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南开大学硕士论文n a d - i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 摘要 以n a d + 为电子受体的n a d + - 依赖型异柠檬酸脱氢酶( n a d i d h ) 是一个核编码线 粒体酶，它是真核生物三羧酸循环的限速酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧成旺一酮戊二酸， 并将氧化型n a d + 还原成n a d h 。已知的真核生物n a d i d h 都是异源寡聚体结构，且 在不同物种中有不同的亚基组成。 我们以拟南芥和甘蓝型油菜( 不育系“陕2 a ”、保持系“陕2 b ”、恢复系“垦c 1 ” 及“t o p a s ”) 叶片，以及油菜不同发育时期的花粉与种子为材料，开展了有关n a d i d h 酶活性、全长e d n a 克隆等方面的研究。发现：油菜不同品系( 种) 间以及不同发育时 期的花粉和种子问n a d i d h 酶活性存在差异，其中“t o p a s ”酶活性最高、“陕2 a ”活 性最低：“t o p a s ”的不同发育阶段的花粉或种子n a d i d h 活性都高于叶片；花粉与种 子发育过程中，n a d i d h 活力呈抛物线规律。利用定量斑点杂交技术对不同发育时期 的花粉与种子总r n a 进行杂交，发现不同时期的花粉与种子n a d i d h 的m r n a 量不 存在差异。对不同品系n a d i d h 基因进行r t - p c r 克隆，序列分析表明油菜n a d - i d h 由b n i d h 0 、b n i d h l 与b n i d h 2 三个亚基所组成，其中b n i d h 0 是催化亚基，b n i d h l 和b n i d h 2 是调节亚基；不同品系各亚基之间，b n i d h 0 和b n i d h 2 是完全保守的，而b n i d h l 在不同 品系间存在一些差异。 细胞质雄性不育( c y t o p l a s m a i cm a l es t e r i l i t y ) 是不能产生有功能的花粉的母性遗传现 象，它形成的分子机制复杂。本文也对n a d - i d u 在花粉与种子发育过程的表达规律和 细胞质雄性不育机制做了一些探讨。 关键词：n a d + 一依赖型异柠檬酸脱氢酶、全长e d n a 、细胞质雄性不育 南开大学硕士论文n a d i d h 基因克降及花粉与种子发育过程中的表达规律 a b s t r a c t n a d + - d e p e n d e n ti s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e a d i d h ) i san u c l e a r e n c o d i n ge n z y m e r e s i d i n gi n m i t o c h o n d r i a i tc a t a l y z e sar a t e l i m i t i n gr e a c t i o ni nt h ec i t r i ca c i d c y c l et h a t c o n v e r t e di s o c i t r a t et o u - k e t o g l u t a r a t ec o u p l e d 谢出t h ep r o d u c t i o no fn a d h a l lk n o w n e u k a r y o t i cn a d i d h s h a v eah e t e r o o l i g o m e r i cs t r u c t u r e f u l l l e n g t he d n a l i b r a r i e so fb r a s s i c an a p u slh a v eb e e nc l o n e da n dn a d i d ha c t i v i t y w a sm e a s u r e di nd i f f e r e n ts p e c i e sa n dbn a p u sc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t yl i n ea n df e r t i l i t y l i n e t h er e s u l t si n d i c a t et h a tn a d i d h a c t i v i t yd u r i n gt h ed e v e l o p m e n t i np o l l e n sa n ds e e d s i sv a r i a b l e ，a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yi np o l l e n sa n ds e e d si sh i g h e rt h a ni nt h el e a v e s a l s o e n z y m ea c t i v i t yb e t w e e nd i f f e r e n ts p e c i e sa n db n a p u sc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y l i n ea n d f e r t i l i t yl i n ei sd i f f e r e n t q u a n t i t yd o tb l o t t i n ga n a l y s i so fb n a p u sd u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f p o l l e n sa n ds e e d sd e m o n s t r a t e dt h ed i f f e r e n c ei sn o td i s t i n c t t h es e q u e n c ea n a l y s e si n d i c a t e n a d i d hi nb n a p u si sc o m p o s e do ft h r e es u b u n i t s ，n a m e db n i d h 0 ，b n i d h la n db n i d h 2 b n i d h 0i sac a t a l y t i cs u b u n i tw h i l eb n i d h la n db n i d h 2a r er e g u l a t o r ys u b u n i t s b n i d h 0a n d b n i d k 2a r e c o m p l e t e d c o n v e r s e da m o n g c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y l i n es h a n2 a ，i t s m a i n t a i n e rl i n es h a h2 ba n d r e c u p t e r a t o rl i n ek e n c 1 h o w e v e rb a s ed e l e t i o n sw e r ef o u n di n s o m eb n i d h lc o l o n i e sf r o m c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t yl i n es h a h2 a a n dm a i n t a i n e rl i n es h a n 2 bo f bn a p u s c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y ( c m s ) i sam a t e r n a l l yi n h e r i t e dc o n d i t i o ni nw h i c h a p l a n ti s u n a b l et o p r o d u c e f u n c t i o n a l p o l l e n a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mi s c o m p l i c a t e d t a k e t o g e t h e r ，w e m a d es o m ep r e s u m p t i o no nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fc y t o p l a s m i cm a l e s t e r i l i t yi nh i g h e rp l a n t si nt h i sp a p e r k e yw o r d s ：n a d d e p e n d e n ti s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e ，f u l l l e n g t he d n a ，c y t o p l a s m i cm a l e s t e r i l i t y 2 南开大学硕士论文 n a d i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 啜p b a p b s a c d n a c m s d e p c d m s o d t t e b e d l i a l d h m o p s m r n a p c r p i p e s p v p s a p m p s s d s 5 _ u t r 略语一览 a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 限c o l ic 7 5 )细菌碱性磷酸酶 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r y d n a互补d n a c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y细胞质雄性不育 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸乙二脂 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲亚砜 d l d 汀h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙淀 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 i s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e异檬酸脱氢酶 3 - m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i c a c i d 3 - f n 吗啉代) 2 一羟基丙磺酸 m e s s a g e rr n a 信使r n a p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n聚合链式反应 p i p e r a z i n e n ，n - b i s ( 2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) ，s o d i u m p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 s t r e p t a v i d i n p a r a m a g n e t i cp a r t i c l e s 链霉抗生物素蛋白磁性珠 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 5 - e n du n t r a n s l a t e dr e g i o n5 - 非译区 3 南开大学硕士论文 n a d i d h 基凶克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 日l j吾 一、n a d i d h 基因 异柠檬酸脱氢酶( i s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e ，i d h ) 在生物体内有两种形式，即以n a d + 为电子受体的n a d + 一依赖型异柠檬酸脱氢酶( n a d i d h ) 和以n a d p + 为电子受体的 n a d p + - 依赖型异柠檬酸脱氢酶( n a d p i d h ) i ”。n a d p i d h 广泛存在于真核生物各个细 胞器( 如叶绿体、线粒体、过氧化物酶体以及胞质) 和原核细胞中，并表现出高活性， 但它是一个小分子蛋白，不具有别构酶性质，没有明显调节作用，在真核生物中主要不 是用于产能，而是在其它代谢中发挥作用2 。】。n a d i d h 则普遍被认为仅仅存在于真核 生物线粒体中，但由于i n o u e 等4 1 在嗜酸硫细菌( a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 中也发 现了n a d i d h ，因此它的分布也变得非常广泛。 真核生物中的n a d i d h 主要参与三羧酸循环，被认为是三羧酸循环的限速酶，负 责催化异柠檬酸氧化脱羧成n 酮戊二酸，并将氧化型n a d + 还原成n a d h ”。尽管真核 生物n a d - i d h 是一个线粒体酶，但其基因却存在于细胞核染色体上，因此它是一个核 编码的线粒体酶1 1 1 。 1 n a d i d h 的酶学性质与亚基组成 1 1 酶学性质 现已从多种生物中分离纯化了n a d i d h 酶，并分析了酶的动力学性质，认为 n a d i d h 是一个别构酶，与异柠檬酸的关系呈s 形曲线，而与n a d 的关系则呈双曲线， n a d h 是竞争性抑制剂，n a d p h 是非竞争性抑制剂，m g h 、m n 2 + 都是激活剂5 卅。尽 管不同来源的n a d i d h 普遍表现这些酶学性质，但通过对真菌、高等动植物以及人 n a d - i d h 的研究，发现影响酶活性因素在不同物种中存在非常明显差异，使n a d i d h 的酶学性质变得非常复杂。 ( 1 ) 哺乳动物的n a d i d h 能够被c a 2 + 离子激活，而在无脊椎动物、植物、酵母 中不存在这种现象。实验中发现由于激素等因素影响导致了细胞质中c a 2 + 浓度提高，而 细胞质中c 矿浓度的提高导致了线粒体c j + 浓度提高以及n a d h 产物增多，而且它不 仅可以影响n a d i d h 活性，还可以激活丙酮酸脱氢酶活性。研究者推测在哺乳动物 n a d i d h 的每个四聚体上可能有一个c a 2 + 结合位点，但是将哺乳动物n a d i d h 亚基 南开大学硕士论文 n a d - i d h 基崮克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 序列与酵母进行序列同源性比较后，并没有发现明显不同，也没有发现哺乳动物 n a d i d h 与其它钙结合蛋白存在明显相似性，因此c a 2 + 对哺乳动物n a d i d h 活性影 响的分子机理并不很清楚【”。 ( 2 ) 腺苷酸等因子对酶活影响也有很大差别。在酵母中，a m p 、a d p 是n a d i d h 的激活剂 8 】；但在豌豆中，a m p 、a d p 、a t p 对酶活都没有任何正的或负的影耐5 1 ：在 马铃薯中，a m p 、a d p 、a t p 对酶活反而表现出一定程度的抑制作用【6 ：在哺乳动物中， 这个酶受a d p a t p 浓度比的调控，随着a d p a t p 浓度比的增加n a d i d h 活性增加 7 】o ( 3 ) h u a n g 等 9 1 发现r e 2 + 离子对猪n a d i d h 酶活性产生影响，并在体外亲和切断 ( a f f i n i t yc l e a v a g e ) 亚基片段。在有氧气与抗坏血酸存在的情况下，f e ”能与猪n a d i d h q 亚基特异性结合，导致f t 亚基被切割成两个肽段而使酶完全失活，而且发现这种亲和 切断仅仅发生在有活性的n a d i d h 上，如果用浓度为6m o l f l 的尿素使酶变性，f e 2 + 将不再把酶切割成两个片段，因此认为这种特异性切断与酶结构有关。实验也发现这种 亲和切断受m n ”保护，但不受n a d 、n a d p h 、a d p 等保护，因此认为是由于m n ”与 f e 2 + 竞争同一位点所致。在有异柠檬酸和氧气存在的情况下，会促进f e 2 + 弓l 起酶失活， 但不会导致酶的亲和切断，表明在异柠檬酸存在下f e ”离子导致失活另有原因，研究者 认为可能是由于半胱氨酸氧化所致。 ( 4 ) 研究发现啤酒酵母线粒体多数基因的m r n a5 - u t r ( 非翻译区) 能与n a d - i d f t 结合【l ，甚至报道了有些线粒体基因如c o x 2 基因的含5 - u t r 的m r n a 是n a d i d h 别 构抑制剂，因为当转录本为o 1i ，t m o l l 时，酶反应速度是没有此转录本时的2 0 ：a t p 9 基因的转录对其也有抑制作用，推测可能是因为转录本中含有潜在茎环二级结构可能能 与n a d i d h 结合，而且1 0 0g m o l l 的别构活化剂a m p 可以消除这种抑制作用，而d a m p 的效果不如a m p ，其它核苷酸则没有任何作用【l ”。但通过对啤酒酵母与粟酒裂殖酵母 的n a d i d h 序列进行同源性比较后，并没有发现在序列上存在能与r n a 结合的保守 氨基酸，而且也有报道指出乳酸克鲁维酵母n a d i d h 不能与线粒体c o x 2 基因的m r n a 结合【l “，所以目前尚不能完全肯定n a d i d h 与线粒体m r n a 结合是否具有普遍性。 此外，m c i n t o s h t 5 】在对豌豆n a d i d h 的研究中还发现1m m o l l 的柠檬酸使酶的最 大速度和米氏常数都发生改变，认为碗豆n a d i d h 的活性还受柠檬酸的影响，也有研 究者报道p h 值影响豌豆n a d i d h 活性。 1 2 亚基的组成 真菌、细菌、高等动植物以及人n a d i d h 的酶学性质表现明显差异外，其亚基组 南开大学硕上论文 n a d i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 成在不同物种中也有很大差异。 ( 1 ) 真菌： 在真菌中，已经对啤酒酵母 8 a 3 1 5 、乳酸克鲁维酵母 1 2 】、粟酒裂殖酵母1 ”、布拉克 须霉【l6 1 等物种的n a d i d h 亚基组成进行了深入研究，认为酵母的n a d i d h 是一个异 源八聚体，由四个 d h l 亚基和四个i d h 2 亚基组成，每个八聚体内有四个异柠檬酸结 合位点，两个a m p 、n a d 结合位点 8 】，但酵母n a d i d h 单个亚基并不具有独立催化 和调节功能。c u p p 和m c a l i s t e r h e n n 【1 川5 1 用基因替代法构建了i d h l 基因或i d h 2 基因 缺失突变株，用w e s t e r n 杂交分析了i d h l 菌株和i d h 2 菌株与野生型的差别，发现 a i d h l 菌株提取物里没有i d h i 蛋白，i d h 2 菌株里也没有i d h 2 蛋白，且没有发现 两突变株具有n a d i d h 活性，但当加入野生型菌株的细胞提取液后，都检测到了 n a d i d h 活性，因此认为i d h l 和i d h 2 两亚基对n a d i d h 活性都必不可少。用含有 i d h 2 亚基基因不同拷贝数的穿梭载体转化到i d h 2 菌株中，发现单拷贝载体的表达水 平与野生型相同，多拷贝载体的表达量提高了3 0 倍，表明这两个基因是独立转录的， 但没有发现i d h 2 基因过量表达导致全酶活性提高现象。同样，用含有i d h l 亚基基因 不同拷贝数的穿梭载体转化进a i d h i 菌株时发现i d h l 基因过量表达也不能提高全酶 活性。p a n i s k o 和m c a l i s t e r h e l l l l 【17 】用酵母双杂交系统研究了两亚基间相互作用，发现 两亚基间既存在相互作用又有独立分工，结构和功能的基本单位是i d h l 和i d h 2 两亚 基组成的异源二聚体，两个亚基都有异柠檬酸结合位点，但在i d h 2 上的活性位点是催 化性质的，而在i d h l 上的活性位点则起调节作用，因此认为i d h 2 主要负责催化，而 i d h l 则主要负责调节。z h a o 1 8 1 等利用氨基酸替代的方法发现天冬氨酸对两亚基的结合 起着关键性作用。实验发现i d h l 的a s p 2 7 9 和l i e 2 8 0 用丙氨酸来取代会导致全酶不能 被a m p 激活，但是其整个的协同性不受影响。而i d h 2 中与i d h i 这两氨基酸同源的 a s p 一2 8 6 和i l e 一2 8 7 用丙氨酸取代不影响全酶a m p 的别构效应，但是使全酶对n a d 的 亲合性大大降低，s o5 下降了7 0 倍，因而导致其最大速度下降了1 6 0 倍，但是其别构活 性不受影响。因此认为i d h l 的a s p 一2 7 9 和i l e 2 8 0 主要负责与a m p 中部分腺嘌呤核苷 酸结合，而i d h 2 的a s p 2 8 6 和l l e 一2 8 7 主要负责与n a d 中部分腺嘌呤核苷酸结合。同 时发现i d h l 的a s p 一1 9 1 对催化活性必不可少，而i d h 2 的a s p 一1 9 7 对别构活性必不可 少，而且这个氨基酸残对两亚基之间相互作用起着重要的作用。结合以前的研究结果， 推测它的结构模式如图1 ： 南开大学硕士论文n a d - 1 d h 摹因克降及花粉与种子发育过程中的表达规律 图1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f k i n e t i cc o n t r i b u t i o no f l d h la n di d h 2s u b u n i t s 除酵母外，a l v a r e z v i l l a f a n e 1 6 1 等还对丝状真菌布拉克须霉n a d i d h 进行了研究， 发现在以乙酸盐为碳源的培养基上培养时，菌内有两种形式的n a d i d h ，并认为其中 一种( i d h 一2 ) 是在特定生长条件下诱导出来的，可能与乙醛酸途径有关，分析发现两 种形式的n a d 1 d h 都是八聚体，都是由两亚基组成，但是这两种形式的i d h 等电点不 同，i d h 1 的等电点为5 2 8 ，而i d h 2 的等电点为4 9 6 ，当用尿素变性电泳时发现i d h 一2 比f d h 一1 更稳定。 ( 2 ) 哺乳动物：现己从猪【9 、牛【、猴p 挪1 、猫f 2 0 】、人【2 1 1 等哺乳动物的某些器官中 分离纯化了n a d i d h 。在高等动物中，n a d i d h 是由、1 3 、v 三个亚基以2 ：1 ：1 形式 组成的四聚体，每个四聚体各有两个a d p 、异柠檬酸、n a d 、n a d h 以及m n 2 + 结合位 点，但没有发现其他金属离子结合位点。其中a 亚基为催化亚基，并有一部分的异柠檬 酸结合位点，而p 、y 亚基可能与调节有关，上面有a d p 结合位点。在体外，a d 、唧 组成的酶也具有n a d i d h 活性，但是脚组成的酶没有n a d i d h 活性 9 1 。k i m 等【2 2 1 等发现人n a d i d h 的d 亚基有两种形式，即p 1 和p 2 ，这两个亚基大小不同，是由同 一个前体经不同的拼接方式而形成，并且发现这两种亚基存在着组织特异性，d 1 主要存 在于心肌和骨骼肌中，而b 2 则广泛存在于非肌肉组织中，推测可能与n a d i d h 活性在 不同组织中的最适p h 值有关。 ( 3 ) 植物：由于植物n a d i d h 非常不稳定、活性低，因此酶的结构目前不是很清 楚，说法不一。碗豆【5 i n a d i d h 被认为可能是一个同源八聚体；烟草2 3 1 的n a d i d h 被 证实是一个异源多聚体，由三个亚基组成，其中i d h a 亚基主要是负责催化作用，i d h b 、 i d h c 可能与调节功能有关。在拟南芥n a d i d h 的早期研究中认为是由两个不同亚基组 成 2 4 j ，但报道指出此两弧基组成的酶不具有n a d i d h 活性；最近在g e n b a n k 中，又有 人报道了拟南芥另外一个n a d 1 d h 亚基序列( 序列号为a f 3 2 4 6 6 4 ) 。 南开大学硕士论文 n a d 1 d h 基凼克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 ( 4 ) 细菌：先前研究指出n a d i d h 仅仅存在于真核生物中，但i n o u e 4 1 等发现嗜酸 硫细菌中也有n a d i d h 后，对长期以来认为n a d i d h 只存在真核生物中的观点提出 了质疑。在细菌中，不仅仅在嗜酸硫细菌中，在那些含有三羧酸循环缺陷型的某些化能 无机营养型细菌中也发现了n a d i d h 的存在【2 ”。嗜酸硫细菌n a d i d h 是一个同源二 聚体，既可以以n a d 为辅酶，也可以以n a d p 为辅酶，但与n a d 的亲和力是n a d p 的7 8 倍，经序列同源性分析发现该酶与其它以n a d 为特异性电子受体的脱羧脱氢酶在 与n a d 结合位点上存在着保守的氨基酸。 2 n a d i d h 的基因克隆以及蛋白的组装和定位 2 1n a d i d h 的基因克隆 现己从真菌、细菌、植物、动物等多个物种中实现了编码n a d i d h 基因全长c d n a 克隆，并在各物种间、同一物种各亚基间以及同一物种不同品种间进行了序列同源性比 较。酵母两个亚基间序列同源性为4 2 1 5 1 。拟南芥两亚基间序列同源性为8 2 7 【2 4 1 。 烟草中的i d h b 与i d h c 有7 7 的同源性，i d h a 与i d h b 只有4 3 同源，与i d h c 只有 4 4 同源 23 1 。猴 7 n a d i d h 的亚基与p 亚基间有4 3 的同源性，亚基与y 亚基间有 4 3 的同源性，p 亚基与y 亚基间有5 1 的同源性。物种间同源性比较指出，嗜酸硫细 菌n a d i d h 与大肠杆菌n a d p i d h 间有5 9 的同源性，高于嗜酸硫细菌与酵母的 2 6 7 【4 】。拟南芥与酵母两亚基间的同源性在3 5 一4 9 之间，而与猴三个亚基的同源性 在4 4 一5 5 之间【2 。哺乳动物之间相同类型亚基的序列同源性高达8 5 一9 9 ，而哺乳 动物与酵母间只有3 5 5 0 t ”。 在植物n a d i d h 基因转录调控研究中，f a l k 2 6 j 等对油菜萌发过程中n a d i d h 的 转录方式进行了研究，发现n a d i d h 酶活性在种子吸胀两天后才检测到活性，而r n a 杂交显示n a d - i d h 的m r n a 在干种子中己存在，并且在第四天后m r n a 水平提高了。 这意味着n a d i d h 酶在油菜萌发过程中存在转录后调控。r o b e r t l 2 3 1 等也发现了烟草 n a d i d h 两个调节亚基在同一组织中存在转录或转录后调控。 2 2n a d i d h 蛋白的组装和定位 n a d i d h 是一个核编码的线粒体酶，核编码蛋白通常以前体蛋白形式转运到线粒 体中，这个前体蛋白的某个区域含有一个可被剪切的前导序列( p r e s e q u e n c e ) ，这个前 导序列在转运过程中或在转运后被蛋白酶剪切去除。此过程同时还有分子伴侣参与，以 防止多肽链内或链问不恰当的相互作用。 南开人学硕士论文n a d - i d h 基冈克隆及花粉与种了发育过程中的表达规律 n a d i d h 蛋白转运与组装研究主要是在酵母中完成。g a d d e 2 剐等和z h a o 2 9 l 等对酵 母两亚基的折叠、组装以及在线粒体中的定位进行了详细研究，研究结果显示两亚基的 组装并不是独立的，i d h 2 在组装中起着主导作用。两亚基在胞质中尚未组装时，性质 差别很大，i d h 2 p 可溶，而i d h l p 不可溶，i d h l p 能够与其他物质共价结合形成i d h l p - c p x 复合物2 ”，研究也显示酵母细胞质中组装的n a d i d h 同样具有酶活性，认为亚基的折 叠和组装无需到线粒体即可完成，不需要特异的线粒体因子作指导【捌。在亚基转运研究 中，发现两亚基的转运都需要各自的前导序列，亚基转运是相互独立的，但目前并不清 楚是否需要分子伴侣参与【2 。影响亚基在线粒体中定位因素的研究显示，各亚基间存在 很大不同，是否存在前导序列是决定i d h 2 能否定位到线粒体中的唯一决定因子；但对 于i d h l ，不仅前导序列是必需的，生长环境因素也可能对亚基定位有一定影响，对两 亚基前导序列对比分析表明它们与其它核编码蛋白的前导序列没有太大区别，都含有几 个带正电荷疏水性碱性氨基酸( 2 9 j 。 3 n a d i d h 的功能研究 随着n a d - i d h 酶学结构、性质和基因克隆方面研究的深入，在生物学功能方面也 开展了大量研究，认为n a d i d h 是一个多功能酶，参与以下生物代谢途径。 3 1 三羧酸循环中的限速酶 在真核生物中，n a d i d h 是三羧酸循环中重要限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧成 酮戊二酸并生成n a d h 。c u p p f l 4 - 15 等在实验中发现缺失n a d i d h 活性的酵母菌株不能 利用乙酸为碳源，而且在乳酸或者甘油为碳源的培养基上，生长速度也比野生型慢很多， 这个生长表型说明n a d i d h 确实在三羧酸循环中起着重要作用。三羧酸循环作为能量 代谢的重要途径对生物体生命活动起着重要的作用，能够提供远比糖酵解大得多的能 量，而且不仅仅是糖代谢的重要途径，也是脂质、蛋白质和核酸代谢最终氧化成二氧化 碳和水的童要途径。由于n a d 一1 d h 是三羧酸循环的限速酶，因此n a d i d h 活性对 生物体的整个生命代谢都有很大影响。 3 2 在氮代谢中的作用 对烟草3 0 1 、l a c c a r i a6 ? d 1 n a d i d h 研究表明n a d i d h 可能在氮代谢中起着重 要作用。l a n c i e n 3 0 l 等发现烟草经短期氮饥饿后重新补给氮源时，编码n a d i d h 基因的 转录水平提高了，但是并没有发现表达的蛋白量出现增多，推测转录水平的提高可能是 由于n a d i d h 催化异柠檬酸生成旺酮戊二酸，而一酮戊二酸与谷氨酸合成有关，也有 南开大学硕士论文 n a d - i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 可能是由于氮源吸收需要三羧酸循环来提供能量。然而对衣藻3 2 1 的研究并没有发现 n a d i d h 对氮代 身 存在明显影响。 3 3 参与乙醛酸循环 乙醛酸循环是三羧酸循环的一种变化形式，仅在微生物、藻类和高等植物中存在， 异柠檬酸裂解酶是这个循环中特有的酶。a l v a r e z v i l l a f a n e 1 6 1 的研究显示n a d i d h 可能 与乙醛酸循环途径有关。当布拉克须霉以乙酸为碳源时，检测到菌体内有两种形式的 n a d i d h ，研究者认为其中一种形式的n a d i d h ( i d h 一2 ) 是在特定生长条件下诱导 出来的，而且发现i d h 2 并不是i d h 1 的同工酶，它与乙醛酸途径中的异柠檬酸裂解酶 存在竞争。 3 4 与线粒体基因的表达及线粒体的其它功能有关 由于在有些酵母中发现某些线粒体基因m r n a 的5 - u t r 能与n a d i d h 结合，因 此推测这种结合可能在调节线粒体基因的翻译中起着重要作用。j o n g 2 3 1 等用p u l s e c h a s e 标记蛋白方法发现这种结合确实导致了线粒体基因翻译产物增加2 3 倍，但是这些新合 成的蛋白与野生型蛋白相比较更不稳定，降解速度提高了2 3 倍，因此研究者认为 n a d - i d h 与线粒体基因m r n a 结合后可能导致线粒体基因m r n a 进行了不正确的翻 译。 g a d d e ”1 等发现不能以乙酸为碳源的k i d h 2 酵母突变株，当其它基因( 三羧酸循环 中编码柠檬酸合成酶的亚基c i t l 基因或其它基因) 发生突变时这种酵母突变株就能够 利用乙酸作为碳源，但造成这种突变抑制的原因并不清楚，研究者提出了三种模型来解 释这种现象：( a ) 可能是蛋白空间结构上的互补；( b ) 可能发生新的代谢途径：( c ) 因为酵母n a d i d h 是一个r n a 结合蛋白，可能与线粒体其它功能有关。此外，也有 研究者日5 j 认为在有些植物中，n a d i d h 有两种存在方式，即膜结合酶和基质酶，其中 与膜结合的酶可能通过与复合物i 结合而参与电子传递链。这些研究暗示着n a d i d h 可能与线粒体其它功能( 线粒体基因的翻译、电子传递、三羧酸循环中其它酶作用) 有 关。 二、植物雄性不育 植物雄性不育是指植株不能产生正常花药，花粉或雄配子的现象，是被子植物一种 较为普遍的生物学特征。它可能由核基因决定，也可能由细胞质基因决定，前者称为细 南开人学硕士论文n a d i d h 基冈克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 胞核雄性不育( n u c l e a rm a l es t e r i l i t y , n m s ) ，后者称为细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i cm a l e s t e r i l i t y , c m s ) 。 1 细胞核雄性不育 在被子植物的小孢子发生、发育及花粉成熟过程中，一系列的细胞和生化变化是由 许多核基因控制的，其中有些是花药特异的( a n t h e r - s p e c i f i c ) ，即只在花药中表达。因此， 只要这些基因中的某个基因结构或表达发生变异，就会引起小孢子发生、发育或花粉成 熟异常，从而导致植株表现出雄性不育。花药特异基因在花药发育过程中的表达有时间 性和区域性，特定基因只在特定时间、特定区域进行表达i ”1 。 a l b a n i 等对油菜花药特异基因进行了研究，发现其花药特异基因呈族存在，一般由 1 0 1 5 个密切相关的基因组成，b 。含有一个基因家族的3 个成员，这个家族的基因是在 小孢子发育早期进行表达，在花粉成熟过程中显著降低，其中1 个基因( b p 。b ) 被认为是无 功能的，因为在5 端和内含子剪切点存在序列重排。b p ，含有1 个基因，它在单核小孢 子时丌始表达，并逐渐增强，在小孢子发育后期达到最高，在花粉成熟过程中显著降低b p 。 基因的启动子和b p 。a ，b p 。c 基因的启动子存在3 个同源序列，和矮牵牛的小孢子的特 异基因c h i a 的上游启动子p 。存在4 个同源序列，其中有1 个同源序列在b 。启动子中 存在两份”“6 1 。 2 细胞质雄性不育 细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y , c m s ) 是一种不能产生有活力花粉的母 性传递的性状，其遗传方式不符合孟德尔规律。这种现象在高等植物中普遍存在。迄今 为止，至少有1 4 0 个物种发现有雄性不育现象，如：菜豆、甜菜、水稻、小麦、玉米、 胡萝h 、洋葱等等。这些雄性不育系有一半以上是自发形成的，大约有2 0 发生的种内 杂交过程中，其余是在种间杂交过程或通过原生质体融合产生的d 7 1 。细胞质雄性不育又 称核质互作雄性不育】。 这种受细胞质与细胞核互作控制的雄性不育类型，其细胞质中有一种能使雄配子败 育的遗传物质s 这种细胞质称为不育胞质，即s 胞质。与其相对应的另一种细胞质中， 一 有一种能控制形成正常雄配子的遗传物质n ，这自自细胞质称为正常( 可育) 胞质，即n 、一 胞质。细胞核具有一对或几对能影响细胞质育性的基因。以一对基因为例，显性基因r f 能使不育性恢复可育，称为恢复基因；隐性的等位基因r f ，不能使育性恢复可育，只能 保持其雄性不育，称保持基因。核、质互作共有6 种遗传结构。 南开大学硕士论文 n a d i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 如某一材料其细胞质为s ( 不育胞质) ，细胞核具一对隐性不育基因r f r f ，它的育性遗 传组成为s ( r f r f ) ，就是不育系；如果某一材料的细胞质为n ( 正常可育胞质) ，细胞核 具有一对隐性不育基因r f r f ，它的育性遗传组成为n ( r f r f ) ，就是保持系：如果某一材料 的细胞质为s 或n ，细胞核存在一对显性恢复基因，它的育性遗传组成为s ( r f r 0 或 n ( r f r f ) ，都是恢复系【4 “。 虽然至今对细胞质雄性不育的分子基础仍不完全清楚，可也有了不少进展。下面从 几个方面来介绍与质雄性不育有关的因素以及核基因对它的影响。 2 1 植物线粒体基因组的嵌合基因以及核基因对它的影响 在许多c m s 系统中，研究发现，植物线粒体基因组中存在的嵌合是导致c m s 的重 要因素。线粒体嵌合基因是如何形成的呢? 现在普遍认为嵌合基因是线粒体基因组重组 形成的。 如与玉米t c m s 有关的线粒体基因为“， 一1 3 ，不育系的该位点是基因组经过7 次 重组所形成的嵌合基因，它含有与r r n 2 6 基因3 侧翼区、a t p 6 基因5 侧翼区非常相似的 序列，以及部分r r n 2 6 基因的编码区。其结构如图2 所示： s a 叫t p 6 ”砬63 诎j r ，产05 m 呲+ 7f 5 8 8c 。d o n s 9c 。d o n s 。：。 图2 ：t - c m s 型玉米中嵌合基因t 鲫3 的结构 玉米t - c m s 细胞质雄性不育基因驴一1 3 最初是利用不育和可育胞质线粒体总r n a 分别同不育线粒体d n a 文库差次杂交发现的。o r f l 3 序列能同3 9k b 、2 0k b 、1 8k b 、 1 5k b 和1 1k b5 种r n a 分子杂交，当引入核恢复基因后该序列则仅同1 , 6k b 和6 0 0 b p 的r n a 分子杂交，且转录产物丰度大大下降；保持系和育性回复突变等可育胞质因无 南开大学硕十论文n a d i d h 基因克隆及花粉与种子发育过程中的表达规律 该基因序列检查不到任何转录产物【4 4 】。 f o r d e 等用线粒体体外翻译方法发现t c m s 玉米不育系合成特异的1 3 k d 蛋白： d e w e y 用人工合成的该基因寡聚多肽以及w i s e 等用f i - - 3 导入大肠杆菌合成的蛋白制 备抗体，均证明该基因合成1 3k d 的多肽；而且1 3k d 蛋白只在不育系中才有合成，当 引入核恢复基因后其丰度显著下降【4 ”。 基于对r f - 1 3 的研究，有人提出了“毒性假说”来解释细胞质雄性不育现象。假说 认为u r f l 3 本身就是一种毒蛋白，它结合在线粒体内膜上形成一个通道，从而导致线粒 体膜通透性增强，基质内离子外泄，正常膜电势降低，能量合成受阻，尽管它可能对t c m s 玉米整株细胞都有毒性，但对花药的毒性更大，因而最终导致花粉败育。线粒体内 蛋白多肽合成后加工过程的紊乱导致花粉败育【4 6 】。 2 2 线粒体质粒以及核基因对其影响 植物线粒体基因组中含独立存在且能自我复制的线粒体质粒。许多研究者发现不育 和可育胞质线粒体质粒不同。如水稻b t 型不育系中的b l 、b 2 和水稻红莲型不育系中 的m 3 等。玉米s 型细胞质雄性不育系线粒体质粒s - 1 和s - 2 。s 1 、s - 2 最大的特点是两 端具有倒转重复序列，推测s 因子两端倒转重复序列同主环同源序列的重组所引起的某 些线粒体基因编码的改变是不育性产生的原因【4 ”，因为在一些育性回复突变体中检测不 到游离的s 1 、s 2 因子，而且核基因影响包括s 一1 、s - 2 因子同源序列在内的线粒体d n a 组织结构【4 ”。 2 3r n a 编辑不完全以及核基因的影响 线粒体基因转录产物r n a 的编辑普遍存在；但有的无编辑发生，如玉米的u j q - 1 3 、 萝b 的咖6 以及小麦的o f f 2 5 6 等基因。r n a 编辑有的与植物细胞质雄性不育有关。最 能说明编辑与c m s 关系的例子是小麦线粒体基因a t p 9 ，与正常品系相比不育系a t p 9 的 r n a 编辑不仅不完全，且有g a 、a g 、u a 等新的编辑形式，3 7 位密码子处由于出现c u 而产生终止密码子，而当引入合适的显性恢复基因后，正常的编辑则被恢复。用转基因 技术把编辑和未编辑a t p 9 基因转化烟草原生质体，结果显示导入编辑a t p 9 基因的再生 植株全部可育，而导入未编辑a t p 9 基因的植株却表现出雄性不育【4 9 1