（遗传学专业论文）马凡氏综合征的fbn1基因突变检测及其应用研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要“3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6月o 舌- j ” 材料与方法7 实验结果1 6 讨论”2 1 结论“2 5 四、本研究创新性的自我评价2 6 五、参考文献”2 7 六、附录 综述一3 0 在学期间科研成绩- 3 9 致谢4 0 个人简介4 1 马凡氏综合征( m a r f a n ss y n d r o m e ，m f s ) 是常染色体显性遗传性结缔组织疾 病，发病率为0 2 0 3 9 0 0 ，病变主要累及骨骼、眼睛和心血管系统，有时也累及肺 部，皮肤和硬脑脊膜等器官。症状主要有主动脉瓣返流，晶状体异位，骨骼过长 和比较严重的新生儿马凡氏综合征。目前在基因方面的研究认为马凡氏综合征发 病的主要原因为编码细胞外基质蛋白原纤维蛋白一l ( 删) 的基因发生突变。 尽管马凡氏综合征有严格的临床诊断标准，但是由于该疾病临床症状表现多样化， 部分患者不一定符合诊断标准，而且马凡氏综合征的许多症状是与年龄增长密切 相关的，多数儿章期的患者并未出现临床症状，因此，许多马凡氏综合征患者需 要基因诊断和临床诊断相结合才能确诊。由于该疾病是常染色体显性遗传性疾病， 确定了致病基因突变位点，对于其后代产前诊断将具有十分重要的意义。 f b n l 基因定位于1 5 q 1 5 - - q 2 1 1 ，该基因长2 3 0 k b ，有6 5 个外显子，m r n a 长度为1 0 k b ，并翻译为含2 8 7 1 个氨基酸残基的蛋白质。由于f b n l 基因比较大， 外显子数目较多，其突变可以发生在整个基因的任意区域，没有集中的突变热点， 这就导致了筛查突变的难度增加。目前国内外针对马凡氏综合征的研究主要是检 测f b n l 基因是否存在突变，而基因突变检出率较低也是目前研究此疾病的最大 难题。本研究旨在筛查f b n l 基因突变，确定突变位点，并寻找快速准确的基因 诊断策略。 材料与方法 一、研究对象： 1 、马凡氏综合征患者：1 1 名由中国医科大学第一附属医院心脏外科临床诊 断的马凡氏综合征患者，其中4 名患者有家族史，分属于两个不同的家系。 2 、正常对照：5 0 名性别和年龄与患者相匹配的正常人。 二、实验方法： 1 、应用p c r d g g e 技术检测1 1 名患者f b n l 基因的6 5 个外显子，d g g e 电泳出现泳动变位患者送往测序，确定其f b n l 基因是否存在碱基变异。 2 、应用p c r r f l p 技术检测患者家系中其他患者、表型正常者及正常对照 者的f b n l 基因，排除该碱基变异为s n p 位点，确定此位置为碱基突变。 结果 1 、应用p c r d g g e 技术结合测序，在一个有家族史的患者家系中发现f b n l 基因出现一个未见报道的无义突变，为c 3 6 7 0 t 引起的g l n l 2 2 4 s t o p ；在3 名患者 中检测到一个已报道的s n p 位点r s 3 8 2 5 9 6 2 。 2 、应用p c r - r f l p 技术验证了患者的突变位点及突变性质。 结论 本研究发现了f b n l 基因的一个未见报道的致病突变为c 3 6 7 0 t 引起的 g l n l 2 2 4 s t o p 和一个已报道的s n p 位点r s 3 8 2 5 9 6 2 ；f b n l 基因突变检出率较低， 其基因诊断的可行性还有待于研究。 关键词 马凡氏综合征( m a r f a n ss y n d r o m e ，m f s ) ；突变检测；船m 基因；p c r d g g e 技术；p c r r f l p 技术；基因诊断 2 英文论著摘要 t h er e s e a r c ho nt h em u t a t i o nd e t e c t i o no ff b n lt o r m a r f a n ss y n d r o m ea n di t sc l i n i c a la p p l i c a t i o n b a c k g r o u n d a b s t r a c t ：m a r i a n ss y n d r o m e ( m f s ) i sac o m m o nh e r i t a b l ed i s o r d e ro fc o n n e c t i v e t i s s u ew i mm a n i f e s t a t i o n si n v o l v i n gp r i m a r i l yt h es k e l e t a l ，o c u l a ra n dc a r d i o v a s c u l a r s y s t e m sb u ta l s oa n dl e s ss y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e dt h el u n g , s k i na n di n t e g u m e n t ，a n d d u r a t h ei n c i d e n c eo fc l a s s i c a lm a r i a n ss y n d r o m ei sa b o u t2 - 3p e r10 0 0 0 i n d i v i d u a l s c a r d i n a lm a n i f e s t a t i o n s i n c l u d ep r o x i m a la o r t i ca n e u r y s m ，d i s l o c a t i o no f t h eo c u l a rl e n s ，l o n g b o n eo v e r g r o w t ha n ds e v e r ed i s o r d e r si n c l u d i n gn e o n a t a lm a r i a n s y n d r o m e r e c e n ts t u d i e so nt h em o l e c u l a rg e n e t i c so fm f sa r es h o w e dt h a tm f si s c a u s e db yt h em u t a t i o n so ff i b r i l l i n - - 1 ( f b n l ) g e n e p a t i e n t sa r ed i a g n o s e db a s e do n d i a g n o s t i cc r i t e r i a , h o w e v e r , t h er e v i e wo ft h em e d i c a lp r o b l e m so fs u r v i v i n gp a t i e n t s h a sr e v e a l e dp o s s i b l eu n i d e n t i f i e dp l e i o t r o p i cm a n i f e s t a t i o n so ft h em a r f a ns y n d r o m e o rm a n i f e s t a t i o n st h a tc o u l db er e l a t e dt oa g i n go ft h i sp o p u l a t i o n ，a n dc o u l dn o ta p p e a r o nt h ee a r l ya g e s oo n l yac o m b i n a t i o no fg e n e t i ct e s t sa n dc l i n i c a la s s e s s m e n tc a n s e t t l et h ed i f f e r e n t i a ld i a g n o s i s f b n ll i e so nt h el o n ga r n lo fc h r o m o s o m e15a t l5 q l 5 - - q 21 1 t h i sv e r yl a r g eg e n e i sh i 曲l yf r a g m e n t e di n t o6 5e x o n s ，t r a n s c r i b e di na10 k bm r n at h a te n c o d e sa2 8 71 a m i n oa c i dp r o t e i n t h em u t a t i o nd e t e c t i o ni sd i f f i c u l tf o rf b n l ，f o rw h i c hi sal a r g e g e n e ，a n dt h em u t a t i o n sa r eu n i q u ea n dt h r o u g h o u tt h ew h o l eg e n e t h ed i f f i c u l t yi nt h e i n t e r n a t i o n a lr e s e a r c ho nm a r f a ns y n d r o m ei st h el o wd e t e c t i o nr a t ef o rf b n lm u t a t i o n t h ea i do ft h i sr e s e a r c hi sd e t e c t i n gt h em u t a t i o no ff b nla n dl o o k i n gf o raq u i c k s t r a t e g yf o rt h eg e n ed i a g n o s i sf o rm a r f a n ss y n d r o m e m a t e r i a la n dm e t h o d s 3 1 p a t i e n t s ：v e i n o u sb l o o do f11m a r f a n ss y n d r o m ep a t i e n t sw e r eo b t a i n e df r o m d e p a r t m e n to fc a r d i a cs u r g e r y ，t h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a l ，c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y ， f o u ro ft h ep a t i e n t sb e l o n gt ot w od i f f e r e n tf a m i l i e s 5 0v e i n o u sb l o o ds a m p l e sa r e f r o mn o r m a li n d i v i d u a l sw i t h o u tg e n e t i cd i s e a s e 2 m e t h o d s ：m u t a t i o n si nt h ec o d i n gr e g i o no ff b n lg e n ei nm f sp a t i e n t sw e r e d e t e c t e db yd e n a t u r i n gg e lg r a d i n e n te l e c t r o p h o r e s i s p c r - r e s t r i c t i o ne n z y m e d i g e s t i o n w a s a p p l i e dt oc o n f i r mt h em u t a t i o n so ft h ef b n lg e n ea n de x c l u d et h es n p s i t e r e s u l t s 1 an e wn o n s e n s em u t a t i o nc 3 6 7 0 tw a sf o u n di nam f s f a m i l y 2 p c r r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o nc o n f i r m e dt h em u t a t i o no ft h ef b nlg e n e 3 ar e p o r t e ds n ps i t er s 3 8 2 5 9 6 2w a sf o u n di n5 2 t hi n t r o n c o n c l u s i o n w eh a v ed e t e c t e dan e wm u t a t i o na n da r e p o r t e ds n ps i t eb yt h ep c r - d g g ea n d s e q u e n c i n gm e t h o d s ；t h ed e t e c t i o nr a t eo ft h em u t a t i o nf o rf b n li s s ol o wt h a tt h e a v a i l a b i l i t yo ft h eg e n ed i a g n o s ef o rf b n ln e e d st ob ed i s c u s s e d k e y w o r d s m a r f a n ss y n d r o m e ；m u t a t i o nd e t e c t i o n ；f b n l ；p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - d e n a t u r i n gg e lg r a d i e n te l e c t r o p h o r e s i s ( p c r d g g e ) ；p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a ( p c r r f l p ) ；g e n ed i a g n o s i s 4 英文缩略语 5 论文 马凡氏综合征的f b n l 基因突变检测及其应用研究 刖吾 马凡氏综合征( m a r f a n 8s y n d r o m e ，m f s ) 是常染色体显性遗传性结缔组织疾 病，发病率为o 2 0 3 o ，病变主要累及骨骼、眼睛和心血管系统，有时也累及肺 部、皮肤和硬脑脊膜等器官。症状主要有骨骼过长、主动脉瓣返流、晶状体异位 和比较严重的新生几马凡氏综合征。尽管马凡氏综合征有严格的临床诊断标准， 但是由于该疾病临床症状表现多样化，部分患者不一定符合诊断标准，而且马凡 氏综合征的许多症状是与年龄增长密切相关的，多数儿章期的患者并未出现临床 症状，因此，许多马凡氏综合征患者需要基因诊断和临床诊断相结合才能确诊。 此外，马凡氏综合征患者都是由于心脏系统发生病变而死亡，而且死亡的年龄与 心脏系统病变的程度有关，但并不影响患者正常的生育能力，因此，准确的基因 诊断对于正确指导患者婚育也具有重要的意义。 马凡氏综合征是由编码细胞外基质蛋白原纤维蛋白一i ( f b n l ) 的基因突变而 引起的疾病。f b n l 基因突变使原纤维蛋白一l 的结构发生改变，影响全身的结缔 组织，如骨骼、眼睛、心血管系统等，而心血管系统病变是导致患者死亡的首要 原因。1 9 8 6 年，s a k a i 和他的同事发现一种新的细胞外基质蛋白将其命名为原纤 维蛋白，这种蛋白是微纤维蛋白重要组成部分，它在细胞外基质内以聚合体的形 式组成弹性纤维【l 】。1 9 9 0 年h o l l i s t e r 通过应用原纤维蛋白的单克隆抗体，发现了 马凡氏综合征患者微纤维蛋白系统的异常【2 l 。1 9 9 1 年，原纤维蛋白基因( f b n l ) 由d i e t z 运用原位杂交技术定位并成功克隆，确认其基因位于1 5 q 1 5 一q 2 1 3 ，并首 次检测到2 例散发m f s 患者的f b n l 基因突变【3 1 。 本研究对临床诊断的马凡氏综合征患者检测进行f b n l 基因突变检测。f b n l 基因全长2 3 0 k b ，有6 5 个外显子，m r n a 长度为1 0 k b ，并翻译为含有2 8 7 1 个氨 基酸残基的蛋白质【4 1 。由于f b n l 基因外显子数目比较多，而且没有集中的突变热 点，突变类型大多是点突变，而p c r d g g e 技术对于各种类型的突变尤其是点突 6 变比较敏感，因此本研究主要通过应用p c r d g g e 技术检测患者f b n l 基因的6 5 个外显子是否存在突变，寻求一种快速准确的诊断方法和策略。此外，我们还采 用p c r - r f l p 方法，证实患者的突变位点及性质并为将来的产前诊断提供确切的 诊断依据。 材料与方法 一、研究对象： ( 一) 马凡氏综合征患者：1 1 名由中国医科大学第一附属医院心脏外科临床 诊断的马凡氏综合征患者，其中4 名患者有家族史，2 、3 号患者属于同一家系， 4 、5 号患者属于同一家系；患者具体资料见表1 。 ( 二) 正常对照：5 0 名性别和年龄与患者相匹配的正常人。 表l ，马凡氏综合征患者资料 t a b l e1 ，b a s i ci n f o r m a t i o no fm f s p a t i e n t s 二、主要实验材料、试剂及仪器 ( 一) 实验材料与试剂 成 1 、p c r 相关试剂 ( 1 ) 扩增f b n l 基因6 5 个外显子及其邻近区域的引物：由上海生工公司合 ( 2 ) t a q 酶及1 0 x 缓冲液( t a k a r a 公司) 7 ( 3 ) 2 5m me a c hd n t p ( t a k a r a 公司) 2 、d g g e 相关试剂 ( 1 ) 丙烯酰胺( s i g m a 公司) ，甲叉双丙烯酰胺( m e r c k 公司) ( 2 ) 尿素，去离子甲酰胺( s i g m a 公司) ，t e m e d ( 3 ) t r i s ，e d t a ，冰乙酸等 3 、电泳相关试剂 ( 1 ) 琼脂糖( t a k a r a 公司) ，丙烯酰胺( s i g m a 公司) ，甲叉双丙烯酰胺( m e r c k 公司) ( 2 ) 电泳缓冲液相关：t r i s ，s d s ，甲醇，e d t a ，硼酸，h c l ，t e 等 4 、p c r r f l p 相关试剂 ( 1 ) 扩增突变位点及其临近区域的引物：由上海生工公司合成 ( 2 ) t a q 酶及l o x 缓冲液( t a k a r a 公司) ( 3 ) 2 5m me a c hd n t p ( t a k a r a 公司) ( 4 ) 限制性内切酶及相应缓冲液( n e b 公司) ( 二) 主要仪器设备 l 、p c r 扩增仪( t a k a r a 公司) 2 、h e r m l e z 3 2 3 k 台式低温超速离心机( 美国) 3 、台式高速离心机( t g l 1 6 g 上海生物仪器厂) 4 、电泳设备( 美国b i o - - r a d ) 5 、紫外检测仪( 江苏海门市医用仪器厂) 6 、凝胶自动成像分析仪( 美国) 7 、紫外分光光度仪( s h i m a d z u ) 8 、微量加样器( 法国g i l s o n 公司) ( 三) 生物信息数据库及辅助设计软件 l 、生物信息数据库 ( 1 ) n c b i - h t t p ：l l w w w n c b i n l m n i h g o v ( 2 ) u c s c ：h t t p ：g e n o m e u c s c e d “ ( 3 ) e n s e m b hh t t p ：w w w e n s e m b l o r g i n d e x h t m l ( 4 ) e x p a s y ：h t t p ：w w w e x p a s y o r g ( 5 ) h g m d h t t p ：w w w h g m d c f a c u k a c i n d e x p h p 2 、辅助软件 ( 1 ) p r i m e r5 ( 2 ) 凝胶成像分析软件包 三、实验方法 ( 一) 马凡氏综合征患者的基因突变筛查 l 、马凡氏综合征患者外周血标本d n a 的提取 ( 1 ) o 5m l 马凡氏综合征患者的抗凝冷冻全血放入1 5l i l l 无菌e p p e n d o r f 管 中。 ( 2 ) 加入o 8m lt e ( p h 8 0 ) 将抗凝血充分混匀，1 2 0 0 0r p m 室温离心2r a i n ， 弃上清。 ( 3 ) 重复( 2 ) 1 次。 ( 4 ) 加入5 0 0p lt e ( p h 8 0 ) 将沉淀充分混匀，然后加入蛋白酶k5p l ( 终 浓度o 1m g m 1 ) ，加入1 0 s d s2 5 山，轻轻混匀，3 7 * ( 2 水浴消化过夜。 ( 5 ) 加入等体积酚( 5 0 0 1 ) ，并充分混匀，呈乳糜状，1 0 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ， 然后吸取上清至另一管内。 ( 6 ) 加入等体积的酚氯仿( 1 ：1 ) 混合液，并充分混匀，1 0 0 0 0r p m 离心1 0 r a i n 然后吸取上清至另一离心管内。 ( 7 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 混合液，混匀后，1 0 0 0 0r p m 离心 1 0 r a i n 。 ( 8 ) 加入1 1 0 体积的n a a c ( 3m o l l p h 5 2 ) 约5 0m ，混匀。 ( 9 ) 加入2 倍体积的无水乙醇1 0 0 0m 。 ( 1 0 ) 室温1 2 0 0 0r p m 离心1 0 r a i n 。 ( 1 1 ) 弃上清，管底的沉淀即为d n a ，加入7 5 的乙醇洗沉淀块2 次。 9 ( 1 2 ) 1 2 0 0 0r p m 室温离心1 0r a i n ，弃上清，空气中干燥约5r a i n ，加入适量 t e ，4 c 保存。 2 、p c r 扩增 ( 1 ) 引物设计与合成 获取f b n i 基因6 5 个外显子及其邻近内含子区域的序列 ( h t t p ：w w w e n s e m b l o r g ) ，应用p r i m e r5 软件设计引物，使p c r 扩增产物覆盖 舢基因6 5 个外显子及其邻近内含子区域。其中，引物5 端带有4 0 b p g c 夹。 各引物序列、扩增片段长度如下： 表2 ，扩增各外显子引物基本信息 t a b l e2 ，b a s i ci n f o r m a t i o no fi n d i v i d u a le x o n i cp r i m e r s 1 0 5 - a a a a t g g t g g g c a t t g a g a c 一3 5 c g g c r 丌g c t c t t g a 丌r c t g 3 5 - 2 7 c a a g a 丁g g a c a c c c a g c a t - 3 5 a t c t c c g c ( 汀g t i t c g g t a a 3 5 一g t c c c a c c a t g a g g g t a g a 3 5 一t g a c t g c g g t c a g l r a 粥t r f 3 5 g g g a a a g c a r 几r t a c c t r r r c 3 5 一g a a g g c a a g t c a a c t l v r t g a a 3 5 - g g c n 几a a g t g c a c t g g t g a 3 5 - t g c t g c a c t g g a a a g t t g a t 3 5 - g a a g t g c c c a g a i t g g t g t l 3 5 一a g a 兀g g g c c c t g t r c t 兀1 p 3 5 t c g g t r 兀1 g a a c a g t 代c t g a 3 5 1 1 a g a c g g g c a g a g t a a c a 3 5 。g c a c a c a c a a c t t g a 戌r 丌c c 3 - 5 。g a g a g g a c a c g g 啪a a r g a a 3 5 - 1 aaa t g a a a c r r g c t _ r g t t g a g 3 5 t g t g aa t g a g t g g c a t g t g a 3 5 - c a c g c a c r 九c a t c t t ( 、1 3 5 - t c j t g t g a g a g g c t l l g t t g a 3 5 t g a c t n 赋c t g g t aa a t g a g a g - 3 5 g g c c t g g t g a a c c c t aaa u ：3 5 一g a a g 下n 阿g 硝n b t t g c t g g g 汀f 3 5 一下n r 丌t c c n r ( k 汀g g a 戌n 厂1 1 - 3 5 一c c c l l r r g t g t g t c c a c a i t g 3 5 1 1 r r g c t a t g g t g c aa t a c g g 3 5 一t g c a c a g c a t g l a g c aa 丌r r l l 3 5 - 下n r g t c c c r r a 丌1 a g 觚a g c a a 3 5 - a g c a ( x g c a g t c t g g a t g t c 3 5 - t c a a t t g g t a g g t r c c c t r r r g 3 5 - g c a g a a g g aap ( r a c a g c c a g b 3 5 - g g a a g g a a c g a a g g a a g g a g 3 5 - c c a g g g t a a a g t g 下丁a c a t c c t 3 5 - c a c t g a a g t g a c c c c c t a c a 3 5 一5 9 a g a c c c t g t g g a a a t t g a g c 3 5 - a a l a a a c g t g g a g c t g c t b 3 5 一g g c c t r 兀c g a g t l a 1 c c 孓3 5 t a g g a r g t g t a g g g g c c a g a 3 5 - a a g l 、g i g c c a g j t c c a a r g t c 3 5 。1 a c a a c t g c a a g g a a c a g ( k 3 5 - c a g c c l l a a 1 1 c t r g c g a c a 3 2 8 76 2 5 。c a g c a g g a a g a a c c t g g a a c 3 3 8 46 2 5 - c c a a c t r r g g c a a t g a t g t c 3 2 9 06 1 5 a g c g a t g a a a a c a a a a c t c a g a 3 3 9 05 9 5 - a t g a c a a a c a a g g g t t l g g a - 3 3 9 4 5 5 5 。一g c t c t c r 几r g g af 丁g c t g g t 3 3 6 86 2 5 一c a a n 盯a a a g a a g t g g a a g c 一3 3 9 95 7 5 一t g c a c a l r a t g g g t t c c a 丁3 4 0 05 0 5 一t g c t a g c c t g a g a a a t g t g g 3 3 6 35 9 5 一c t g t g c a g c a a g a g a a 戌r j ( ；- 3 3 9 55 7 5 一( 丌- g a c g g c c c t t g t g t a g t c 3 3 4 45 7 5 一t g g a a t g t r r g g t g c t g t r b 3 2 7 66 2 5 - t r g g g aa 1 aa g g t c c c c t c b 3 3 9 85 9 5 乙a a l 3 i g c 筒r r i c t 丌瞩o c a r i g t 3 。2 8 55 9 5 - c a n 叼门t g g t r 丌g c a g g t c a 3 2 6 55 9 5 一a g g g a t g c c a g c a c t c a g 3 3 9 56 2 5 c a a 眦a c a c t t t g c t t c c t 3 3 5 85 3 5 c a g g g t g t r 眦a c a g t 丌g 3 4 9 65 7 5 - t g l g aaa r r c g c c a a g t g t g 3 2 8 65 7 5 1 r c t g a a g a c a a a c t c 丁r g g g l a 3 2 4 9 5 9 5 一t c a t g t t c a g 硝r t g c c a a a g a 3 4 7 95 6 5 - ( c t g g a a c a c t a g a g 声i t g a t g c 3 2 9 85 9 5 - c a g g t l l c a g a a a g a a g c a r 卜3 2 9 86 0 5 - c c m t g c c c t t g c 戌几1 g r r - 3 3 8 86 0 5 一c a g a g c t r r g c c a t g t l t g a 3 2 9 55 9 5 - a a a t aa c t a c c a a g c t c c t g a g a 3 3 8 45 8 5 一t t g c t t c t a a a t g a a g g g a c a a a 3 2 9 55 9 5 - a a c 下l 蜩广1 1 a g t g c c t c t t g g 3 3 6 25 9 5 - a a t g a t c a a t g g c c c a t c a - 3 3 9 95 7 5 一a g g g a a g c l l t g a g g g a c a 3 2 6 45 7 5 - a c t c a g a g c c c a g g l l c 1 f 3 。3 4 45 6 5 5 一a g a a g t c t g g g t l l c a g c a - 3 2 8l5 7 5 t - t c c 筒r a 丁n k 鲴r c ：t ( 玎g r n a 3 4 0 06 0 5 - c g g g g a a a g aa aaa g g a a a c - 3 3 5 95 0 5 5 - g g c t t g c c t g t g g a g t 陀t 3 2 8 05 5 5 - t c t n 1 c c a a c a g c a g a g g a 3 2 9 25 4 5 a g g t g c c a 觚a g c c a c a c a g 3 2 9 75 3 5 - c a g c l r c a g a a a g c a a g c a g 3 2 9 36 2 5 c c r ( 撇t a g g a c a g g t a 舶m ( 孓3 4 0 0 5 7 5 c t t g g a g g a a a c c a c a g g a a 3 3 4 7 5 5 5 6 5 5 - g c a g c a t a a g g c a g aaaa t l g 3 5 - t g a t i c t g a t t g g g g g a a a a 3 5 8 35 7 巧拍勰汐如引勉”m弱撕卯鲳姆们驼够斛钙铂钉铝锣如引驼铅m巧鲐鼹钞们酡斛 ( 2 ) 反应体系及反应条件如下： 6 5 个外显子p c r 扩增使用的是相同的体系和相同的反应条件及相应的复性 温度，均使用2 5p l 体系，各组分如下： 各组分体积( p 1 ) l0 x b u f f e r d n t p 目的基因上游引物( 1 0r t m ) 目的基因下游引物( 1 0 “m ) d n a t a q 酶( 5 u t 1 ) d d h 2 0 t b t a l 2 5 0 反应条件如下： 5 c 毗s 复性温度3 0 s 7 2 。c4 0s + 7 2 1 0m i n 3 、p c r 扩增产物检测 琼脂糖电泳检测扩增产物，5 “l 产物加上1 “l6 载样缓冲液在1 5 琼脂糖凝 胶中1 4 0v 电泳5 0m i n ，紫外灯下观察电泳结果。 4 、d g g e 技术检测马凡氏综合征患者基因突变 ( 1 ) d g g e 变性胶各组分配制 4 0 聚丙烯酰胺：丙烯酰胺3 8 9 ，甲叉双丙烯酰胺2 9 ，先加入6 0 m l 蒸馏水充 分溶解，再定容至1 0 0 m l 。 5 0 x t a e ：t h s2 4 2 9 ，冰乙酸5 7 1 m l ，0 5 me d t a ( p h 8 0 ) 1 0 0 m l ，加d d h 2 0 定 容至1 0 0 0 m l 。 o 变性液配制( 体积为1 0 0 m 1 ) 1 2 5 笱 5 d 5 5 d 2 & 2 2 0 0 l 0 l 各组分体积 4 0 聚丙烯酰胺 5 0 x t a e d d h 2 0 t e m e d 1 5 m l 2 m l 8 3 m l l o o g l 总计1 0 0 m l 1 0 0 变性液配制( 体积为l o o m l ) 各组分体积 4 0 聚丙烯酰胺 5 0 x t a e 去离子甲酰胺 尿素 t e m e d d d h 2 0 1 5 m l 2 m l 4 0 r a l 4 2 9 1 0 0 肛1 定容至l o o m l 总计looml ( 2 ) 垂直变性梯度凝胶电泳 垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测每对引物的最适解链条件( 即变性浓度) 。 按上述配方制备变性浓度为0 到1 0 0 的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度递增的方向 与电泳方向垂直。p c r 产物加上样缓冲液后上样，3 0 0 4 0 0 “l 孔，电压1 5 0 v ， 温度6 0 0 c ，时间2 h - - - 4 h 。 ( 3 ) 平行变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解 链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存 在泳动变位。p c r 产物加上样缓冲液后，2 5 p l 3 0 p l 孔，电压1 5 0 v ，温度6 0 。c ， 时间3 h - - 6 h 。 d g g e 电泳出现泳动变位的标本均重复3 次实验。 5 、测序 1 3 所有d g g e 电泳出现泳动变位的样品送往上海生工生物公司测序。 ( 二) 酶切法确定马凡氏综合征患者的基因突变 l 、引物设计与合成 在碱基变异位点处引入酶切位点，扩增后患者的序列与正常人的序列在酶切 位点处有差别。 2 、p c r 扩增 同( 一) 。 3 、p c r 扩增产物检测 琼脂糖电泳检测扩增产物，5m 产物加上1g l 载样缓冲液在1 2 琼脂糖凝胶 中1 0 0v 电泳3 0m i n ，紫外灯下观察电泳结果。 4 、酶切反应 酶切反应体系及反应条件： 各组分 体积斗l d n a 内切酶( 5 u p 1 ) b u f f e r d d h 2 0 6 o 5 2 1 1 5 t o t a l 2 0 9 l 反应条件：3 7 。c 孵育4h 。 5 、电泳检测 ( 1 ) 1 2 中性聚丙烯酰胺凝胶的配制 1 4 ( 2 ) 电泳 首先预电泳l h ，取1 2l a lp c r 产物加入5 “l 上样缓冲液，1 0 5v 电泳2 小时 至二甲苯氰指示剂至凝胶底部为止。 ( 3 ) e b 染色 1 5 实验结果 一、p c r - d g g e 技术结合测序对f b n l 基因6 5 个外显子及其邻 近内含子区域的检测结果 ( 一) f b n l 基因6 5 个外显子及其邻近内含子区域垂直d g g e 结果 对f b n l 基因6 5 个外显子及其邻近内含子区域p c r 扩增后分别进行垂直 d g g e 电泳，为后续的平行d g g e 电泳提供合适的胶浓度范围。 图l ，垂直d g g e 电泳结果 f i g 1 ，r e s u l to f v e r t i c a ld e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o m s i s a 处变性浓度为0 ，d 处变性浓度为1 0 0 。b 和c 代表p c r 产物最适变性 浓度范围。其中，b 处变性浓度= ( a b a d ) 1 0 0 ，c 处变性浓度= ( a c a d ) 1 0 0 。 ( 二) f b n l 基因第2 9 外显子及其邻近内含子区域检测结果 对1 1 名患者的6 5 个外显子检测后发现2 号患者( 系谱图中标号为3 ) 与3 号患者( i i1 ) 第2 9 外显子出现了c3 6 7 0 t ，对此家系继续检测发现另一个患者( i i3 ) 与之有相同的突变( i i3 外周血标本为后来追加收集，并未与1 1 名患者一同检测) ， 而家系中正常人并未出现此突变。 1 6 2 3 5678 图2 ，m f s 2 号患者家系系谱图 f i g 2 ，t h ep e d i g r e ec h a r to f t h em f sp m i e n t2 2 图3 ，2 号与3 号患者d g g e 检测出现泳动变位。 f i g 3 ，t h ee l e c t r o p h o r e s i sm o b i l i t ys h i f tw a sf o u n di np a t i e n t2a n dp m i e m3 t h r o u g hd g g e 2 0 0 aatbta6ct6t 2 1 02 2 0 nadc c 6dg tt 图4 ，f b n i 基因第2 9 外显子及邻近内含子区域测序结果 f i g 4 ，s e q u e n c i n gr e s u l tf o rt h e2 9 t he x o na n di t sa d j a c e n ti n t r o n so f f b n l 1 7 ( 三) f b n l 基因第5 3 外显子及其邻近内含子区域检测结果 对1 1 名患者的6 5 个外显子检测后发现7 、8 、1 0 号患者d g g e 出现了泳动 变位，测序后发现在5 2 内含子靠近第5 3 外显子处存在一个s n p 位点，n c b i 检 索其编号为