（遗传学专业论文）重组菌株合成类胡萝卜素的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文利用基因工程的手段，构建含有类胡萝卜素合成基因的工程菌株， 筛选出r 。和r 。菌株进行产类胡萝卜素的研究。结果发现： ( 1 ) 最佳发酵条件是：1 浓度的糖蜜培养基，首先3 7 恒温振荡9 小 时，加入诱导剂口1 g 后转入2 3 继续培养至4 8 小时。 ( 2 ) 类胡萝卜素的最佳抽提方法为：收集的菌体用6 m l3 m o l l 的盐酸 在室温下浸泡并振荡6 0 分钟，取出后沸水浴加热4 分钟，迅速冷却后离心， 然后用丙酮浸提。 ( ( 3 ) 应用薄板层析进行色素分离的最适展层剂为：v 甲尊：v 硼：v 石油t = 2 ：5 ：3 ，在此条件下至少可分离出五种成分。) 衫 i 够工程菌在1 l 和3 l 发酵罐中小试，其细胞生物量达到2 5 m g m l ， 色素产量达到o 5 5 p g m l 。 关键词：类胡萝h 素、重组菌、抽提色素、正交试验、发酵条件、薄层层 析、发酵罐 i 浙江大学硕士学位论文 s t u d y o nc a r o t e n o i d s b i o s y n t h e s i s o f t h er e c o m b i n a n ts t r a i n a b s t r a c t t h er e c o m b i n a n ts t r a i nh a r b o r i n gt h ec a r o t e n o i d sb i o s y n t h e s i sg e n ew a s c o n s t r u c t e dv i ag e n e t i ce n g i n e e r i n g ，a n dt w or e c o m b i n a n ts t r a i n s ( 4a n dr + 6 ) w e r es e l e c t e d a na n a l y s i so fc a r o t e n o i d sp r o d u c t i o nw a ss t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e d ： ( 1 ) t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：m e d i u mo fl m o l a s s e s ，f i r s t l yi tg r e w a t3 7 co ns h a k e rf o r9h o u r s ，t h e ni p t gw a sa d d e d a n dc u l t i v a t e da t2 3 f o r3 9h o u r s ( 2 ) a no p t i m u mm e t h o do fc a r o t e n o i d se x t r a c t e df r o mr e c o m b i n a n ts t r a i n h a db e e nc o n f u - m e a t h ec e l l sw e r ei m m e r s e di n6 r a lo f 3 m o 儿h c lo ns h a k e ra t r o o m t e m p e r a t u r e f o r6 0r a i n , a n dw e r et a k e ni n t ob u r n i n gw a t e rf o r4m i n ，t h e n w e r ec o o l e dq u i c k l ya n dc e n t r i f u g a t e d , a tl a s te x m m t e d b y a c e t o n e ( 3 ) t h ep i g m e n tw a s s e p a r a t e db yt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y o nk l e s e lg e l p l a t e 、) l r i 廿lm e t h a n o l ：a c e t o n e ：l i g a r i n e = 2 ：5 ：3 t h ec a r o t e n o i d sw e r e c o m p o s e d o f a tl e a s tf i v ec o m p o n e n t s ( 4 ) f e r m e n t a t i o nw e r ec o n d u c t e di n1 la n d3 lf e r m e n t o r t h eb i o m a s so f d r i e dc e l lw a s 2 5 m e d r n l ，a n dt h ey i e l do f c a r o t e n o i d sw a s0 5 5 “咖1 k e yw o r d s ：c a r o t e n o i d s ，r e c o m b i n a n ts t r a i n ，e x t r a c t i o n , o r t h o g o n a lt e s t ， f e r m e n t a t i o n ，f e r m e n t o r , t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 2 浙江大学硕士学位论文 前言 类胡萝h 素( c a r o t e n o i d s ) 是c 。类萜化合物，存在于植物的花、果实和 根部中，许多微生物体内也存在类胡萝h 素，而人体和动物体内不能合成 它，必须从外界摄取i l 】。类胡萝t - 素是植物生存所必不可少的，它可保护 叶绿素免受强光导致的光氧化破坏，同时它又是光合天线和反应中心复合 体不可缺少的结构成分。有些类胡萝卜素还是脱落酸a b a 合成的前体【2 】。 类胡萝h 素作为食品添加剂和营养增补剂，其优良的品质和功效，早已为 世界各国所公认，目前已广泛应用于食品、医药及饲料添加剂。类胡萝h 素不仅色泽鲜艳，而且作为维生素a 的前体，更富有营养。近年来报道1 3 一胡萝h 素是抗癌维生素，在防癌抗癌和预防心血管疾病方面有明显作用。 动物试验表明，1 3 一胡萝h 素对皮肤癌、乳腺癌、唾液腺癌、结肠癌、口腔 癌、胃癌和前列腺癌等有阻碍作用m “。全世晃对合成和天然的类胡萝h 素 ( 以1 3 一胡萝h 素计) 总需求量在l 千吨以上。在美国需求以每年1 0 - 1 5 递增率增长。在我国需求量也日益增大，已开始从澳大利亚等国进口。因 此，研究和开发生产类胡萝h 素是一个很重要的课题。 类胡萝i - 素可分成4 个亚族：胡萝卜素，如。一、b 一、y 一胡萝f 素、 番茄红素；胡萝h 醇，如叶黄素、玉米黄质、虾青素；胡萝卜醇的酯 类，如b 一阿朴一8 ，_ 胡萝h 酸酯；胡萝h 酸，如藏红素、胭脂树橙【5 q 。 目前已从自然界中分离鉴定出6 0 0 多种类胡萝h 素，约有4 0 多种可为人类 食用。已被多数国家批准使用于食品、饲料、化妆品和药品的有1 0 多种【6 】。 其中除1 3 一阿朴一8 ，_ 胡萝h 醛，1 3 一阿朴一8 ，- 胡萝h 酸乙酯和橙黄质3 种完 全由全化学合成制造外，其它均可利用相应的微生物资源产生【7 】。 l 浙江大学硕士学位论文 当前生产类胡萝卜素的方法有化学合成法和生物法两种，随着毒理学 和分析技术不断发展，合成色素的毒性问题越来越受到人们的关注，许多 国家限制合成色素的使用【8 1 。生物方法制取的类胡萝h 素是天然色素。一 是从植物中提取类胡萝卜素，例如从柑橘皮、番茄、胡萝卜中提取。吉宏 武等以狗牙根为制备材料，采用混合溶剂提取与自动柱层分析方法和正己 烷一丙酮一乙醇一甲苯与4 0 甲醇氢氧化钾浸提皂化1 2 h 的制备方法，制备了 4 种胡萝卜索：b 一胡萝卜素、叶黄素、堇黄素、新黄素嗍。由于受季节、 气候、产地和运输等条件的限制，加上植物的类胡萝h 素含量低，因此很 难大规模生产。二是微生物发酵法生产类胡萝h 素。许多微生物类胡萝卜 素的含量较高，因此用微生物生产类胡萝h 素易于大规模工业化生产，是 很具有开发潜力的。迄今，来源于微生物具有应用价值的类胡萝卜索主要 有b 一胡萝h 素、番茄红素、角黄素、叶黄素、虾青素等。 近年来关于利用微生物生产类胡萝h 素的报道甚多。红酵母 ( p h a f f l a r h o d o z y m a ) 是七十年代才发现的一种新的酵母属，它的胞内可产生 十几种类胡萝卜素，野生株中最大的组分是虾黄质。杨文等1 9 9 3 年对从红 酵母中提取类胡萝i - 素的生产方法进行初步研究，得出了一条简便、适宜 工业化生产的工艺路线t s 。王武等对红酵母产特种胡萝卜素酮进行研究， 经多次诱变和胡萝h 素酮生成条件的优化，其产率提高了1 7 倍【1 1 1 。三孢布 拉氏霉菌( b l a k e s l e at r i s p o r a ) 是产1 5 一胡萝卜素的丝状真菌，易于培养，便于 遗传操作和实现工业化生产。早在2 0 世纪6 0 年代，国外许多公司和研究 单位就对其生理代谢、遗传特征进行深入研究。乌克兰用1 0 m 3 发罐生产 三孢布拉氏霉菌，由1 9 9 2 年发酵生产b 一胡萝h 素1 2 0 m g l 发酵液提高到 2 糟 浙江大学硕士学位论文 1 9 9 6 年3 0 0 0 m g l 发酵液，生物量达7 5 9 干菌重l ，主要作为饲料添加荆m 1 。 我国自9 0 年代初就开始三孢布拉氏霉菌发酵生产b 一胡萝h 素的研究，但 由于该菌发酵时生物量大，发酵液粘稠度高，溶解氧利用难，因此主攻研 究发酵技术和后处理工艺技术“2 1 。姜文侯等利用三孢布拉氏霉菌( b l a k e s l e a t e i s p o r a ) 产类胡萝h 素，培养5 6 天总胡萝h 素产量在l g , l 以上，其中8 0 9 0 是1 3 一胡萝b 素1 4 1 。 另据文献报道，小球藻( c h l o r e l l a ) 、绿藻( c h l o r c o c c u m ) 、衣藻 ( c h l a m y d o m o n a s ) 、土壤绿藻( n e o s p o n g i o c o c c u m ) 等藻类富含类胡萝h 素中 的叶黄素m 。螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 含有较丰富的类胡萝卜素，且主要 是b 一胡萝h 素“1 。浅红链霉菌( s t r e p t o m y c e sr u b e s c e n s ) 含丰富的番茄红素， 隔孢伏革菌( p e n i o p h o r a ) 和短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m ) 贝1 含虾青素们。 除了直接从自然界中分离获得能产类胡萝p 素的微生物外，许多研究 者还进行了许多用其它方法获得产类胡萝卜素菌株的研究。用甲基磺酸乙 酯( e m s ) 和亚硝基胍( n t g ) 对红酵母野生型菌株进行诱变处理，选择对终产 物的结构类似物有抗性的已解除反馈抑制的突变株。如对1 3 一紫罗兰酮( 1 0 。 3 t o o l l ) 有抗性的突变株产虾青素可达到1 0 0 0 a e , g t h 】，用原生质体融合的方 法培育红酵母高产虾青素菌株也有报道。c h u n 成功分离出该菌的色氨酸等 氨基酸缺陷型突变株。突变株经融合产生3 5 个杂交种，其中有3 种杂交种 产虾青素显著高于亲本，达到2 0 0 0 p g g 。杂交种的d n a 含量高于亲本2 3 倍以上，而且是单核，回复突变频率稳定( q 1 1 0 i ”。 近年来，类胡萝p 素生物合成途径的研究取得巨大进展，关键酶基因 先后得到克隆，并已初步实现通过基因工程调控类胡萝h 素的合成。随着 浙江大学硕士学位论文 生命科学领域的不断扩展，基因工程技术的不断进步，将基因重组和微生 物发酵两种技术合二为一，开展类胡萝h 素生物合成的研究，不但在方法 上突破陈规，具有新意，在技术应用方面也处于领先水平。国外曾有利用 重组基因技术构建高产菌株的报道邮“q 。国内关于利用重组菌株进行发酵 生产类胡萝卜素方面的研究尚未见报道。 乙酰辅酶a l m v a ( 甲羟戊酸) l i p p ( 异戊烯焦磷酸) 上 d m a p ( 二甲基丙烯焦磷酸酯) l g p p ( - - y 基- 辛- 烯焦磷酸) l f p p ( 法尼基焦磷酸) ；+ c r t e ( g g p p 合成酶) g g p p ( 二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸) i + _ c r t b 八氢番茄红素 j + - c r t l 番茄红素 l + - c r t y d 一胡萝p 素 i + - c r t z 玉米黄素 i c r t x 玉米黄素一p 一二葡糖苷 图1 噬夏孢欧文氏菌的类胡萝i 、素生物合成简图 浙江大学硕士学位论文 类胡萝h 素通过异戊二烯途径合成，该途径是一个十分庞大的次生代 谢途径，除合成类胡萝h 素外还合成叶绿素、细胞分裂素及a b a 等物质m j 7 】。绝大多数类胡萝h 素是由8 个c ，异戊烯单位聚合而成的碳氢四萜类( 胡 萝p 素) 及其含氧衍生物( 叶黄素) 。它们最初的前体是乙酰辅酶a ，经甲 羟戊酸( m ) 形成异戊烯焦磷酸( i p p ) ，并异构化形成二甲基丙烯基二 磷酸( d m a p ) ，d m a p 再先后与三分子i p p 通过头尾结合的方式形成c 。o 的二甲基辛烯二磷酸( g p p ) 、c ，的法尼基二磷酸( f p p ) 以及c 2 。的二甲 基辛烯二甲基辛烯二磷酸( g g p p ) 。在g - g p p 的基础上，形成了八氢番茄 红素、番茄红素、b 一胡萝卜素、玉米黄素、玉米黄素二糖苷等系列的 类胡萝卜素( 图1 ) 。 在噬夏孢欧文氏菌( e r w i n i au r e d o v o r a ) 中，类胡萝卜素合成的系列反 应都是在c n 基因簇【1 9 1 编码的酶的催化下完成的。c n 基因簇由六个基因组 成，它们是c r t e 、c r t b 、e r t l 、c r t y , c r t z 、c r t x , 分别编码c _ 抡p p 合成酶， 八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶和一胡萝卜素脱饱和酶， 番茄红素环化酶，b 一胡萝卜素羟化酶以及玉米黄素一b 一葡萄糖营酶。 实验室的前期已经从拟南芥菜( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 的染色体基因库中 分离出一段含有g g p s 6 基因( 相当于c r t e 基因功能) 的3 3 k b 的d n a 片 段。所以本试验利用此基因通过体外重组d n a ，构建表达质粒p g g p s 6 ， 把质粒p a c c a r 2 5 e r t e 和p g g p s 6 先后导入大肠杆菌中进行表达。通过 产类胡萝卜素条件优化及后期的发酵调控，进一步提高类胡萝卜素的产量。 此研究不仅为微生物产类胡萝卜素开辟了条新的途径，而且对类胡萝h 素的工业化生产也将产生巨大影响。 浙江大学硕士学位论文 材料与方法 一、菌株与质粒( 见表i ) 菌株与质粒基因型来源 f 。，a r a d l 3 9 ，( a r a ，l e u ) 7 6 9 7 ， l a c x 7 4 ，g a i k ，r p s l ，d e 0 r ， 菌株： 8 0 c l l a c za m 1 5 ，e n d a l ，n u p g ， ec o l i d h l o b r c c a ，m c r a ，( m r r ，h s d r m s ， m o r b s ) 氯霉素抗性，含c r t b 、c r t l , c r t x , c r t y , 质粒： 由m i s a w a , g c r t z 等类胡萝h 素合成相关基因， p a c c a r 2 5 c r t e博士提供 1 0 7 5 k b p g g p s 6 本实验室构 氨苄青霉素抗性，含g g p s 6 基因，6 2 k b ( 以p b s k s 为载体构建) 建 p b s k s 氨苄青霉素抗性，l a c z 启动子，2 9 6 k b p q 二、培养墨 1 l b 培养基 酵母膏0 5 、蛋白胨l 、氯化钠( n a c i ) 1 、p h 7 2 2 玉米粉培养基 葡萄糖2 、磷酸氢二钾( k 2 册0 4 ) o 1 5 、磷酸二氢钾o ( h 2 p 0 4 ) 0 1 、 硫酸镁( m g s 0 4 ) 0 0 5 、玉米粉o 5 1 5 、p h 7 2 6 浙江大学硕士学位论文 3 糖蜜培养基 葡萄糖1 、k 2 h p o 0 1 5 、k h 2 p 0 0 1 、m g s 0 4 0 0 5 、糖蜜1 、 p h 7 2 以上培养基加1 5 的琼脂粉即为固体培养基，在l k g c m 2 压力条件下 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 后用于制备斜面和平板。 三、试剂 1 氨苄青s 素( a m p i c i l l i n ，加n p ) 母液5 m g m l ，最终浓度5 0 9 9 m l 。 2 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c r n ) 母液3 m g m l ，最终浓度3 0 9 9 m l 。 + 3 溶液i ：葡萄糖 5 0 m m t d s - h c l ( p h 8 o ) 2 5 r a m e d t a1 0 r a m + 4 溶液i i ：n a o h2 0 0 m m s d s1 5 溶液1 1 1 ：醋酸钠或醋酸钾( p h 4 8 ) 3 m + 6 t e 缓冲液：t r i s - h c i ( p h 8 0 ) 1 0 m m e d l al m m + 7 t s b ( t r a n s f o r m a t i o na n ds t o r a g eb u f f e r ) 溶液： l b 培养液o h 6 i ) p e g 6 0 0 0 m g c l 2 m g s 0 4 1 0 1 0 m m l o m m 浙江大学硕士学位论文 d m s o ( 4 下保存备用) 5 ( 使用前加入) 8 5 t b ef t r i s - b o r a t ee d t ab u f f e r ) 溶液： t r i s 碱 5 4 9 硼酸 2 7 5 9 0 5 me d t a ( p h 8 2 0 m l 加水定溶至l l 9 苯酚：将5 0 0 9 苯酚于6 5 c 水浴中溶解。在通风柜内，将苯酚倒入大 烧杯。加0 5 98 - 羟基喹啉和5 0 0 m l 5 0 m m o f l t r i s h c i ( p h 8 o ) 。搅拌1 0 m i n 。 每1 0r a i n 换两次t r i s h c l 。将苯酚贮存于棕色瓶中i ”】。 1 0 氯仿 1 1 7 0 酒精 1 2 无水乙醇 1 3 3 m 醋酸钠( p h 5 2 ) 1 4 1 0 溴酚兰 1 5 1 0 m g m le b ( 溴化乙锭) 1 6 。琼脂糖( 购于上海生工生物工程公司) 1 7 无菌水 + 1 8 8 0 甘油 1 9 1 m 盐酸溶液 2 0 2 m 盐酸溶液 2 1 3 m 盐酸溶液 2 2 丙酮 * 2 3 消泡液 浙江大学硕士学位论文 2 4 硅胶g 薄板( 购于华东医药股份有限公司) 2 5 甲醇 2 6 石油醚 2 7 异丙基硫代半乳糖苷( i p t g ) ( 注有“”者，需经1 k g t 3 m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0 r a i n ) 四、仪器设备 恒温培养箱、恒温振荡摇床、低温冷冻离心机、微型混合器、稳流稳 压电泳仪、h 6 一l 微型电泳槽、7 2 1 型分光光度计、l l 恒温生化反应器( b l m f 一1 7 型) 、3 l 发酵罐( 1 江f 2 0 0 0 型) 五、重组菌株的构建 1 g g p s 基因的p c r 扩增 首先，根据已发表的g g p s 6 基因的发表碱基序列设计两个引物( 上游 引物s 。和下游引物a 。) 。 s ，：5 - c 0 & 色衄g a t g c t c t g t a a g g t t 3 ( 上游引物含有e c o ri 限制位点) a ：5 - a a q q 苜正c c p d a c a g g a c c 姐1 g t a - 3 ( 下游引物含有b a m hi 限制位点) 利用s ，和a 。引物，以拟南介菜的染色体d n a 为模板，采用p c r 方 法( 9 4 c l m i n ，4 5 c 2 m i n ，7 2 c 3 m i n ，3 0 c y c l e ) 扩增出长度为1 2 k b 含有 e c o ri - b a m h i 两个酶切位点的g g p s 6 结构基因全序列片段。利用t 4 d n a 9 浙江大学硕士学位论文 连接酶将g g p s 6 基因克隆入p b s k s 质粒。 2 制备大肠杆菌d h l 0 b 感受态细胞 ( 1 ) 取4 m ll b 液体培养基，接种ec o l id h l 0 b 在3 7 ( 2 、1 6 0 r p m 摇床上 振荡培养过夜。 ( 2 ) 次日取出后接入1 0 0 m ll b 液体培养基中，3 7 c 、1 6 0 r p m 摇床上振荡 培养4 小时，使其o d 值达到0 6 左右。 ( 3 ) 将培养液冰浴2 0 m i n ，使其停止生长。 ( 4 ) 倒入离心管4 条件下4 0 0 0 r p m 离心4 m i n ，收集菌体。 ( 5 ) 加t s b 缓冲液i m l ，使菌体悬浮，再加入5 0 p 1d m s o 混匀，冰浴 2 0 m i n 。 ( 6 ) 分装1 0 0 9 l 到数个e p p e n d o r f 管中，即为转化用的ec o l i 感受态细胞 ( - 4 0 可长期保存) 。 3 质粒转化 ( 1 ) 取一管ec o l i 感受态细胞，加入0 1 “g ( 3 4 p i ) p a c c m 匕5 c r t e 质 粒，冰浴条件下静止2 0 m i n 。 ( 2 ) 加入：t s b 8 0 0 9 l d m s o 5 0 9 l 葡萄糖( 1 h d2 0 l ( 3 ) 3 7 c 条件下1 6 0 r p m 摇床培养1 小时。 ( 4 ) 取出后离心，浓缩成2 0 0 p 1 菌液，在l b + c m 固体培养基上涂平板， 在3 7 c 温n 养箱中培养一晚上，可观察到有p a c c a r 2 5 c r t e d h i o b 小 菌落形成。 1 0 浙江大学硕士学位论文 ( 5 ) 用接种环挑取菌落，接种入4 m ll b + c m 液体培养基。在3 7 条件下 1 6 0 r p m 振荡过夜。次日接种入1 0 0 m ll b + c m 液体培养基中，在正式培养 4 小时后，重复制备感受态细胞的各步步骤，最终可得到p a c c a r 2 5 a c r t e f d h l 0 b 感受态细胞。 大肠杆茵咱卜含有p a c c a r 2 5 a c r t e 质粒的大肠杆茵一一重组茵株 l i 对照菌株 注：导入质粒p a c c a r 2 5 c r t e ；导入质粒p g g p s 6 ；导八质粒p b s k s 图2 重组菌株与对照菌株的构成 ( 6 ) 取l o o p 1p a c c a r 2 5 a c r t e d h l 0 1 3 感受态细胞，加入o 1 p , gp g g p s 6 质粒，重复质粒导入的各步步骤，最后在含有c m 和a m p 的l b 固体培养 基上培养，在3 7 c 恒温培养箱中培养一晚上，观察到含有p a c c a r 2 5 a e r t e 和p g g p s 6 两种质粒的d h l 0 b 菌落的形成。 ( 7 ) 取1 0 0 1 a lp a c c a r 2 5 c r t e d h l 0 b 感受态细胞，加入0 1 1 t gp b s k s 质粒，重复质粒导入的各步步骤，最后在含有c m 和a m p 的l b 固体培养 基上培养，在3 7 c 恒温培养箱中培养一晚上，观察含有p a c c a r 2 5 e r t e 和 p b s k s 两种质粒的d h i o b 菌落的形成。 4 抽提质粒 ( 1 ) 将冷冻保存的p g g p s 6 d h l 0 b ( 或p a c c a r 2 5 a c r t e d h l 0 b ) 菌种 取出，吸取1 5 0 1 a l 接入l b 液体培养基+ a m p ( 或l b 液体培养基+ c m ) 中， 在3 7 摇床中振荡培养过夜。 浙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 次日将小试管预培养菌液接种入1 0 0 m ll b + a m p ( 或l b + c m ) 的培 养基中，在3 7 c 摇床中振荡培养过夜。 ( 3 ) 取出菌液，倒入1 0 0 m l 离，f i , 管中，在4 c 、5 0 0 0 r p m 条件下离心1 0 m i n ， 弃去上清液，收集菌体。 ( 4 ) 加入2 m l 溶液i 在旋涡混合器上剧烈振荡，使菌体悬浮，室温条件下 静止1 0 m i n 。 ( 5 ) 加入4 m l 溶液，温和倒转离心管数次，以混匀内容物( 千万不要振 荡) ，冰浴条件下静止1 0 m i n 。 ( 6 ) 加入3 m l 溶液，同上温和翻转数次，冰浴条件下静止1 0 m i n 。 ( 7 ) 4 c 条件下5 0 0 0 r p m 离心2 0 r a i n ，将上清液移至新的离心管中。 ( 8 ) 加入等体积的苯酚：氯仿( 1 ：1 ) 共s m l 并充分振荡混匀，室温下 5 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n 。 ( 9 ) 吸取上层水相移至新的离心管中，加入0 4 m ln a a c ( p h 5 2 ) ，再加入2 5 倍体积的预冷无水乙醇混匀，放入_ 4 0 冰箱中3 0 r a i n ，取出后5 0 0 0 r p m 离 心2 0 r a i n 。 弃去上清液，加入1 0 m l 预冷7 0 7 , 醇后，在5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 洗涤沉淀。 o d 弃去上清液，沉淀物自然干燥后，加入1 0 0 9 l t e 缓冲液溶解质，置 - 4 0 ( 2 冰箱中保存。 5 琼脂糖凝胶电泳 ( 1 ) 用t b e 缓冲液配置浓度为o 8 的琼脂糖凝胶1 0 0 m l ，在微波炉中完 全溶解，取出后使其冷却至6 0 左右，再加入1 0 m g m l 溴化乙锭l o u l 。 1 2 浙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 浇制琼脂糖凝胶，待其完全硬化后，放入电泳槽电泳缓冲液中，使其 液面高出胶面。 ( 3 ) 将上步所得质粒样品与溴酚兰混合，用微量可调移液器将样品加入各 个样孔。 ( 4 ) 接通电源，调电压约为5 v c m ，使样品向阳极移动。 ( 5 ) 电泳完成后，拍摄其照片。 六、重组菌株显色最佳条件及与对照菌株的对比 1 重组菌株的平板培养 表2 重组菌株的平板培养条件 将转化有p a c c a r 2 5 a c r t e 和p g g p s 6 两种质粒的菌株在平板上培 养，把这四个平板分别放到表2 的4 个条件下培养，观察菌落的生长情况 及显色情况。 2 重组菌株的液体培养 挑取一环重组菌株于3 m il b + a m p + c m 的培养基中在3 7 摇床培养过 夜，后以6 的接种量接入锥形瓶中( 5 0 m l 2 5 0 m 1 ) ，分别处在2 3 c 、2 8 ( 2 、 3 3 条件下1 6 0 r p m 培养。每隔一定的时间将菌液稀释3 倍后测光密度值， 观察不同温度菌液颜色变化的时间和程度。 浙江大学硕士学位论文 3 与对照菌株的对比 将对照菌株( 含有p a c c a r 2 5 a e r t e 和p b s k s 两种质粒) 转化菌株 在平板上培养，3 7 恒温培养箱培养过夜。次日挑取对照菌株和重组菌株 在l b + a m p + c m 平板上划线，3 7 恒温培养箱培养一天之后，转入2 3 c ：h 音 养。3 4 天后，观察两菌株菌落颜色及形态。 七、产类胡萝l 、素黄色菌株的筛选 将导入p r c c a r 2 5 c r t e 和p g g p s 6 两种质粒的重组菌液涂在 l b + a m p + c m 平板上，3 7 c 恒温培养一天。待长出菌落后，将长势好并有 可能显黄色的菌落编号。挑取编号的菌株于3 m ll b + a m p + c m 培养基中， 3 7 c 条件下1 6 0 r p m 摇床培养过夜，次日在菌液中加入最终浓度为1 5 的 甘油，混匀后置于- 4 0 ( 2 低温冰箱中保存。 平板继续在2 3 c 培养，然后从大量菌落中选出颜色比较黄，长势好的 菌落。根据编号从冰箱中取出相应的保存菌株，经预培养后加到 l b + a m p + c m5 0 m l 2 5 0 m l 的培养基中2 3 、1 6 0 r p m 培养4 8 小时。最后提 取类胡萝h 素，在4 5 0 h m 测光密度值。根据该光密度值，初筛出几个菌株。 将初筛出的菌株预培养后以6 接种量接入l b + a m p + c m5 0 m l 2 5 0 m l 的培养液中，3 t c 条件下1 6 0 r p m 恒温振荡培养8 小时后，加入最终浓度 是l m m 的i p t g 转入2 3 c 继续培养4 0 小时。提取类胡萝 素，在4 5 0 r i m 测光密度值，最终筛选出颜色黄、产量高的菌株。 1 4 浙江大学硕士学住论文 八、重组菌株类胡萝f 、素的抽提 1 研磨破壁萃取法 先取2 0 m l 菌液5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 得菌体，再用蒸馏水洗涤后5 5 c 烘干至恒重。加入石英砂、4 m l 丙酮充分研磨，离心去沉淀，用分光光度 计4 5 0 r i m 测光密度值。 2 盐酸破壁溶剂萃取法 设计正交试验，如表3 所示。取2 0 m l 发酵液5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 得 菌体，用蒸馏水洗涤后加入a 浓度h c ib “于室温振荡浸泡cr a i n ，沸水 浴加热dr a i n ，迅速冷却，3 5 0 0 r p m 离心1 0 r a i n 弃去上清液。沉淀用蒸馏 水洗涤后加入4 m l 丙酮，室温振荡3 0 m i n ，离心得上清液为类胡萝h 素提 取液，用分光光度计4 5 0 n m 测光密度值。由于类胡萝卜素易发生氧化降解 反应，在色素提取过程中应尽量减少氧的破坏，尽可能避免光和热的影响。 表3 盐酸破壁溶剂萃取法条件 3 类胡萝h 素含量的计算 将类胡萝h 素浸提液适当稀释，在4 5 0 n m 处测定吸光度( 7 2 1 型分光 光度计) ，按下列公式计算类胡萝i - 素含量p s j 。 类胡萝h 素含量( p g n d ) = a d v e w 式中：a = 最大吸收波长4 5 0 n m 下的吸光度。 1 5 浙江大学硕士学位论文 d = 浸提液稀释倍数。 v = 浸提所用有机溶剂的总体积。 w = 提取色素所用发酵液。 e = 类胡萝b 素的消光系数，为o 1 6 。 九、重组菌株产类胡萝i 、素的最佳条件 1 l b 培养基培养重组菌株 将重组菌株预培养后以6 接种量接入l b + a m p + c m5 0 m l 2 5 0 m l 培养 基中，分别在三种温度2 3 c 、2 8 ( 2 、3 3 c ，1 6 0 r p m 恒温振荡培养7 2 小时。 提取类胡萝卜素，测细胞生物量( 以茵体干重计) 。取8 0 r r t l 发酵液5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，放入5 5 c 烘箱中烘3 0 小时至恒重。 2 重组菌株、对照菌株和原始菌株在l b 培养基中生长曲线的测定 重组菌株、对照菌株经预培养后以6 接种量接入l b + a m p + c m 5 0 m l 2 5 0 r r d 培养基中，大肠杆菌也以同样条件接入l b 培养基中，1 6 0 r p m 恒温振荡培养( 重组菌2 3 ，对照菌和原始菌2 8 ) 。每隔一定时间，取 l m l 发酵液稀释4 倍后，以最初发酵液作对照，用分光光度计6 0 0 r i m 测光 密度值。并记录。 3 玉米粉培养基培养重组菌株 摇瓶装量5 0 m l 2 5 0 m l ，1 6 0 r p m 恒温振荡培养。最终提取类胡萝p 素， 用分光光度计在4 5 0 r i m 测光密度值。 根据表4 所列的四因素三水平设计正交试验。 1 6 浙江大学硕士学位论文 表4 玉米粉培养基培养重组菌株培养条件 玉米粉浓度培养温度 培养时间培养基初始p h 值 2 3 1 1 5 2 8 3 3 4 8 h 7 2 h 7 2 7 s 4 糖蜜培养基培养重组菌株 根据表5 中所列的四因素三水平设计正交试验。 表5 糖蜜培葬基培养重组菌株培养条件 摇瓶装量5 0 m l 2 5 0 m l ，1 6 0 r p m 恒温振荡培养，最终提取类胡萝h 素， 用分光光度计在4 5 0 n m 测光密度值。 5 重组菌株在糖蜜培养基中生长曲线的测定 以正交试验所得的最佳条件培养重组菌株，每隔一定时间取发酵液稀 释3 倍后在6 0 0 r i m 测光密度值。 6 通气量对重组菌株显色的影响 应用糖蜜培养基，经预培养后以6 的接种量接入摇瓶中，先在3 7 培养9 小时，加入i p t g 后转2 3 恒温振荡培养。设计三因素二水平正交 浙江大学硕士学位论文 试验( 表6 ) 。 表6 通气量对重组菌株显色的影响 十、小型发酵罐培养重组菌株 1 1 l 发酵罐培养条件优化及生长曲线的测定 应用糖蜜培养基，经预培养后以8 接种量接入小型发酵罐中的8 0 0 r a l 培养基中，参考摇瓶培养所得的产类胡萝h 素最佳条件，对小型发酵罐的 发酵条件进行优化。 在优化条件下培养并定时取样，稀释3 倍后在6 0 0 h m 测光密度值，确 定生长曲线。 2 3 l 发酵罐培养条件的优化及生长曲线的测定 应用糖蜜培养基，经预培养后以8 接种量接入3 l 发酵罐中的2 7 l 培 养基中，参考前面所得产类胡萝h 素的条件，对3 l 发酵罐的发酵条件进 行优化。在优化条件下定时取样，稀释3 倍后在6 0 0 h m 测光密度值，确定 生长曲线。 浙江大学硕士学位论文 十一、薄板层析 1 展层剂的选择 选用不同极性的展层剂，进行纸层析试验。根据纸层析r f 值及斑点的 形状选择最佳的展层剂。 2 薄板层析 取硅胶薄板置烘箱中，让温度升到1 1 0 ( 2 ，保持1 小时，关闭电源， 待温度降至室温时，取出放入干燥器中备用。将新鲜的色素提取液用毛细 管点样，以上述所得最佳展层剂展层。将点好样的薄板置于预先饱和的层 析缸中。层析结束后取出薄板晾干，观察色素斑点，计算r f 值。 1 9 浙江大学硕士学位论文 结果 一、重组菌株的获得 1 载体质粒的选取 选取适当的载体用于基因表达，而作为合适的载体通常具备以下特点： ( 1 ) 能在宿主细胞中独立复制；( 2 ) 有一定的选择标记，易于识别和筛选；( 3 ) 可插- - 段较大的外源d n a ，而不影响其本身的复制。 本实验选用了p b s k s 作为g g p s 6 基因克隆的载体，此载体为2 9 6 k b ， 含有l a c z 启动子，具有a m p 抗性标记基因( 具体见图3 ) 。 图3p b s k s 质粒结构图 浙江大学硕士学位论文 2 质粒的体外重组 ( g o p s p c r 产物) l 锚7 1 连接爵 ( p b s k s ) i 丘r i 妇h i 处理 0 g g p s 6 费粒) 图4p f i g p $ 6 质粒构建过程图 用e c o ri 和b a m h i 限制性内切酶处理扩增产物c , - g p s 6 片段和p b s k s 质粒载体，使这两种d n a 具有相同的粘性末端。并利用t 4 d n a 连接酶将 处理后的g g p s 6 基因片段连接于p b s k s 载体的多克隆位点e c o r - b a m h i 酶切位点之间，即可得到表达质粒p o g p s 6 ( 图4 ) 。表达质粒p o g p s 6 构 成后，即将其导入大肠杆菌d h l 0 b 受体细胞中，一方面为了扩增质粒， 另一方面为构建工程菌株作准备。 2 1 浙江大学硕士学位论文 3 琼脂糖凝胶电泳 将重组菌株抽提d n a 进行电泳，可观察到有明显的条带产生。电泳含 有两条条带，一条与p g g p s 6 相对应，另一条与p a c c a r 2 5 z lc r t e 相对应。 由此可知重组菌株内的确转化了两种质粒。 图5 琼脂糖凝胶电泳图 二、重组菌株显色最佳条件及与对照菌株的对比 1 平板显色的最佳条件 根据表2 所列四种条件进行平板培养，菌落的生长情况及显色情况如 表7 所示。 浙江大学硕士学位论文 表7 平板培养菌落的生长及显色情况 l3 7 黄色的菌落出现 2 8 3 7 一4 4 第2 天出现小菌落，菌落由小变大，培养5 6 天后 出现淡黄色菌落，菌落边缘界限模糊 第2 天出现小菌落，之后菌落大小基本不变，3 4 天 后菌落显黄色，颜色鲜亮，菌落小，边缘界限清晰 基本无菌落形成，无颜色变化 2 重组菌株与对照菌株的对比( 表8 ) 表8 重组菌株和对照菌株的对比 点培养的平板和划线培养的平板，两种菌株颜色对比明显，如附页图 6 照片所示。 3 液体培养显色的最佳条件 菌株接种到摇瓶后，分别在2 3 、2 8 、3 3 振荡培养，同时每隔一 定的时间肉眼观察菌液颜色的变化，并记录在6 0 0 r i m 下的光密度值。记录 结果如表9 。 浙江大学硕士学位论文 表9 液体培养显色条件 3 3 培养 2 3 2 8 u 时间丽i 虿一o d 。 颜色o d 颜色 o d 6 h o 1 1 2 0 1 5 3淡黄0 2 9 5 1 2 h 淡黄0 2 5 0黄色0 5 8 7 棕黄0 7 1 2 2 4 h棕黄0 9 5 1黄色0 8 1 3 0 8 8 3 3 0 h 棕黄 1 0 8 0棕黄0 9 5 6 0 8 2 0 3 6 h 深黄 1 2 9 00 8 4 8 0 7 8 7 4 8 h 深黄 1 3 8 9 0 7 8 80 6 5 0 5 4 h 1 3 8 0 o 7 7 4 0 6 1 5 7 2 h1 3 1 0 0 7 6 5 0 6 0 7 02 04 06 08 0 时间( 小时) 图7 重组菌在三种温度的生长曲线图 o o o o 浙江大学硕士学位论文 从图7 可知：重组菌在3 3 ( 2 条件下最先进入平稳期，但其菌液的光密 度最大值却d , - 7 ：2 8 c 和2 3 ( 2 ；2 3 c 条件下培养的重组菌生长开始有生长延 迟现象，但生长后期其产色情况明显较好。 三、产类胡萝l 、素黄色菌株的筛选 将导入p a c c a r 2 5 e r t e 和p g g p s 6 两种质粒的重组菌液涂平板后， 3 7 ( 2 培养一天，转入2 3 ( 2 恒温培养箱中继续培养，3 天后出现黄色菌落， 将黄色菌落编号。从这些显黄色的菌落中选出了3 2 个颜色比较黄，长势好 的菌落。根据编号从冰箱中取出相应的保存菌株，正式培养后提取类胡萝 h 素，其类胡萝h 素提取液4 5 0 r i m 的光密度值如表1 0 。 表l o 产类胡萝i 、素黄色菌株的筛选 由表1 0 可知不同的菌株经液体培养后，其类胡萝h 素的产量不同。从 这3 2 个菌株中，根据固体培养颜色和液体培养类胡萝h 素的产量，初筛可 得7 个菌株产量较高：。、r 。、码。、r 5 。、，、r 。、r 。将这7 个菌株 正式培养时，先3 7 c 振荡培养8 小时，加入诱导剂i p t g ，转入2 3 继续 2 5 浙江大学硕士学位论文 振荡培养4 0 小时。7 个菌株类胡萝卜素提取液在4 5 0 n m 的光密度值如表i i 。 表ii 类胡萝l 、素提取液在4 5 0 砌的光密度值 ( 注：培养过程中加入i p t g 。) 由表1 1 可以看出，加入色素诱导剂i p t g 后，各菌株的色素产量都有 提高，但提高的幅度不同，结合平板菌落的生长状况，最终筛选出两株产 色素较好的菌株：r 。和r 。菌株。 四、重组菌株类胡萝l 、素抽提方法的优化 1 研磨破壁萃取法 用此法抽提类胡萝h 素，色素抽提不完全，最终丙酮提取液在4 5 0 r i m 测光密度值，一般在0 0 5 卅