e v e l o p i n gm o l e c u l a rm a r k e r s t om a pg e n e sa n de n r i c hg e n e t i cl i n k a g em a p d i p l o i ds p e c i e so ft h i n o p y r u me l o n g a t u mi so n eo f t h ev a l u a b l er e l a t i v e sf o rw h e a tq u a l i t ya n dy i e l d i n gi m p r o v e m e n t f o rb e t t e ru t i l i z a t i o no f t h eg e n e s o rs u p e r i o rc h a r a c t e r sd e p o s i t e di nt h e l o n g a t u ms p e c i e s ，w h e a t t h e l o n g a t u md i s o m i ca d d i t i o n a l a n ds u b s t i t u t i o nl i n e sh a v eb e e no b t a i n e dt h r o u g hc r o s sb e t w e e nw h e a ta n dt h e l o n g a t u m h o w e v e r , t h em a r k e r sf o rd e t e c t i o na n dt r a c k i n go fa l i e ng e n e t i cm a t e r i a lo ft h e l o n g a t u mw e r ev e r yl i m i t e d a n dt h u si m p e d e du sb e t t e rt ou s et h i sp l a n tr e s o u r c e si nw h e a tb r e e d i n g i nt h i ss t u d y , s e v e n t yf o u r e c h r o m o s o m es p e c i f i cm o l e c u l a rm a r k e r sw e r ea c q u i r e da n dt h r e eo ft h e mw e r es u c c e s s f u l l y c o n v e r t e di n t ot h ec h r o m o s o m es p e c i f i cp c rm a r k e r s t h er e s u l t sp r e s e n tt h e r ew o u l dp r o v i d en e w w a y sf o rr a p i dd e t e c t i o no fa l i e ng e n e t i cm a t e r i a lt r a n s f e r r e dt h r o u g ht h e l o n g a t u mi n t oc o m m o n w h e a t t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 s c r e e n i n go fe - c h r o m o s o m es p e c i f i cf r a g m e n t so ft h e l o n g a t u m 1 1p r i m e r sc o m b i n e di n t o3 5p r i m e rc o m b i n a t i o n sw e r eu s e dt os c r e e nt r i t i c u ma e s t i v u mc v c h i n e s es p r i n g ，t h e l o n g a t u ma n dc s t h e l o n g a t u md i s o m i ca d d i t i o n a ll i n e sf o rd e v e l o p m e n to f e c h r o m o s o m es p e c i f i cm o l e c u l a rm a r k e r so ft h e l o n g a t u m i tw a ss h o w e dt h a t7 4f r a g m e n t s w h i c hw e r es p e c i f i cf o r1et 07 ee x c e p t2 ec h r o m o s o m ew e r eo b t a i n e d t h es p e c i f i cf r a g m e n t s d i s t r i b u t e di n1 e ，3 e ，4 e ，5 e ，6 ea n d7 ec h r o m o s o m e sw e r e7 ，7 ，1 5 ，1 9 ，9a n d l 7 ，r e s p e c t i v e l y a b u n d a n c eo fs p e c i f i c i t yi nd i f f e r e n tc h r o m o s o m e sw a sd i f f e r e n t ，s u c ha ss p e c i f i cf r a g m e n to f2 e c h r o m o s o m ew a sn o tf o u n d w ea l s of o u n dt h a ts p e c i f i c i t yo feg e n o m ei nt h ec o n t e x to fw h e a t r e v e a l e db yd i f f e r e n tp r i m e rc o m b i n a t i o n sh a dac e r t a i nd e g r e eo fd i f f e r e n c e i nt h r e et y p e so f p r i m e rc o m b i n a t i o n s ，i r a pa n di s s ra m p l i f i e ds p e c i f i cf r a g m e n t sf e w e r , w e r e8 a n d7 r e s p e c t i v e l y , a n dr e m a pa m p l i f i e ds p e c i f i cf r a g m e n t sm o s t ，w e r e5 9 扬州人学硕七学位论文 2 s e q u e n c i n ga n db l a s t i n go fs p e c i f i cf r a g m e n t s o n e5 ea n df i v e7 ec h r o m o s o m es p e c i f i cf r a g m e n t sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d a f t e r s e q u e n c ea l i g n m e n t e di nn c b ig e n b a n k ，i tw a s i n d i c t e dt h a to n es p e c i f i cf r a g m e n to f5 ea n dt w o s p e c i f i cf r a g m e n t so f7 ew h o s ev e c t o r sw e r er e m o v e dw e r e4 4 5 ，7 5 7a n d3 2 5 b p ，r e s p e c t i v e l y t h e y w e r es on u m b e r e dz 2 - 4 4 5 ，z 2 1 7 5 7a n dz 1 2 3 2 5 a p a r tf r o ma b o u t1 0 0 b po fb a r l e y r e t r o t r a n s p o s o nb a r e - 1l t rd n as e q u e n c e ，t h e s et h r e es e q u e n c e sh a dn os i m i l a rs e q u e n c e b e c a u s et h ep r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nl t rs e q u e n c e ，t h e yc o u l da m p l i f ya b o u t10 0 b po f l t rs e q u e n c ea c t u a l l y n o n - h o m o l o g o u ss e q u e n c e sw e r el i k e l yt ob ep a r t i a ls p e c i f i cs e q u e n c eo f t h e l o n g a t u m w es u r m i s e dt h a tt h ep r i m e r sd e s i g n e db a s e do ns u c hs e q u e n c e sc o u l da m p l i f yt h e s p e c i f i cf r a g m e n t , w h i c hc o u l db eo b s e r v e dt h r o u g ht h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd i r e c t l y , e a s i l y a n d q u i c k l y a n dt h u st h e yw e r ec o n v e r t e di n t os p e c i f i cp c r m a r k e r s 3 d e v e l o p m e n to f e - c h r o m o s o m es p e c i f i cp c r m a r k e r sf o rt h e l o n g a t u m w ed e s i g n e dt h r e ep a i r so f p r i m e r sa n dn u m b e r e d5 e - 1 、p 4 、z c p la c c o r d i n gt os e q u e n c e so f z 2 4 4 5 、z 2 1 7 5 7 、z 1 2 3 2 5 ，w h i c hc o u l da m p l i f yf r a g m e n t s3 0 4 、3 2 9a n d1 0 5 b p ，r e s p e c t i v e l y a f t e r s c r e e n i n gc s ，t h e l o n g a t u ma n dc s - t h e l o n g a t u md i s o m i ca d d i t i o n a la n ds u b s t i t u t i o n a ll i n e s ， 5 e - 1 、p 4a n dz c p 1s u c c e s s f u l l ya m p l i f i e dt h ea n t i c i p a t e df a g m e n t si nt h e l o n g a t u ma n dc s - t h e l o n g a t u md i s o m i ca d d i t i o n a la n ds u b s t i t u t i o n a ll i n e s a m o n gt h e m ，5 e 一1o n l ye x i s t e di n t h e l o n g a t u m ，c s5 ea d d i t i o n a la n ds u b s t i t u t i o n a ll i n e s ，w h i l ep 4a n dz c p 1o n l yp r e s e n t e di nt h e l o n g a t u m ，c s7 ea d d i t i o n a la n ds u b s t i t u t i o n a ll i n e s t h e nw eu s e dp 4a n dz c p 1t os c r e e n7 e sa n d 7 e ld i t e l e s o m i ca d d i t i o n a ll i n e s ，t h e yo n l ye x i s t e di n7 e ld i t e l e s o m i ca d d i t i o n a ll i n e t h e yw e r e t h o u g h tt ot h e l o n g a t u m7 e lc h r o m o s o m es p e c i f i cp c r m a r k e r s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tz 2 4 4 5 、 z 21 7 5 7a n dz12 - 3 2 5c o u l db ec o n v e n e di n t oc h r o m o s e m es p e c i f i cp c rm a r k e r s s u c c e s s f u l t r a n s f o r m a t i o n5 ea n d7 ec h r o m o s o m es p e c i f i cp c rm a r k e r sw e r er e p e a t a b l e ，s t a b l e ，e a s y , q u i c k a n dl o wc o s ta f t e rs e v e r a lt e s t s 1 1 1 e y + w e r ep a r t i c u l a r l ys u i t a b l ef o rd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a r m a r k e r sw h e nt h e r ew a sn or e l a t e dg e n o m i cs e q u e n c ei n f o r m a t i o n t h e yc o u l db eu s e df o r i d e n t i f y i n gt h et r a n s l o c a t i o nl i n e so rt h ea l i e ng e n e t i cm a t e r i a l so ft h e l o n g a t u m i nt h ei n t r o g r e s s i o n i nw h e a tc h r o m o s o m ee n g i n e e r i n g ，a sw e l la sp r o v i d i n gm o r em o l e c u l a rm a r k e r sf o rg e n ec l o n i n g k e yw o r d s ：t h i n o p y r u me l o n g a t u m ；a d d i t i o n a ll i n e s ；s u b s t i t u t i o n a ll i n e s ；i n t e r - s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ( i s s r ) ；i m e r r e t r o t r a n s p o s o na m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ( i r a p ) ；r e t r o t r a n s p o s o nm i c r o s a t e l l i t e a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ( r e m a p ) 张超：长穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 符号说明 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 4 8 _ _ 一 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除 文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的 研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 弘岛 签字日期： 矽d 7 年6 月厶日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部 门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国 学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名： 衣趣 导师签名： 签字日期： 沙p 7 年6 月1 0 日 婵醐。叩“脚 张超：艮穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 第一章文献综述弟一早义i 颚综迎 小麦是世界上种植面积最大、总产量最高的粮食作物。在我国，种植面积和产量仅次于 水稻，居粮食作物第二位( 庄巧生，1 9 9 0 ) 。2 0 世纪中期以来，世界小麦发展很快，单产和总产 不断提高。但由于在育种过程中频繁地使用某些亲本，使小麦品种的遗传组成趋向单一化， 遗传变异日益贫乏，对各种病虫害和干旱等不良环境的抵御能力下降。在小麦野生近缘植物 中蕴藏着极丰富的遗传变异，可以通过远缘杂交导入其中的优良遗传变异，拓宽小麦的遗传 基础，丰富遗传多样性，从而使小麦产量和品质不断提高。目前，通过导入小麦野生近缘种 中的优良基因进行小麦遗传改良已成为小麦育种的有效途径之一。 1 外源遗传物质向小麦的转移 小麦属于禾本科( g r a m i n e a e ) d 、麦族( t r i t i c e a e ) d x 麦属( t r i t i c u m ) 。小麦族包含大量的小麦野 生近缘属、种，在其中蕴藏着丰富的抗病、虫和耐盐碱等极为丰富的遗传变异。将控制这些 优良性状的基因导入普通小麦，改良其遗传组成，提高其对各种生物或非生物胁迫的抗、耐 性，是提高产量和改善品质的一条重要途径。 小麦有三级基因库，根据亲缘关系的远近，将与小麦具有相同染色体组的种，称为小麦 的初级或一级基因库；小麦的次级或二级基因库是与普通小麦至少有一个相同染色体组的物 种：将小麦族中其它与小麦染色体组具有部分同源关系的二倍体和多倍体种，称为小麦的三 级基因库( j i a n ge ta l ，1 9 9 4 ) 。一般而言，小麦第一和二级基因库中的物种，由于与小麦具有一 个或多个相同的染色体组，可与小麦直接杂交，通过染色体联会配对和交换，将携带目的基 因的染色体片段直接转移到普通小麦背景，而不需要其他特殊措施。而小麦三级基因库中的 物种与小麦亲缘关系较远，染色体配对及重组较难，转移其携带优良基因的染色体片段需采 用诱导产生易位的方法。 2 小麦背景中外源遗传物质的检测 将外源遗传物质导入小麦后，除了从外部性状的变化来判断外源遗传物质进入小麦外， 人们还希望早期了解外源遗传物质的进入多少、有利遗传物质的存在情况，因此非常有必要 对转移到受体小麦中的外源遗传物质( 目的基因或外源染色体片段) 进行跟踪鉴定，避免不良 性状的产生，从而在最大程度上避免远缘杂交和基因转化等基因转移方法的盲目性，提高育 种效率。目前，检测小麦外源遗传物质的方法主要有：形态学、细胞学、生物化学、原位杂 交和分子生物学方法等。 2 1 形态学 形态学检测是早期检测外源遗传物质的常用手段。主要利用植物的外部形态特征，如株 高、叶色及形状、穗型和育性的变化等( 李平路等，2 0 0 2 ) 。形态学标记具有简单、直观和易于 识别等优点，但数目少，多念性差，受环境影响较大，容易导致矛盾的实验结果而无法作出 准确判断，因而应该结合其他方法进一步鉴定。 扬州人学硕士学位论文 2 2 2 细胞学 细胞学方法是利用染色体形态、计数、配对和分带等方法来检测外源遗传物质。染色体 分带是检测易于显带且特征带纹清晰可辨的外源染色体( 片段) 的有效手段。随着分带技术的 不断改进和完善，用染色体c 带不仅可以区分普通小麦的全部2 1 对染色体( g i l le la t , 1 9 9 1 ) ， 而且还可区分小麦背景中的异源染色质。利用该技术现已成功地检测到小麦遗传背景中的中 间偃麦草( f r i e b ee ta l ，1 9 9 1 ；f r i e b ee la l ，1 9 9 3 ；f r i e b ee ta t , 1 9 9 6 ；f r i e b ee ta l , 1 9 9 6 ) 、簇毛麦( 齐 莉莉等，1 9 9 9 ；付体华等，2 0 0 2 ) 、山羊草属( g i l l ，1 9 8 7 ) 和赖草属( 孙文献等，1 9 9 7 ) 等物种的外源 遗传物质。但并非所有外源物种的染色质都能显示出易于区别的特征带纹，且带型会因小麦 基因型不同而呈现多态性。此外，染色体带型对分带方法、化学试剂、植物材料和实验条件 等反应敏感，对实验技术的要求比较高，往往重复性较差，而且分析样本的数量有限，所揭 示的外源遗传物质还是在染色体片段水平，因而在实际应用分析时具有一定的局限性。 2 3 生化标记 生化标记包括同工酶标记和非同工酶形式的蛋白质标记。随着生化技术的不断改进和完 善以及生化遗传的建立，可以将生化标记定位于特定的染色体( 臂) 上。生化标记分析已经广 泛应用于小麦遗传研究，结合形态标记已将大量生化标记定位于小麦及其近缘物种的染色体 上( p a y n ee la l ，1 9 8 6 ) 。利用不同物种或染色体组在蛋白质或同工酶位点的差异及多态性，可 以检测出不同异源染色体附加系及易位系。利用这些标记，还可以初步确定小麦与所附加外 源染色体的部分同源关系。目前，该技术已成功用于小麦遗传背景中的黑麦、大麦、山羊草 和中间偃麦草等外源染色质的检测。但是，同工酶和非同工酶都是基因的表达产物，非遗传 物质本身，它们的表现易受环境和发育状况的影响，这些因素决定了生化标记具有一定的局 限性。 2 4 原位杂交 原位杂交是传统的细胞学与现代分子生物学相结合的产物。其原理是标记的d n a 或 r n a 探针和细胞学制片上的染色体d n a 在变性和复性过程中进行杂交，通过特定检测系统， 将特定序列探针的杂交位点在染色体上显示出来，从而在细胞内对外源染色体( 片段) 或特定 序列的位置进行物理定位。19 6 9 年，j o h n 等建立了放射性原位杂交技术( j o h ne ta t , 19 6 9 ) ，但 由于放射性元素对人体有害、检测时间长、标记好的探针不能存放，使这一技术未能在植物 研究中得到广泛应用。1 9 8 2 年，l a n g e r - s a f e r 等提出了利用非放射性生物素标记探针进行染 色体原位杂交的方法( l a n g e r - s a f e re la t , 1 9 8 2 ) ，此技术于1 9 8 5 年被r a y b u m 和g i l l 率先用于 植物研究，成功地用于小麦黑麦易位系的鉴定( r a y b u me ta l ，1 9 8 5 ) 。随后，又发展了地高辛 标记探针的荧光原位杂交技术和荧光素直接标记的快速原位杂交方法。由于标记探针技术和 信号检测方法的不断改进，非放射性原位杂交技术检测的灵敏度和效率大为提高。目前在远 缘杂交中应用最多的是基因组d n a 为探针的原位杂交。该技术已先后用于黑麦、大麦、簇 毛麦和偃麦革等属外源染色体( 片段) 鉴定( c h e ne ta l ，2 0 0 3 ；h a r te ta t , 2 0 0 4 ) 。原位杂交分析样 张超：长穗偃麦草e 组染色体特异p c r 标记开发 本的数量有限，成本和技术要求高，从探针制备到最后结果显示的任何一个步骤出错都可能 导致失败，同时存在非特异性杂交，因而在实际应用中难以用于育种中间过程的选择分析。 2 5 分子标记 分子标记是以d n a 分子变异为基础的一种遗传标记。分子标记检测的是基因组d n a 水 平的差异，可直接反映外源遗传物质的存在，与上述遗传标记相比，具有以下特点：遗传多 态性高；无上位性，既不影响目标性状基因的表达，也不与不良性状连锁；直接以d n a 形 式表现，在植物各个组织、各发育时期均可检测，不受季节和环境条件限制，不存在表达与 否问题；大多数分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合和杂合基因型，可提供完整的遗传信 息。作为一种理想的遗传标记，分子标记最早用于人类遗传研究，并很快应用到作物遗传育 种研究。利用分子标记己在分子图谱构建、种质资源评价与鉴定、基因标记与定位和比较基 因组作图等方面取得了很大进展，在分子标记辅助育种和基因克隆领域有着广阔的应用前景。 2 5 1 基于p c r 技术的分子标记 p c r 技术是一种利用酶促反应对特定d n a 片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常 少量( 通常在纳克n g 级范围内) 的d n a 样品，在短时间内以样品d n a 为模板合成上亿个拷 贝。经过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出所扩增的特定d n a 区段。p c r 技术以 短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温的d n a 聚合酶( t a q 酶) 。典型的p c r 技术通常进 行2 5 , - - - - 5 0 个循环，每个循环包括三个步骤。第一步为d n a 变性，通常将温度升至9 4 ，使 模板d n a 变成单链；第二步为d n a 复性，依据引物序列的长度及其与样品d n a 中目标序 列的同源性程度等因素，将温度控制在2 5 - - - - 6 5 ，使引物与模板上的同源序列结合；第三步 为d n a 合成，所用温度应选择最适合d n a 聚合酶活性的温度，通常为7 2 。经过这样一 个循环，目标d n a 片段即被复制一次。随着循环数的增加，d n a 扩增产物呈指数增加。p c r 技术具有快捷、简易、灵敏等优点，在d n a 标记技术的发展上起到了巨大的作用。主要有 i s s r 、s s r 、s c a r 、s t s 、r g a p 等。现选择两种分子标记的原理和应用介绍如下： 2 5 1 1 简单重复序列间区( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 该技术是由z i e t l d e w i c z 等1 9 9 4 年提出的，它检测的是两个s s r 之间的一段短d n a 序 列上的多态性( z i e t k i e w i c ze ta l ，1 9 9 4 ) 。以一条在s s r 序列3 或5 端加锚1 - - - 3 个核苷酸的寡 聚核苷酸为引物，对位于反向排列的s s r 之间的d n a 序列进行p c r 扩增。由于s s r 序列 广泛分布于高等生物的基因组中，所以i s s r 具有很强的多态 生( m c g r e g o re ta t , 2 0 0 0 ) ，而且 i s s r 还具有引物设计不需要知道基因组d n a 序列，扩增结果稳定性好等优点。 近年来，i s s r 标记技术已应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定、遗传关系及遗 传多样性分析、基因定位、植物基因组作图研究等。k m a 等的研究表明，( a c ) n 双核苷酸 重复序列非常适合小麦的染色体作图，并成功地定位了一系列i s s r 标记( k o j i m a e l a l ，1 9 9 8 ) 。 t s u m u r a 等研究发现，基于( a g ) 。和( c t ) 。序列的i s s r 标记在柏树和松树中是最有用的 o s u m u r ae ta 1 19 9 6 ) 。 扬州人学硕士学位论文 4 2 5 1 2 简单重复序歹t ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) s s r 又称微卫星d n a ，它是一类由l 6 个碱基组成的基序( m o t i o 串联重复而成的d n a 序列，如( c a ) ( a t ) 扑( g g c ) 、( g a t a ) 。等重复，其中n 代表重复次数，一般为1 0 , - 一5 0 ， 它们广泛分布于基因组的不同位置。由于基本单元重复次数的不同，而形成s s r 座位的多态 性( 图1 1 ) 。每个s s r 座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对 特异引物来扩增s s r 序列。经过电泳分离，比较扩增带的迁移距离，就可知不同个体在某个 s s r 座位上的多态性。在植物基因组中一般每6 - 7 k b 就有一个s s r ( c a r d l ee ta l , 2 0 0 0 ) 。 _-_- 嚎巫噩砸函囚圆匦匦应厦匦匿乎一a p c r 分析示意图 a 、b 、c 分别代表不l 刊的基因型 f i g 1 1a m p l i f i c a t i o ns t r a t e g yf o rs s r a 、b 、cr e p r e s e n td i f f e r e n tg e n o t y p e sr e s p e c t i v e l y 目前s s r 标记已广泛应用于遗传连锁图谱和物理图谱的构建、核心种质构建、遗传多样 性分析、分子标记辅助选择( m a r k e ra s s i s t a n ts e l e c t i o n , m a s ) ( 郑威等，2 0 0 8 ) 。在远缘杂交后代 中已用于外源基因鉴定与标记，p e n g 等找到了与野生二粒小麦抗条锈基因y r h 5 2 连锁的s s r 标j , e ( p e n ge ta l ，19 9 9 ) 。 2 5 2 基于反转座子的分子标记 反转录转座子( 本文简称反转座子) 是散布于基因组中的中度重复序列。根据其结构特征， 反转座子又可分为带有长末端重复序歹l j ( 1 0 n gt e r m i n a lr e p e a t ，l t r ) 和非长末端重复序列 ( n o n 1 0 n g t e r m i n a lr e p e a t ，n o n l t r ) 的两个类型( 图1 2 ) 。l t r 反转座子两端各有一正向排列的重 复序列，l t r 间的内部序列由1 3 个开放阅读框( o r e ) 构成，分别编码转座所需的酶，根据它 们序列相似程度和基因编码产物排列次序又可分为t y l 一c o p i a 和t y 3 - g y p s y 两个亚族。非l t r 型 张超：睦穗候立草e 组染色体特异p c r 标记开发 的反转座子根据，l 件k 度和成分可分为长散布重复序列元件( 1 0 n gi n t e r s p e r s e dr e p e t i t i v e e l e m e n t s ，l i n e ) 和短散布重复序列元件( s h o r ti n t e r s p e r s e dr e p e t i t i v ed e m e n t s ，s i n e ) 。反转座子 导致的基因纽多样性主要有两个原因：( 1 ) 转座作用，由于反转庄子在基因纽中的复制与转鹰 造成基因组的多样性：位) 反转座子或其长末端重复序列之口】的同源重组。由于以卜特性，使 植物的反转座于很容易作为一种分子标记，应用于遗传变异的研究中。其中最常用的主要是 s s a p 、i r a p 、r e m a p 、r l ；i p 四种。 二# # 十 自t _ _ t + 匕二二：= = = = = = = 里西睡基= 丁二二! = + 二5 * i 孔 d 直爱= ：二二1 0 + 、l i 、! + o 口+ i i # fr e - 雠。帅t 。+ 二匦 ：i ：二互口奠匠r 】互卫西缸z i p + 。一。，互多 至j 二e 亡e 墨窭翌卫工互p + 7 ，oy ；。 m+ 田= 童工3 互丁匕菌【 + j f + t 翌+ 刚i2 植物转鹰子的类型和结构图 l t r ：k 末端重复；g a g ：种群专一性抗原；刚：酶基冈区域；p r ：蛋白酶，i n t ：整台酶； r t ：反转录酶：r n a s e h ：核糖核酸酶：黑色箭头：插入位点正向重复序列 f i g i2t h e t y p ea n ds t l l c l l l m o f # a m t r a n s l x ：曲m l t r ：l o n g t e r m i n a lr e p e a t , g a g ：g r o u p - s f e c i f i ca n t i g e n ；p o l ：p o l y p m t m n ；p r ：p r o t e a s e ；i n t ：i n t e r g r a s e ； r t ：n 孵r 辩t r a m e t i p t a s e ；r n a s e h ：