（遗传学专业论文）脆壁克鲁维酵母pdi基因高表达菌株的构建和功能研究.pdf

摹 、 莎曩 。 - 。 a b s t r a c t a k f p d ig e n eh i g h e x p r e s s i o n c a s s e t t ew a sc o n s t r u c t e d a n dc l o n e di n t od i f f e r e n tt y p eo fv e c t o r s s o m et r a n s f o r m a n t s w i t hm u l t i c o p yn u m b e ro f i n t e g r a t e dk f p d ig e n e w e r eo b t a i n e d b yi n t r o d u c i n gt h ee x p r e s s i o nv e c t o r si n t oy e a s tk l u y v e r o m y c e s f r a g i t i s b y t h ee x a m i n a t i o no fp r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e a c t i v i t y , t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o p yn u m b e ro f t h ek f p d i g e n ei nt h ey e a s tt r a n s f o r m a n t sw a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h el e v e l o fp d ia c t i v i t i e s a ni n t e r f e r o n e x p r e s s i o n v e c t o rw a s t r a n s f o r m e di n t ot h et h ek f r a g i l i ss t r a i n sw i t hd i f f e r e n tc o p i e s o fp d i g e n et oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fo v e r e x p r e s s i o no f p d i o nt h es e c r e t i o no fi n t e r f e r o n k e yw o r d ：y e a s t ，p r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e ，g e n ee x p r e s s i o n 引言 蛋白二硫化物异构酶( p r o t e i nd i s u i f i d ei s o m e r a s e ，p d i ) 功能研究新进展 利用真核分泌系统表达外源蛋白可以对表达产物进行有效的翻译后加工 和分泌，从而保证其得到正确地折叠、组装和糖基化等修饰这些郝是保证表 达产物的生物活性所不可缺少的因素然而，有时虽然外源基因达到了高水平 转录，但蛋白产物的分泌并未能得到相应地提高在很多情况下，造成这一限 制的主要原因是未成熟蛋白在内质网中的滞留蛋白二硫化物异构酶( p r o t e i n d i s u l f t d ei s o m e r a s e ，p d i ) 作为真核生物内质网腔中的一种重要成分，它能催 化二硫键的氧化、还原和异构化，并帮助蛋白折叠以形成正确的空间结构，在 内质网中还与错误折叠的蛋白结合而沉积 i ，2 】当处于还原状态的胞质、内 吞体和细胞表面时，p d i 催化二硫键的还原，从而参与例如受体调控，细胞一细 胞之间的相互作用，基因表达和肌纤蛋白的聚合等生理过程 3 研究发现，蛋白二硫化物异构酶是一种酶和分子伴侣的集合体近年来， 人们还提出p d i 具有反分子伴侣的活性【4 】，即在某些条件下，p d i 使反应底物 发生错误折叠并加速其在细胞内的聚合 5 一方面，从酶的角度来看，p d i 蛋白催化二硫键的氧化、还原和异构以牛胰酶抑制蛋白的体外折叠为例，当 有p d i 蛋白存在时，二硫键的氧化形成速度可以提高3 5 倍，重排速度可以提高 3 0 0 0 6 0 0 0 倍 6 】6 另一方面，和分子伴侣相似，p d i 也是一种底物特异性很低 的催化蛋白有人作过实验，用不同长度和序列的多肽作底物，发现p d i 的作 用特异性只和多肽序列的长度以及c y s 残基的多少有关，说明其识别序列和分 子伴娘一样以肽链骨架为主 7 ，8 】进一步计算p d i 蛋白的克分子活性( 一种表 示酶促活力的指数) ，发现其和多数分子伴娘一样小于1 ，而酶一般要高于1 0 0 0 。 在内质网中，针对这种情况，近年来有关专家提出了折叠酶( f o l d a s e ) 的概念， 用来定义象蛋白二硫化物异构酶这类催化枸象形成有关的化学反应的蛋白分 子p d i 作为酶和分子伴侣，是构成折叠酶两个不可缺少的方面，共同完成对 二硫键的催化作用和蛋白的正确折叠 9 】，使其反应底物成为具有正常结构和 生物功能的蛋白分子目前已定义的折叠酶共有两种：一种是p d i ，另一种是 肽基脯氨酰异构酶p e p ti d y lp r o l y l is o m e f f ls o ，p p i 。 下面从p d l 分子伴侣 活性，反分子伴侣活性，p d i 在抗体突变研究中的应用以及p d i 过量表达对外 源基因的折叠和分泌的影响等几个方面加以具体阐述。 1 p d i 作为分子伴侣，是内质网中质控机制的重要组成部分 早在1 9 8 5 年，人们就提出了p d i 是一种分子伴侣这一概念，随着对p d i 蛋 白研究进一步的加深，p d i 在很多方面显示出其分子伴侣的作用例如，p d i 阻 止非折叠蛋白的聚合沉积，加速变性底物的折叠以及与多肽的结合等p d i 的 异构酶活性不仅是维持蛋白正常结构舜口功能所必需的，而且对于蛋白的分泌也 是十分重要的。缺失p d i 蛋白的异构酶活性位点会导致舍二硫键的分泌蛋白在 内质网中滞留，但并不导致不舍有二硫键蛋白的滞留。这说明p d i 作为异构酶 具有严格的底物特异性。n o i v a 等认为哺乳动物p d i 蛋白的分子伴侣活性区位 于c 端50 个氨基酸以内的酸性匠这与其异构酶活性区不同缺失分子伴侣 活性区的p d i 不再具有促进蛋白折叠的分子伴侣样作用，且这种作用与蛋白中 是否合有二硫键无关在酵母中，缺失相应的分子伴侣作用区后，其对多肽的 结合只有正常p d i 蛋白的1 4 【2 】 蛋白折叠是一个很容易发生错误的过程例如牛胰酶抑制蛋白的折叠中间 物是由内部半胱氨酸之间发生随机组合而形成的，并没有正确的时空顺序，必 须经过p d i 对之进行重排后才能继续被折叠，形成正确的空间结构，进一步修 饰加工后，形成具有生物活性的大分子 10 】 发生错误折叠的分泌蛋白在内质网中通过质控( q u a l i t yc o n t r 0 1 ) 机制被识 别，然后通过以s e c 6 1 为主要成分的蛋白通道返回细胞质，在那里被蛋白酶降 解 1 1 】内质网中的q u a l i t yc o n t r o l 机制一直是人们研究蛋白分泌的热点 随着对p p i 蛋白功能的深入研究，人们发现p d i 作为分子伴侣，在这一生理过 程中扮演着十分重要的角色当分泌蛋白进入内质网后，p d i 与含有半胱氨酸 的蛋白结合，催化二硫键之间的氧化，还原或异构，使其形成正确的空间结构； 另外，p d i 特异识别并结合发生镨误折叠的分泌蛋白，这一过程与蛋白是否舍 有半胱氨酸无关，而且当p d i 的分子伴侣活性区缺失时，其对错误蛋白的亲和 力下降为正常的1 9 【2 】 p d i 结合错误折叠的蛋白后，这一蛋白复合物所接受的分泌信号以及分泌 通道开放机制，到目前为止并不知晓。通过一系列实验所推测的由p d i 参与的 可能机制如下2 ：结合有错误折叠蛋白的p d i 与内质网中的另一主要成分免 疫球蛋白重链结合蛋白( i m m u n 0 9 1 0 b u l i nh e a v yc h a i nb i n d i n gp r o t e i n ，b i p ) 发生作用。b i p 也是具有分子伴侣活性的h s p 7 0 家族中的一员在通常情况 下，b i p 蛋白封闲蛋白运输孔道，p d i 与错误折叠蛋白所形成的复合物与b i p 结 合，使b i p 蛋白的空问构象发生变化，从孔道的内质网腔面分离下来，从而使 发生错误折叠的蛋白有可能插入运输孔道，并最终导致其通过孔道被运输到胞 质中，被那里的蛋白酶降解在一些体外的微粒体实验中，当孔道蛋白的主要 成分s e c l 6 发生突变时，错误折叠的蛋白与p d i 结合，并滞留在孔道的内质网 腔面。由此可见，p d i 参与引导错误蛋白输出内质网的过程图1 为蛋白从 内质网中输出至细胞质过程的模式图正常情况下，内质网中的b i p 与p d i 以 复合物的形式存在未折叠的分泌蛋白在内质网腔中与b i p p d i 复合物发生作 用，并使它们很快解离切掉了信号肽的蛋白处于游离或与分子伴侣结合这两 种状态，这是一个动态地不断发生变化的过程正常分泌蛋白的折叠快速有效 且随着进一步有效地折叠，它们与内质网中分子伴侣的结合越来越少，平衡很 快偏向游离状态，最终这些具有正确空间结构的分泌蛋白被包装成分泌小体， 排出内质网相反，发生突变的分泌蛋白更倾向与分子伴侣结合以防止蛋白的 聚合沉积，也许通过与错误折叠蛋白中某些疏水氨基酸的结合，p d i 识别突变 蛋白，并阻止其进一步折叠，引导其从内质网中输出，在胞质中被降解在蛋 白的折叠，包装和输出完成之后，游离的p d i 和b i p 重新结合成复合物在这 一过程中，根据底物性质不同，还有许多其它分子伴侣参与其中，包括钙联结 蛋白( c a t n e x i n ) 钙网蛋白( c a lr e t c u i t n ) ，免疫亲和蛋白( i m m u n o p h i l i n s ) 和 g r p 9 4 等 1 2 ，13 ，1 4 1 a w i l d t y p cs e c r e t o r yp r o t e i n l q ，j ， j 1 b m m f a t c k a c 吖p m t e i m 乙q l t 图1 正常与错误折叠的分泌蛋白在内质网中与分子 伴侣的作用及其运输过程 2 p d i 的反分子伴侣活性 在某些条件下p d i 会使底物发生错误折叠，并与底物一起形成聚合物，这 就是所谓反分子伴侣活性p d i 蛋白的这一特性可能是细胞行使正常功能所必 需的，但也可能是引发疾病的一个环节 一般认为p d i 从三个方面影响蛋白的折叠，这依赖其在折叠反应中的浓度 和底物的性质，即底物是否具有聚合倾向( 1 ) p d i 浓度当反应中p d i 浓度远 大于底物浓度时，就象抗原抗体反应中抗体过量的情况一样，未折叠的蛋白与 p d i 结合，而这个p d l 分子还没有和其它的蛋白结合，这样的一对一结合阻止两 者的结合物进一步聚集成网络状沉积，增加了溶质的可溶性【1 5 】因此p d i 表 现为抑制聚合，从另一角度说，即是增加蛋白的分泌( 2 ) 底物的性质当底 物不具有聚合倾向时，蛋白通过缓慢催化巯基一二硫键反应加速蛋白的折叠； 反之，则表现为加速反应底物的聚合p d i 蛋白的反分子伴侣活性还与其反应 缓冲液有关，特别与缓冲液中的离子强度有密切关系 16 ，1 7 ，1 8 】在p d i 蛋白 的突变实验中，当c 端分子伴侣活性部位的半胱氨酸被丝氨酸取代时，p d i 蛋白 完全失去分子伴侣的活性，并且无论底物和p d i 的浓度发生什么样的变化，始 4 终表现其反分子伴侣活性。实验表明，p d i 蛋白的巯基一二硫键部位对维持p d i 蛋白的分子伴侣活性有着十分重要的作用，但对于反分子伴侣活性却并非必 需另外，p d i 蛋白多肽结合区失活会影响其异构酶和分子伴侣活性，却并不 影响其反分子伴侣活性由此可见，p d i 蛋白的反分子伴侣活性确实存在，且 其活性区与异构酶和分子伴侣活性区不同。 处于还原状态，变性的溶菌酶在中性溶液中易形成聚合物p d i 在氧化及 重新折叠以产生具有生物活性的溶茵酶过程中起着重要的作用。在舍有谷胱甘 肽的缓冲液中，变性的溶菌酶( 浓度为卜1 0 u m ) 处于合成生物活性物和形成p d i 聚合物的动态平衡中当变性溶茵酶的浓度是p d i 的10 倍时，p d i 就会表现出 反分子伴侣活性，只有约1 0 左右溶菌酶形成正确的构象反之，当p d i 浓度 是变性溶菌酶的5 - i 0 倍时，p d i 表现分子伴侣活性，几乎所有的溶菌酶都会被 正确地折叠加工由于p d i 蛋白的反分子伴侣作用而形成的p d i - 溶菌酶聚合 物中p d i 与溶菌酶有着一定的比率当溶茵酶浓度为i o - 5 0 u m 时，形成最大量 聚合物时溶菌酶与p d i 的比率接近1 0 ：1 通常情况下，溶菌酶以4 0 个分子聚集 在一起，形成沉降率为23 s 的可溶物当与p d i 形成交叉形不可溶聚合物时， 每个23 s 的溶菌酶可溶物周围有4 个p d l 分子，两者一起形成网格状，如图2 所 示 蝴： 图2p d i 乖溶茸酶发生网格状聚合物的过程 p d i 的反分子伴侣作用很可能具有重要的生理功能，即作为一种定量控制 因素而使发生错误折叠的蛋白有效地滞留在内质网中。当细胞中蛋白的正确折 叠途径受到干扰时，比如蛋白的过量表达，a t p 耗尽及氧化还原处于非平衡状 态时，一些蛋白就通过与内质网中的主要蛋白b i p 1 9 ，2 0 或p d i 【2 1 形成聚合 物而滞留在内质网中。当细胞恢复正常生理状态时，内质网中的这些聚合物就 重新被正确地折叠和加工 2 2 ，23 】p d i 的这种反分子伴侣作用在一定程度上 起到了保护细胞中非折叠蛋白的作用，防止非折叠蛋白的降解 蛋白的错误折叠和聚合在许多疾病的形成中扮演着重要的角色淀粉样病 变，例如早老性痴呆，帕金森病，亨廷顿舞蹈病以及家族性淀粉样多神经病等 都与可溶性蛋白的错误折叠与聚合有关 2 4 ，2 5 ，2 6 】虽然通过特殊的折叠中间 物而形成的c y o ss - s c a f f o l dn l o t i f 已经被公认为是淀粉样物质形成的机制 2 7 】， 但众所周知，还有许多其它的聚合物也有可能是这种淀粉样物质产生的中间物 2 8 。分子伴侣等其它蛋白很可能起到了加速这种不可溶性蛋白聚合物形成的 作用另一方面，s n y d e r 等人所描述的在早老性痴呆中神经斑的主要成分 一锄y l o i d p 【2 9 的结构与p d i - 溶菌酶聚合物十分相似不仅如此，人们发现， 溶菌酶参与淀粉样疾病的发生 1 8 ，1 9 】，溶菌酶基因的突变与遗传性淀粉样变 性有关 3 0 形成聚合物是溶茵酶折叠的短暂中间物过程 3 1 】。虽然目前还没 有报道表明正常溶菌酶与p d i 之间的相互关系，但人们已在体内实验中发现 p d i 与错误折叠的溶菌酶之间有着必然的联系【3 2 】 3 p d i 在抗体突变研究中的应用 在生物工程中，p d i 较成熟的应用之一是在抗体突变的研究，通过添加p d i 而使抗体形成正确的构象，从而缩短实验周期并提高效果实验证明，在离体 系统中，b t p 和p d i 协同完成抗体折叠【3 3 】r i p 在内质网中与许多新生蛋白 都有短暂的结合【3 4 ，3 5 】和家族的其它成员一样，b i p 具有弱a t p 酶活性b i p 有一个具有选择性的肽结合区，选择性结合由7 个疏水性氨基酸组成的序列， 这在抗体折叠中是十分重要的 3 6 】未折叠抗体和b i p 的结合可以阻止其形成 半胱氨酸被掩埋的构象，使半胱氨酸充分暴露激活，从而使接下来p d i 与这样 的抗体之间有充分的结合，有利于p d i 在最大程度上发挥其异构酶活性 b i p 与底物的反复结合和解聚由a t p 的分解提供能量p d i 在这一抗体二硫键的形 成和重排中只表现其异构酶活性，而没有分子伴侣的活性【3 7 4 p d i 在外源基因表达中的应用 p d i 的第二个应用是在外源基因的表达方面，通过在大肠杆菌，酵母或昆 虫细胞中共表达p d i 来有效地提高外源基因的表达量【3 8 ，3 9 】。卖验证明，通 过过量表达蛋白二硫化物异构酶，使之对外源蛋白进行正确高效地折叠加工， 可以较大幅度地增加外源蛋白的分泌量在1 9 9 3 年，a i 3 1 1 0 等人通过实验证明 了蛋白二硫化物异构酶( p d i ) 的高表达可以增加酿酒酵母中外源蛋白的分泌量 【4o 】。他们将g a p d h 启动子控制下的酿酒酵母单拷贝删基因整合到酿酒酵母 基因组中，构建成y v h l0 菌株发现该y v h l 0 菌株与野生型菌株b 1 5 4 6 4 相比， p d i 表达量增加了1 6 倍。将带有人血小板生长因子b 同源二聚体( 助矗卜脚基 因的质粒分别导入y v h l 0 和b j 5 4 6 4 酵母菌内，实验结果发现转化y v h l 0 菌株时， 有10 种不同的酵母转化子，其平均p d g f - b b 分泌量是野生型b j 5 4 6 4 转化子分 泌量的1o 倍。在随后的研究工作中，先后有6 a 0y 4 1 】和s h u s t a 4 2 】等实验 室报告说通过宿主菌( 大肠杆菌，酵母或昆虫细胞) 中共表达蛋白二硫化物异构 酶可以有效帮助外源基因的正确折叠和高效表达在近二年的研究中人们还发 现，在帮助外源基因的正确折叠和高效表达中，p d i 对宿主菌和所表达的外源 蛋白有一定的选择性在大肠杆菌，酵母和昆虫细胞中，无论是简单的蛋白还 是复杂的融合蛋白，p d i 的过量表达都是有利的，即能增加它们的正确折叠和 分泌但在哺乳动物细胞中，p d i 的作用却并非一致例如在2 0 0 0 年，r a y m o n d d 4 3 ，4 4 】等利用中国仓鼠卵巢细胞( c h i n e s eh a m s t e ro v a r y ，c h o ) 作为宿主，通 过过量表达重组人蛋白二硫化物异构酶( r h u p o i ) 实现外源蛋白的高效表达 c h o 细胞是目前广泛用于表达重组蛋白的适宜宿主希望实现高效表达的两个 蛋白分别为白介素1 5 ( i l - 1 5 ) 和人肿瘤坏死因子受体- f c ( t n f r ：f c ) 融合蛋白 其中白介素15 是舍有2 个二硫键的球蛋白，而人肿瘤坏死因子受体- f c 融合蛋 白含有1 4 个二硫键在实现了c h o 中r h u p d i 的过量表达之后，他们发现， t n f r ：f c 在胞内的滞留增加，而分泌到细胞外的量与对照( p d i 表达在正常水平) 相比有所下降且t n f r ：f c 在胞内与r h u p d l 结合形成复合物过量表达酶活 7 性部位发生突变的r h u p d l 并不影响t n f r ：f c 在细胞中的分布 说明p d i 作为 异构酶，它的过量表达与t n f r ：f c 在细胞中的滞留有关。利用内质网中的其它 分子伴侣所进行的实验中也有类似的情况。例如在昆虫表达系统中过量表达 b i p 使外源重组蛋白的分泌量增加，同时分泌蛋白的活性也有所提高 4 5 】但 在哺乳动物细胞中过量表达b i p 却使外源重组蛋白在细胞中的滞留增加，分泌 减少 4 6 。到目前为止，在哺乳动物细胞中，过量表达分子伴侣对外源蛋白选 择性滞留作用的机制还有待进一步研究论证有人认为，这是因为用于表达外 源蛋白的宿主茵不同而造成的，但究竟是哺乳动物与其它宿主茵( 细菌，酵母 和昆虫) 哪些分泌机制的不同而造成这样的差别还有待作进一步的分析 5 p d i 在其它方面的功能 在真核细胞中，p d l 分子量约为55 k d a ，包括二个独立的 4 7 】且不完全相同 4 8 的硫氧化还原活性区，每个活性区都包括两个半胱氨酸( c g h c ) 的结构域。 p d i 以二聚体的形式存在关于p d i 蛋白的生物学功能，除了上文提到的二硫 化物异构酶，分子伴侣乖反分子伴侣作用以外，还有以下多种发现：1 ) p d i 被 发现是脯氨酸羟化酶的b 亚基，脯氨酸羟化酶是一个o 【：d ：四亚基的聚合酶，其 羟化多肽链脯氨酸的活性位点在0 【亚基上，以前认为其d 亚基有脱氢抗坏血酸 的作用，现在则倾向于认为d 亚基是帮助o 【亚基结合和稳定【4 9 】 2 ) p d i 还 是3 ，3 ，5 一三吲哚酪氨酸结合蛋白的亚基之一，有人推测p d i 上的一x d e l 引导 肽可以帮助结合蛋白留在内质网中 4 9 】在这两种复合酶中，p d i 的作用是 稳定其它多肽链的折叠构象，使其处于可溶状态，以保证其在最大程度上发挥 酶和分子伴侣的活性。3 ) 在肌肉组织中p d i 在肌质网内作为一种低亲和力高含 量c a ”结合蛋白行使功能，c a ”结合区以c 区为主【5 0 ，5 1 4 ) 对酵母研究发现 p d i 蛋白和生孢反应密切相关，同时发现p d i 的二硫键重排局限于分子内二硫 键，对分子间二硫键作用很低 5 2 】5 ) 在上皮成纤维细胞中发现p d i 和前胶原 有大量的结合和聚集，实验已证明p d i 参与了胶原的成熟、加工和运输 5 3 】 在医学领域，围绕p d i 研究的进展在近年来显著增加主要有：( 1 ) 发现 p d i 在t 细胞抗原呈递中起作用，可以结合进入细胞的多肽抗原并将之呈递给i 型m h c 分子这样的好处在于p d i 的广泛结合性使之能和进入t 细胞的各种抗 不足。但他们也有着这样那样的缺憾，有的没有已知内源质粒，在表达外源基 因时只能通过整合进行，增加了工作难度；有的遗传背景仍不够清楚，缺少合 适的选择标记：还有的在密码子用法偏爱性方面又不尽如人意 6 2 1 。这就要求 我们在利用分子生物学对有关宿主进行改造，用基因工程手段构建出能在各方 面都很“优异”的酵母表达系统。 脆壁克鲁维酵母能利用乳糖作为唯一碳源，有较强的蛋白分泌能力，长期 用于生产酒精、乳糖酶和单细胞蛋白，有良好的安全记录，是理想的基因工程 候选宿主菌，有很好的开发应用价值本实验室曾从丘m 占，j 酵母基因文 库中克隆得到一个具有蛋白二硫化物异构酶活性l ok b 大小的初始克隆”对 该克隆结构分析的结果显示，它与乳酸克鲁维酵母( k 1 u y v e r o m y c e sl a c t i s ) k i p d i 基因的氨- t - 酸编码序列有7 8 的同源性。因此将它命名为k y p d i 基因“。1 为了研究置，a 占f j j 5 酵母中砌j r 基因高表达对外源蛋白正确折叠= 币口分泌的 影响，首先需要构建k y p d i 高表达的宿主菌株本论文的工作内容为构建脆壁 克鲁维酵母k y p d i 基因高表达菌株，并在具有不同p d i 拷贝数的菌株中转入游 离干扰素表达载体，观察户口，过量表达对外源蛋白表达的影响 1 0 材料和方法 一材料 1 1 茵株 大肠杆菌ec o l i t g l ( s u p e h s d 5 t h i l a c - p r o ，f t r a d 3 6 p r o a b + l a c l q l a c z m l 5 】) ，受体茵 脆壁克鲁维酵母k l u y v e r o m y c e s 胁占，i sh k y3 9 ( u r a 3 ) ，受体茵 脆壁克鲁维酵母k l u y v c r o m y c e s ，a 占，sh k y1 1 8 ( h k b8 4 ) ，干扰素表达阳性对照 酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v j s i a ed c 0 4 ( 仅，u r a 3 ，l e u 2 ) ，受体茵 酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s l a ey 3 3 ( c 【，u r a 3 ，l e u 2 ，a d o l ，h i s 3 ) ，受体菌 1 2 质粒 名称 长度( k b )选择标记主要酶切位点 p c x j l 8 ( 1 4 7 ) 5 8u r a 3e e o r i ，b a m h l ，s a i l ，x b a i p c x j 3 ( 2 0 8 ) 5 9 5u r a 3 g 4 l8e c o r i ，b a m h l ，s a i l ，x b a l p h c i1 一i f n 吐( 8 4 ) 1 5 7 l e u 2 ，a m p b a m h l ，s a i l ，p s t l p g k p d i 3 9 5 a m p e c o r l ，b a m h l ，k p n l ，s a l l p g e r l 1 一1 8 8 2 g 4 1 8 ，a m p e c o r l ，b a m h i ，n c o r l 上述菌株和质粒均为本实验室保存 2 主要醇类 d n ar e s t r i c t i o ne n d o n u c l e as o ，t 4d n al i g as o ，c i p ，d n ap 0 1 y m e r a s ei ，d n a p o l y m e r a s ei ( k 1 e n o wf r a g m e n t ) ，d n a s ei ，d n am e i c c h l a r w e i g h t m a r k e ri i 购 自美国n e we n g l a n db i o l a b s ) 娴，美国f r o m e g a ) 奢 ，德国b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司和中国华美公司r n a s ea 购自美国s i g m a 4 匕学公司p r o t e i n a s ek 购自德国e m e r c k 公司 3 主要生化试剂 t r is 为b m e r c k 进口分装，p o l y p e p t o n e 购自瑞典日本制药株式会社，y e a s te x t r a c t b a c t o - h g a r ，y e a s tn i t r o g e n b as ew l oa m i n oa c i d s ( y n b ) 购自美国d i f c o & 司， g 4 1 8 ，l o wg e l l i n gt e m p e r a t u r e a g a r o s e ，g l a s sb e a d s ，l y s o z y m e ，s o r b i t e l 购 自美国s i g m a 化学公司， c 【一”pd a t p 购自美国d up o n t 公 司，p h e n y l m e t h a n s u l f o n y l f l u o r i d ( p m s f ) ，p e g 4 0 0 0 ，p e g 6 0 0 0 购自德国b m e r c k 公司，d i t h i o t h r e i t o l ( d t t ) ，x - g a l i p t g 购自美国f e i n b i o c h e m i c a 公司， n i tr o c e l l u l o s em e m b r a n e 购自英国a m e r s h a m ) 娴 其余试剂为国产分析纯试剂，常用试剂配制参见m o l e c u l a rc l o n i n g ( j s a m b r o o k e ta 1 ，2 n d e d i t i o n ，c o i ds p r i n gh a r b o rl a b o r a t o r yp r e ss ，1 9 8 9 ) 4 常用培养基与培养6 - f q 大肠杆菌完全培养基l b ：1 p c l y p e p t o n e ，1 n a c i ，0 5 y e a s te x tr a c t ，p h 7 0 大肠杆菌选择培养基l b a ：含有a m p i c i l l i n ( 1 0 0 u g m 1 ) 的l b 培养基 酵母菌完全培养基y e p d ：1 y e a s te x tr a c t ，2 p c i y p e p t o n e ，2 g l u c o s e 酵母茵选择培养基y e p d g ：含有3 0 0 6 0 0 u gg 4 1 8 m l 的y e p d 培养基 酵母茵选择培养基s d ：0 6 7 y n b ，2 g l u c o s e ，2 0 - 4 0 m g l 所需氨基酸及碱基， 以上均为液体培养基若配固体培养基，再加1 5 b a c t o - a g a r 若配半固体培养 基，加0 5 b a c t o a g a r 。所有培养基都以1 5 磅2 0 分钟高压灭菌 5 主要嗷器 h i t a c h ia u t o m a t i ch i g hs p e e dr e f r i g e r a t e dc e n t r i f u g e2 0 p r 一5 2 d ，j a p a n 7 2 1 分光光度计，上海第三分析仪器厂 6p c r 引物： 5 一c c a t a a g c t t t t g c c a t t c t c a c c g 一3 5 一g c t a g g t a c c t g a a t t c g a a a a c t c a t c g a g c a t c a a a t g 一3 二方法 1 b o o l l 质粒d r a 制备 ( 1 ) 碱变性法e c o i i 质粒d n a 快速微量制备 挑取在选择性平板上生长的单茵落于3 m l l a 培养基中置3 7 ( 2 摇床培养1 2 - i6 小 时，转移培养液于i 5 m le p p e n d o r f 管中，3 0 0 0 5 0 0 0 r p m ，离心5 分钟，收集茵体， 用溶液i 、i i 、i i i 按照1 ：2 ：2 5 的比例依次处理离心去除细菌碎片及染色体d n a 沉淀后再用酚氯仿抽提上清i 一2 次，无水乙醇沉淀回收，t e 溶解并用r n a s e 处 理，一2 0 保存待用 ( 2 ) e c o l i 质粒d n a 的大量制备 挑取选择性平板上生长的单茵落于5 0 m l l h 培养基25 0 三角瓶中，3 7 摇床中 培养1 6 小时培养物转于5 0 m l 离心管中，离心3 0 0 0 r p m ，5 分钟弃上清，沉淀加 溶液i 、i i 、i i i ，比例同上加同体积酚氯仿( 酚：氯仿：异戊醇为25 ：2 4 ：1 ) 抽提， 2 离心8 0 0 0r p m ，5 分钟取上层水相，加同体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提，离心同前 取上层水相。加2 倍体积无水乙醇，l 1 0 体积3 mn a a c ( p t t 4 8 ) ，一2 0 x 3 沉淀1 小 时高速离心1 0 分钟，沉淀以75 乙醇洗盐，沉淀经真空干燥后，加1 0 m l t r n a s e 溶解，3 7 ，15 分钟再进行一次酚氯仿抽提，乙醇沉淀，方法同前 沉淀最终 溶于3 - 5 m l p h 8 0t e 缓冲液中 ( 3 ) 用华顺公司出售试剂盒。步骤根据其操作手册。 2 酵母酋总d n a 少量制备 酵母茵接入4 0 r a l 培养基经3 0 c 培养过夜，4 c ，5 k ，5 m i n 离心，茵体悬浮于 3 m l0 9 ms o r b i t a l p h 7 5 的0 1 me d t a 中，力口入0 1 0 2 m lz y m 0 1 a s e1o o t ( 2 m g m 1 ) ，3 7 c ，3 0 - 6 0 分钟在v o r t e x 上加入5 m lp h7 4 的t e ( 5 0 i l l mt r i s h c i p i t 7 4 ，2 0 m re d t a ) ，临用时加入0 5 m l ，i o s d s ，充分混匀65 水浴3 0 m i n 加 入1 5m l5 mk a c ，混匀，冰浴l h 4 c 离心，1 0 k ，1 0 m i n 上清液经等体积酚氯仿 抽提二次16 离心，1o k ，1o m i n 上清液用2 体积无水乙醇室温静置沉淀10 m i n ，1 6 离心，1 0 k ，1 0 m i n d n a 沉淀抽干溶解于0 6 m l ，p h 7 4 的t e 中，加入5 0 u l ， p r o t e i o a s ek ( 2 m g m 1 ) ，3 7 ，1 h ，65 ，3 0 m i n 加入6 u 1r n as e ( 1 0 m g m 1 ) ，3 7 ，3 0 me n 等体积酚氯仿抽提，室温i o k ，5 m i n 离心，上清液用1 1 0 体积p h 4 8 的3 mn a a c 及2 体积无水乙醇，一3 0 沉淀过夜1 2 k ，15 m i n 室温离心，d n a 沉淀溶 解于p h 8 0t e ，- 3 0 保存 3 酵母总d n a 微量快速制备 3 0 培养酵母受体茵过夜离心茵体并以0 5 m l 无菌水洗涤轻微振松茵体后 悬浮在2 0 0 u l 破壁缓冲液里加入2 0 0 u l 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 和0 3 9 玻璃珠v o r t e x 振荡3 4 m i n ，加入2 0 0 u i t e ( p h 8 0 ) 离心5 m i n 取上清加入 i m l 无水乙醇沉淀离心2 m i n 弃上清加入4 0 0 u l t e 重悬浮加入3 u l1 0 m g m l r n a s e a ，3 7 c 静置5 m i n 加入1 0 u 1 4 m 醋酸氨和l m l 无水乙醇沉淀产物最后溶于 5 0 u 1 破壁缓冲液： 2 t r i t o nx - 1 0 0 ，1 s d s ，1 0 0 m mn a c l ，1 0i i i mt r is c l ( p h 8 0 ) ， l m mn a 2 e d t a 3 4d n a 限制性酶切片段分离： 将酶切完全的质粒做琼脂糖凝胶电泳，待不同的条带明显可分离后，用刀小心 割下所需条带，约1 0 0 u g ，放入e p p e a d o r f _ 管，加入溶胶液s 13 0 0 u t 及1 0 0 u l 异丙 醇，5 0 ，1 0 分钟，至完全溶解后加入柱内，离心3 0 秒，用舍有乙醇的溶液洗过 后，离心3 0 秒，弃管中乙醇，再离心5 分钟，最后用t e 缓冲液溶解，高速离心3 0 秒，收集至管e p p e t t d o r f 中。 5 线状质粒d n a 的去磷酸化 用2 - 3 倍过量的限制酶消化闭环质粒d n a ( 10 - 2 0 u g ) ，消化完全后，用等量酚： 氯仿( 1 ：1 ) 抽提一次，用等量氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提二次，加入十分之一体积3 m 醋酸钠( p h 7 0 ) 和2 倍体积无水乙醇一2 0 c 沉淀一小时，高速离心10 分钟，以回收 d n a 用9 0u 1 无菌水重溶d n a ，加入10 u l ( 1 0 x ) c i p 缓冲液( 1 0 m b fz n c l 2 ，1 0 m m m g c l2 ) ，0 5 单位c i p ( 牛小肠碱性磷酸酶) 。3 7 放置3 0 分钟加入6 u llo s d s ( 终 浓度为0 5 ) ，l u l 0 5 me d t a ( p h 8 0 ) ( 终浓度为5r a m ) ，5 u l 2 m g m l 蛋白酶k ( 终浓 度为10 0 u g m 1 ) 5 6 3 0 分钟，75 l o 分钟用等体积酚：氯仿( 1 ：1 ) 抽提一次， 用等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提二次，加入t 10 体积3 m 醋酸钠( p h 7 0 ) 和2 倍体 积冷无水乙醇，一2 0 沉淀过夜，高速离心15 分钟，弃上清，d n a 沉淀真空抽干1 5 分 钟后，溶于适量p h 8 0 的t e 中，保存于一2 0 6d n a 线性片段连接反应 ( 1 ) 普通连接 连接反应体系中若克隆片段与栽体d n a 是同一种粘性末端，则两者摩尔数之比 应不少于5 ：1 反应总体积一般不超过20 u l ，其中载体d n a 去磷酸化后取5 0 - 1 0 0 n g 进行连接反应时，因d n a 的末端特性不同而适当改变酶量和反应时间，一般平末端 连接效率低，所用酶量较多 ( 2 ) 胶内连接 将目的片段从已分离好的低熔点电泳胶上割下，转入无菌m i r c o f u g et u b e 中， 6 8 ，1 0 m i n ，v o r t e x 迅速吸取适量含d n a 的胶与栽体d n a 均匀混合，3 7 ，5 m i n 加入等体积2 x l i g a s em i x t u r e ，v o r t e x ，迅速置于冰浴中，5 m i n ，然后1 6 过夜 该反应体积一般不超过4 0 u l ，与普通连接反应相比酶量有所增加2 0 u l2 l i g a s e 4 m i x t u r e 配方：0 5u l10 0 b s a ，4 u 11 0 l i g a s eb u f f er ，4 u 11 0 m ma t p ，l u i t 4 l i g a s e ( 4 0 0u n its ) ，1 1 5u ld d h 2 0 。 7 质粒d n a 转化b c o l i 从保茵平板上挑取1 个单茵落的受体茵，接种于2 m l l b ，3 7 c ，摇床培养1 6 h 。 取0 4m 1 种子液，转接八4 0m ll b 。3 7 摇床培养2 h ( 0 1 ) 6 0 0 ；0 4 - 0 6 ) 冰浴 i o m i n 4 离心，4 ，0 0 0r p m ，5m i n ，弃上清液菌体悬浮于1 0 m l 冷5 0 m mc a c l h 冰浴2 0m i n 4 c 离心，4 ，0 0 0r p m ，5m i n 弃上清液菌体悬浮于3m l 冷5 0l i i m c a c l ：在置于冰浴上的无菌玻璃试管内反应每支转化管中加入0 3 m l 感受态菌， 0 1 m lt c m ( 1 0 d t r is - h c lp h 7 41 0m mc a c l2 ，i0 m mm g c l2 ) 加入转化d n a ，若为 完整质粒d n a ，则加入0 1 - o 2 u g ；阴性对照管内不再加任何d n a 冰浴3 0m i n 42 ，2m i n 室温，5m i n 每管中加入l m ll b 培养基。3 7 ，50 分钟往每 块选择性平板上加1 0 0 - 2 0 0 u l 转化茵液，并用无菌涂布棒涂布均匀3 7 培养1 6 h 8 缺口平移法标记探针 在e p p e n d o r f 中混合下列反应液：1 0 缺1 ：7 平移液5u l ；待标记的d n a 1 u l ( 0 5 u g ) ；d g t p ( 1 0 0 u m ) ，d c t p ( 1 0 0 u m ) ，d t t p ( 1 0 0 u r n ) 各5 u l ；d d h 2 0 2 0 u l ； d n a s e l ( 6 0 n g m 1 ) 3 u 1 加入d n ap o l y m e r a s e l5 单位1 4 反应6 0 分钟加入2 u l 0 5 m e d t a ( p h 8 0 ) 终止反应 9 杂交( t h e n 8p r o c e d u r e ) 配制预杂交液( d d h2 08 6 m l ，s a l m o ns p e r md n a ( 1 0 m g m 1 ) 0 2 m l ，n e t ( 2 0 ) 6 o m l ，d e n h a r d t 7s ( 2 0 ) 5 o r a l ，i 0 s d s0 2 m l ，总体积2 0m 1 ) 将n c 膜 放入杂交管加入预杂交液6 0 c ，2 h 加入变性后的探针5 0 0 u 1 ，杂交6 0 c ，1 6 h 用6 xs s c ，0 i s d s 洗涤3 0 m i n ，重复3 次晾干膜放射自显影 d e n h a r d ts2 0 x ( 0 4 x b s a ，0 4 p v p ，0 4 f c o l l ) n e t2 0x ( 3 m n a c l ，0 3 m t r is h c l p h 8 3 ，0 0 2 b l b d t a ) s s c2 0 ( 3 m n a