（遗传学专业论文）米尔比霉素肟化物scfv噬菌体抗体库的构建.pdf

中文摘要 米尔比霉素肟化物s e f v 噬菌体抗体库的构建 摘要 噬菌体抗体库技术是继单克隆抗体制备技术后具有换代地位的抗体制备技 术，在功能蛋白的表达、疾病诊断和治疗等领域得到了广泛研究，用在农兽药等 小分子抗体的制备上也获得了亲和力较高的抗体。因其筛选通量高、试验周期短、 效率高、特异性强及亲和选择范围广等特点在农药抗体制备和检测技术发展等方 面具有广泛的应用前景。本研究构建了小分子米尔比霉素肟化物噬菌体抗体库， 以期建立十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，为相关药物的检测和筛选奠 定基础。 1 人工抗原的合成及免疫：将设计合成的米尔比霉素肟化物半抗原( m i l o 5 琥珀酰半酯) 利用碳化二亚胺法与牛血清白蛋白( b s a ) 偶联形成人工抗原，免 疫b a l b e 小鼠，其抗血清效价最高可达1 ：2 5 6 0 0 ，建立的c i - e l i s a 检测范围抑 制率在2 0 7 0 。 2 抗体可变区基因的获得及目的基因的构建；取抗血清效价较高的小鼠脾 脏提取总r n a ，r t - p c r 分别扩增得到抗体重链可变区基因( v h ) 和轻链可变 区基因( v l ) ，大小分别为3 6 0 b p 和3 4 0 b p 左右；纯化回收的v h 与v l 基因在接 近等摩尔的浓度下，首先采用含有l i n k e r 接头片段的引物利用重叠延伸p c r 法 ( s o e - p c r ) ，将v h 与v l 基因片段拼接起来，再用带有限制性内切酶位点的引 物扩增出单链抗体( s c f v ) 基因片段，获得大小约7 5 0 b p 的目的片段。 3 s e f v 噬菌体抗体库的构建：s e f v 基因纯化后经s i l l 和n o t i 双酶切，与同 样经过双酶切的载体p c a n t a b s e 连接，化学法转化大肠杆菌t g i 感受态细胞， 提取质粒经p c r 初步鉴定，进一步测序证明有外源片段插入且与目的片段一致。 转化菌经辅助噬菌体m 1 3 k 0 7 超感染后，收集上清，得到库容量为 2 4 x 1 0 6 p f u m l 的噬菌体抗体库。为下一步抗体库筛选技术的建立和抗体的筛选 奠定了基础。 关键词：米尔比霉素肟化物；酶联免疫检测法；噬菌体抗体库；单链抗体 英文摘要 c o n s t r u c t i o no fs c f v p h a g e a n t i b o d yl i b r a r ya g a i n s tm i l b e m y c i uo x i m e a b s t r a c t p h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r yt c c h a o l o g y , w h i c hh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h e d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fd i s e a s e ，a n df u n c t i o n a lp r o t e i n e x p r e s s i o n ，w a sa h i g h - p e r f o r m a n c e ，t i m es a v i n g , a n de f f e c t i v et e c h n i q u ef o rp r o d u c i n gs p e c i f i c a n t i b o d i e s s e v e r a lh i 【g ha f f i n i t ya n t i b o d i e sa g a i n s tm i c r o - m o l e c u l a rs u b s t a n c e s ，s u c h a sp e s t i c i d e so rv e t e r i n a r i a n , h a v eb e e nr e p o r t e dt ob es u c c e s s f u l l yo b t a i n e db yp h a g e d i s p l a ya n t i b o d yt e c h n o l o g y , w h i c hg a v ei tab r i g h tp r o s p e c ti nt h ed e v e l o p m e n to f i m m u n o a s s a yf o rp e s t i c i d e i nt h i ss t u d y , ap h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r ya g a i n s t m i l b e m y c i no x i m ew a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ，t h eo b j e c t i v ew a st od e v e l o pa s p e c i f i cp h a g ed i s p l a yu t 玎a r y f o r s c r e e n i n ga n t i b o d i e sa g a i n s tc o m p o u n d sw i t h 1 6 - m e m b e r e dm a e r o e y c l i eb a e k b u n e 1 i m m u n o g e ns y n t h e s i z i n g a n da n i m a l i m m u n i z i n g t h e h a p t e n 5 0 一s a c e i n o y l m i l b e m y c i n o x i m ew e r eb o u n dt ob s ab yt h ec a r b o d i i m i d ea c t i v a t i o n 。 f o u rb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t hm i l o - b s a , a f t e rt h et i t e r so fa n t i s e n n n r e a c h e dl ：2 5 6 0 0 am i l o - o v a - b a s e dc i - e l i s aw a sc o n d u c t e dw i t ht h ea n t i s e r u m t h ei n h i b i t i o nc u r v es h o wr a n g ef o rd e t e c t i o nm i l b e m y c i no x i m ew a sb e t w e e n2 0 a n d 7 0 2 t h eo b t a i n e do fi m m u n o g l o b u l i nv a r i a b l eg e n e sa n ds p l i e i n g t h et o t a lr n a w a se x t r a c t e df r o ms p l e e nc e l l so fm o u s ew i t l lt h eh i g h e s ta n t i s e r u mt i t e r s u s i n gt h e r t - p c r , i m m u n o g l o b u l i nv a r i a b l eh e a v yc h a i nr e g i o ng e n e s h ) a n dv a r i a b l el i g h t c h a i nr e g i o ng e n e s ( v l ) ，w h i c hw e r ea b o u t3 6 0 b pa n d3 4 0 b pr e s p e c t i v e l y , a r ef i r s t a i i i p i i & d t h ea p p r o x i m a t e l ym o lv ha n dv lg e n e sw h i c hh a v eb e e np u r i f i e dw e r e j o i n t e dt o g e t h e rt h r o u g hs p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n ( s o e ) ，u s i n gt h ef x a g m e n t s c o n t a i np a r t so ft h el i n k e r t h es c f vg e n e s 、e r ea b o u t7 5 0 b pg e n e r a t e db yp c r , u s i n gt h ep r i m e r st h a tc o n t a i nt h es l i c es i t e so f r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e 英文摘要 3 t h ec o n s t r u c t i o no fs c f vp h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y a f t e rd i g e s t i n g w i t hs f i ia n dn o t i ，t h es c f vg e n ef r a g m e n t sh a v eb e e nl i g a t e di n t ot h ep h a g ev e c t o r p c a n t a b 5 e t h a th a v eb e e nd i g e s t e du s i n gt h es a m ee n z y m e sa n dw o r et r a n s f o r m e d i n t oc o m p e t e n te c o l it g lc e l l s p l a s m i de l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a tt h e r ew e l d i n s e r t i n gf r a g m e n t sa n dt h ea i m e df i a g m e n t sw f f f ea m p l i f i e du s i n gp c i lw i t hp r i m e r s r 1a n dr 2 t h et r a n s f o r m e db a c t e r i u mw e r ei n f e c t e dw i t hh e l p e rp h a g em 1 3 k 0 7 ， s e d i m e n t e dt h ec e l la n dc o l l e c t e dt h es u p e m a n t t h e nap h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y c o n t a i n i n g 2 4 1 0 p f u m lb a c t e r i o p h a g ep l a q u e h a sb e e n s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d t h er e s e a c ha r eh e l pf o re s t a b l i s h i n gn e w $ g - r e o nm e t h o d so f a n t i b o d yl i b r a r ya n d a n t i b o d yp a n n i n g k e y w o r d s ：m i l b e m y e i no x i m e ，e l l z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，p h a g e d i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y , s i n g l e - c h a i nv a r i a b l ef r a g m e n t s ( s e f v ) i 前言 前言 2 0 世纪8 0 年代随着分子生物学技术的进展，噬菌体抗体库技术逐步建立和 发展起来。通过d n a 的重组技术克隆全套抗体可变区基因，运用载体系统表达 有功能活性的抗体分子片段，从中筛选出特异性抗体的基因。是近年来建立和发 展的利用噬菌体表达外源基因的新技术，该技术使得建立各种文库以及体外筛选 任何目的分子成为可能，实现了基因型和表型的转换，提供了高效率筛选系统， 且利用该技术还可以简单预测生物靶分子的空间结构。 随着噬菌体抗体库技术及农兽药等小分子酶联免疫检测技术( e l i s a ) 的研 究进展，9 0 年代初，国内外许多学者利用噬菌体抗体库技术来获得具有较高亲 和力的针对免疫原性较弱的农兽药和生物毒素小分子的抗体，或从特异性较高的 抗体库中筛选具有相同结构的一类小分子抗体，筛选到的抗体与e l i s a 法相结 合可进行农兽药等小分子残留分析。c a r l o s 等1 9 9 3 年就报道了从半合成抗体库 中筛选三种小分子半抗原的高亲和力抗体。y il i 等在也在混合小分子抗体库中 筛选出阿特拉津、西玛津、异丙隆、2 甲4 氯丙酸等四种除草剂的高亲和力抗体。 e m a n u e l 等人构建了肉毒杆菌毒素的鼠源噬菌体抗体库，筛选得到的噬菌体抗体 在e l i s a 检测中性能优于其单克隆抗体。t o u t 等从分泌单克隆抗体的杂交瘤细 胞株上获取基因材料，制备了一种对除草剂毒莠定具有特异性的合成单链可变功 能区片段( s c f v ) ，与单克隆抗体的亲和性能相近，特异性较强。a l c o c e r 也利用 特定引物从两株杂交瘤细胞株中分离出了特定识别乐斯本的功能区的s c f v 。 试验采用的材料米尔比霉素肟化物( m i l o ) 是一种商品化的驱虫兽药，具 有十六元大环内酯结构，与目前广泛应用于农业和畜牧业的抗虫药物阿维菌 素，依维菌素以及我国江西农业大学发现的杀虫活性物质梅岭霉素具有相似的化 学结构。本试验构建了小分子米尔比霉素肟化物噬菌体抗体库，以期建立十六元 大环内酯类化合物的特异性抗体库，为相关药物的检测和筛选奠定基础。 试验首先将已改设计合成的小分子米尔比霉素肟化物半抗原( m i l o 5 - 琥珀 酰半酯) 利用碳化二亚胺法与蛋白偶联形成人工抗原，经紫外扫描鉴定和 s d s p a g e 凝胶电泳鉴定均偶联成功后免疫b a l b c 小鼠，测得其抗血清效价最高 可达1 ：2 5 6 0 0 ，建立的c i e l i s a 检测范围抑制率在2 0 - 7 0 ，与常规e l i s a 检 前言 测要求的1 0 9 0 的抑制率范围还有一定差距。因此进一步构建特异性抗体库 以获得高亲和力及高特异性的抗体是必要的。 取小鼠脾脏提取总r n a ，经r t - p c r 分别扩增出得到抗体重链可变区( v h ) 基因和轻链可变区基因( v l ) ，大小分别为3 6 0 b p 和3 4 0 b p 左右，与k a b a t 等数 据库所报道的抗体片段大小相符。 纯化回收的v h 与v l 基因在接近等摩尔的浓度下，先采用含有l i n k e r 接头 片段的引物利用重叠延伸p c r 法( s o e - p c r ) ，将v h 与v l 基因片段拼接在一 起，再用带有限制性内切酶位点的引物扩增出单链抗体( s c f v ) 基因片段，获得 大小约7 5 0 b p 的目的片段，纯化后经s f i i 和n o t i 双酶切，与同样经过双酶切的 载体p c a n t a b 5 e 连接，化学法转化大肠杆菌t g i 感受态细胞，提取质粒经p c r 初步鉴定，进一步测序证明有外源片段插入且与目的片段一致。转化菌经辅助噬 菌体m 1 3 k 0 7 超感染后，收集上清，即得到库容量为2 4 1 0 6 p f u m l 的噬菌体 抗体库。 本课题的完成，为下一步抗体库筛选技术的建立和抗体的筛选奠定了基础； 也为基因工程抗体的研究在农兽药等小分子免疫检测研究中开辟了一条新的途 径，具有重要的理论意义和实际应用价值。 v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：型! 边 日 期：趔21 。丘二兰 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子叛和纸质版；有权将学位论文用于菲赢烈目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：至基监 日 期：遮1 1 2 圭 米尔比辑素肟化物s c f v 噬菌体抗体库的构建 文献综述 l 噬菌体抗体库技术及其研究进展 1 1 噬菌体抗体库技术( p h a g ed i s p l a ya n t i b o d yt e c h n o l o g y ) 的产生 1 8 9 0 年，德国的学者b e h r i n g 和日本学者北里发现白喉抗毒素可以中和白喉 毒素，继之b e h r i n g 又将免疫血清用于传染病的被动免疫和血清学诊断，由此开 创了多克隆抗皿清研究时代，多克隆抗体是抗原按一定程序直接免疫试验动物后 获得的抗血清。由于抗血清中的抗体是不同的抗原决定簇刺激不同的b 淋巴细 胞( 抗体产生细胞) 克隆产生的抗体混合物，所以称为多克隆抗体。该抗体制备 过程简单、生产成本低、无需特殊的仪器设备，所以目前仍是众多实验室制备抗 体的首选方法。但是具有多抗特异性不强，动物个体差异大，不利于批量生产等 缺点。 1 9 7 5 年k o h l e r 和m i l s t e i n 开创脾细胞与骨髓瘤细胞融合建立的杂交瘤技术以 产生单克隆抗体以来，使体外制备针对某一特定抗原的高亲合性抗体成为可能。 虽然杂交瘤技术制备的单克隆抗体纯度均一、特异性强、亲合性商，但其由于技 术的限制很难制备出人源性单克隆抗体，由于免疫耐受机理很难获得自身抗原的 自身单克隆抗体，由于b 细胞克隆激活的限制使高亲合性且多样性单克隆抗体 的筛选遇到困难。 随着分子生物学技术的进展，到2 0 世纪8 0 年代逐步建立起了抗体库技术， 即通过d n a 的重组技术克隆全套抗体可变区基因，运用载体系统表达有功能活 性的抗体分子片段，从中筛选出特异性抗体的基因，可用来制备人源性、高特异 性单抗，是一项极具潜力的生物技术。噬菌体抗体库技术最初由美国m i s s o u r i 大学的s m i t h i q 所创建，是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的新技 术，该技术与p c r 等技术结合，使得建立各种文库以及体外筛选任何目的分子 成为可能，实现了基因型和表型的转换，提供了高效率筛选系统，且利用该技术 还可以简单预测生物靶分子的空间结构。 噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术的发展：第一，p c r 技术的 发展使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因。目前已设计了 文献综述 多套扩增v h 和v l 基因的引物，包括：( 1 ) 以f r l 和f r 4 保守序列为基础设计 的引物；( 2 ) 基于抗体基因家族性保守序列设计的引物；( 3 ) 以前导序列为5 端和j 片段为3 端为基础设计的引物。第二，从大肠杆菌内分泌有结合功能的 免疫球蛋白分子片段获得成功。第三，噬菌体展示技术的建立。噬菌体抗体库技 术是噬菌体展示技术成功应用的具体体现之一。噬菌体展示技术( p h a g ed i s p l a y t e c h n o l o g y ) 是以改造的噬菌体为载体，将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入编 码噬菌体衣壳蛋白的基因区，从而将所克隆的基因与其所编码的蛋白质有机地结 合在一起，并使目的基因表达的产物展示在噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛 选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性的多肽或蛋白质， 是实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。 1 2 噬菌体展示技术载体系统的发展 用于蛋白质或多肽展示的系统主要有3 种：1 噬菌体展示系统；2 噬粒展示 系统；3 细菌细胞表面展示系统。其中，以前两种系统较为成熟，为大多数实验 室采用。构建噬菌体展示系统的噬菌体包括 噬菌体、t 4 噬菌体和丝状噬菌体。 1 2 1 丝状噬菌体展示系统( f i l a m e n t o u sp h a g ed b p l a ys y s t e m ) m 1 3 ，f l ，f d 都属于丝状噬菌体，为单链d n a 病毒，其复制型d n a 被用 来作基因克隆的载体。它们通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞，然后将病 毒d n a 注入细菌的胞质，利用细菌胞质内的酶转变成复制型的d n a 双链，并 通过滚动复制产生子一代d n a 分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体d n a 的结构和复制特点，将m 1 3 或f d 作为良好的基因工程载体。因为其d n a 复制 与装配不受d n a 分子的限制，因此可以将外源d n a 插入到它的一些非必需区， 仅导致噬菌体颗粒的加长，不会影响噬菌体的活性和完整性，插入的外源多肽对 噬菌体的正常繁殖会有一定的影响，可以通过使用辅助噬菌体( m 1 3 k 0 7 ) 超感染 后正常进行下一轮繁殖，通过此方法即可得到一些插入外源d n a 的基因重组体， 还可以把插入的d n a 片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上，且呈现表达于 噬菌体表面的外源多肽分子能够保持其原有的空间构象及功能。 m 1 3 丝状噬菌体展示系统中虽有多种外壳蛋白被试用于噬菌体展示，目前 主要应用的是基因蛋白和基因m 蛋白，基因蛋自是噬菌体的主要外壳蛋白， 约有2 7 0 0 个拷贝，分子质量为5 2 k d ，由5 0 个氨基酸组成。其c 端与d n a 结 2 米尔比霉素肟化物s c f v 噬菌体抗体库的构建 合，n 端伸出噬菌体外，较小的外源片段可与基因的n 端融合。其中央有一段 疏水区，当噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖时所产生的基因蛋白通过这段疏水区 镶嵌在细菌内膜上，当释放时，包被在噬菌体d n a 外面。将外源蛋白的基因与 基因融合，就会在噬菌体表面表达出多个副本的外源蛋白。基因展示系统可 用来筛选亲和力较低的配体【2 j 。 基因蛋白的分子量是4 2 k d ，含有4 0 6 个氨基酸残基，它的结构与基因 蛋白类似，在病毒感染的细菌内，以其靠近c 端的2 3 个氨基酸组成的穿膜区固 定于内膜上，n 端朝向质周腔。基因蛋白位于噬菌体颗粒的一端，每一个噬菌 体有3 - 5 个蟊q 本，其n 端1 - 1 9 8 位氨基酸能够与大肠杆菌的性菌毛结合介导噬菌 体颗粒对大肠杆菌的感染，其c 端部分则与子代噬菌体从细菌胞内释放有关。 将外源基因与基因融合，在噬菌体表面仅表达少量外源性蛋白，尤其在使用噬 菌粒作为表达载体时，噬菌体表面仅表达一个外源性蛋白分子，有利于高亲和力 配体或受体的淘选，故在构建展示文库时常使用基因i 蛋白为载体来筛选高亲合 力的配体例。 目前常用的单链噬菌体载体有表达f a b 段抗体的p c o m b 3 载体系统，它是在 噬菌体载体p b l u s c r i p 的基础上，由美国加州的s c r i p s 研究所所构建的，已被广 泛用于f a b 段抗体的表达【4 】。还有表达s e f v 单链抗体的p c a n t a b 5 e 载体系统， 它是由英国剑桥大学蛋白质工程中心和抗体技术有限公司构建的表达s c f v 抗体 的载体系统。 1 2 2t 4 噬菌体展示系统( p h a g et 4d i s p l a ys y s t e m ) t 4 噬菌体展示系统属于羧基端展示系统，目前应用最广的是将外源肽或蛋 白质与t 4 噬菌体的小衣壳蛋白s o c 的c 端融合而被展示【5 1 。s o c 分子量约为 9 k d ，其衣壳有9 6 0 个拷贝，头部有1 0 4 个拷贝，是t 4 衣壳组装所必需的，而 且不论是在体内还是体外，它都具有与成熟的衣壳表面特定位点高亲和力的专一 结合的能力，利用1 个阳性选择载体将融合有外源序列的s o c 融合基因同源整 合入缺失s o c 的t 4 基因组中，选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体，即可将 外源肽或蛋白质展示于噬菌体表面。t 4 噬菌体与丝状噬菌体不同，其病毒颗粒 是在宿主细胞内组装，不需要通过分泌途径，因而其表面展示多肽和蛋白的范围 广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质 6 1 。t 4 噬菌体展示 3 文献综述 系统容量大( 3 5 k d 以上蛋白质) 、拷贝数高，在分析抗原表位、细胞因子、受体 及生物工程学等方面有相当大的应用潜力。 羧基端展示系统还有近年来发展的t 7 展示系统 7 1 ，其优点是复制周期短，细 胞质蛋白组装，操作和储存方便，克隆效率高，稳定性好，且筛选方便。主要用 于分析配体与受体的作用机制。 1 2 3 噬菌体展示系统( p h a g e 九d i s p l a ys y s t e m ) 噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体主要尾部蛋白p v 的c 端折叠区 嘲，或噬菌体头部组装必需的d 蛋白n 端或c 端p o 】，实现外源蛋白的表面展示。 x 噬菌体是在宿主细胞内完成装配，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌周质，可展 示有活性的大分子蛋白( 1 0 0 k d 以上蛋白) 及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围 较广。 近年来，随着展示技术的不断发展，外源目的基因不仅限于呈现在丝状噬菌 体m 1 3 表面，还可以呈现在酵母及核糖体等其它载体表面，出现了酵母表面展示 系统和核糖体展示技术， 1 2 4 酵母表面展示系统( y e a s ts u r f a c ed i s p l a ys y s t e m ) 酵母表面展示系统【1 1 】是继噬菌体展示技术后发展起来的真核展示系统，酵母 具有和哺乳动物相似的蛋白质合成机制，且其具有的翻译后的修饰功能可以更好 地保持蛋白质的原始三维结构，更好的表达多种功能蛋白质分子，与原核细胞相 比，更有利于抗体的亲和力的成熟，另外酵母是真核细胞，可用流式细胞仪进行 筛选和分离，而且，这种展示技术能很好地区分微弱亲和力差异的突变株，这就 使得基于特定亲和力改变的突变体分离成为可能。 1 2 5 核糖体展示技术( r i b o s o m ed i s p l a ys y s e m ) 核糖体展示技术1 2 1 是一种新型体外筛选和分子进化功能性蛋白质的生物文 库技术，最早被用于筛选蛋白靶分子的肽类配体。载体外翻译后，m r n a 及其编 码的蛋白质均附着在核糖体上，使基因型与表型联系在一起，经过配体的亲和筛 选，不与配体结合的核糖体复合物被洗去，得到可与配体特异结合的核糖体复合 物。核糖体展示年技术自1 9 9 7 年首次用于完整功能蛋白质的展示以来，在蛋白质 结构与功能及蛋白质一蛋白质相互作用，特别是在抗体s c f v 库的筛选方面取得了 极大成功。与其他筛选方法相比，具有库容量大，易于达到多样化，操作简便易 4 米尔比霉素肟化物s c f v 噬菌体抗体库的构建 于筛选，可进行蛋白质体外转化等优点。 1 3 噬菌体抗体库的类型 根据抗体基因来源的不同，抗体库可分为未经免疫的天然抗体库，免疫性抗 体库和由体外人工设计合成的抗体基因构建的化学合成抗体库。 1 3 1 天然抗体库( n a i v el i b r a r y ) 从未经免疫的生物体b 细胞构建的抗体库称为天然抗体库咖。该库是从未 经免疫的生物体的b 淋巴细胞i g m 的m r n a 中获取可变区基因( v ) ，以结合于 v 区基因框架区f r l 和f r 4 的寡核苷酸为引物，从e d n a 中扩增v 基因，重链 和轻链随机组装成s c f v 或f a b ，继之将这些抗体片段克隆到噬菌体或噬菌粒载 体进行表达或呈现【1 4 1 。理论上讲，所有抗原的抗体都可以从天然抗体库中筛选得 到。其优点是不需要免疫供体，且如果库容量足够大就能筛选出针对很多抗原的 抗体1 5 1 。缺点是需要构建比免疫抗体库大得多的文库，才能从中筛选到高亲和力 的抗体。 1 3 2 免疫抗体库( i m m u n i z e dl i b r a r y ) 免疫抗体库是利用经某种抗原免疫过的生物体的b 淋巴细胞构建的抗体库 0 6 。由于经过了免疫的压力选择，免疫抗体库中对应于相应免疫原的特异性抗体 的丰度大大高于其他非特异性的抗体，这对于富集抗原特异性的抗体非常有利。 由于该抗体库中编码识别特定免疫原的功能性抗体的基因比率较高，这意味着从 库容量较小的文库中就可能筛选出针对免疫原的功能性抗体或基因，并且由于抗 体经过亲和力成熟过程，因此抗体库中高亲和力抗体的数目将大大增加，而与杂 交瘤途径比较，该法能够得到更多甚至更好的抗体【1 7 】。免疫抗体库的不足：每一 个抗原需构建一个免疫抗体库，以获得针对该抗原的特异性抗体，这无疑加大了 工作量，对于人源性抗体库，由于不能对人任意进行主动免疫，对自然的免疫反 应过程无法控制，因而很难得到识别某种抗原的抗体，免疫耐受机制也使得旨在 获得某些抗自身抗原抗体的目的很难实现，特别是对抗肿瘤抗体的产生具有极大 的影响。 1 3 3 化学合成抗体库( s y n t h e t i cl i b r a r y ) 根据人工设计改造抗体基因的方法构建而成的，又分为半合成抗体库和全 合成抗体库。半合成抗体库的构建是在胚系免疫球蛋白v 基因片段上引入具有 文献综述 倾向性水平的随机c d r 序列，将免疫球蛋白胚系v 、d 、j 等基因片段通过体 外扩增后进行重组，从而组装成新的v 基因，或重排的v 基因【瑚。抗体的c d r 区可用寡核苷酸直接突变或基于p c r 的方法进行部分或完全随机化，由于经过 初次免疫重排和再次免疫的突变，抗体基因序列的多样性及其变幻性非常之大， 故而单纯在体外拼接免疫球蛋白基因并不能获得足够的抗体基因序列的多样性。 全合成抗体库是由人免疫系统抗体的全部序列信息进行序列同源性分析后分组， 根据各组相对保守的序列设计并合成各自通用的基因，作为构建组合抗体库的主 干基因库，然后通过模式化的基因酶切位点的引入和完全模式化的载体系统的构 建，最终形成次级库。在c d r 区的设计中，基于对抗体可变区序列的分析，已 确认重链c d r 3 是抗原结合部位的中心，其结构及序列的多样性最大，因此目前 的化学合成抗体库均是围绕重链c d r 3 进行抗体基因设计的【1 9 1 。发展合成抗体 库的目的在于建立比天然抗体库更具有多样性，更为通用的抗体库，以克服生物 来源的抗体库抗原多样性的偏向性。但明显的劣势是有效库容量的不足。 根据噬菌体表面展示的抗体片段的不同，可分为单链可变区噬菌体抗体库 ( s c f v ) 、f a b 噬菌体抗体库或二硫键稳定的f v 噬菌体抗体库及双体抗体噬菌体 抗体库。 免疫球蛋白基因是一个基因超家族伫伽，由一对轻、重链组成，轻链分一个可 变区( v a r i a b l er e g i o n ) 及一个恒定区( c o n s t a n tr e g i o n ) ，重链( h c a v yc h a i n ) 则 可分为一个可变区和3 个恒定区。其中可变区基因由许多胚系v 基因片段重排 而成，轻链可变区基因由v 、j 片段重排而成，重链可变区基因则由v 、d 、j 片 段重排而成。同一类型抗体的恒定区序列保守，可变区序列则随抗原识别特异性 不同的抗体而有不同。可变区中又分为高变区或互补决定区( c o m p l e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n gr e g i o n c d r ) 和框架区( f r a m w o r kr e g i o n ，f r ) ，c d r 主要参与构 成抗原结合部位。每个轻、重链可变区各有3 个c d r 区和4 个f r 区，一对轻、 重链的各3 个c d r 形成的环状结构，共伺构成一个抗原结合部位，其空间结构 多种多样，以适应于针对不同抗原的决定簇。 1 3 4s c f v 抗体库( s i n g l e - c h a i nv a r i a b l ef r a g m e n t sa n t i b o d yf i b r a r y ) 1 9 8 8 年s k e r r a 等【2 l j 报道用大肠杆菌表达出抗体重链可变区( v h ) 和轻链可 变区( v l ) 抗体片段，即f v 抗体。而f v 抗体的v h 和v l 仅靠非共价键连接， 6 米尔比霉素肟化物s c f v 噬苗体抗体库的构建 其结构的稳定性较差。b i r d 等 2 2 1 利用计算机辅助设计了几种短肽系列，通常为 ( g l y 4 s e r ) 3 的弹性短肽，习惯称之为“l i n k e r ”。并用这些短肽连接已知的一个抗 体可变区v h 和v l ，经过大肠杆菌表达后进行纯化复性，并与抗原结合，证明这 些抗体具有良好的结合活性，这些抗体后来被称为单链抗体( s i n g l e c h a i n 图1 抗体分子结构示意图 f i g 1t h es t r u c t u r eo f a n t i b o d ym o l e c u l e a n t i b o d i e s ) 或单链可变区片段( s i n g l e c h a i nv a r i a b l ef r a g m e n t s ，s c f v ) 。研究 表明，细胞质内的s e f v 可以结合并失活任意胞质结构，若在s e f v 上加上细胞核 定位信号( n l s ) ，可直接进入细胞核，而在s c f v 的碳末端加上一段内质网保留 信号( k d e l ) 序列，则s e f v 即可定位于内质网上。 1 3 5f a b 抗体库( a n t i g e nb i n d i n gf r a g m e n t sa n t i b o d yf i b r a r y ) f a b 抗体是重链f d 片段和轻链的复合体。1 9 8 8 年b e t t e r 等口3 1 于大肠杆菌中 表达了f a b 抗体片段。1 9 9 1 年h o o g e n b o o m 等分别将重链f d 片段和轻链克隆 于载体和辅助噬菌体，超感染后在噬菌体表面表达出f a b 抗体，继之g r a m 等【1 3 1 等用噬菌粒p c o m b 3 作为表达载体将f a b 表达在同一个载体。 1 3 6 双体抗体库和双特异性抗体库( d i a b o d yl i b r a r y ) 双体抗体是两个s e f v 通过共价键结合的二聚体。由于它具有两个抗原识别 位点并可同时结合两个抗原，所以它的亲和力较s c f v 或f a b 都有明显提高，有 的可达到全抗体的水平 2 5 】。将一个抗体a 的v h 和另一抗体b 的v l 用一短肽连 接，同时将抗体a 的v l 和抗体b 的v h 也用此类短肽连接，当这两个异源抗体 s e f v 基因同时表达，由于短肽“l i n k e r ”的限制，使同一条多肽链上的v h 和、，l 不能匹配，而被迫于另一多肽链上的同源的v l 和v h 匹配，这样双体抗体便可 7 文献综述 识别两个不同的抗原，发挥不同的抗体功能，此抗体为双特异性抗体。同样f a b 也可以通过蛋白融合方式与另一种抗体桥接，形成双特异性抗体。1 9 9 6 年， m c g u i n n e s s 等 2 6 1 成功地构建了双体抗体库，并从中筛选到双特异性抗体，证明 利用抗体库制备双体抗体和双特异性抗体的可行性。因其独特的功能在药物导向 等医学领域有着广阔的前景1 2 7 矧。 1 3 7 二硫键稳定型抗体库( d i s u l f i d e - s t a b l i l i z e df vf r a g m e n t sa n t i b o d yl i b r a r y ) 二硫键稳定型抗体是利用基因突变的方法分别将抗体v h 和v l 基因的一个 氨基酸突变为半胱氨酸，表达后使其提高抗体的稳定性。b r i n k m a n n 等 2 9 1 用噬菌 体技术展示了d s f v ，并筛选出抗t a c 的特异性的d s f v 抗体。d i m a s i 等t 3 0 l 也成功 地构建了此类型的抗体库，为大规模筛选奠定了基础。 1 4 噬菌体抗体库的构建 1 4 1 目的基因的获得 构建一个噬菌体抗体库，首先要通过人工合成或生物体来源的渠道获彳导抗体 基因，实验表明，杂交瘤细胞、免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞等都 可以作为建库的来源。杂交瘤构建的抗体库，理论上其亲和力和特异性较高。但 实际操作未必能恢复重链和轻链基因的天然配对，亲和力较常规杂交瘤抗体低， 且库容小。致敏b 细胞抗体库不需制备杂交瘤，库容量也较大，但不能以抗原 预先致敏人体。k e t t l e b o r o u g h 等口认为，考虑到高亲和力抗体筛选所需要的步 骤和抗体的多样性，选用淋巴结细胞建库是比较好的。 目前，获得可变区基因的途径主要有两个：一是从基因文库中获取可变区基 因口如，但这一过程相当费时，而且由于免疫球蛋白基因结构的复杂多样性以及 大量非功能性假基因的存在，使得从基因文库中筛选出的阳性基因并不一定是可 变区基因，还需要将功能性和非功能性重排片段区别开来；二是用p c r 法扩增 免疫球蛋白的v h 和v l 基因，这得益于1 9 8 9 年o r l a n d i 等【3 3 】“通用引物”的合 成并极大地推动了基因工程抗体的研究。由于它所需模板量少，操作简便、省时， 重链、轻链各自的一对引物不需要精确匹配，并常可在引物中加入限制性酶切位 点，使扩增基因可直接连入表达载体中，所以目前人们构建噬菌体抗体库时，可 变区基因的获取多采用这一途径。其中引物设计关系到噬菌体抗体库的库容，尤 为关键。目前引物设计大致有以下几种方案：含引导肽引物的设计：框架引物的 8 米尔比霉素肟化物s c f v 噬菌体抗体库的构建 设计；混合引物的设计。在使用时，应根据不同的目的设计不同的引物。就目前 人们所掌握的有限的免疫球蛋白的结构序列信息来说，设计能把所有抗体基因都 扩增出来的通用引物还存在一些困难。但可通过对现有p c r 程序进行改造，如 先用l a r r i e k 等 3 4 1 的前导简并引物扩增e d n a 的可变区，其p c r 产物再用k a n g 等的引物扩增，这种半套式p c r 引物可扩增出抗体库的全部基因。”。 1 4 2 抗体可变区基因的表达 噬菌体直接作抗体载体的不足之处在于其感染效率较低，复制数和d n a 稳 定性也较低，抗体表达水平不易调控，插入较大片段时，对噬菌体的感染产生不 利影响。因此，目前较多采用噬粒来构建抗体库。用于噬粒呈现系统的主要载体 有p h e n l ，p c o m b 3 ，p c o m b 8 ，p s e x ，p c a n t a b 5 e ，噬粒是一类将噬菌体和质粒 的某些元件组合在一起的载体，其主要构成元件包括大肠杆菌复制子、抗药性基 因、噬菌体包装信号基因、原核启动子、操纵子和酶切位点等。载体酶切位点的 选择是根据k a b a t 等【3 6 】数据库中的可变区基因序列，借助计算机分析来实现的。 构建载体噬菌粒的常用限制性内切酶有n o t l 、n c o i 、s f i i 、s p e i 、s a c i 、x h o i 、 x b a i 、n h e i 、h i n d 等少数几种。 构建的表达载体转染或转化宿主细胞即可表达抗体片段。噬菌体抗体库所用 宿主细胞有e c o h t g l 和e c 0 瑚b 2 1 5 1 。采用不同的方法可表达附着型或分泌型 抗体片段f a b 、f v 或s c f v 。在载体设计时，需在抗体基因和妒m 之间插入一个 琥珀终止密码子，当此密码子受到抑制时抗体就展示在噬菌体表面，而密码子不 受抑制时抗体就分泌表达。因此，当重组噬菌体生长在抑制型大肠杆菌 e c o h t g l 时，抗体基因就与g p i 融合表达于噬菌体表面，用于筛选含有高亲和 力抗体的噬菌体。当重组噬菌体生长在非抑制型大肠杆菌e c o h h b 2 l s l 时，抗 体基因就分泌表达于大肠杆菌的周质腔中，用于制备高亲和力抗体，这两个过程 分别模拟了b 细胞和浆细胞的功能 3 7 1 。 1 5 噬菌体抗体库的筛选 从构建好的噬菌体抗体库中获得所需目的配体，是一个复杂的过程，包括配 体结合、洗涤、洗脱和扩增等步骤，筛选常用的方法有以下几种： 1 5 1 固相化或液相抗原筛选法( s o l i do rl i q u i da n t i g e ns e l e c t i o n ) 将纯抗原直接或问接包被于固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱， 9 文献综述 然后加入待