（遗传学专业论文）转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除.pdf

转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记 的消除 摘要 本论文研究是在臧晓南博士构建的转牙鲆生长激素基因集胞藻基础上进行 的。转牙鲆生长激素集胞藻通过鱼类生长因子在饵料生物体内表达，能够明显促 进鱼类的生长，可以被用来开发新型鱼类饵料添加剂。成功构建转基因藻之后， 实现高密度培养是转基因集胞藻能否走向应用的关键环节之一。 卡那霉素抗性基因在转基因集胞藻的转化中起标记基因作用，牙鲆生长因子 基因已经在集胞藻中稳定存在，不需要卡那霉素抗性基因在生产中再作为选择标 记，因此可以通过基因剔除将卡那霉素抗性基因从转基因集胞藻中敲除，彻底的 消除卡那霉素抗性基因的影响。 本实验研究了培养及组成、培养温度、光照强度等培养条件对转牙鲆生长激 素基因集胞藻生长的影响。通过研究培养基中硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐对转牙鲆 生长激素基因的集胞藻生长影响的单因子实验，得到n a n 0 3 适宜浓度范围是 1 0 - - - 1 5g l ，k 2 h p 0 4 适宜范围是0 0 4 - 0 0 6 9 l 。n a 2 c 0 3 适宜范围是0 0 2 - o 0 4 9 l l 。然后再对以上3 个营养因子进行三水平的正交实验，得到培养基中硝 酸盐、磷酸盐、碳酸盐的优化组合：n a n 0 31 2 5 9 l ，k 2 i - i p 0 40 0 4g l ，n a 2 c 0 30 0 3 g l ( 其它同b g 1 l 培养基) 。在培养基中营养盐优化基础上，对培养温度、光 照强度、p h 值进行三因素三水平的正交实验，以确定最适的培养条件。实验结 果表明，转基因集胞藻在3 0 c ，光照强度6 0 1 x m o l m - 2 s ，p h 值8 培养条件下， 藻细胞的生物量得到有效提高，特定生长速率达到2 0 6 4 ，这为转牙鲆生长激素 基因集胞藻在生产应用中高密度放大培养提供了依据。 在本实验室已经构建的质粒p z g h 基础上，包括集胞藻的同源片断g r o e s l ， i s i a b 启动子( p r o m o t e r ) ，牙鲆生长激素基因( g h ) 和卡那霉素抗性基因，根 据卡那霉素抗性基因两端的序列，用限制性内切酶n o t l 和x h o l 双酶切，获得含 有同源重组位点g r o e s l 而不含卡那霉素抗性基因的质粒。再利用转基因集胞藻 卡那霉素抗性基因两侧设计双交换同源重组位点，采用自然转化方法，将抗性基 因从转基因集胞藻中去除。 关键词：转基因集胞藻；正交实验设计；优化；培养条件：选择标记；卡那霉 素抗性基因 o p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o n sf o rt r a n s g e n i c s y n e c h o c y s t i sa n dt h er e m o v a lo fs e l e c t i v em a r k e rg e n e a b s t r a c t t h i sr e s e a u r c hw a sc a r r i e d0 1 1t h et r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i s 、析mp a r a l i c h t h y s o l i v a c e u sg r o w t hh o r m o n eg e n ew h i c hw a sc o n s t r u c t e db yd r z a n g t h et r a n s g e n i c s y n e c h o c y s t i s 谢t ht h eg r o w t hh o r m o n e ，c a t lo b v i o u s l ys p e e du pt h ef i s hg r o w t h , a n d m a yu s ef o rt h ed e v e l o p m e n to ft h ep r o m i s i n gf i s hf o o dc h e m i c a la d d i t i v e a f t e rt h e s u c c e s s f u lc o n s t r u c t i n go ft r a n s g e n i ca l g a e ，h i g hd e n s i t yc u l t u r ei st h ek e yf a c t o rf o r p r a c t i c a la p p l i c a t i o no ft h et r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i s m a l k e rg e n e sa l ee f f e c t i v e l yu s e df o rs e l e c t i o nf o rt r a n s g e n i cp l a n t s t h e e x i s t e n c eo f k a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n ei nt r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i si sm a i n l yt oc h o o s et h e t r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i sa sas e l e c t i v em a r k e r t h eg r o w t hh o r m o n eo fp a r a l i c h t h y s o l i v a c e u si sc l o n e da n de x p r e s s e ds t a b l yi ns y n e c h o c y s t i s ，t h e r e f o r et h ek a n a m y e i n r e s i s t a n tg e n ei sn o tn e e d e dt oa c ta st h es e l e c t i v em a r k e r sa n y m o r ei nt h ep r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，b yr e j e c t i n gt h ek a n a m y c i n r e s i s t a n tg e n ef r o ms y n e c h o c y s t i st h r o u g ht h eg e n e r e m o v a lm e t h o dw ec a l le l i m i n a t et h ei n f l u e n c eo f k a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n e i nt h i st h e s i s ，w eh a v ee x a m i n e dt h ec o m p o s i t i o no fm e d i u m ，c u l t u r et e m p e r a t u r e ， l i g h ti n t e n s i t yo nt h eg r o w t ho ft r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i s 、7 i ，i t l lp a r a l i c h t h y so l i v a c e u s g r o w t hh o r m o n eg e n e b ya n a l y z i n gt h ee f f e c to fn i t r a t e ，p h o s p h a t ea n dc a l b o n a t e c o n t e n ti nt h em e d i u m ，w ec o n d u c t e ds i n 西ef a c t o r e x p e r i m e n t sa n dg o tt h e a p p l i c a b l er a n g eo fc o n c e n t r a t i o no fn a n 0 3 ，k 2 h p 0 4 , n a 2 c 0 3w a si 0 1 5g l ， 0 0 4 - - - - 0 0 6 9 l ，0 0 2 - - - 0 0 4 e c lr e s p e c t i v e l y t h eo r t h o g o n a lt e s tb a s e do nt h et h r e e n u t r i e n tf a c t o r sw a sc o n d u c t e di no r d e rt oo b t a i nt h eo p t i m a lc o m b i n a t i o no fn a n 0 3 ， k 2 h p 0 4 ，a n dn a 2 c 0 3 t h en a n 0 3 ，k 2 h p 0 4a n dn a 2 c 0 3c o n c e n t r a t i o n sw e r e1 2 5 9 l ， 0 0 4g la n do 0 3g lr e s p e c t i v e l y ( t h er e s to ft h ec o m p o n e n t sw e r et h es a m ea s b g 一11m e d i u m ) o nt h eb a s i so fo p t i m a lc o m b i n a t i o no fn u t r i e n t s ，t h eo r t h o g o n a lt e s t w a sd e s i g n e dt os e a r c hf o rc u l t u r ec o n d i t i o n so ft e m p e r a t u r e ，l i g h ti n t e n s i t y , p h t h e r e s u l t so fo u re x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u mc o n d i t i o n sf o r t r a n s g e n i ca l g a ew e r ed e t e r m i n e d a s f o l l o w ：t e m p e r a t u r e3 0 ，l i g h ti n t e n s i t y 6 0 1 x r n o l m - 2 s 一，p h8 0 u n d e rt h e s eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h eb i o m a s so ft h e t r a n s g e n i ca l g ai n c r e a s e de f f e c t i v e l ya n dt h es p e c i f i cg r o w t hr a t eo ft h et r a n s g e n i c s y n e c h o c y s t i sr e a c h e dt o2 0 6 4 t h i sp a p e rp r o v i d e st h eb a s i st oa c h i e v eh i 曲d e n s i t y a n da m p l i f i c a t o r yc u l t u r i n go ft r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i s b a s e do nt h ep l a s m i dp z g hc o n s t r u c t e db yt h el a b o r a t o r yw h i c hi n c l u d i n g s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nf r a g m e n tg r o e s l ，i s i a b p r o m o t e r , p a r a l i c h t h y so l i v a c e u sg r o w t hh o r m o n eg e n ea n dk a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n e a c c o r d i n gt ot h e5 a n d3 s e q u e n c eo fk a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n e , t h ep l a s m i dw h i c h i n c l u d e sh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nf r a g m e n to fg r o s e lb u tw i t h o u tl m n a m y c i n r e s i s t a n tg e n ew 雒o b t a i n e db yu s i n gt h er e s t r i c t i o ne n z y m e sn o t ia n dx h o i b ym e a n so f l l a t u i t r a n s f o r m a t i o n , w ec a l ld e l e t et h ek a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n ef i o mt h et r a n s g e n i c s y n e c h o c y s t i st h r o u g hh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n k 吖w o r d s ：s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ；o r t h o g o n a lt e s t s ；o p t i m i z e ；c u l t u r ec o n d i t i o n ； s e l e c t i v em a r k e r ；k a n a m y c i nr e s i s t a n tg e n e 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 洼! 翅塑直墓丝霞要挂型直明数! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：细嘲签字嗍悖石月厂。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：多倦乏云 导师签字： 签字腓怖6 月【o 日 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 厶j l 刖罱 第一节集胞藻p c c 6 8 0 3 分子生物学的研究进展 1 蓝藻的简介 蓝藻是藻类生物，又称蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ，是藻类中最原始的门类， 大约3 4 亿年前地球上就已出现。大多数蓝藻的细胞壁外面有胶质衣，因此又叫 粘藻。在所有藻类生物中，蓝藻是最简单、最原始的一种。所有的蓝藻都含有一 种特殊的蓝色色素，蓝藻就是因此得名。但是蓝藻也不全是蓝色的，不同的蓝藻 含有一些不同的色素，有的含叶绿素，有的含有蓝藻叶黄素，有的含有胡萝i - 素， 有的含有蓝藻藻蓝素，也有的含有蓝藻藻红素。 蓝藻的繁殖方式有两类，一为营养繁殖，包括细胞直接分裂( 即裂殖) 、群 体破裂和丝状体产生藻殖段等几种方法，另一种为某些蓝藻可产生内生孢子或外 生孢子等，以进行无性生殖。孢子无鞭毛。目前尚未发现蓝藻有真正的有性生殖。 蓝藻是最早的光合放氧生物，对地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境起 了巨大的作用。有不少蓝藻( 如鱼腥藻) 可以直接固定大气中的氮，以提高土壤 肥力，使作物增产。还有的蓝藻为人们的食品，如著名的发菜和普通念珠藻( 地 木耳) 、螺旋藻等。 蓝藻个体微小、易于培养、生长速度快，而且它们的细胞结构和遗传特性与 革兰氏阴性菌相似，细菌的遗传操作技术可以移植到蓝藻的研究中，这使得蓝藻 成为一种独特的基因工程受体。而且一些蓝藻的天然产物具有开发应用潜力，目 前应用生物技术可以对有应用价值的蓝藻进行工厂化生产【l 】。 2 集胞藻的概述 2 1 集胞藻的背景资料 集胞藻( s y n e c h o c y s t i ss p ) p c c 6 8 0 3 属于蓝藻门( c y a n o p h y t a ) ，蓝藻纲 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 ( c y a n o p h y c e a e ) ，色球藻目( c h r o o c o c c a l e s ) ，色球藻科( c h r o o c o c c a c e a e ) ，集 胞藻属( s y n e c h o c y s t i s ) 。 1 9 6 8 年，集胞藻p c c 6 8 0 3 从淡水湖中分离出来并被保存于巴斯德菌种保藏 中心( p a s t e u rc u l t u r ec o l l e c t i o n ，p c c ) 。2 0 世纪8 0 年代，s e r g e ys h e s t a k o v 和 j o h nw i l l i a m s 教授研究发现该物种具有天然的d n a 转化系统，这为该物种的分 子生物学研究奠定了坚实的基础【2 】。该物种于1 9 9 6 年实现了全基因组测序，这 在光合作用生物中是第一个。与此同时，研究者也开始用集胞藻表达有价值的外 源产物，已经有多种药物一解毒酶、超氧化物歧化酶、金属硫蛋白等在集胞藻中 得到了表达。现在，集胞藻作为一种模式蓝藻已广泛地被全世界的科学家使用。 在应用方面，由于集胞藻无毒，其潜在的实用价值引起了科学家注意。在世界公 认的藻类食用大国日本，已开展了集胞藻在食用和安全方面的研究，阪本宪司 ( 1 9 9 8 ) 等进行了集胞藻s y - 4 培养的海产s 型轮虫对真鲷仔鱼和牙鲆仔鱼的 投喂实验，发现集胞藻可以提高仔鱼的成活率 3 1 。 国内于1 9 9 4 年开始了对集胞藻p c c 6 8 0 3 的研究，小鼠金属硫蛋白首先在该 物种中得到了表达 4 1 。1 9 9 9 年，周杰【5 】等将人肝金属硫蛋白突变体1 3 基因在集胞 藻中得到表达，2 0 0 1 年宋凌云【6 】等在集胞藻中表达人肝金属硫蛋白突变体d d 基 因。1 9 9 9 年和2 0 0 1 年，吴庆余等对集胞藻的o r f 4 6 9 基因和a g p 基因进行分子 克隆并构建了缺失突变工程株【刀。徐旭东嘲等通过对集胞藻o r f s 侧翼序列进行 p c r 扩增，研究了集胞藻定向基因插入失活的策略，孔任秋1 9 等开展了集胞藻的 随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选工作。随着集胞藻基因工程和分子生物 学研究的升温，集胞藻应用方面的研究也迅速开展起来，郭祥学【1 0 】等也在集胞 藻p c c 6 8 0 3 中表达了小鼠金属硫蛋白，使转基因藻株对金属离子的抗性约为野 生藻2 倍，王淑瑶1 等对转小鼠金属硫蛋白基因集胞藻6 8 0 3 的培养方法进行了 研究，王永红【1 2 】等研究了集胞藻6 8 0 3 的混合培养光照强度和葡萄糖的影响， 还研究了封闭式光生物反应器集胞藻6 8 0 3 光自养和混合营养培养比较。可见集 胞藻不仅是在分子生物学研究中有广泛的应用，它更将在实际应用中有广阔的前 景。 集胞藻是地球上最早进行光合作用的生物之一，距今已生存了约3 5 亿年， 在集胞藻存在的漫长的历史中，其基因具有高度的保守性，始终与蓝藻中的其他 2 转牙鲆生 ：= 激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 种类保持着高度的同源性。目前还没有关于集胞藻对人类健康和生态环境造成过 不利影响的记载。 2 2 集胞藻的生物学特性 生长，但必需每天接受5 m i n 的短时光照，称为光激活异养生长( l a h g ) 。l a h g 强在0 5 9 m 0 1 m - 2 s 1 以下。显然，短时的弱光对集胞藻6 8 0 3 只是种环境信号， 调节细胞异养代谢，这为集胞藻的大规模培养提供了有利的条件。 漕。j 演。誊j 必 。j a 。，。屯 “茹一 淄 ： 菇盛渗 湖矽 妒茹，0 多? 够翻 。 ” 湓垒漤 j o0 2 3 集胞藻的基因组 集胞藻作为一种古老的物种，它的基凶具有很大保守性，其他种类的蓝藻 始终保持着高度的同源性。集胞藻6 8 0 3 具有天然的d n a 转化系统，被作为光 合系统分子生物学研究的重要模式生物0 1 3 】。该种全基因组序列于19 9 6 年公布1 4 】， 是最早完成序列分析的几种微生物之一，而在光合生物中则是第个。集胞藻 6 8 0 3 的基因组大小为3 , 5 7 3 ，4 7 0 b p ，含有3 1 7 2 个编码蛋白的潜在基因，还有两个 r r n a 基凶丛和4 3 个t r n a 基凶。 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 集胞藻采用分裂生殖的生殖方式，一般情况下不与同种或近缘种发生杂交， 因此不会与同种或近缘种进行遗传物质交换，不存在与其他生物进行遗传物质交 换的可能性。在目前对集胞藻的基因操作中，均未发生集胞藻的自发性突变现象。 而且也没有由于集胞藻的遗传变异而对人类健康或生态环境造成不利影响资料。 2 4 集胞藻p c c 6 8 0 3 的质粒和载体系统 载体是指携带外源基因并导入到受体细胞中的中间介质，它是影响外源基因 表达效果及表达稳定性的重要因素，也是基因工程的关键所在。藻类基因工程中， 除可利用病毒质粒以及从中派生出的具有各种特点的载体外，还可利用藻类自身 的质粒构建成穿梭载体。 自1 9 7 3 年a s a t o 1 5 】发现蓝藻质粒以来，已在约5 0 被检测单细胞及丝状蓝 藻证明了内源性质粒的存在，质粒数目从l l0 不等，大小在1 3 1 3 0 k b 之间。 人们已经检测到一些质粒体内体外转录和翻译的产物。1 9 9 3 年y a n g 等l l6 j 从集胞 藻p c c 6 8 0 3 中分离了小分子量的质粒p c a 2 4 及通过测序可知p c a 2 4 含有2 4 7 8 个核苷酸，有一个复制蛋白基因r e p a 基因。通过对r e p a 基因诱导的氨基酸序列 分析，质粒p c a 2 4 的r e p a 基因编码的复制蛋白与宋内志贺菌质粒p k y m 的r e p a 的基因编码的复制蛋白、革兰氏阳性菌p u b l l 0 质粒编码的复制蛋白、念珠藻质 粒和织线藻质粒p r f l 的开放阅读框编码的蛋白具有同源性。s c h w a b c 等【 】将铜 锈微囊藻m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 的内源质p m a i 插入p u c l 8 中构成载体p c m a i ， 转化e c o l i ，发现在其中新合成了两个多肽产物，分别为5 0 k d 和4 3 k d 。 2 0 0 3 年，k a n e k o 等研究发现集胞藻的基因组中含有大小几个不同的质粒， 目前已经获得的质粒的有p s y s m ( 1 2 0k b ) ，p s y s x ( 1 0 6k b ) ，p s y s a ( 1 0 3k b ) a n dp s y s g ( 4 4k b ) 。 蓝藻的内源性质粒不能直接作为载体用于转化蓝藻。利用蓝藻内源质粒与 e c o l i 质粒及其衍生的质粒载体重组构建穿梭载体已成为蓝藻遗传操作的基本途 径。只有构建不仅含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点，而且也含有蓝藻源质粒 的复制起始位点的穿梭质粒，才能既转化大肠杆菌，又能转化蓝藻。 集胞藻6 8 0 3 转基因载体构建的主要方法是利用d n a 同源重组实现外源基 因在集胞藻6 8 0 3 中的稳定表达。w i l l i a m s1 1 8 l 利用集胞藻6 8 0 3 的光系统i i 基因作 4 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 为同源重组平台，将含有卡那霉素抗性基因的质粒转入集胞藻6 8 0 3 中。吴桂芳 1 1 9 1 通过p c r 扩增了集胞藻的a g p 基因，进一步以p u c l l 8 为载体将其克隆到大 肠杆菌中，构建了p u c a 质粒。通过d n a 体外重组，以红霉素抗性基因部分取代 a g p 基因片段，构建了既含a g p 基因上游及下游序列又携带选择性标记一红霉素 抗性的p u c a e 质粒。该质粒转化野生型集胞藻6 8 0 3 细胞，获得了能在含红霉素 的培养基上正常生长的a g p 基因缺失突变株。 2 5 筛选方法的研究 1 9 9 2 年，s o d e r 0 】等在研究海洋集胞藻的转化时发现了抗性转化子的筛选只 能在含有2 5 r t g m l 卡那霉素的液体培养基中进行。w i l l i a m s t l 8 】认为如果集胞藻 6 8 0 3 的基因组含有6 8 拷贝，在转化后，恢复培养1 8 小时，将藻细胞涂布在含有 1 0 1 - l g m l 的k m 的固体培养基上连续划线培养一个月以分离转化子。周杰【5 】等则将 恢复培养两天后的集胞藻直接置于含有5 0 p 咖l 氨苄青霉素的抗性平板上的滤膜 上，两周后筛选得到转化子，再转到相同浓度的液体培养基中扩大培养。宋凌云 等【6 1 先筛选起始浓度1 5 1 a g m l ，在含5 0 r t g n 1 l 氨苄青霉素b g - l1 培养液中扩大培养。 吴庆余等则是先在3 0 i - t g m l 的红霉素平板上筛选，再转入相同浓度的液体培养基 中扩大培养。孔任秋等【9 】在转化集胞藻6 8 0 3 后，将其涂于覆有混合酯纤维素膜的 b g 1 1 平板，光照一天后转到7 5 t g m l k m 的平板上，一周内长出转化子。 因此，转化后恢复培养对于外源基因在集胞藻6 8 0 3 中的表达是很有必要的。 恢复培养的时间太短或太长都不利于外源基因的表达。转化子的筛选可以直接在 固体平板上进行，但固体培养基表面最好覆有滤膜。l “f 匆k t 2 1 】等研究集胞藻6 8 0 3 的最佳转化条件的结果表明将细胞涂布于覆有滤膜的固体培养基上能提高转化 子的数量。 2 6 转化方法的研究 1 9 6 8 年b a z i n 证实了蓝藻的遗传重组现象和1 9 7 0 年s h e s t a k o v 与k h y e n 2 2 l 首次在s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 3 中发现d n a 的天然转化作用以来，至今已发 展了两种类型的蓝藻基因转移系统：一种是遗传转化( g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ) 系 统，包括天然转化，诱导转化，电击转化；另一种是接化( c o n j u g a t i o n ) 系统。 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 目前，认为能被天然转化的蓝藻都是无异型分化的单细胞蓝藻。在集胞藻 6 8 0 3 中实现的转化方法有：1 、接合转移。丝状蓝藻基因转化的有效系统。2 、 自然转化。集胞藻6 8 0 3 已经被确认也具有自然转化系统田】，而且越来越多的人 利用集胞藻6 8 0 3 的天然转化系统进行基因转化。 在在转化时候，藻细胞与外源质粒温浴的时间，外源基因的用量等对集胞藻 自然转化效率也有一定的影响。在低d n a 浓度下，转化子数量与d n a 浓度呈 线性关系，在高浓度下计量曲线出现平台，d n a 的半饱和浓度为2 9 9 m l ，饱和 浓度为5 0 p g 瑚。温浴时间在不同实验室的做法中有所不同，吴桂芳等将转化细 胞与外源d n a 混合物温浴了9 小时；w t u i a m s t l 8 】转化时温浴时间为6 小时； k u f r y k t 2 l 】等在研究集胞藻6 8 0 3 的最佳转化条件得出结论：当d n a 浓度在 o 1 ，1 0 p g m l 时，集胞藻6 8 0 3 的最佳转化时间是6 小时。 此外，转化时集胞藻的状态、转化时是否需要光等也都是影响转化效率的因 素。臧晓南研究表明，不同生长期的集胞藻p c c 6 8 0 3 转化效率也不相同，峰值 出现在对数生长中期，生长状态越好，转化效率越高。这可能是集胞藻培养时间 增长，d n a 酶大量聚集在细胞表面，会产生粘液而不利于外源d n a 的进入。在 d n a 吸收阶段是否需要光，不同的作者意见不同。在已成功转化的试验中，通 常是在光照条件下温浴，而郭祥学等在用穿梭质粒转化集胞藻6 8 0 3 ，是将细胞 与质粒载体在黑暗中培养6 小时，在抗性平板上筛选到了抗性藻株。 3 集胞藻6 8 0 3 的应用前景 集胞藻p c c 6 8 0 3 是一种单细胞蓝藻，在自养和异养条件下均可以生长。它具 有自然转化外源d n a 的能力，是一种良好的转基因材料。蓝藻作为转基因受体系 统和生物反应器，兼具微生物和植物的优点。它可以利用葡萄糖进行异养生长， 可以高密度培养，在实际生活中可以用来生产有用的药物及其他产物。而且集胞 藻作为蓝藻的一种，其潜在的食用价值已经引起了科学家注意。现在，研究者开 始利用集胞藻表达有用的基因产物，1 9 9 9 年周杰等用集胞藻表达了人肝金属硫 蛋白突变体d 基因，2 0 0 1 年宋凌云等又在集胞藻中实现了人肝金属硫蛋白突变体 b 基因表达。随着集胞藻的科研及实用价值逐渐被人们所认识，利用集胞藻6 8 0 3 进行科学研究和生产生活必将迎来它广阔的前景。 6 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 第二节鱼类生长激素异源表达的研究概况 鱼生长激素是鱼类脑垂体中分泌的促进生长的单一亚基的蛋白激素。它参与 鱼的生长代谢，能够加速蛋白质合成和脂类降解等生理功能，鱼生长激素能够大 大地加快鱼类的生长，在鱼类的水产养殖领域有重大的应用价值。2 0 世纪3 0 年 代以来，在对生长激素生物化学功能研究的基础上，对鱼类生长激素的生理功能 和作用机制进行了系统深入的探讨，为鱼类生长激素基因工程研究奠定了基础。 随着分子生物学技术的发展，4 0 多种鱼类的生长激素基因及其c d n a 被克隆， 鱼类生长激素基因工程研究取得了一系列重要进展：应用d n a 重组和基因转移 技术，获得了多种转生长激素基因鱼，由于重组生长激素基因的“内源性”表达， 转基因鱼获得生长快、饵料转化效率高等优良生产性状，显示了生长激素基因在 鱼类基因工程育种中的广阔应用前景；另一方面，鱼类生长激素基因在工程菌中 ，_ 表达的技术体系得以建立和发展，使获得大量廉价的鱼类生长激素产品成为可 能，为渔业养殖新型饵料添加剂的研制开辟了新的途径。 1 鱼类生长激素的异源表达 研究发现，高浓度的生长激素是鱼快速生长的直接原因，给鱼饲喂基因工程 生产的重组鱼类生长激素，能显著提高鱼体血液中生长激素的含量，从而促进鱼 体的生长【2 4 】。转基因鱼血液中生长激素的含量是对照组的1 9 3 3 2 1 倍【2 5 】，高浓 度的生长激素是鱼体快速生长的直接原因同样，给虹鳟饲喂基因工程生产的重组 鱼类生长激素，也能显著提高鱼体血液中生长激素的含量，从而促进鱼体的生长 【2 6 】。大量生长激素可以通过重组生长激素基因工程菌发酵而获得鱼类生长激素 基因在大肠杆菌中的表达。 鱼类生长激素在大肠杆菌中的表达最早是由s e k i n e 在1 9 8 5 年完成的，诱导表 达的生长激素蛋白产物占细胞总蛋白的1 5 【2 7 1 。随后，虹鳟 2 s 】、鲑鱼( 2 9 】、金枪 鱼【3 0 1 、鲤鱼【3 1 , 3 2 1 、草鱼【3 3 】、石斑鱼【3 4 】等的生长激素也在大肠杆菌中相继获得表 达。 有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展：其一是表达效率 的提高，根据大肠杆菌编码密码子和己知的草鱼生长激素氨基酸序列，人工合成 7 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 草鱼生长激素e d n a ，并构建表达载体p e t g h ，转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，在t 7 启动 子的驱动下，通过诱导，获得的草鱼生长激素表达量占细胞总蛋白量4 0 t 3 3 1 。 t s a i 的等 ”j 构建了重组金枪鱼生长激素cd _ n a 到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中，使用卸 启动子，表达的活性r f g h 占细胞总蛋白的4 4 4 7 。j e h 等【蚓利用双顺反子系统在 大肠杆菌w 3 1i o ( a t c c3 7 3 3 9 ) 中成功表达了牙鲆生长激素基因，表达量超过细胞 总蛋白的4 0 。经提纯的重组牙鲆生长激素添加入饵料中投喂牙鲆4 周，实验鱼 比对照鱼体重增力1 1 2 4 。本实验室的臧晓南等【3 7 】采用逆转录聚合酶链式反应a 盯 p c r ) 方法，从牙鲆脑垂体总对妊中扩增出编码牙鲆生长激素成熟肽基因序列， 重组至融合表达载体p g e x - 4 t 3 中，构建成牙鲆g h 基因融合表达载体p g e x - g h ， 转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经i p t g 诱导表达，得到的g h 达细胞总蛋白的1 8 3 。 新型表达载体的研制和应用，也为获得更高表达量的外源蛋白提供了条件。然而 虽然鱼类生长激素基因可以在大肠杆菌中高效的表达，但影响g h 基因在原核细 胞中的表达水平的因素是多方面的。大肠杆菌表达产物往往形成包涵体，对其处 理耗时、繁琐，同时表达粗提物中含有内毒素，必须对目的产物进行严格的分离 纯化才可应用。因此人们又转而尝试可作为饵料的表达系统。 二是采用可作为饵料的表达系统。酵母是单细胞低等真核生物，它不仅具备 原核细胞增殖快、易培养、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋 白质翻译后加工的功能和重组蛋白正确折叠的细胞内环境，加之酵母粉本身就是 很好的单细胞蛋白饵料添加剂，富含各种必需的氨基酸、维生素。因此，酵母越 来越多地被作为生长激素的表达宿主菌。啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 首 先被用来作为鱼类生长激素的表达宿主【3 羽。e u r w i l a i c h i t r a - 窨t 3 9 1 使用2 种( t e f i 和 g a l l ) 启动子在啤酒酵母中分别得至t j 3 3m g l 和4 2m g l 的重组巨鲶鱼 ( p a n g a s i a n o d o n g i g a s ) 生长激素。而p i y a v i r i y a k u l 等h o 使用p g k 启动子在啤酒酵母 中获得1 0 2 5 r a g l 的重组巨鲶鱼生长激素。马进等1 4 l j 把经过p c r 技术改造的虹鳟 生长激素e d n a 克隆到含啤酒酵母p g k 启动子的大肠杆菌一酵母穿梭质p m a 9 1 中，转化啤酒酵母y 3 3 。构建表达鱼生长激素的酵母工程菌y 3 3 ( p m a r g h l 6 ) ， 得到的重组生长激素的表达量约占细胞可溶性蛋白总量的3 。由于啤酒酵母不 适合高密度培养，且在大量表达外源蛋白时，性状不够稳定，质粒易于丢失，现 在多用毕赤酵t 孽( p i c h i a p a s t o r i s ) 作为g h 的表达宿主。鲤鱼【4 2 ，4 3 1 、鲈鱼m “5 1 、草 3 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 鱼m 】等的生长激素相继在毕赤酵母中表达。 一。 。 k a w a t a 等1 47 】构建另一类表达载体p q s g l ，在藻类中表达重组的鲑鱼生长激 素，表达量占细胞蛋白含量0 1 。将鲈鱼生长激素基因与烟草花叶病毒3 5 s 启动 子及载体p a m l1 4 6 连接，构建整合型表达载体p a m g h ，导入聚球藻7 9 4 2 ，经p c r 检测证实鲈鱼生长激素基因已经整合进入蓝藻7 9 4 2 的染色体中。本实验室的臧晓 南等【4 8 】将牙鲆生长激素c d n a 重组到集胞藻中，在集胞藻自身的诱导型启动子一 铁缺乏诱导蛋i 刍( i s i a b ) 启动子的调控下，在蓝藻中表达了牙鲆生长激素，表达量 为2 2 3n g g h m g 藻粉。将该重组牙鲆生长激素基因集胞藻添加于饵料中投喂牙 鲆，喂养7 周后，0 5 和2 0 试验组鱼的体重增长分别比对照组提高了4 2 9 6 和5 4 8 5 ：以1 0 剂量投喂大菱鲆4 0 d ，试验鱼比对照鱼生长率提高2 1 6 7 。 新型表达载体的研制和应用，可以获得更高表达量的外源蛋白。 生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以以 活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收 大分子并转移进入血液循环。给虹鳟投喂重组鱿鱼生长激素，虹鳟的体重和体长 明显高于对照，通过荧光标记生长激素进一步确证，虹鳟的后肠是吸收生长激素 的部位，在生长激素通过胃和肠道前部时，其中大部分被降解，余下的小部分到 达后肠并进入血液循环，当生长激素以抗酸多聚物包被后投喂鱼，鱼体血液中的 生长激素水平以及鱼的生长速度都明显提高【4 9 】。鲤科鱼类与蛙科鱼类不同的是 没有胃，灌喂不同鱼同样浓度的辣根过氧化物酶，发现鲤鱼血浆中的辣根过氧化 物酶是虹鳟血浆的1 0 0 0 倍，所以生长激素在投喂给鲤科鱼类时，可以有更多的生 长激素蛋白分子到达后肠而被吸收。更令人有兴趣的结果来自等c h e n 的【5 0 】报道， 将富含重组猪生长激素的酵母投喂鸡，鸡的生长速度显著的提高，很可能部分片 段化后的生长激素仍保留了可与受体相结合的功能域，进而促进鸡的生长构建的 稳定整合草鱼生长激素基因的毕赤酵母，酵罐放大培养，收获菌体，裂解后作为 饵料添加剂，显著地促进了黄河鲤苗种阶段的生长【5 l 】。 2 鱼类生长激素在水产养殖中的应用展望 鱼类生长激素的分子生物学研究不仅具有重要的理论意义，使人类能够从分 子水平上深人认识鱼类生长激素的组成、结构、功能、基因调控及其进化分类意 9 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 义等，而且具有重大的应用价值。如何更好地发挥鱼类内源生长激素的生理作用 或将外源生长激素( 或基因) 引人鱼体，以促进生长、提高抗性，已成为当前鱼类 生长激素应用于水产养殖研究的重大课题。 鱼类生长激素研究随着生物技术的发展获得了快速的进展。通过生长激素基 因的转移，促使鱼类体内生长激素的大量产生，提高了鱼的生长速度。同时，利 用原核生物表达鱼类生长激素，提高了生长激素的产量，降低了生产成本。 第三节转基因藻的培养条件研究概况 随着藻类基因工程的发展，转基因蓝藻已有可能被大规模应用于植物疫苗 生产、环保及高附加值产品生产等。转基因蓝藻大规模应用中必然涉及的蓝藻高 密度培养技术研究日益引起人们的关注。因此在成功构建转基因藻之后，实现转 基因蓝藻高密度培养是转基因藻能否走向应用的关键环节之一。 1 各种营养盐对转基因藻生长的影响 与其它细菌相比，蓝细菌对周围环境的营养要求简单得多。由于长期对外界 环境的适应，蓝细菌已具备在体内合成各种重要元素贮存物的能力，如以糖原或 p h b 作为碳元素贮存物，以多聚磷酸贮存磷元素，以藻胆蛋白、蓝藻素等贮存 氮元素。这些物质的合成过程通常是耗能的过程，当出现营养限制时，相应物质 便开始降解，释放能量，并为细胞的正常生长提供原料。只有当这些贮存物消耗 到一定程度时，营养限制对细胞生长的影响才会体现出来。 自然界中除少数蓝藻具有自身固氮能力外，微藻必须从环境中吸收一定的氮 源，以满足其生长繁殖的需要【5 撕5 j 。氮是藻类培养中常见的限制性元素，是蛋白 质、核酸、磷脂的主要成分，也是组成叶绿素的主要元素，还参与构成各种酶与 辅酶。适当的氮源及理想浓度，才能促进藻的生长1 5 6 1 。 吴桂芳，吴庆余【5 7 l 等对硝酸钠浓度对集胞藻细胞生长影响的结果表明，蓝 细菌体内氮源贮存物的缓冲功能较强，足以维持细胞在较长一段时间内不受外界 条件的影响。但是当硝酸钠的浓度在0 3 1 5 9 l 时，细胞可得到持续的氮供应， l o 转牙鲆生长激素基因集胞藻培养条件的优化及其选择标记的消除 生长不出现减慢或停滞。在所研究的细胞浓度范围内，混养培养基中硝酸钠浓度 为0 3 9 l 便可满足细胞正常生长的需要。刘志伟等通过研究不同的氮源对转基因 鱼腥藻生长影响，结果表明硝酸钠作为氮源，转基因鱼腥藻生长旺盛，培养1 5 d 后，生物量达到1 4 6 8g l ，为最合适氮源。且当碳源含量一定时，硝酸钠的含量 低于2 2 5g l 时，生物量随着硝酸钠的含量