（遗传学专业论文）高效启动子的克隆及其在黄瓜和烟草组织中的活性分析.pdf

南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：- j a7 孰 珈哦年s 具，讧日 。 l ， 摘要 摘要 基因表达的最终产物是附峪和蛋白质，这两大类物质及其次级产物维持着 整个生命的有序活动。任何基因表达调控程序上的缺陷，均会对生物体造成严 重后果。因此，基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。蛋白质 编码基因的表达需要转录和翻译两大环节，每个环节都存在着不同的基因表达 调控位点。转录环节是最主要的调控位点，而启动子的调控在转录环节中又占 有十分重要的地位。因此，克隆及研究启动子的功能对于基因表达调控机制及 表达外源蛋白的研究具有十分重要的意义。 本研究使用p c r 方法从甜瓜基因组中克隆了一个双向启动子d p 。通过软件 分析该启动子在两个方向上的顺式作用元件后，发现一系列的诱导调控元件， 如d o f - b o x ，e b o x ，d p b f c o r e ，g t l c o r e ，m y c - c o r e 和w - b o x ；还发现一系列 预期能够启动下游基因高效转录的增强子元件，如c p b b i n d i n gm o t i f ， e e c m o t i f ，g a r a b o x 。 用d p 启动子在两个方向上取代载体p b l l 2 1 上i 约c a m v3 5 s 启动子，检测了该 启动子在两个方向上启动g u s 报告基因的活性，并将d p 插入到c a m v3 5 s 启动子 的下游构成双启动子，检测了其双启动子启动g u s 报告基因活性。结果表明，d p 启动子可驱动g u s 基因在黄瓜的叶、茎、果实和烟草的叶、茎中表达；在上述五 种组织中，d p 启动子在两个方向上的活性显著高于c a m v3 5 s 启动子；由d p 和 c a m v3 5 s 构成的双启动子活性反而低于单个d p 启动子在相应组织中的启动子 活性。 上述结果证明，甜瓜的d p 是一个天然的双向启动子，且其在不同组织中启 动子活性显著高于c a m v3 5 s 启动子，但不适于将d p 插入到c a m v3 5 s 启动子下 游组成双启动子在黄瓜和烟草中驱动下游基因的表达。 本研究首次从甜瓜基因组中克隆了一个天然的双向启动子，为进一步了解 植物的生长发育过程、探讨植物对其生长环境的适应机制以及更好地控制外源 基因在转基因植物中的表达等奠定了一定基础。 关键词：双向启动子、g u s 报告基因、双启动子、黄瓜、烟草 a b s t r a c t a b s t r a c t r n aa n dp r o t e i n sg o tf r o mg e n e sh a v et h em o s ti m p o r t a n tr o l e so fm a i n t a i n i n g t h en o r m a lf u n c t i o no fl i f e a n ym i s t a k ei nt h er e g u l a t i o no fg e n e se x p r e s s i o nw i l l d a m a g em u c ht ot h eo r g a n i s m s t h e r e f o r e ，t h em e c h a n i s mo fg e n er e g u l a t i o nh a s b e e nt h eh o tp o i n to fr e s e a r c h e si nl i f es c i e n c e s t h e r ea r et w os t e p s ( t r a n s c r i p t i o n a n dt r a n s l a t i o n ) d u t i n gg e n ee x p r e s s i o n t h ep r i m a r yr e g u l a t o r ys t e pi st r a n s c r i p t i o n ， i nw h i c hp r o m o t e rp l a y s v e r yi m p o r t a n tr o l e s t h e r e f o r e ，c l o n e a n ds t u d yt h e f u n c t i o n so fp r o m o t e rm a k es p e c i a ls e n s e sf o rt h es t u d yo fr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo f g e n ee x p r e s s i o na n de x p r e s s i o no fi n t e r e s tg e n ei nh o s to r g a n i s m s ab i d i r e c t i o n a lp r o m o t e r ( d p ) w a sc l o n e db yp c ra p p l i c a t i o nw i t ht h eg e n o m e d n ao fm e l o na st h et e m p l a t e a f t e rt h ea n a l y s i so ft h ep o t e n t i a lc s a c t i n ge l e m e n t s o fd pi nb o t ht h ed i r e c t i o n s ，i ti sf o u n das e r i e so fi n d u c i b l er e g u l a t o r ye l e m e n t s ，s u c h a sd o f - b o x ，e - b o x ，d p b f c o r e ，g t l - c o r e ，m y c c o r ea n dw b o x ，a n ds o m e e n h a n c e re l e m e n t s ，s u c ha sc p b - b i n d i n gm o t i f , e e c m o t i f , g a t a - b o x ，w h i c hm a y c o n f e rt ot h e h i l g h a c t i v a t i o no ft r a n s c r i p t i o no fg e n ed o w n s t r e a mu n d e ro u r p r o s p e c t i v e t h e n ，t h ep r o m o t e ri nb o t ht h ed i r e c t i o n sw e r ec l o n e di n t ov e c t o rp b l l2 1t o r e p l a c ep r o m o t e rc a m v3 5 sw i t ht h ep u r p o s e o fe v a l u a t i n gt h et r a n s c r i p t i o n a c t i v a t i o nb yu s i n gt h eu i d ar e p o r t e rg e n e f u r t h e r m o r e ，d pi nb o t ht h ed i r e c t i o n s w a si n s e r t e d i n t o t h ed o w n s t r e a mo fc a m v3 5 st of o r md o u b l ep r o m o t e rt o i n v e s t i g a t ew h e t h e rt h ed o u b l ep r o m o t e rc a ne x p r e s su d ar e p o r t e rg e n ea th i g h e r l e v e lt h a ne i t h e rd pp r o m o t e ri ne i t h e rt h ed i r e c t i o no rc a m v3 5 sp r o m o t e r t h ea n a l y s i sb a s e do nt r a n s i e n tt r a n s f o r m a t i o no fl e a v e s ，s t e m s ，f r u i t so f c u c u m b e ra n dl e a v e s ，s t e m so ft o b a c c os h o w e dt h a tt h ec l o n e dd p p r o m o t e ri nb o t h t h ed i r e c t i o n sd r o v et r a n s c r i p t i o nt om u c hh i g h e rl e v e l st h a np r o m o t e rc a m v3 5 si n a l lt h e f i v e t i s s u e sm e n t i o n e da b o v e ，a n dt h a tt h ep r o m o t e ra c t i v i t i e so fd o u b l e p r o m o t e ra r el o w e rt h a nt h ec o r r e s p o n d i n ga c t i v i t i e so fs i n g l ep r o m o t e rd pi nb o t h t h ed i r e c t i o n s t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h ed pp r o m o t e rc l o n e df r o mm e l o ni sa u a b s t r a c t n a t u r a lp o t e n t i a lb i d i r e c t i o n a lp r o m o t e r , w h i c hh a sm u c hh i g h e rp r o m o t e ra c t i v i t y t h a nc a m v3 5 sp r o m o t e ra n di ti sn o ts u i t a b l et oi n s e r td pi ne i t h e rd i r e c t i o ni n t ot h e d o w n s t r e a mo fc a m v3 5 sp r o m o t e rt of o r md o u b l ep r o m o t e rt oe x p r e s sg e n e d o w n s t r e a mi nc u c u m b e ra n dt o b a c c o i t i st h ef i r s tt i m et h a tb i d i r e c t i o n a lp r o m o t e rw a sc l o n e df r o mt h eg e n o m eo f m e l o n t h i ss t u d yw i l lb eh e l p f u lt os t u d yb i d i r e c t i o n a lp r o m o t e r sf r o mp l a n t s ，a n d g e n e r a t et r a n s g e n i cp l a n t sw h i c hc a l le x p r e s si n t e r e s tg e n ea th i 【g hl e v e lw i t ht h e p o t e n t i a lb i d i r e c t i o n a lp r o m o t e rd p k e y w o r d s ：b i d i r e c t i o n a lp r o m o t e r , g u sr e p o r t e rg e n e ，d o u b l ep r o m o t e r , c u c u m b e r , t o b a c c o 1 1 1 目录 目录 第一章 第二节 第三节 第二节 第三节 第三章 第一节 第二节 第三节 第四节 目录 第五章结论5 5 致谢5 6 参考文献。5 7 个人简历。6 1 v i 第一章引言 第一章引言 第一节研究的目的和意义 基因表达的最终产物是r n a 和蛋白质，这两大类物质及其次级产物维持着 整个生命的有序活动。任何基因表达调控程序上的缺陷或紊乱，均会对生物体 造成严重后果。因此，基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。 蛋白质编码基因的表达需要转录和翻译两大环节，每个环节都存在着不同的基 因表达调控位点。不管是原核生物还是真核生物，在基因表达调控的细节上尽 管差异很大，但两者的调控模式却具有惊人的相似性和可比性转录环节是 最主要的调控位点。而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位。因 此，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。 植物基因工程作为改善植物特异性性状或者建立新性状的工具已被广泛应 用，由此而产生了一个新的名词分子农业( 使用植物生产具有商业价值和 药用价值的蛋白质) 。它的目标是能够大量生产安全廉价的重组药用蛋白。植物 表达系统由于其本身的一些优势非常适合生产动物来源的药用蛋白，比如同哺 乳动物相似的真核表达系统、廉价、易于大规模生产、且不易产生各种污染i l j 。 植物表达系统已经被广泛应用于表达多种蛋白质，如抗体1 2 l 、人工血液代用品1 3 j 、 疫苗【4 】等。另外有很多方法已经被应用于提高外源蛋白的表达量，如特异的将外 源蛋白定位于细胞间隙或者内质刚5 1 。然而，最常用且较有效的增强外源基因表 达的方法就是使用具有较高活性的启动子和增强子。有研究报道，使用双c a m v 3 5 s 启动子驱动下游g u s 基因的转录可使其转录水平达到单c a m v3 5 s 启动子的 两倍【6 1 。 即使现在转基因工程已经广泛应用，最常用的组成型启动子依然是c a m v 3 5 s 启动子1 7 】和n o s 启动子。其中的原因是由于目前克隆到的植物内源启动子仍然 较少，只有泛素启动子【引、肌动蛋白启动子等少数的几种。另外，随着c a m v 3 5 s 启动子在转基因工程上的广泛应用，出现了一种转基因沉默现象，转基因沉默 是指同一外源基因在不同的转基因株系中的表达量不同或者外源基因不表达的 现象。当使用c a m v3 5 s 启动子在转基因植物中表达全长的i g g 时其表达量占到 可溶性总蛋白的o 3 5 到1 3 不等。为了克服这种问题，植物来源的启动子被应 、第一章引言 用于植物基因工程，有研究表明，植物内源性启动子能够在t o 、t 1 、t 2 代转基 因植物中显著提高外源基因的表达水平和降低外源基因表达差异性【9 1 。由于植物 来源启动子目前还比较少，因此克隆植物自身来源的启动子就成为了转基因工 程的一个重要研究方向。另外，当我们使用相同的启动子来表达外源基因时， 即使转基因工程中使用高活性启动子也有可能发生同源基因沉默1 1 。一个解决 的方法是减少启动子的数量。因此，使用双向启动子来表达多个基因将是未来 转基因工程的发展方向之一。由于人来基因组的测序完成，人类基因组中的双 向启动子已经被广泛报道。同样，双向启动子在其它物种中也已有报道，比如 植物病毒、老鼠等。到目前为止，植物基因组中还未见天然的双向启动子的克 隆的有关报道。 本研究使用p c r 方法从甜瓜基因组中克隆了d n a 片段d p ，通过瞬时转化研 究此启动子在黄瓜和烟草组织中相对于c a m v3 5 s 启动子的活性高低，并将此启 动子插入到c a m v3 5 s 启动子的下游构建了双启动子，检测了双启动子在黄瓜和 烟草组织中相对于c a m v3 5 s 和d p 启动子的相对活性。为我们进一步了解植物的 生长发育过程、探讨植物对其生长环境的适应机制以及更好地控n ； i - 源基因在 转基因植物中的表达等奠定一定基础。 第二节植物启动子的结构和功能 植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结 果。基因表达受生物体内各种理化因素的调节控制，生物能够根据自身需要及 环境的改变，定时、定位及定量地表达所需的基因产物。可将基因的调控分为 基因表达在d n a 水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后加工、运输 及定位等各个水平的调控。植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种 顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因启动子是重要的顺式 作用元件，是位于结构基因5 端上游区的d n a 序列，能指导全酶与模板的正确 结合，活化r n a 聚合酶，并使之具有起始特异性转录，并决定转录的方向和效 率以及所使用的r n a 聚合酶类型，是转录调控的中心。因此，植物启动子是理 解基因转录调控机制和表达模式的关键。研究表明，植物启动子区域存在各种 特征元件，通过同r n a 聚合酶i i 识别、结合，诱导转录过程。研究植物启动子， 对我们进一步了解植物的生长发育过程、探讨植物对其生长环境的适应机制以 2 第一章引言 及更好地控制外源基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。 1 2 1 转录起始位点 高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子( a u g ) _ i z 游4 0 - , 7 0b p 处。大多数情况下( 9 0 ) 转录起始位点周围为嘌呤残基。l u t c k e 等1 1 1 j 分 析了6 1 种植物的翻译启始密码的序列后指出，植物a u g 密码旁侧的序列较为 保守，常为a a c a a u g g c 。转录起始位点发生变化或缺失就会影响转录，对水 稻z b 8 基因研究表明碱基的改变不影响转录的精确起始而是影响到转录的速 率，同时1 及+ 1 嘌呤嘧啶的转换对于转录的精确起始是非常关键，但也有学者 认为该位点不足以成为转录的必须信号i l 引。 1 2 2 启动子的组成 基因的启动子区基本上是由两部分组成：一部分是形成普遍性转录结构所 需要的，通常称为核心启动区；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域。 两部分都参与基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用。启动子的结构 一般包括一些特定的基序，它们可能通过与一些调节蛋白直接或间接作用来控 制r n a 聚合酶的活性，从而特异性地转录出一定量的m r n a 。启动子富含a t 碱基，转录起始位点( 帽子位点) 一般为a ，两边通常为嘧啶碱基。以2 5 - - 一3 0 为 中心的区域称为t a t a b o x ，c a a t - b o x 以转录起点7 5 位为中心，可以增强转录 效率，没有c a a t - b o x 的基因以一个类似的a g g a - b o x 来代替。8 0 - 1 1 0b p 区 含有g c - b o x 。一般认为觚碱基对容易解链，有利于转录的起始。在启动子上 还存在着一些与反式因子相互作用的正负调控序列。习惯上将t a t a 区上游的保 守序列称为上游启动子元件( u p e ) ，这些特定序列和结构共同作用确保转录精确 而有效地起始。 1 2 2 1t a t a - b o x 植物启动子区域最具特征的就是t a t a 盒序列，是第一个被确定的r n a 聚 合酶i i 的启动子元件，也是一些反式作用因子与d n a 相互作用的位点之一。位 于转录起点上游以- - 2 5 - - 3 0 位为中心的区域富含a t 序列，其共通保守序列为 5 t c a a 唆必耥g3 t 即t a t a a a 序列1 1 3 4 1 。t a t a 盒与转录起始点之间的碱 3 第一章引言 基长度是转录精确起始的必需因素，不同基因的t a t a 盒共有序列并不完全相 同，序列的变化反映了受到了不同调节因子的作用，还有些基因缺乏t a t a 盒或 具有两个以上t a t a 盒。在t a t a - b o x 内，一个碱基的改变可以使转录效率大大 降低，而其上下游少数碱基的改变却不能阻止r n a 聚合酶继续从t a t a b o x 下 游2 0 3 0 个核苷酸处开始转录。结合t a t a b o x 及附近核苷酸的蛋白因子称为 通用转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t n ，包括t f i i a ，t f i i b ，t f i i d 和t f i i e 等。 一般被认为t a t a 盒参与决定转录的方向，并在依赖于r n a 聚合酶i i 和i i i 的启动子内起作用。近年来的研究表明，t a t a 盒是没有方向性的。上游激活因 子序列具有双重作用，既能通过r n a 聚合酶i i 加强下游的转录，又能抑制r n a 聚合酶i i 和i i i 指导的上游方向的转录【1 引。在b s p ( b o n es i a lp r o t e i n ) 基因的启动子 中，反向的t a t a 盒，即5 - t v f a t a 3 ，仍能指导下游方向的转录，而且与 t b p ( t a t a b o x b i n d i n gp r o t e i n ) 的结合能力与一般5 - t a t a a a 3 的启动子的结合 能力相似【1 6 】。这种反向的t a t a 盒能与t b p 结合并指导下游的转录表明，在真 核生物中t a t a 盒的方向并不决定转录的方向。t a t a 盒的功能依赖于它所在位 置相对于起始位点的位置，碱基置换会使最小启动子失洲1 7 1 。因此，t a t a 盒是 依赖于r n a 聚合酶i i 转录所必需的，能指导起始前复合物的形成，决定转录起 始位点，并调控上游激活蛋白的行为。 1 2 2 2ln r 元件 一 起始因子( i n r ) 是基因启动子核心结构的第二种类型，与转录起始位点相重叠 i l 剐，一致序列为p y p y a n t a p y p y ，其功能与t a t a 盒相似，能指导转录起始前 复合物的装配、决定转录起始位点并调节上游激活蛋白的活性。 关于t a t a 盒和i n r 的关系近年的研究也较多。在缺乏激活子的情况下，t a t a 因子比i n r 的活性高很多，而且i n r 的结合比只有t a t a 启动子稍有效些；在共 表达激活蛋白存在下，t a t a 因子是最有效的，i n r 活性也增加了许多，表明在 两种因子间有合作关系。对激活子s p l 则例外，它在只有i l l r 的启动子中更有效， 增加t a t a 盒并没有增加其活性，而且在t a t a + i n r 的启动子能够部分或完全抵 制由转录因子t f i i b 突变造成的负面影响1 1 9 j 。t a t a 盒和i l l r 之间的距离不是核 酸序列对精确转录起始是重要的，二者之间的特殊核酸序列可能影响转录的速 度。其他研究表明，i n r 是一个共通的因子能影响转录的方向和转录起点的定位， 然而一般来讲i i l r 不能改变启动子内包含两个核心序列因子的t a t a 活性【刎。 4 第一章引言 1 2 2 3c m i - b o x c a a t - b o x 在t a t a - b o x 的上游约5 0b p 处的一段5 c c a a t3 序列称为 c a a t - b o x 。其转录激活因子是n f l 和c t f 成员等多种蛋白，从拟南芥克隆的 n f y 新成员中大多数具有单一的组织特异性，然而a t n f y c 9 却是普遍存在的 【2 。c a a t 框对基因转录有较强的激活作用，对两个方向都可激活，而且作用距 离不定。但有些基因无此框，如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无c a a t - b o x 而被 c a t c b o x 代替。 1 2 2 4 g c - b o x g c b o x 经常在转录起始位点上游9 0b p 左右处，最近位置的g c b o x 是在 起始点上游4 0 - - 7 0b p 处，它可以处于t a t a b o x 与c a a t - b o x 之间，也可位于 c a a t - b o x 上游，位置因不同基因而异。这种框的保守序列为5 g g g c g g3 ， 可有多个拷贝，并能以任何方向存在而不影响其功能。g c 框仍需与另一种特异 的转录因子( s p l ) 结合才能促进基因转录。 第三节植物启动子的分类 到目前为止，已经有许多植物启动子被分离，不同的植物启动子能使基因 具有不同的表达特性。习惯上，将植物基因的启动子按其基因的表达方式分为 组成型启动子( 其基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达) 、 诱导型启动子( 其基因的表达受某种物质的诱导，没有诱导物存在，基因表达水 平很低甚至没有) 和组织特异性启动子( 其基因的表达分布在植物的某个组织或 器官中) 。另外还有两类较为特殊的启动子双向启动子和可变启动子。这种 分类大体上反映出了它们各自的特点，但这种分类是相对的，在某些情况下， 一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。如在水稻转基因植物中， 组成型启动子c a m v 3 5 s 所调控的基因的表达也具有组织特异性；同一启动子可 能具有两种或两种以上的特异性，双向启动子往往是组成型表达，而可变启动 子的表达通常呈组织或器官特异性。 1 3 1 组成型启动子 该类型启动子在所有组织中都启动基因表达，由这类启动子控制的结构基 5 第一章引言 因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织表达水平也没有明显差异。其特 点是：表达具持续性，r n a 和蛋白质表达量也是相对恒定；它们不表现时空特异 性，也不受外界因素的诱导。从结构上看，大多数组成型启动子转录起始位点 上游，存在有六聚体花纹( h e x a m e r m o t i f s ) 序列t g a c t g 。其往往以重复形式再现 并被6 - - 8 个核苷酸隔开，缺失及点突变分析指出六聚体花纹的存在对维持 c a m v 3 5 s 启动子、n o s 启动子和o c s 启动子的转录活性是必须的【2 】。 目前使用最广泛的两个组成型启动子是烟草花叶病毒( c a m v ) 3 5 s 启动子和 来自根癌农杆菌面质粒t - d n a 区域的胭脂碱合成酶基因启动子( n o s ) 和章鱼碱 合成酶基因启动子( o c s ) 。另外，水稻a c t l 启动子序列结构也有大量研究报道。 1 3 1 1 异源组成型启动子 c a m v 3 5 s 启动子是烟草花叶病毒基因的启动子，能在大部分植物中对异源 基因进行启动表达，是组成型启动子【2 2 1 。这种启动子在植株被c a m v 感染期间， 指导3 5 sr n a 合成，并且使之在许多双子叶植物的组织中高效表达，但它是单 子叶植物的一种较弱的启动子【矧。将该启动子分为几个区段研究的结果表明， 不同区段能够对基因表达产生组织特异性。3 5 s 启动子起始于c a m v3 5 sr n a 转录起始点9 4 1 至+ 2 0 8 的b 西i i 片段，在位于c a m v3 5 sd n a 中的4 6 至1 0 5 区段存在增强子序列，该启动子包括t a t a 盒、c a a t 盒、倒转重复序列和增强 子核心序列四个部分。从9 0b p 至+ 8b p 为a 区域，主要负责在胚根、胚乳及根 组织内表达；区域b ( 3 4 3 至9 0b p ) 主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织及维 管组织内表达。在b 区域内的增强子序列可以提高表达水平，如果3 5 s 启动子 中存在两个b 区将能使3 5 s 启动子的活性提高1 0 倍，并对异源启动子也有作用， 值得注意的是对某些启动子，b 区起到一个表达的阻遏因子作用1 2 4 j 。完整的 c a m v3 5 s 启动子是植物基因工程中应用最为广泛的组成型启动子，如在马铃薯 【2 5 1 、拟南芥【2 6 l 等植物中的转基因应用。 n o s 和o c s 启动子虽然来自细菌，但它们具有与植物相似的共有序列 ( c o n s e n s u ss e q u e n c e ) 。它们都含有与t a t a - b o x 同源的序列，该序列位于转录起 点上游3 0 - 4 0b p 处；位于5 端上游6 0 8 0b p 处也有类似的c a t - b o x 的序列。 a n g e n o n 的研究表吲z 7 1 ，n o s 和o c s 启动子也具有一定的损伤诱导和激素诱 导活性，如在1 2 3 1 1 4 之间存在有2 0 个碱基对的序列 t g a c g t a a g c a c a t a c g t c a 。它含有由六聚体花纹组成的反向重复序列，中 6 第一章引言 间由8 个核苷酸序列隔开，六聚体花纹序列可以与亮氨酸拉链蛋白因子( 调节因 子) 相互作用，该序列是对诱导其组织活性所必须的。由此可见，启动子的分类 不是绝对的，在某种意义上取决于研究方式。值得注意的是n o s 启动子在禾本 科植物中几乎没有启动表达能力或表达能力很弱。另外还发现，n o s 启动子的强 度依组织部位及器官位置不同而变化。在老组织内通常比新生组织中强，在生 殖器官内随着发育状态而不同。 1 3 1 2 来源于植物的自身的组成型启动子 从病毒中克隆出来的基因启动子序列应用到植物基因工程中，可能存在潜 在的生物不安全性，因此，从植物本身克隆活性强的组成型启动子势在必行。 n a o m i 等【2 8 1 从拟南芥的色氨酸合成酶蛋白b 亚基基i 习( p t s b l ) 和植物光敏色素b 基因( p p h y b ) 中克隆了启动子序列做为替代c a m v 3 5 s 的组成型启动子，p t s b l 、 p p h y b 启动子分别与g u s 基因融合后，转基因烟草的g u s 活性相比c a m v 3 5 s 启动子融合的g u s 活性具5 0 或更高的活性；当3 种启动子分别驱动n p t i i 标 记基因时，3 种启动子几乎都一样有用。这表明p t s b l 和p p h y b 是从植物中克 隆的替代c a m v 3 5 s 启动子的强组成型启动子。 植物a c t i n 启动子是一个高效表达的组成型启动子，a c t i n 蛋白基因是植物细 胞骨架的基本组分，因此该启动子可能在所有组织中都有活性。a c t l 启动子是 a c t i n 基因家族中使用最广泛的启动子之一，其起始转录的必需元件位于a c t l 基 因转录起始密码子上游的1 3k b 长的区域。水稻a c t l 基因5 端有大量重复的小 元件：在6 0 8 6 1 9b p 和5 5 9 - 5 7 0b p 处有一个1 2b p 的重复序列g g l 丌兀a a g t t ； 3 1 的3 4 5b p 处一前一后排列两个1 6b p 的序列a a g c c c c ( t ) a a a g t g c c t a ， 其下游相隔2 0 个碱基处重复接连8 组保守序列c c c a a 。位于这些重复元件下 游的大量序列被证实能调控基因的表达，从1 4 6 1 8 6b p 的碱基是一个多聚a 的 序列，该4 0 个碱基中有3 5 个是a 碱基。一般认为从3 5 一- 4 1 间是一个t a t a 框， 该框的3 端是一个7 9b p 的外显子，是一个g c 丰富区并包括大量的重复序列 a t c c 三聚碱基。a c t l 基因5 端有一个3 1 3b p 长的内含子，它的第一内含子序 列对基因的表达有至关重要的作用。单子叶植物常用组成型启动子还有玉米泛 素基l 习( u b i q u i t i n ) 的启动子等。 1 3 2 组织特异性启动子 7 第一章引言 由于组成型启动子会使驱动的目的基因在植物各组织中恒定而持续的表 达，过度消耗细胞内的物质和能量，不能从时间和空间上有效地调控目的基因 的表达，因此在应用中存在一定的缺陷。如外源基因在整株植物中表达，产生 的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡， 不利于产量和品质的提高；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植 物的正常生长，甚至导致死亡。如利用组成型启动子表达病毒衣壳蛋白，就可 能会引起病毒衣壳转移，从而导致植物病毒新株系的产生。另外，重复使用同 一种组成型启动子驱动2 个或2 个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或 共抑制现象i 捌。因此，人们在寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组 成型启动子，以更好地调控植物基因表达。 组织特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织 中，目前已发现这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件， 其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。深入研究这些 启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛 的应用价值。 1 3 2 1 维管组织特异性启动子 目前发现的能够定位于维管组织的启动子根据其来源基本可以分为2 种： 一是植物本身特异性表达蛋白的基因的启动子，如能在韧皮部特异表达的玉米 蔗糖合成酶基因s h l 启动子、谷氨酰胺合成酶基因g s 3 4 启动子、土壤杆菌生 根基因r o l c 、a r a b i d o p s i s 蔗糖合成酶基因a s u s l 启动子，能在木质部特异表达 的p a l2 基因( 编码苯丙氨酸脱氨酶) 启动子、c c o a o m t ( 咖啡因辅酶a 3 o 甲基 转移酶) 基因启动子、g r p l8 基因( 编码甘氨酸富含蛋白) 启动子、p t x 3 h 6 和 p t x l 4 a 9 启动子，能在植物维管组织特异性表达的p s a m1 ( 编码s 腺苷l 厂甲硫氨 酸合成酶) 基因启动子、a c t y p l ( a r a b i d o p s i st h a l o a n a 胞质亲环蛋白) 启动子。二 是能特异性侵染植物维管组织的病毒基因启动子，如能在韧皮部特异表达的 r t b v 启动子、水稻t u n g r o 杆状病毒r t b v 启动子、鸭砣草黄斑驳病毒 ( c o y m v ) 启动子等。 人们在对特异性定位启动子的研究中发现，特异性维管组织定位启动子存 在正调节元件或负调节元件，有时二者同时存在，对基因的特异性表达起调节 作用，控制基因的表达。这些调控元件包括n r e 负调控元件，r s e 调控元件( 2 6 8 第一章引言 b p ，9 8 7 3 ) ，v s e 调控元件，s e l ( 2 4b p ，1 1 99 6 ) 、s e2 等 3 0 l 。从目前的研 究来看，各个启动子的调控元件数目各不相同，调控方式的差异也很大，还没 有对这些调控元件有规律性的报道。 1 3 2 2 韧皮部特异表达启动子 韧皮部特异性启动子区别于其它类型启动子的一个显著特点是在该类启动 子序列中存在一段与启动子的韧皮部特异性表达有关的基序。将几种韧皮部特 异性启动子的序列进行比较，发现在距t a t a - b o x 上游的不同位置，有一个1 3 n t 的保守序列t a t a a g t a a c g a a t c c a ，可能与韧皮部特异表达有关。除此保守 基序外，启动子中可能还存在其它的决定韧皮部特异性的元件，例如在对杨树 树皮贮藏蛋i 兰l ( b a r ks t o r a g ep r o t e i nb s p ) 基因、笋瓜韧皮部蛋白2 基因( p p 2 ) 及竹节 花黄斑驳病毒( c o m m e l i n ay e l l o w m o t t l ev i r u s ，c o y m v ) 启动子序列分析发现，前两 者分别存在特征基序g c t a t g 和c g t a t g ，与c o y m v 启动子决定韧皮部特异 性的c c t a t g 序列极为相似，推澳 ( g c ) ( g c ) t a t g 序列可能也与启动子的韧皮 部特异性及启动子的活性密切相关。 1 3 2 3 根特异启动子 根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及 其启动子无疑是重要的。 拟南芥根中特异表达的黑芥子酶( m y r o s i n a s e ) 是由 p y k l 0 基因编码的。p y k l 0 启动子中存在若干器官特异性表达和植物激素应答 的特异元件，如a c g t - 核心序列、c a n n t g m o t i f s 、g a t a - m o t i f s 、诱导物( e l i c i t o r ) 应答元件w - b o x ( ( t ) t g a c ( c ) ) 、植物激素应答元件( 如a s 一1 元件、生长素和脱落 酸应答元件、m y b 元件) 和细胞特异表达元件等。其中a c g t ，c a n n t g ，g a t a 等顺式作用元件是决定组织器官特异表达的转录因子结合位点，m y b 元件在控 制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用。 根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际 分泌等问题。b o r i s j u k 等【3 1 】用根特异启动子m a s 2 、g f p 和烟草钙网蛋白 ( c a l r e t i c u l i n ) 基因构建融合表达载体，水培转基因烟草结果表明，根细胞不仅能 够高效生产g f p ，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。因此利用该启动 子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合，不仅可大量生产目的蛋白质，且更 便于回收产物。 9 醇脱氢酶非常 与植物体内影 启动子与马铃 白质基因的启 该启动子还包 合位点。构建 示该启动子驱 茎的发生、分 求，如人们对 素的一种含量 、远距离水分 的存在也有一 定的负面作用。因此，人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量。目前多 使用c a m v 3 5 s 启动子驱动目的基因，近年来已分离一些木质素生物合成途径中 关键酶基因的启动子，如4 c l 、f s h 等基因的启动子，人们正在尝试利用这些 特异性启动子来调节木质素的生物合成。b e l l l e l o n g 等1 3 3 】已从拟南芥中分离了 肉桂酸羟4 基化酶( c i n n a m a t e 4 - h y d r o x y l a s e ，c 4 h ) 基因的启动子，本实验室首次 从毛白杨中分离了c 4 h 启动子，并对该启动子的功能进行了初步鉴定。g u s 组 织化学染色和g u s 荧光测定结果表明，c 4 h 启动子驱动外源基因在烟草茎的维 管组织中丰富表达，有望将来利用该启动子驱动功能基因调控木质素的生物合 成过程。 1 3 2 5 叶特异启动子 研究人员从咖啡( c o 骶aa r a b i c a ) q b 克隆了1 ，5 二磷酸核酮糖羧化酶力口氧酶 ( r u b i s c o ) d , q 1 7 基基因r b c s l ，该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达。研究发 现r b c s l 启动子上游g t g g t r a a t 序列与豌豆r b c s 3 a 启动子的b o x l l 核心 序列相同；在其启动予g b o x ( g c c a c g t g g c ) 两侧分别有一个类i - b o x ( 核心序 列为g a t a a g ) ，形成i - g i 结构，推测g - b o x 十个碱基的回文结构可能结合某 个转录因子；其a b lb o x ( a g a a t i t t - t a i t ) 与其他r b c s 和c a b 基因的a t - 1 1 0 第一章引言 b o x ( a a t a i t i t r a t t ) 相比只有两个碱基不同；类l - b o x ( a a a 册a c c a a ) 与马 铃薯r b c s l 和r b c s 3 a 启动子的相同。由此可见，植物叶特异表达顺式元件具 高度保守性。 有趣的是在玉米中发现了一个双元启动子系统( d u a lp r o m o t e rs y s t e m ) 。 p d k ( p y r u v a t eo r t h o p h o s p h a t ed i k i n a s e ) 是c 4 植物光合反应中的一个叶绿体酶，该 酶基因p d k 具有一个双元启动子系统( c 4 p d k 启动子和细胞质p d k 启动子) 。这两 个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异，c 4 p d k 启动子驱动p d k 转 录成较长的m r n a ，基因产物定位在叶绿体中；细胞质p d k 启动子在p d k 基因 的第一个内含子中，驱动p d k 转录，成较短的m r n a ，它所编码的蛋白质定位 于细胞质中，又